Koagulaasi-negatiivisten stafylokokkien adheesio, invaasio ja lisääntyminen sekä laktoferriinin vaikutusin vitro utare-epiteelisoluilla
Sari Käyhkö Pro gradu-tutkielma Ravitsemus- ja elintarvikebiotekniikka Biotieteiden laitos Luonnontieteiden ja ympäristötieteiden tiedekunta Kuopion yliopisto Tammikuu 2008
KUOPION YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja ympäristötieteiden tiedekunta Biotieteiden laitos
Ravitsemus- ja elintarvikebiotekniikka
KÄYHKÖ, SARI K. : Koagulaasi-negatiivisten stafylokokkien adheesio, invaasio ja lisääntyminen sekä laktoferriinin vaikutusin vitro utare-epiteelisoluilla
Pro gradu, 60 sivua, 3 liitettä (3 sivua)
Ohjaajat: ELL Paula Hyvönen, KuY ja Prof. Atte von Wright, KuY Tammikuu 2008
_________________________________________________________________________
Avainsanat: Utaretulehdus, KNS, utare-epiteelisolut, boviinilaktoferriini, adheesio, invaasio, monistuminen
Utaretulehdus on yleisin ja suurimmat taloudelliset tappiot aiheuttava lypsytilalla todettu sairaus.
Koagulaasi-negatiiviset stafylokokit (KNS) aiheuttivat lähes joka toisen utaretulehduksen vuoden 2001 kartoituksessa. Tulehdukset ovat yleensä oireeltaan lieviä ja niitä tavataan useimmiten poikimattomilla hiehoilla ja nuorilla lehmillä niiden maidontuoton alkuvaiheessa.
Boviinilaktoferriini on rautaa sitova glykoproteiini. Rauta on useimmille bakteereille kasvun edellytys. Maidon laktoferriinipitoisuus kohoa sitä korkeammaksi mitä infektiivisempi tulehdusta aiheuttava bakteeri on.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää utare-epiteelisolumalli (BME) utaretulehdusta aiheuttavien bakteerien virulenssin tutkimiseen ja erityisesti selvittää boviinilaktoferriinin vaikutusta in vitro KNS-bakteerien adheesio-, invaasio- ja solun sisäiseen lisääntymiskykyyn.
Lisäksi vertailtiin eri KNS-bakteerien virulenssia. Kantoina käytettiin kliinisistä ja piilevistä utaretulehduksista eristettyjä S. aureus, S. chromogenes, S. simulans, S. epidermidis, S.
haemolyticus jaS. cohnii -kantoja.
Menetelmän validoinnissa kontrollikannoilla hajontojen huomattiin olevan suuria. Kuitenkin tutkimuksessa käytetty positiivinen kanta adhesoitui, invasoitui ja monistui parhaiten ja negatiivinen kanta huonoiten tutkituista kannoista. Kantojen tulokset, verrattiinpa niitä keskenään tai saman päivän positiiviseen kantaan, eivät eronneet toisistaan Altistusvaiheista adheesio ja invaasio sekä monistumisen ja monistuskerroin korreloivat hyvin. Tässä tutkimuksessa patogeenisiksi ja heikosti patogeenisiksi luokitellut kannat olivat saaneet maidon solupitoisuuden nousemaan korkeaksi, kun taas suurin osa apatogeenisiksi luokitelluista kannoista ei ollut aiheuttanut kliinisiä oireita. Tutkimuksen persistoivat kannat olivat joko heikosti patogeenisia tai apatogeenisia. Laktoferriinikäsittely alensi joka toisen tutkitun kannan invaasiota ja monistumista, mutta vain monistumisen alenema oli tilastollisesti merkittävä. Altistusvaiheisiin tai laktoferriiniin vaikutukseen ei saatu tilastollisesti merkittävää eroa persistoivien ja ei- persistoivien kantojen välille.
Tutkimuksessa todettiin eroja KNS-kantojen patogeenisyydessä, ja laktoferriini näyttää alentavan KNS-kantojen monistumista. Tutkimuksessa kantojen sisäinen hajonta oli kuitenkin suurta, joten tuloksia voidaan pitää vain suuntaa-antavina.
UNIVERSITY OF KUOPIO, Faculty of Natural and Environment Science Department of Biosciences
Degree Programme in Nutrition and Food Biotechnology
KÄYHKÖ, SARI K.: The effect of lactoferrin adhesion, invasion and intracellular multiplication of coagulase-negative staphylococcus in bovine mammary epithelial cell model
Master Thesis, 60 pages, 3 appendix (3 p.)
Supervisors: DVM Paula Hyvönen, KuY and Prof. Atte von Wright, KuY January 2008
_________________________________________________________________________
Keywords: Mastitis, CNS, Bovine Mammary Epithelial Cells, Bovine lactoferrin, Adhesion, Invasion, Intracellular multiplication
Mastitis is the most common disease and can cause most economic losses in dairy cattle.
Coagulase-Negative Staphylococcus (CNS) caused almost half of the Finnish mastitis cases in 2001. Symptoms of CNS-mastitis are usually mild. Mastitis caused by CNS bacteria is most common among unbred heifers and first-milking cows. Bovine lactoferrin is an iron-binding glycoprotein. Most bacteria require iron to multiply. The more severe the intramammary infection is the higher the lactoferrin concentration.
The objective of this study was to develop Bovine Mammary Epithelial Cell model to investigate the virulence of mastistis bacteria and especially to define the effect of bovine lactoferrin in vitro to adhesion, invasion and intracellular multiplication of CNS bacteria. In addition, the virulence of different CNS bacteria was compared. The species used were S. aureus, S. chromogenes, S.
simulans, S. epidermidis, S. haemolyticus and S. cohnii, which have been isolated from clinical and subclinical mastitis.
The method was validated using the controlspecies The variation of results was high. However, adhesion, invasion and multiplication were highest with the positive species used in this study and lowest with the negative species. The species could be examined by comparing them with each other, because comparing the species to the positive control of the same day didn’t make a difference. Both adhesion and invasion and also multiplication and rate of multiplication correlated well. Mainly species that were classified pathogenic and slightly pathogenic reached higher cell concentration. Most of the species that were classified non-pathogenic did not cause symptoms. The persistent species of study were either slightly pathogenic or non-pathogenic. The lactoferrin treatment reduced the invasion and multiplication of half of the examined species, but only in the case of multiplication and the rate of multiplication the reduction was statistically significant. It was not possible to make any statistical difference in the exposure phase or the effect of lactoferrin between persistent and non-persistent species.
We found a difference between the examined CNS species pathogenity, and bovine lactoferrin treatment lowered the multiplication statistically significantly. However, the distribution of examined species was high and that´s why the results are only indicative.
Sisällysluettelo
JOHDANTO... 6
KIRJALLISUUSOSIO 1 UTARETULEHDUS ... 8
1.1 Utaretulehdukselle altistavat tekijät... 8
1.2 Utaretulehduksen vaikutus maidon laatuun... 9
1.3 Utaretulehdusta aiheuttavat bakteerit... 10
1.31Staphylococcus aureus utaretulehduksessa ... 10
2 KOAGULAASINEGATIIVISET STAFYLOKOKIT UTARETULEHDUKSESSA ... 12
2.1 Koagulaasi-negatiivisten stafylokokkien luonne ja esiintyvyys ... 12
2.2 Yleisimmät KNS-kannat... 13
3 KNS -INFEKTION PATOGENEESI... 15
3.1 Virulenssitekijät... 15
3.2 Adhesoitumis- ja invasoitumismekanismit ja niiden esto ... 15
4 SOLUVILJELYN KÄYTTÖ PATOGENEESIN SELVITTÄMISEKSI ... 18
4.1 Koagulaasi-negatiiviset stafylokokit... 18
4.2Escherichia coli... 18
4.3Staphylococcus aureus... 19
4.4Streptococcus uberis jaStreptococcus dysgalactiae... 20
5 LAKTOFERRIINI ... 21
5.1 Yleistä ... 21
5.2 Vaikutusmekanismit... 22
5.21 Vaikutus adheesioon, invaasioon ja solunsisäiseen monistumiseen... 22
5.22 Vaikutus KNS-kantoihin... 23
5.23 Vaikutus muihin bakteereihin... 23
5.3 Laktoferriinin vaikutus in vitro kokeissa... 24
5.4 Laktoferriinin vaikutus in vivo kokeissa ... 25
TUTKIMUSOSIO 6 MATERIAALIT JA MENETELMÄT ... 27
6.1 Stafylokokit ... 27
6.11 Stafylokokkien käsittely ennen altistusta... 28
6.21 Utare-epiteelisolujen käsittely ennen altistusta ... 29
6.3 Boviinilaktoferriini... 30
6.4 Menetelmän validointi ... 30
6.5 Altistus ... 31
6.6 Adheesio- ja invaasioprosentin sekä monistuskertoimen laskeminen... 32
6.7 Tilastolliset menetelmät... 32
7 TULOKSET JA TULOSTEN TARKASTELU... 34
7.1 Menetelmän validointi kontrollikannoilla ... 34
7.2 Altistuskokeet KNS-kannoilla ... 36
7.3 Korrelaatio ... 40
7.4 Bakteerikantojen patogeenisyys ... 41
7.5 Laktoferriinin vaikutus kantoihin... 44
7.6 Persistoivien ja ei-persistoivien kantojen vertailu... 47
8 POHDINTA... 49
LÄHTEET ... 53
LIITTEET...58
JOHDANTO
Utaretulehdus on yleisin ja suurimmat taloudelliset tappiot aiheuttava lypsytilalla todettu sairaus.
Vuosittain utaretulehduksien takia lääkitään n. 20 % karjamäärästä ja 30 – 40 % karjasta sairastaa piilevää utaretulehdusta. Lisäksi joka kolmannen poiston syynä on utaretulehdus. Utaretulehdus aiheuttaa maatilalle ylimääräistä työtä ja taloudellista tappiota hoito- ja lääkekuluina sekä etenkin tuotannon menetyksinä (Rautala 1996.) Utaretulehdusta voidaan ehkäistä navetan hyvällä ilmastolla, kuivikkeiden riittävyydellä ja lypsinten kunnolla. Käsihygienialla ja lypsyjärjestyksellä estetään taudin leviäminen (Alenius ja Reinvaldt 1989; Saloniemi 1986.) Stafylokokit ovat yleisin utaretulehdusta aiheuttava bakteerisuku (Pitkälä ym. 2004; Nevala ym.
2004). Stafylokokit pystyvät kiinnittymään utarekudokseen, etenkin jos se on vaurioitunut, ja kasvamaan siinä sekä suojautumaan antimikrobisilta tekijöiltä. (Pyörälä ja Tiihonen 2005) Stafylokokit pystyvät myös lisääntymään fagosyyttien sisällä (Bayles ja Bohach 2001.) Stafylokokit invasoituvat utaresoluihin f -aktiinimikrofilamenttien avulla (Almeida ym 1996;
Almeida ja Oliver 2001). Koagulaasi-negatiiviset stafylokokit (KNS) ovat lehmän normaaleja ihobakteereja, joiden aiheuttamia utaretulehduksia tavataan yleisimmin sisäruokintakaudella (Simojoki ym. 2005; Taponen ja Pyörälä 2006, julkaisematon.) Yleisimmät KNS-kannat ovat Staphylococcus simulans, S. chromogenesja S. epidermidis(Aarestrup ym. 1999).
Rauta on useimmille bakteereille kasvun edellytys (Levay 1995.) Virulenttiset bakteerit, kuten Staphylococcus aureus, tuotavat kasvaessaan vähä-rautaisissa olosuhteissa raudan kelaattoria, joka sitoo rautaa solun ulkopuolisesta ympäristöstä ja siirtää raudan bakteerin solukalvoreseptorien avulla solun sisälle (Neilands 1984). Laktoferriini on nisäkkäillä rautaa sitova glykoproteiini. Maidon laktoferriinipitoisuus nousee ummessa ollessa ja utaretulehduksessa (Pierce ym. 1991; Varnam ja Sutherland 2001). Maidon laktoferriinipitoisuus kasvaa sitä korkeammaksi mitä infektiivisemmästä bakteerista on kyse. S. aureus - utaretulehduksissa laktoferriinipitoisuus on huomattavasti korkeampi kuin KNS-tulehduksissa (Kai ym. 2002b; Hagiwara ym. 2003.) Molemmilta stafylokokkityypeiltä on löydetty laktoferriinireseptorit, joihin sitoutuessaan laktoferriini voimistaa komplementtistä puolustusjärjestelmää (Naidu ym. 1990 ja 1991).
Tässä työssä mallitimme utarekudosta Bovine Mammary Epithelial (BME) soluilla ja testasimme S. aureus ja KNS-kantojen adhesoitumista, invasoitumista ja monistumista solun sisällä ja boviinilaktoferriinin vaikutusta näihin vaiheisiin.
KIRJALLISUUSOSIO
1 UTARETULEHDUS
1.1 Utaretulehdukselle altistavat tekijät
Utaretulehdukselle altistavia tekijöitä ovat navetan korkea ilmankosteus ja lämpötila tai vastaavasti vetoisuus ja kylmyys. Tällöin utaretulehdusta aiheuttavat bakteerit pystyvät elämään lehmän lähiympäristössä pintakosteudella. Kosteissa utareissa veto vähentää verenkiertoa, jolloin utareen puolustuskyky heikkenee. Vedinvaurioita, joista bakteerit pääsevät tunkeutumaan utareeseen, voi syntyä, jos kuivikkeita on vähän ja parret ovat liukkaita ja likaisia.
Utaretulehdusbakteerit leviävät helposti sairaista eläimistä terveisiin hoitajan käsien, lypsyliinojen, lypsinten ja hyönteisten välityksellä. Huono utare- ja käsihygienia yhdessä hoitamattomien nännien kanssa lisäävät utaretulehdusriskiä (Alenius ja Reinvaldt 1989;
Saloniemi 1986.) Utaretulehdukseen ei aina liity bakteeri-infektioita, vaan utaretulehdus voi aiheutua muista ulkoisista ärsykkeistä, jotka lopulta herkistävät infektiolle. Tällaisia tekijöitä ovat esimerkiksi rehun nopeat vaihdokset ja sen huono laatu (Sandholm 1986b; Alenius ja Reinvaldt 1989.)
Lypsytapahtumalla on merkitystä tulehdusten synnyssä ja leviämisessä vedinkanavaan ja - kammioon. Tulehdukselle altistavia tekijöitä ovat puutteellinen utareen esikäsittely ennen lypsinten kiinnittämistä, liian pitkä lypsyaika ja kovakourainen loppulypsy. Utarekudokseen saattaa syntyä vaurioita, jos lypsimessä on vääränlainen tykytys, yhdyskappale tai nännikupin rakenne. Lypsimessä saattaa olla myös virheellinen alipaine, joka kuljettaa bakteereja neljänneksestä toiseen ja utareen sisälle. Lisäksi lypsin voi siirtää utaretulehdusbakteereja lehmästä toiseen (Alenius ja Reinvaldt 1989; Saloniemi 1986.)
Hiehojen utaretulehdusta havaitaan merkittävästi useammin korkeatuottoisilla karjoilla kuin vähemmän maitoa tuottavilla. Hiehojen utaretulehduksessa hoitotulokset ovat parempia kuin vanhempien lehmien (Myllys 1995.) Tämä voisi selittyä nuorien lehmien vedinkanavan hyvällä
kunnolla ja niiden maidon korkeammalla laktoferriinipitoisuudella (Rautala 1996; Hagiwara ym.
2003).
1.2 Utaretulehduksen vaikutus maidon laatuun
Utaretulehduksesta tulee maatilalle taloudellista tappiota hoito- ja lääkekuluista, mutta suurimmat tappiot aiheutuvat kuitenkin tuotannon menetyksistä. Lisäksi hoidoista ja maidon erilleen lypsämisestä aiheutuu ylimääräistä työtä; utaretulehdusta sairastavan lehmän maitoa ei saa lypsää terveiden lehmien tuottaman maidon joukkoon. Tulehduksessa vaurioitunut utarekudos ei myöskään pysty täyteen tuotantoon (Rautala 1996.)
Terveen maidon solut ovat makrofageja, ja niiden normaalipitoisuus on n. 100 000 solua/ml. Kun maito on peräisin tulehtuneesta utareista, sen solupitoisuus on kasvanut verestä tulevilla valkosoluilla, neutrofiilisillä granulosyyteillä (Alenius ja Reinvaldt 1989; Sandholm 1986a.) Tulehduksessa veren märkäsoluja ja valkuaisaineita siirtyy maitoon, koska veri-maitoeste on laimentunut. Maidon natrium- ja kloridipitoisuudet nousevat ja emäksisyys kasvaa. Lisäksi solun sisäisiä entsyymejä vuotaa maitoon, ja maitoa tuottavien solujen toiminta heikkenee (Sandholm 1986b.)
Utaretulehdusmaito, vaikka se sisältääkin runsaasti antibakteerisia tekijöitä, on erittäin hyvä kasvualusta bakteereille (Mattila 1986). Utaretulehduksessa maidon eri ravinneainepitoisuudet ovat muuttuneet, mikä vaikuttaa maitotuotteiden koostumukseen ja määrään. Antibioottijäämät pilaavat mikrobifermentaatioon perustuvat prosessit, kuten juuston ja hapanmaitotuotteiden valmistuksen. Entsyymiaktiivisuuden lisääntyminen utaretulehdusmaidossa hajottaa ainesosia maidossa ja maitotuotteissa, jolloin säilytysominaisuudet heikkenevät. Tuotteisiin voi tulla myös haju- ja makuvirheitä (Sandholm ja Kaartinen 1990.)
1.3 Utaretulehdusta aiheuttavat bakteerit
Aiheuttajabakteerit voidaan jakaa eläimistä toisiin tarttuviin ja ympäristöstä tuleviin. Edelliseen ryhmään kuuluvat Streptococcus agalactiae ja Str. dysgalactiae sekä stafylokokit. Näiden bakteerien aiheuttamia tulehduksia tavataan piilevinä ympäri vuoden. Jälkimmäiseen ryhmään puolestaan kuuluvat Escherichia coli, Str. uberis sekä Actinomyces pyogenes. Nämä bakteerit ovat kausiluonteisia. Kaksi ensimmäistä aiheuttavat tulehduksia lähinnä talvella ja kolmas lähinnä kesällä. (Raekallio 1986.) Ympäristöstä tulevista bakteereista A. pyogenes esiintyy yleensä yhdessä toisen bakteerin kanssa ja aiheuttaa tulehduksia lähinnä hiehoille ja ummessa oleville lehmille (Waage ym. 1999).
Suomessa utaretulehdusta aiheuttavien bakteerien laji on muuttunut aikojen kuluessa. Str.
agalactiae oli tärkein patogeeni 1940- ja 1950-luvulla. Eniten tulehduksia aiheuttaneeksi bakteeriksi nousi 1960-luvullaS. aureus, mutta 1980-luvulla sen aiheuttamat tulehdukset laskivat ja koagulaasi-negatiivisten stafylokokkien ja ympäristöstä peräisin olevien streptokokkien aiheuttamat tulehdukset lisääntyivät (Myllys 1995.) Utaretulehduksista n. 5 % on kliinisiä.
Kliinisissä utaretulehduksissa S. aureus on nykyisin yleisin bakteerilaji. Se aiheuttaa noin joka neljännen tulehduksen (Fox ym. 2001; Nevala ym. 2004.) Vuonna 2001 tehdyssä utaretulehduskartoituksessa yleisimmin utaretulehdusta, lähes puolessa tapauksista, aiheuttivat koagulaasi-negatiiviset stafylokokit. S. aureus –bakteerin aiheuttamat tulehdukset olivat laskeneet, mutta silti niitä havaittiin 10 % infektoituneissa utareissa ja laji oli kolmanneksi yleisin utaretulehduksen aiheuttaja Corynebacterium bovis -bakteerin jälkeen (Pitkälä ym. 2004.) C.
bovis -bakteeri on luokiteltu heikoksi patogeeniksi, joka ei juurikaan nosta utaretulehduksessa maidon laktoferriinipitoisuutta normaalista tasosta (Hagiwara ym. 2003).
1.31 Staphylococcus aureus utaretulehduksessa
S. aureus -bakteerilla on todettu pintaproteiineja, jotka kykenevät sitomaan fibronektiiniä, fibrinogeeniä ja kollageenia. Adheesiokyky on tehokkain S. aureus -bakteerilla, muilla stafylokokeilla se on vaihtelevampi. S. aureus pystyy tuottamaan superantigeeneja sekä hemo- ja
utarekudosta vahingoittavia toksiineja (Fox ym. 2001; Pyörälä ja Tiihonen 2005.) S. aureus - bakteerin virulenssitekijöitä ovat mm. proteiini A, adhesiinit, pseudokapseli ja , - sekä - toksiinit. Myös koagulaasin tuotolla voi olla merkitystä virulenssiin (Fox ym. 2001.) Stafylokokit pystyvät sitomaan pinnalleen lehmän immunolobiineja, kaseiinia, fibronektiiniä tai rasvapallomembraania, jolloin ne saavat luonnollisen suojamuurin itselleen ja puolustusmekanismit niitä vastaan ovat heikompia. Virulenssitekijöistä potentiaalisesti tuhoisin on alfa-toksiini, joka aiheuttaa usein kroonisen ja fataalin tulehduksen (Pyörälä ja Tiihonen 2005.)
F-aktiinimikrofilamentit, jotka ovat pitkiksi toistensa ympäri kiertyneiksi ketjuiksi polymerisoituneita proteiinisäikeitä, ovat tärkeä osa solun tukirankaa ja osallistuvat solun supistumiseen. Näiden mikrofilamentien avulla S. aureus -bakteeri invasoituu utaresoluihin.
Mikrotubulukset, jotka ovat solulimassa esiintyviä putkimaisia rakenteita, joiden avulla solu säilyttää muotonsa ja kuljettaa vesikkeleitä ja proteiinipartikkeleita, eivät osallistu invaasioon.
S. aureus-bakteeri esiintyy utarekudoksessa vakuoleissa, kussakin vakuolissa oli 1 – 4 bakteeria (Tirri ym. 2001; Almeida ym. 1996.)
S. aureus -bakteeri kolonisoituu vedinkanavan suuosaan, jossa se voi säilyä useita viikkoja tunkeutumatta syvemmälle utarekudokseen aiheuttamaan tulehdusta. Tunkeuduttuaan utarekudokseen bakteeri on turvassa immuunipuolustukselta (Niskanen 1986; Fox ym. 2001.)
2 KOAGULAASINEGATIIVISET STAFYLOKOKIT UTARETULEHDUKSESSA
2.1 Koagulaasi-negatiivisten stafylokokkien luonne ja esiintyvyys
Koagulaasi-negatiivinen stafylokokki (KNS) on lehmän normaali ihobakteeri, jota esiintyy myös limakalvoilla ja elinympäristössä. Näiden bakteerien tartuntalähteinä toimivat piilevää utaretulehdusta sairastavat lehmät, jotka erittävät bakteeria, sekä haavat ja ruhjeet etenkin vetimissä, kintereissä ja nivusissa (Simojoki ym. 2005; Heiskanen ym. 2002.) KNS-bakteerien aiheuttamat utaretulehdukset ovat yleisimpiä poikimattomilla hiehoilla ja ensimmäisessä maidontuotannossa. Niitä esiintyy jopa ennen siemennystä, jolloin saatu tulehdus lisää lehmän riskiä saada uusi utaretulehdus maidontuotantovaiheessa. Ensimmäistä kertaa poikivat lehmät saavat usein KNS-infektion ennen maidontuotantoa, kun taas useamman kerran poikineet vasta myöhemmässä maidontuotannon vaiheessa (Aarestrup ja Jensen 1997; Taponen ym. 2007.)
KNS-bakteerit voivat esiintyä satunnaisesti, mutta myös niiden aiheuttamia epidemioita on tavattu. Useissa maissa KNS-bakteerit aiheuttavat vain pienen osan utaretulehduksista, ja niitä pidetään vähemmän tärkeänä patogeeninä. Yleisimmin KNS-bakteerien aiheuttamaa utaretulehdusta tavataan sisäruokintakaudella eli talvella sekä keväällä ja vähiten myöhäissyksyllä sekä alkutalvella (Taponen ja Pyörälä 2006, julkaisematon; Waage ym. 1999).
KNS-bakteerien spontaania eliminaatiota pidetään korkeana, mutta näin ei aina ole asianlaita (Taponen ym. 2006).
KNS-bakteerien aiheuttamat infektiot ovat usein piileviä tai kliinisiä, mutta oireeltaan lieviä.
Kahden yleisimmän, S. simulans ja S. chromogenes -bakteerien aiheuttamissa kliinisten utaretulehdusoireiden voimakkuudessa ei havaittu eroa (Taponen ym. 2006.) KNS-infektiossa on osoitettu maidon rautapitoisuuden nousevan, mikä johtunee vaurioituneen maitorauhaskudoksen epiteelisolujen kuolemisesta, mistä seuraa ferritiinin vapautuminen maitoon (Diarra ym. 2002).
KNS-bakteerien aiheuttamissa utaretulehduksissa solupitoisuus jää matalaksi. Solupitoisuus nousee kaksin- tai kolminkertaiseksi verrattuna infektoitumattomiin utareiden solupitoisuuksiin ja on noin puolet normaalin utaretulehduksen solumäärästä. Persistoivien KNS-bakteerien aiheuttamassa tulehduksessa maidon solumäärä oli kolminkertainen verrattuna ei-persistoivien
kantojen aiheuttamaan tulehdukseen (Zhang ja Maddox 2000; Pitkälä ym. 2004; Taponen ym.
2007.) Hoitamattomana KNS-infektio saattaa persistoida utareessa, nännikanavassa ja iholla koko lypsykauden (De Vliegher ym. 2003). Utareen KNS-infektio aiheuttaa lypsykauden alussa vakavammat oireet ja suuremmat maitomuutokset, kuten solupitoisuuden nousun, kuin kauden lopussa. KNS-bakteerit vaurioittavat maitorauhaskudosta ja lisäävät sidekudoksen muodostumista sekä leukosyyttien infiltraatiota utarekudokseen. Vauriot eivät kuitenkaan ole pysyviä, mistä merkkinä on maidon solupitoisuuksien palaaminen normaalille tasolle tulehduksen jälkeen (Myllys 1995; Oliver ym. 2003.)
Osana normaaliflooraa KNS-bakteerit voivat toimia luonnollisena suojana myöhempää KNS- infektioita vastaan (Myllys 1995). Utareen KNS-infektio saattaa suojata utaretta muilta vakavammilta taudinaiheuttajilta nostamalla maidon solupitoisuutta, aiheuttamalla bakteerien keskinäistä kilpailua elintilasta tai erittämällä muiden bakteerien kasvua estäviä aineita (De Vliegher ym. 2003; Taponen ja Pyörälä 2006 julkaisematon). Aarestrup ja Jensen (1997) sekä Pitkälä ym. (2004) eivät havainneet tutkimuksissaan tätä suojaavaa vaikutusta. Pitkälä ym. (2004) havaitsi KNS-bakteerien olevan yleisin ryhmä, joka esiintyi muiden bakteerien kanssa. Vuonna 2001 tehdyssä tutkimuksessa runsaalla 70 % maitonäytteistä, joissa kasvoi kahta bakteeria, toinen oli KNS. Yleisimmin yhdessä KNS-bakteerin kanssa löydettiinCorynebacterium bovis, S. aureus tai enterokokki.
2.2 Yleisimmät KNS-kannat
Maailmanlaajuisesti yleisimmät utaretulehduksista eristetyt KNS-kannat ovat S. simulans, S.
chromogenes ja S. epidermidis (Aarestrup ym. 1999.) Toistaiseksi ei ole voitu varmuudella osoittaa eri kantojen välisiä virulenssieroja, joita todennäköisesti on olemassa. Mahdollisesti S.
chromogenes jaS. hyicus ovat virulentimpia kuin muut (Pyörälä ja Tiihonen 2005.)
S. simulansoli vuonna 2001 yleisin Suomessa KNS-utaretulehduksesta eristetty laji. Se aiheuttaa useammin kuin muut KNS-bakteerit kliinisiä infektioita ja muita suuremman tulehdusvasteen (Pitkälä ym. 2004; Myllys 1995.) S. simulans -bakteeria todetaan myös vanhemmilla lehmillä
maidontuoton myöhäisemmässä vaiheessa (Taponen ym. 2006). S. simulans -bakteeria havaittiin samassa neljänneksessä muutamia viikkoja, mikä on osoitus tämän bakteerin kyvystä aiheuttaa persistoivia infektioita (Aarestrup ja Jensen 1997). Aarestrup ym. (1999) huomasivat tyypittäessään KNS-bakteereja kahden S. simulans -kannan aiheuttavan yli puolet KNS:en aiheuttamista tulehduksista. PääasiassaS. simulans -kannat siirtyivät lypsyn yhteydessä lehmästä toiseen, mutta muitakin tartuntareittejä oli.
S. chromogenes aiheuttaa selvästi enemmistön ennen lehmän tiinehtymistä havaituista tulehduksista. Useimmiten ennen maidontuotannon alkua havaittu bakteeri häviää nopeasti eikä aiheuta myöhemmin tulehdusta. Kuitenkin lähellä poikimista utareen iholla havaittu bakteerikolonisaatio lisää tulehdusriskiä. (Aarestrup ja Jensen 1997; De Vliegher ym. 2003.) Useimmilla S. chromogenes -kannoilla ja muutamilla muilla KNS-kannoilla havaittiin sytotoksista aktiivisuutta, joka ei kuitenkaan yleensä ollut soluille lyyttistä tai pysyvää toisin kuin S. aureus -bakteereilla. S. chromogenes -bakteeri tuotti paljon proteaasia, mikä voi osoittaa bakteerin olevan patogeeninen (Zhang ja Maddox 2000.)
S. epidermidis aiheuttaa nopeasti ohi menevän infektion. Se on ihmisen normaalibakteereja ja aika harvinainen lehmän limakalvolla tai iholla, joten infektioiden lähteenä voi olla ihminen.
Samaa S. epidermidis -kantaa on löydetty lypsäjän käsistä ja saman karjan utaretulehduksesta (Aarestrup ja Jensen 1997; Thorberg ym. 2006.) S. epidermidis-bakteerit ovat yleisiä kliinisissä utaretulehduksissa, mutta niitä ei havaittu ennen poikimista otetuista näytteistä (Myllys 1995;
Taponen ym. 2007).
S. xylosus -bakteeri on yleisin poikimattomilta hiehoilta eristetty KNS ja se aiheuttaa lähinnä piileviä utaretulehduksia, toisin kuin oireiltaan usein kliinistä tulehdusta aiheuttava S. hyicus - bakteeri. S. haemolyticus -bakteeria ei havaittu ennen poikimista otetuista näytteistä (Myllys 1995; Taponen ym. 2007.)
3 KNS -INFEKTION PATOGENEESI
3.1 Virulenssitekijät
Bakteerien virulenssitekijöiksi luokitellaan toksiinit (ekso- ja endotoksiinit sekä lipopolysakkaridi), adhesiinit (pilus ja ei-pilus adhesiinit), invasiinit (ryhmä adhesiinimolekyylejä, jotka signaloivat isäntäsolun ottamaan bakteerin sisälle) ja isäntäsolun sisällä eritettävät entsyymit (mm. happiradikaaleja neutraloivat ja proteolyyttisiä entsyymejä pilkkovat yhdisteet, jotka estävät isäntäsolun puolustusta toimimasta kunnolla) (Finlay ja Falkow 1997).
KNS-bakteerien virulenssitekijöiksi on esitetty hydrofobisuutta, kapselia ja liman muodostusta sekä KNS-bakteerien kykyä sitoutua fibronektiiniin ja kollageeniin (Almeida ja Oliver 2001).
Eräät KNS-kannat tuottavat myös useita toksiineja ja entsyymejä, kuten hemolysiiniä, lipaasia ja proteaasia (Zhang ja Maddox 2000).
3.2 Adhesoitumis- ja invasoitumismekanismit ja niiden esto
Adheesio ja invaasio ovat reseptorivälitteisiä ja ne tarvitsevat isäntäsolun viestin välitystä ja solun tukirangan uudelleen järjestymistä onnistuakseen (Finlay ja Falkow 1997). Miedzobrodzki ym. (1988) havaitsi, että kroonisista ja akuuteista utaretulehduksista eristetyt KNS-bakteerit sitoutuvat pääasiassa kollageeniin, kun taas S. aureus -kannat sitoutuvat pääasiassa fibronektiiniin. KNS-bakteerien sitoutuminen kollageeniin oli voimakasta etenkinS. epidermidis, S. xylosus, S. hyicus ja S. simulans -kannoilla. Tutkimuksen 70 KNS-kannasta vain 5 sitoutui fibronektiiniin vähintään 10 %:sesti. Watts ym. (1990) totesivat kollageeniin sitoutuvista kannoistaS. hyicus-bakteerin nostavan maidon solupitoisuutta.S. epidermidis ja S. chromogenes -kannat eivät nostaneet solupitoisuutta.
Altistettaessa utaresoluja S. epidermidis, S. xylosus ja S. hyicus -bakteereilla epiteelisolun solukalvoon ilmestyi pseudopodimaisia jalkoja ja kuppimaisia rakenteita. Pseudopodimainen
rakenne levittäytyi bakteerin ympärille, jolloin syntyi vakuoli. Bakteerien invaasioon tarvittiin F- aktiinimikrofilamentteja. Utaresolussa bakteeria havaittiin kalvoon sitoutuneissa vakuoleissa.
Useimmiten yhdessä vakuolissa oli yksi bakteerisolu. S. hyicus -bakteerin todettiin olevan vapaana solulimassa. (Almeida ja Oliver 2001.)
Samassa tutkimuksessa utaresoluja käsiteltiin signalointia inhiboivilla aineilla ja seurattiin vaikutusta KNS-bakteerien invaasioon (Taulukko 1). Kaikki käytetyt KNS-kannat adhesoituivat ja invasoituivat hyvin, kun solun signalointia ei häiritty. Eukaryoottisoluissa solunulkoisten viestien välitys tapahtuu useimmiten proteiinikinaasien avulla. Jos KNS-bakteerit tuottavat proteiinikinaaseista riippuvaisia sisäänottosignaaleja, proteiinikinaasin aktiivisuuden alentaminen staurosporiinilla pitäisi vähentää bakteerien invaasiota. Koska staurosporiini voi estää myös invaasioon osallistuvan proteiinikinaasi-C:n toiminnan, soluja käsiteltiin tätä kinaasia aktivoivalla forboli-12-myristaatti-13-asetaatilla (TPA). Tämän aineen kanssa soluja inkuboitiin 15 min ja 24 h. (Almeida ja Oliver 2001.)
TAULUKKO 1. Eräiden solun toimintaa inhiboivien aineiden vaikutus KNS-bakteerien invaasioon utare-epiteelisoluihin (Almeida ja Oliver 2001).
Aine Vaikutus soluihin Vaikutus KNS-bakteerien invaasion Sytokalasiini B ja D F-
aktiinimikrofilamenttien depolymerisoituminen
Invaasion aleneminen
Staurosporiini Proteiinikinaasin toiminnan esto
Invaasion aleneminen
TPA ProteiinikinaasiC:n
aktivointi
Invaasion aleneminen (1 vrk inkubointi). Invaasion kasvu (15 min) Genisteiini Tyrosiinikinaasin
toiminnan esto
Huomattava invaasion aleneminen Tyrphostin AG 1478 Tyrosiinikinaasin
toiminnan esto
Huomattava invaasion aleneminen Kolkisiini Tubuliini-yksiköiden
polymerisoitumisen esto
Ei vaikutusta invaasioon
KNS-bakteerien invasoituminen utaresoluun vaatii isäntäsolun solun tukirangan polymerisoitumista ja proteiinikinaasin fosforointia. S. xylosus -bakteeri käytti invasoitumiseen etupäässä epidermaalisen kasvutekijän tyrosiinikinaasi -aktiivisuutta. S. hyicus jaS. epidermidis -
bakteerit käyttivät muita tyrosiinikinaasireittejä. KNS-bakteerit pääsivät utaresolun sisään, vaikka kaikki proteiinikinaasia inhiboivia aineita olisi käytetty eli vaihtoehtoisia reittejä on olemassa (Almeida ja Oliver 2001.)
4 SOLUVILJELYN KÄYTTÖ PATOGENEESIN SELVITTÄMISEKSI
Koagulaasi-negatiivisia stafylokokkeja ei ole juurikaan testattu utare-epiteelisolu-mallissa, kun taas solulinjaa on käytetty muita utaretulehdusbakteerikantoja tutkittaessa. Altistuskokeissa on yleensä käytetty MAC-T-solulinjaa, jonka on osoitettu vastaavan tässä tutkimuksessa käytettyä BME-solulinjaa (Cifrian ym. 1994).
4.1 Koagulaasi-negatiiviset stafylokokit
Almeidan ja Oliverin (2001) tutkimuksessa S. xylosus adhesoitui ja invasoitui paremmin kuin S. hyicus ja S. epidermidis -kannat. KNS-kantojen patogeenisyyttä on tutkinut myös Anaya- López ym. (2006) tutkimuksissaan. Tutkimuksessa käytettiin primäärisiä epiteelisoluja, joilla testattiin piilevistä utaretulehduksista eristettyjen koagulaasi-negatiivisten stafylokokkien ja S.
aureus-bakteerin invaasiota soluihin. He huomasivat vainS. aureus -kantojen jaS. epidermidis- kannan invasoituvan. Tutkimuksessa käytetyt S. haemolyticus, S. equorum, S. xylosus ja Brevibacterium stationis-bakteerit eivät invasoituneet.
4.2Escherichia coli
MAC-T-solulinjan soluilla tutkittaessa persistoivat ja transientitE. coli -kannat adhesoituivat yhtä hyvin, mutta persistoivat kannat invasoituivat, lisääntyivät ja selvisivät solusisäisesti paremmin kuin transientit kannat. Sytokalasiini D ja kolkisiini alensivat invasoitumista sekä persitoivilla (75
%) että transienteilla (90%) E. coli-kannoilla. Isäntäsolun solurangan uudelleen järjestäytyminen ja fosforylaatiovälitteinen viestikaskadi helpottivat E. coli -kantojen invasoitumista soluihin.
Kaikkien persistoivien kantojen solunsisäinen bakteerimäärä lähes kaksinkertaistui 2 vrk aikana, kun taas transienttien kantojen bakteerimäärät laskivat (Dogan ym. 2006.)
Toisessa tutkimuksessa selvitettiin kliinisistä utaretulehduksista eristetyillä E. coli -kannoilla niiden adhesoitumista ja invasoitumista MAC-T-soluviljelmässä. Huomattiin, että molemmat
vaiheet olivat annos- ja aikariippuvaisia. E. coli -kannat, jotka oli eristetty kroonisesta utaretulehduksesta, invasoituivat jopa kolme kertaa nopeammin kuin transientit kannat. KaikkiE.
coli -kannat adhesoituivat osaan soluista, kun taas osa solusta jäi kokonaan ilman bakteerikontaktia. Solun sisäisissä vakuoleissa havaittiin invasoituneita E. coli -bakteereja.
Tumakalvon kanssa bakteerit eivät olleet kontaktissa. MAC-T-solujen pinnalle muodostui pseudopodimaisia rakenteita ennen kuin bakteeri ympäröintiin kalvolla. Testatuilla E. coli- kannoilla adheesio pysyi aina korkeampana kuin vastaavan kannan invasoituminen, toisin kuin samaan aikaan tutkituilla salmonelloilla. Niillä kannan adheesio oli invasoituneiden määrää pienempi. Kannan patogeenisuutta rajoittavina tekijöinä tutkimuksessa pidettiin E. coli - bakteerin invasoitumista ja salmonellojen adhesoitumista (Döpfer ym. 2000.)
4.3Staphylococcus aureus
Tamilselvamin ym. (2006) tutkimuksissa suurimmat utaresolun sisäiset bakteeripitoisuudet S.
aureus -bakteerille saatiin kahden päivän päästä invasoitumisesta. Tämä voisi johtua joko siitä, että bakteeri kykeni lisääntymään solun sisällä tai siitä, että utaresolut olivat kuolleet, bakteerit vapautuneet ja invasoituneet uudelleen. Ensimmäistä vaihtoehtoa pidettiin todennäköisempänä, koska solut olivat antibioottiliuoksen ympäröimänä. Lisäksi Almeidan ym. (1996) tutkimuksissa havaittiin S. aureus -bakteerien pystyvän invasoitumaan utaresoluviljelmissä soluihin ja kasvamaan solun sisällä niin, että invaasiomaksimi saavutettiin 4 tunnin kuluttua altistuksen aloituksesta. Tamilselvamin ym. (2006) tutkimuksessa huomattiin S. aureus -bakteerin aiheuttavan solutuhoa ja vaurioita, jonka seurauksena solunsisäiset bakteerimäärät laskivat, kun altistusaikaa jatkettiin yli kahden vuorokauden.
4.4Streptococcus uberisja Streptococcus dysgalactiae
Tamilselvam ym. (2006) tutki kahden Str. uberis -kannan invasoitumista MAC-T-soluihin.
Osoittautui, että toinen kannoista invasoitui aluksi paremmin, mutta toinen säilytti elinkykynsä pidempään. Str. uberispystyi selviämään solunsisäisesti 120 tuntia ilman isäntäsolun elinkyvyn alenemista. Koska solu ei kuole, seurauksena on persistoiva ja krooninen infektio, jossa bakteeri jakautuu solun sisällä harvoin.
Almeida ja Oliver (1995) tutkivat Str. dysgalactiaen invasoitumista MAC-T-soluihin kahdella utaretulehdusmaidosta eristetyllä kannalla. Molemmat kannat invasoituivat jo puolen tunnin päästä altistuksen aloituksesta. Tällöin havaittiin piluksia muistuttavien rakenteiden muodostumista ja sytoplasmisen solumembraanin alueella elektronitiheä kasautuma, missä bakteeri vuorovaikutti epiteelisolumembraanin kanssa. Aktiinifilamentit osallistuivat bakteerien invasoitumiseen. Str. dysgalactiae -bakteerin invasoitumisessa havaittiin pseudopodimaisia pidennyksiä, jonka jälkeen solukalvo ympäröi ja invasoi bakteerit. Bakteerin kalvolla uskotaan olevan ligandeja, jotka vuorovaikuttavat MAC-T-solujen pinnalla olevien reseptorien kanssa, josta seuraa bakteerin invasoituminen. Invasoituneet bakteerit olivat membraaniin sitoutuneiden vakuoleiden sisällä. Yleensä vakuoli sisälsi yhden bakteerisolun ja harvemmin diplokokki- rakenteen, joka syntynee bakteerin ajoittaisesta jakautumisesta. Str. dysgalactiae pystyy persistoimaan MAC-T-soluissa, koska se ei jakaudu usein ja herätä näin ollen solun puolustusmekanismeja. Solunsisäiset bakteeripitoisuudet nousivat altistusajan edetessä ja eniten solunsisäisiä bakteereja havaittiin, kun altistuksen aloituksesta oli kulunut neljä tuntia. Bakteerit eivät vaikuttaneet MAC-T-solujen elinkykyyn. Solunsisäistä lisääntymistä ei havaittu, joten invasoituneiden bakteerien määrän nousun arveltiin johtuvan bakteerien lisääntymisestä supernatantissa.
5 LAKTOFERRIINI
5.1 Yleistä
Boviinilaktoferriini on monomeerinen, 708-aminohappoa pitkä glykoproteiini, jonka alussa on yksi 19-aminohapon pituinen signaalipeptidi (Baker ym. 1994; Pierce ym. 1991).
Boviinilaktoferriini sisältää kaksi globulaarista aluetta, N- ja C- lohkot, joista molemmat ovat vielä jakautuneet kahteen alueeseen (N1, N2 ja C1, C2). (kuva 1) Molemmat lohkot sisältävät yhden tiukasti, mutta reversiibelisti, rautaa sitovan alueen, joka on näiden kahden alueen välissä. Nämä alueet ovat rakenteellisesti keskenään hyvin samanlaisia. Raudan sitoutuminen laktoferriiniin vaatii kahden bikarbonaatti-anionin samanaikaisen sitoutumisen, joka on erityinen piirre transferriinien perheessä (Baker ym. 1994; Moore ym. 1997.) Raudan ja bikarbonaatti-anionien sitoutumiskohdat ovat syvällä lohkon sisällä. Bikarbonaatin sitoutuminen neutraloi positiivisia varauksia, jotka muutoin voisivat torjua kationeja ja toisaalta se pohjustaa rauta-vapaan laktoferriinin metallin sitoutumiskohdan lisäämällä siihen kaksi potentiaalista ligandia (Levay 1995.) Laktoferriiniä esiintyy aina maidossa, mutta sen pitoisuus kohoaa, jos lehmä on ummessa tai se sairastaa utaretulehdusta (Varnam ja Sutherland 2001). Laktoferriiniä esiintyy myös muissa eritteissä, kuten virtsassa, syljessä ja suolinesteissä (Mantere-Alhonen 1994). Tulehduksissa vapautuvissa neutrofiilisissä granulosyyteissä laktoferriini on pääasiallisena komponenttina.
Nämä solut tulevat tulehduspaikalle ja osallistuvat itsepuolustuksen säätelyyn (Spik ym. 1994.) Lehmän maidossa laktoferriinipitoisuus on matala (Sánchez ym. 1994). Pitoisuus vaihtelee terveillä lypsävillä lehmillä 0,03 - 1,0 mg/ml ollen keskimäärin 0,17 mg/ml. Ternimaidossa laktoferrriiniä on 2 – 5 mg/ml ja ummessa olleilla naudoilla laktoferriinin on osoitettu kohoavan
KUVA 1:
Boviinilaktoferriinin kaavakuva. Kuvassa näkyvät N- ja C- lohkot. Rauta-atomit on esitetty kuvassa ympyröinä ja karbonaatti-anionit neliöinä (Harridas ym.
1994.)
jopa pitoisuuteen 30 mg/ml (Hagiwara ym. 2003; Naidu ym. 1990.) Akuutissa utaretulehduksessa on havaittu kaksinkertainen laktoferriinipitoisuus krooniseen utaretulehdukseen verrattuna (Komine ym. 2005). Laktoferriinipitoisuus kasvaa mitä infektiivisempi bakteeri on.
Keskimääräinen laktoferriinipitoisuus maidossa, kun utareet olivat infektoituneet S. aureus tai Streptococcus spp. -bakteereilla, oli huomattavasti korkeampi kuin KNS-utaretulehdusmaidoissa (Kai ym. 2002b; Hagiwara ym. 2003.)
5.2 Vaikutusmekanismit
Laktoferriini on rautaa sitova proteiini. Rauta on useimmille bakteereille kasvun ja lisääntymisen edellytys. Laktoferriinin on todettu estävän faagien ja virusten jakautumista. Laktoferriinin on todettu rautaa sitomalla välillisesti osallistuvan myös proteiinisynteesiin, lymfosyyttien tuotantoon, vasta-aineiden erittymiseen ja interleukiini 1:n ja 2:n sekä tuumorinekroositekijä- toimintaan. Laktoferriini tehostaa synnynnäistä vastustuskykyä, etenkin C3 -komponentin tuottoa (Levay ym. 1995; Kimber ym. 2002; Kai ym. 2002a.)
Laktoferriini vaikuttaa ternimaidossa yhdessä vasta-aineiden ja lysotsyymin kanssa lisäten niiden penetroitumista bakteerisoluun. Laktoferriini auttaa polymorfonukleaaristen solujen adheesiota ja aggregaatiota endoteeliseen pintaan (Naidu ym. 1991; Ellison ja Giehl 1991.) Paikallisesti infusoituna boviinilaktoferriini edistää polymorfonukleaaristen solujen migraatiota lisäämällä sytokiinien tuottoa. Laktoferriini lisää myös veri-maitoesteen läpäisevyyttä, jolloin komplementtisen puolustusmekanismin komponentit pääsevät helposti tulehduspaikalle (Kai ym.
2002b.)
5.21 Vaikutus adheesioon, invaasioon ja solunsisäiseen monistumiseen
Laktoferriinin adheesiota alentavan vaikutuksen uskotaan olevan seurausta laktoferriinin kyvystä heikentää bakteerin solukalvon pinnalla ilmennettävien virulenssiproteiinien toimintaa sitoutumalla bakteerien pinnan reseptoreihin (Ochoa ym. 2006; Valenti ja Antonini 2005.)
Laktoferriinin uskotaan estävän bakteerin invaasiota sitoutumalla isäntäsolun glykosaminoglykaaneihin ja bakteerin invaasioon käyttämiin pintaproteiineihin, jotka tulevat herkiksi proteolyysille. Ihmisperäisellä laktoferriinillä itsellään ei ole proteolyyttistä aktiivisuutta.
Jos invaasioon käytettäviä rakenteita ei tuoteta solunsisäisessä lisääntymisessä, bakteerit eivät pääse enää invasoitumaan uuteen soluun ja täten laktoferriini pysäyttää infektion. (Valenti ja Antonini 2005; Gomez ym. 2003) Lisäksi on mahdollista, että laktoferriini pääsee isäntäsolun tumaan ja osallistumaan siellä geenien säätelyyn, jolloin bakteerin invaasio estyy.
Monistumisvaiheessa laktoferriinin bakteerien lisääntymistä estävä vaikutus perustuu osittain sen kykyyn ottaa bakteereilta pois vapaa rauta, jota ne välttämättä tarvitsevat lisääntymiseensä (Valenti ja Antonini 2005; Ochoa ym. 2006.)
5.22 Vaikutus KNS-kantoihin
KNS-bakteerien pinnalta on tunnistettu laktoferriinireseptorit (Naidu ym. 1991).
Boviinilaktoferriinin on havaittu sitoutuvan koagulaasi-negatiivisten stafylokokkien pinnalle ja voimistavan naudan komplementtisen systeemin aktivoitumista vaihtoehtoisen tien kautta. KNS- kantoja testattaessa 150 kannasta 93 sitoi jodi-leimattua boviinilaktoferriiniä.S. xylosus -bakteeri sitoi eniten ja S. hyicus -bakteeri vähiten. Sitoutuminen oli optimaalisinta happamassa pH:ssa ja kyllästysaika vaihteli tunnista neljään. Leimatun boviinilaktoferriinin sitoutuminen laski, jos joukossa oli ihmisperäistä laktoferriiniä (Naidu ym. 1990; Kai ym. 2002a.)
5.23 Vaikutus muihin bakteereihin
Laktoferriinin kasvunesto on kantakohtaista ja virulenteillä bakteereilla on tapoja välttää tämä vaikutus. Ne pystyvät tuottamaan kasvaessaan vähä-rautaisissa olosuhteissa molekyylipainoltaan matalaa raudan kelaattoria, joka sitoo rautaa solunulkopuolisesta ympäristöstä. Kun kelaattori- rautakompleksi on sitoutuneena reseptoreilla bakteerin ulkokalvoon, rauta pääsee solun sisälle (Neilands 1984; Kutila 2004a.) Laktoferriini rajoittaa selvästi stafylokokkien ja koliformien kasvua toisin kuin streptokokkien, joilla on vähäinen raudan tarve (Sandholm 1986a). S. aureus
–bakteeriin sitoutunut laktoferriini voi estää bakteerin kyvyn adhesoitua solun ulkopuolisiin proteiineihin, joiden avulla invaasio soluun tapahtuu. Myös enteroaggretatiivisella E. coli - bakteerilla laktoferriini irrottaa ja alentaa adheesioon tarvittavien fimbrioiden muodostumista (Diarra ym. 2002; Ochoa ym. 2006.) Laktoferriini lisää bakteerin solukalvon läpäisevyyttä antibiooteille ja vaurioittaa gram-negatiivisten bakteerien ulkokalvoa sekä estää niiden lipopolysakkaridin haitalliset vaikutukset sitoutumalla lipidi A -osaan (Ellison ym. 1988;
Appelmelk ym. 1994).
5.3 Laktoferriinin vaikutusin vitro kokeissa
Diarran ym. (2003) tutkimuksessa laktoferriinin todettiin vähentävän S. aureus -bakteerin invaasiota epiteelisoluihin, mutta fagosytoosin pelkällä laktoferriinillä ei ollut vaikutusta, paitsi jos laktoferriinin lisäksi käytettiin G-penisilliiniä. Näiden yhdisteiden yhteisvaikutus oli suurempi kuin kummankaan erikseen. Laktoferriinin on aiemmin todettu vähentävän joidenkin utaretulehdusta aiheuttavien S. aureus -kantojen lisääntymistä ja eritettävien proteiinien tuottoa, jotka vaikuttavat polymorfonukleaaristen granulosyyttien normaaliin toimintaan. S. aureus – bakteerit selviävät paremmin polymorfonukleaaristen granulosyyttien sisällä, jonne penisilliini ja muut -laktamaasi-antibiootit eivät pääse. Tämän seurauksena syntyy piilevä krooninen utaretulehdus. G-penisilliinin käyttö tuottaa suurempia stafylokokkeja, joita on vaikeampi tappaa. Laktoferriini kumosi tämän G-penisilliinin vaikutuksen ja sai polymorfonukleaaristen granylosyytteihin invasoituneet S. aureus -bakteerit alttiiksi antibiooteille ja puolustusmekanismeille (Diarra ym. 2003; Labro 2000.)
Kutilan (2004a) tutkimuksissa laktoferriinin vaikutusta testattiin kliinisistä utaretulehduksista eristetyillä kannoilla. Laktoferriiniä käytettiin 0,67, 1,67 ja 2,67 mg/ml pitoisuuksina.S. aureus ja KNS -kantojen välisissä laktoferriiniherkkyyksissä oli suurempia eroavaisuuksia kuin E. coli - kantojen. Kolme S. aureus -kantaa oli herkempiä laktoferriinille kuin kaksi muuta, kun laktoferriini pitoisuus oli 0,67 mg/ml. Neljä KNS-kantaa inhiboitui laktoferriinillä, mutta yksi oli resistentti
Lee ym. (2004) tutki bakteerien herkkyyttä laktoferriinille, jota käytettiin aina konsentraatioon 50 mg/ml asti. Pienin pitoisuus, jolla herkkyyttä testattiin oli 0,007 mg/ml, joka riitti estämään Prototheca zopfii -bakteerin kasvun. Laktoferriini esti kaikkienE. coli tai streptokokki-kantojen kasvun, kun taas lähes puolet S. aureus- ja suurin osa KNS-kannoista sekä kaikki enterokokit kykenivät lisääntymään laktoferriinin läsnäollessa. KNS-kannoistaS. haemolyticus jaS. schleiferi olivat herkkiä laktoferriinille. Laktoferriiniherkkyys oli kantaspesifistä.
5.4 Laktoferriinin vaikutus in vivo kokeissa
Lehmille aiheutettiin E. coli-utaretulehdus (Kutila ym. 2004b.) jonka oireiden vakavuus vaihteli merkittävästi. Utaretulehdusta hoidettiin joko antamalla 3 kertaa boviinilaktoferriiniä tai antibioottia. Oireissa ei havaittu eroa näiden kahden ryhmän välillä, kuten ei myöskään maidon tuotannossa, bakteerien tai somaattisten solujen määrissä. Antibioottihoidetuilla lehmillä utareen epiteelisoluista vapautuvan NAGaasi-entsyymin ja bakteerien määrät kuitenkin laskivat nopeammin kuin laktoferriinillä hoidetuilla. Lipopolysakkaridi (LPS) aiheuttaa usein utaretulehduksen kliiniset oireet. Maidon LPS-pitoisuus oli merkittävästi matalampi laktoferriinillä hoidetuilla kuin antibiootilla hoidetuilla, mikä selittynee sillä, että joko laktoferriini neutraloi LPS:a tai antibiootti tappoi nopeammin bakteereja, jolloin LPS-taso kohosi.
Kun ummessa oleville stafylokokki-utaretulehduksesta kärsiville lehmille infusoitiin boviinilaktoferriinia, parantuivat ne nopeammin kuin antibioottihoidolla olleet kontrolliryhmän lehmät. Niissä utareneljänneksissä, joihin oli infusoitu boviinilaktoferriiniä, havaittiin stafylokokkipitoisuuksien merkittävää alenemista 2, 7 ja 14 päivän kuluttua infusoinnista.
Laktoferriinikäsitellyiden utareiden maidon kokonaissolupitoisuus kohosi (Kai ym. 2002b.)
Hyvösen ym. (2006) tutkimuksessa käytettiin transgeenisiä lehmiä, jotka erittivät maidossaan humaanilaktoferriiniä. Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään, pystyykö humaani- ja boviinilaktoferriini estämään kokeellisesti aiheutettujaE. coli -utaretulehduksia.E. coli-kanta oli eristetty kliinisestä utaretulehduksesta ja se oli in vitro kokeessa herkkä laktoferriinille. Maidon korkea humaanilaktoferriinipitoisuus ei estänyt lehmiä saamasta utaretulehdusta. Bakteerin
kasvussa tai eliminaatiossa ei havaittu eroa verrattuna normaaleja lehmiä sisältävään kontrolliryhmään. Kliiniset yleisoireet, mutta ei paikalliset, olivat lievemmät ja seerumin kortisoli ja haptoglobiini-pitoisuudet matalampia mitä kontrolliryhmällä. Tämä voitaneen selittää laktoferrriinin LPS:a neutraloivalla ja immunivasteita tehostavalla vaikutuksella (Hyvönen ym.
2006.)
TUTKIMUSOSIO
Tutkimuksen tavoitteena oli kehittää soluviljelymalli utaretulehdusta aiheuttavien bakteerien virulenssin tutkimiseen ja erityisesti selvittää boviinilaktoferriinin vaikutusta in vitro KNS- bakteerien adheesio-, invaasio- ja solun sisäiseen lisääntymiskykyyn. Tutkimus koostui kolmesta osa-alueesta. Ensin menetelmän toimivuus testattiin positiivisella ja negatiivisella kannalla.
Seuraavaksi BME-soluja altistettiin KNS-kannoilla ja viimeisessä vaiheessa tutkittiin miten boviinilaktoferriini vaikuttaa tutkittujen KNS-kantojen adheesioon, invaasioon ja monistumiseen.
6 MATERIAALIT JA MENETELMÄT
6.1 Stafylokokit
Stafylokokki-kantoina käytettiin kliinisistä ja piilevistä utaretulehduksista eristettyjä S. aureus, S.
chromogenes, S. simulans, S. epidermidis, S. haemolyticus ja S. cohnii -kantoja. Kahdentoista kannan persistointia oli tutkittu aiemmin (Taponen ym. 2007.) (Taulukko 2) Kannat saatiin Helsingin yliopiston eläinlääketieteelliseltä tiedekunnalta. Positiivikontrollina käytetty S. aureus 298 (HY, eläinlääketieteellinen tiedekunta) oli jokaisella altistuskerralla mukana.
Negatiivikontrollina käytetty S. epidermidis 808 (EELA) oli eristetty juustosta. KNS-kannat oli tunnistettu käyttäen kaupallista biokemiallista API Staph ID 32-testiä ja AFLP:ta (Amplified Fragment Length Polymorphism). Yleisimmät kannat olivat S. simulans ja S. chromogenes (Taponen ym. 2006.)
TAULUKKO 2: Altistukseen käytetyt kannat niiden tunnus ja tietoja *)(Taponen ym. 2007)
Kanta Tunnus
Persistoi (+/-)
Oireet (1-3)
CMT (1-5)
S. aureus, pos. kanta 298 3 5
S. epidermidis, neg. kanta 808
S. aureus ATCC 25923
S. chromogenes 74 1 5
S. aureus 228
S. chromogenes 37 2 5
S. simulans 15 2 5
S. chromogenes 117 2 5
S. simulans 2 1,5 5
S. simulans 18 1,5 5
S. simulans 19 2 5
S. chromogenes 22 2 5
S. chromogenes 52 2 5
S. chromogenes 72 2 5
S. epidermidis 163 - 1 1
S. epidermidis 221 + 1 4
S. haemolyticus 94 - 1 3
S. chromogenes 312 + 1 4
S. simulans 198 + 1 4
S. simulans 261 + 1 4
S. chromogenes 314 - 1 1
S. chromogenes 93 + 1 2
S. chromogenes 98 - 1 1
S. haemolyticus 224 - 1 1
S. haemolyticus 252 + 1 2
S. cohnii urealyticus 351 + 1 2
*)Persistoi: + tarkoittaa, että kanta persistoi ja – ettei. Oireet: 1. ei oireita, 1,5 lieviä oireita, 2 lievästi lämpöä ja muitakin oireita, 2,5 kuumetta ja selviä oireita, 3 korkea kuume ja voimakkaat oireet. CMT: California Mastitis Testin tulos, jossa 1 on matalin ja 5 on korkein solupitoisuus
6.11 Stafylokokkien käsittely ennen altistusta
Bakteerikannat uudistettiin verimaljoille 2 vrk ennen altistusta. Seuraavana päivänä niistä otettiin yksi pesäke BHI (Brain Heart Infusion Broth, LabM) -liemeen. Bakteereja kasvatettiin tasan 18 tuntia +37 C ennen altistuksen aloitusta. Altistuspäivänä bakteeriliemet sentrifugoitiin (Jouan SA, Br4i) 10 min. 3000 rpm ja pestiin kaksi kertaa 1 x PBS (Euroclone). Pesujen välillä oli
sentrifugointi. Bakteerisaostuma liuotettiin 5 ml RPMI 1640 (Invitrogen) -kasvatusliuosta ja tätä bakteerisuspensiota pipetoitiin RPMI 1640 -liemeen niin, että suspension absorbanssiksi (A 625) tuli 0,2 – 0,3 (Genesys 10 UV, Thermo Electron Corporation).
6.2 Utare-epiteelisolut
Bovine Mammary Epithelial -solulinjaa (BME-UV1) käytettiin kuvaamaan stafylokokkien kykyä adhesoitua, invasoitua ja lisääntyä naudan utareen epiteelisoluissa. BME-solulinja oli peräisin Prof. Burvenichilta Belgiasta. (Van Oostveldt ym. 2002.)
6.21 Utare-epiteelisolujen käsittely ennen altistusta
Utare-epiteelisoluja kasvatettiin 25 cm3 soluviljelypulloissa (Sarstedt). Solujen kasvatuksessa käytetty kasvatusliemi valmistettiin Ham´s F12 (40 %) (Invitrogen), RPMI 1640 (23 %) (Invitrogen) ja NCTC 135 (20 %) (Invitrogen) -kasvatusliuoksista, joihin lisättiin inaktivoitua FBS:a (10 %) (Fetal Bovine Serume, Sigma), 10 % laktoosia (1 %) ( -Lactose monohydrate, Sigma), 10 % laktalbumiini hydrolysaattia (1 %) (Lactalbumin Entzymatic Hydrolysate, Sigma), 400 mM GSH:ta (0,3 %) (L-Glutathione reduced, Sigma), 0,5 % L-askorbiinihappoa (0,2 %) (Ascorbic Acid, Sigma), 0,005 % hydrokortisonia (2 %) (Hydrocortisone, Sigma), 1 % insuliinia (0,01 %) (Insulin, Sigma) ja antibioottia (2 %) (Antibiotic Antimycotic Mix, Sigma). Suluissa on esitetty aineiden suhteelliset pitoisuudet lopullisessa kasvatusliemessä. Kasvatusliemi vaihdettiin soluille 2 – 3 kertaa viikossa.
Solutiheyttä seurattiin mikroskoopilla lähes päivittäin ja kun soluviljelypullo oli n. 80 %:sti konfluentti, solut jaettiin uuteen pulloon. Jakovaiheessa solut pestiin 1 x PBS:llä ja inkuboitiin 5 min. inkubaatiokaapissa (Heraus, Hera Cell, +37 C, 5 % CO2), jonka jälkeen suoritettiin trypsinointi. Trypsinoinnissa pesuun käytetty PBS poistettiin pullosta ja tilalle lisättiin 0,05 % Trypsin-EDTA-liuosta. Pulloa inkuboitiin inkubointikaapissa 10 min., jonka jälkeen solujen irrottamiseksi trypsiiniliuosta pipetoitiin muutaman kerran edestakaisin ennen liuos-soluseoksen
siirtämistä kasvatusliemen joukkoon. Kasvatusliemi pysäyttää trypsinoinnin. Kasvatusliemi- trypsiini-soluseosta sentrifugoitiin 5 min. 1100 rpm (Heraus, Biofuge Primo), supernatantti poistettiin ja solumassa suspensoitiin kasvatusliemeen. Solut laskettiin Bürker-kammion avulla 1:5 0,1 % erytrosiini-B-väriaineliuoksella (Sigma) laimennettuna. Uuteen pulloon laitettiin n.
500 000 solua.
Altistuksessa käytettiin jakokertoja 5 – 7. Viimeistä edellinen jako suoritettiin 75 cm3 soluviljelypulloon, jolloin soluja saatiin riittävästi altistukseen. Viimeisen jaon solut kasvatettiin kuoppalevyllä, jossa altistus stafylokokeille tehtiin. Kuopille jaettiin 100 000 solua/ml/kuoppa.
Kuopille jaosta seuraavana päivänä kasvatusliemen tilalle vaihdettiin antibiootiton kasvatusliemi, jolloin pohjaan kiinnittyneiden solujen kasvu kiihtyi. Seuraavana eli altistuspäivänä antibiootittoman kasvatusliemen tilalle vaihdettiin 1 x PBS.
6.3 Boviinilaktoferriini
Boviinilaktoferriini (Apo-lactoferrin, Biopole SA) puhdistettiin endotoksiinista käyttäen polymyksiini B:stä (Sigma) ja separoosi 4B:stä (Sigma) valmistettua geeliä proteiinin sitomiseen ja oktyyli- -D-glukopyranoosi-liuosta (Calbiochem/Behring Diagnostics) endotoksisen proteiinin erottamiseen (Karplus ym. 1987). Endotoksiinipitoisuus puhdistusta ennen ja jälkeen määritettiin Työterveyslaitoksen työhygienian ja -toksikologian laboratoriossa Kuopiossa. Pitoisuus määritettiin LAL (Limulus Amebosyte Lysate) -entsyymiin perustuvalla kineettisellä kromogeenisellä menetelmällä. Puhdistusta ennen boviinilaktoferriini sisälsi endotoksiinia 44 EU/mg ja puhdistuksen jälkeen 0,21 EU/mg.
6.4 Menetelmän validointi
Tutkimusmenetelmän toimivuuden varmistamiseksi teimme altistuksen ensin positiivisilla S. aureus 298 jaS. aureus 288 -kannoilla sekä negatiiviseksi oletetulla, lieväoireisen tulehduksen aiheuttaneella S. chromogenes 74 -kannalla. Positiivisista kannoista S. aureus 298 osoittautui
parhaiten adhesoituvaksi, invasoituvaksi ja monistuvaksi. S. chromogenes 74 oli heikosti negatiivinen kanta, joten sen tilalle otettiin myöhemmin saatu S. epidermidis 808 (EELA), joka oli eristetty juustosta. Tätä kantaa käytettiin lopuissa altistuksissa negatiivisena kantana, koska sen todettiin adhesoituvan, invasoituvan ja monistuvan huonosti. Viimeisillä altistuskerroilla testasimme myös S. aureus ATCC 25923 -kannan. Se ei ollut yhtä hyvin adhesoituva, invasoituva ja monistuva kanta, kuin koko tutkimuksen ajan positiivisena kantana käytetty oli.
6.5 Altistus
Absorbanssin säädön jälkeen bakteeriliuoksia pipetoitiin kuoppalevyille 500 l/1 x 108 PMY/kuoppa. Altistuksia tehtiin aina kolme rinnakkaista kuoppaa/levy ja levyjä oli kolme; yksi adheesiota, yksi invaasiota ja yksi monistumista varten. Lopuista bakteeriliuoksista viljeltiin TS (LabM) -maljoille sopivat laimennokset, jolloin saatiin tietää bakteeripitoisuus altistuksen alussa.
Adheesiokuoppalevyä inkuboitiin (Revco, +37 C, 5 % CO2) 30 min. altistuksen aloituksesta, jonka jälkeen kuopat pestiin 5 kertaa 1 x PBS-liuoksella. Kuopille lisättiin 500 l edellisenä päivänä tehtyä 0,1 % Triton-X-PBS-liuosta ja levyä inkuboitiin jäillä 10 min. Tämän jälkeen Triton-X-PBS -liuosta pipetoitiin edestakaisin solujen irrottamiseksi kuopan pohjasta ja liuos laitettiin 4,5 ml peptonisuola-laimennusveden joukkoon. Laimennosvesi sekoitettiin hyvin ja siitä tehtiin laimennossarja. Sopivat laimennokset viljeltiin TS-maljoille rinnakkaisina. Maljoja inkuboitiin (Termaks) 24 h +/- 2 h +37 C ja pesäkemäärät laskettiin.
Invaasiokuoppalevyä inkuboitiin 2 h kuten myös monistuskuoppalevyä, jonka jälkeen levyt pestiin 3 kertaa 1 x PBS:llä ja kuopille lisättiin 500 l gentamysiini (Gentamycin Sulfate, Sigma)- antibioottiliuosta (100 g/ml), jonka on todettu tappavan solun ulkopuolisia bakteereja (Diarra ym. 2003). Levyjä inkuboitiin 1,5 h, jonka jälkeen monistuskuoppalevylle vaihdettiin laimea (5 g/ml) antibioottiliuos ja inkuboitiin 21 h altistuksen aloituksesta. Invaasiokuoppalevy pestiin kerran 1 x PBS:llä, solut irrotettiin Triton-X-PBS-liuoksella ja kuopat käsiteltiin kuten adheesiolevyä käsitellessä. Seuraavana aamuna monistuskuoppalevyä ei pesty 1 x PBS-liuoksella
vaan Triton-X-PBS-liuos vaihdettiin antibioottiliuoksen tilalle ja levy käsiteltiin kuten aiemmat levyt.
Boviinilaktoferriini vaikutusta tutkittaessa endotoksiinivapaa boviinilaktoferriini liuotettiin RPMI 1640 -kasvatusliuokseen siten, että 100 l:ssa, joka pipetoitiin soluille juuri ennen bakteerisuspension lisäystä, oli 1 mg laktoferrriiniä. Kuopassa laktoferriinipitoisuus oli 2 mg/ml.
Altistuskerroilla oli rinnakkain saman bakteerin altistus ilman laktoferriiniä ja laktoferriinin kanssa, jolloin saatiin olosuhteista riippuvat erot poistettua ja laktoferriinin vaikutusta kannalle voitiin vertailla. Muutoin levyjen käsittely tapahtui aiemmin mainitulla tavalla.
6.6 Adheesio- ja invaasioprosentin sekä monistuskertoimen laskeminen
Adheesio- ja invaasioprosentit laskettiin vertaamalla adheesiossa ja invaasiossa saatuja keskimääräisiä bakteeripitoisuuksia saman kannan ja päivän lähtöpitoisuuteen. Esim. kannalleS.
aureus 298 eräänä altistuskertana lähtöpitoisuus oli 4,55 x107 PMY/ml ja adheesiokuopilla oli 1,94 x 106 PMY/ml. Tästä laskettiin adheesioprosentti:1,94 x 106 / 4,55 x107 x 100= 4,3 %.
Taulukossa 4 (liite 1) on esitetty kunkin kannan kaikkien altistuskertojen adheesio- ja invaasioprosenttien keskiarvot ja niiden hajonnat. Monistuskerroin eli bakteerikannan solunsisäinen monistumiskyky saatiin selville vertaamalla kannan monistusvaiheen bakteerimääriä invaasiovaiheen bakteerimääriin. Esim: kannalle S. aureus 298 eräänä altistuskertana monistusvaiheen bakteeripitoisuus oli 3,95 x 108 PMY/ml ja invaasiovaiheen bakteeripitoisuus 1,62 x 106PMY/ml. Tästä laskettiin monistuskerroin:3,95 x 108/ 1,62 x 106x 100 = 24 302. Taulukossa 5 (liite 2) on esitetty kunkin kannan kaikkien altistuskertojen monistuskertoimien keskiarvot ja niiden hajonnat.
6.7 Tilastolliset menetelmät
Tilastollisessa käsittelyssä käytettiin SPSS for Windows versio 14.0.1-ohjelmistoa.
Boviinilaktoferriinin vaikutuksia kantojen adheesioon, invaasioon ja solunsisäiseen monistumiseen tutkittiin yhden näytteen t-testillä. Spearmanin järjestyskorrelaatiota käytettiin altistusvaiheiden korrelaation laskemiseen ja todistamaan, että KNS-kantojen virulenssiä voidaan tarkastella kantoja keskenään vertaamalla. Kahden riippumattoman otoksen t-testillä tarkasteltiin, eroaako adheesio- ja invaasioprosentit sekä monistuskerroin tai boviinilaktoferriinin vaikutus merkittävästi persistoivien ja ei persistoivien kantojen välillä.
7 TULOKSET JA TULOSTEN TARKASTELU
7.1 Menetelmän validointi kontrollikannoilla
Aluksi menetelmä validoitiin kontrollikannoilla. Kontrollikantojen adheesio, adheesioprosentti, invaasio ja invaasioprosentti on esitetty taulukossa 4 (liite 1) ja kantojen monistuminen ja monistumiskerroin on esitetty taulukossa 5 (liite 2). Kannoille on laskettu sarjojen välinen (SD) hajonta. Jokaisella altistuskerralla mukana olleelle S. aureus 298 -kannalle laskettiin lisäksi sarjojen sisäinen (CV %) hajonta, joka laskettiin altistuskertojen sisäisenä ja välisenä.
Adheesiovaiheessa CV % (sisäinen%/välinen%) oli 20/59, invaasiossa se oli 28/56 ja monistumisessa 24/53. Tämä hajonta kuvaa parhaiten menetelmän luonteesta aiheutuvaa hajontaa, mutta sisältää myös kannan oman hajonnan.
Kuvassa 2 on esitetty kontrollikantojen adheesioprosentit, kuvassa 3 invaasioprosentit ja kuvassa 4 monistuskerroin. Negatiivisena kantana käytetty S. epidermidis 808 adhesoitui lähes yhtä hyvin kuin positiiviset kannat, mutta invaasio oli huomattavasti alhaisempi kuin muilla kontrollikannoilla. S. epidermidis 808 ja S. aureus ATCC 25923 -kantojen monistuskertoimet olivat lähellä toisiaan. Positiivisena kontrollina näissä tutkimuksissa käytetty S. aureus 298 oli kaikissa vaiheissa parhaiten adhesoituva, invasoituva ja monistuva kanta. Muut positiiviset kannat,S. aureus 228 ja S. aureus ATCC 25923, sijoittuivat negatiivisen ja positiivisen kannan väliin. Kontrollikantojen validoinnissa huomattiin että kantojen hajonnat olivat korkeita.
(taulukko 4 ja 5, liite 1 ja 2)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
S. aureus 298 S. epidermidis 808
S. chromogenes 74
S. aureus 228 S. aureus ATCC 25923
%
KUVA 2:Kontrollikantojen adheesioprosentit ja niiden hajonnat.
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0
S. aureus 298 S.
epidermidis 808
S.
c hrom ogenes 74
S. aureus 228 S. aureus ATCC 25923
%
KUVA 3: Kontrollikantojen invaasioprosentit ja niiden hajonnat
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
S. aureus 298 S. epidermidis 808 S. aureus ATCC 25923
log mk
KUVA 4: Kontrollikantojen monistuskertoimet ja hajonnat logaritmisinä. Kannoista S. aureus 228 jaS. chromogenes 74 ei saatu monistustuloksia.
PositiivisellaS. aureus 298 -kannalla invaasioprosentti oli useina altistuskertoina korkeampi kuin adheesioprosentti. Selvisi että, kanta sieti gentamysiiniä olematta kuitenkaan resistentti. Tällöin bakteerit mahdollisesti pystyivät säilymään elossa supernatantissa ja nekin bakteerit, jotka eivät kahdessa tunnissa ennättäneet invasoitua pääsivät solun sisään. Kanta voi olla myös niin virulentti, että se kykeni lisääntymään solun sisäisesti 3,5 h aikana, joka oli adheesio- ja invaasiokuoppalevyn käsittelyn välinen aika. Ensimmäistä teoriaa vastaan on se tosi asia, että käytimme kolmessa viimeisessä altistuksessa gentamysiinin ohella lysostafiinia (5 g/ml), jonka on myös todettu tappavan solun ulkopuolisia stafylokokkeja, muttei solunsisäisiä (Diarra ym.
2003). Tästä huolimatta saimme samansuuntaisia invasoitumispitoisuuksia kuin pelkällä gentamysiinin käytöllä.
7.2 Altistuskokeet KNS-kannoilla
Puolen tunnin inkuboinnin jälkeen BME-soluihin adhesoituneiden bakteerienmäärät vaihtelivat 30 000 ja 9 000 000 välillä. Adheesioprosentin vaihtelu oli 0,05 % - 3,6%.Tutkituista kannoista (n=22) neljä adhesoitui alle 0,1 %:sesti, yksitoista 0,1 – 1 %:sesti ja seitsemän kantaa yli 1
%:sesti. Tarkemmat tulokset on esitetty taulukossa 4 (liite 1).
Adheesiota tutkittiin vertailemalla kantoja keskenään ja kunkin kannan adheesiota saman päivän altistuksen positiivisen kannan adheesioon. Kantojen keskinäinen vertailu on informatiivisempää, mutta vertaamalla kantaa aina saman päivän altistuksen positiivisen kantaan saadaan luotettavampia tuloksia, koska silloin otetaan huomioon altistusolosuhteista johtuvat muutokset.
Molemmilla tarkastelutavoilla saadut tulokset järjestettiin niin, että vähiten adhesoitunut kanta sai luvun 1 ja eniten adhesoitunut kanta luvun 22. Sen jälkeen vertailin näiden tarkastustapojen eroa Spearmanin järjestyskorrelaatiolla. Korrelaatioksi saatiin 0,739, joka kertoo tarkastelutapojen korrelaation olevan voimakasta ja tuloksia voidaan tarkastella suoraan kantoja keskenään vertaamalla ilman suurta tulosten vääristymistä.
Kuvassa 5 on esitetty viiden KNS-bakteerikannan adheesioprosentit ja niiden hajonnat.
Kannoiksi otettiin monistuskertoimeltaan erilaisia kantoja. Valitut kannat ovat S. haemolyticus
224,S. simulans19,S. chromogenes 312,S. simulans 261 jaS. chromogenes 37. Näistä kannoista ensimmäinen adhesoitui huomattavasti muita kantoja paremmin ja valitutS. chromogenes -kannat adhesoituivat paremmin kuinS. simulans -kannat.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
S. aur eus
298
S. epidermidis S808
S. hae molyticus 224
S. simulans 19 S. c
hrom ogenes 3
12
S.sim ulans
261
S. chrom ogenes 3
7
%
KUVA 5: Valittujen KNS-kantojen adheesioprosentit ja niiden hajonnat. Kuvassa on myös positiivinen (S. aureus 298) ja negatiivinen (S. epidermidis S808) kanta.
Kolmen ja puolen tunnin, josta kaksi ensimmäistä tuntia ilman antibioottia, inkuboinnin jälkeen BME-soluihin invasoituneiden bakteerien määrät vaihtelivat 100 ja 2 000 000 välillä.
Invaasioprosentin vaihtelu oli 0,001 % - 0,7 %. Tutkituista kannoista (n=21) kuusi invasoitui alle 0,01 %:sesti, yhdeksän 0,01 – 0,1 %:sesti ja kuusi yli 0,1 %:sesti. Tarkemmat tulokset on esitetty taulukossa 4 (liite 1).
Tarkastelutapojen eroa (kantoja vertaaminen keskenään vs. kannan vertaaminen positiiviseen kantaan) selvitettiin kuten adheesiokohdassakin. Järjestyskorrelaatioksi saatiin 0,647, mikä kertoo korrelaation olevan keskivoimakasta. Tuloksia voidaan tarkastella kantoja keskenään vertaamalla, mutta nämä tulokset eroavat vähän positiiviseen kantaan verratuista tuloksista.
Tutkimuksessamme kantojen invaasio pysyi aina kannan adheesiota matalampana. Keskimäärin adhesoituneista bakteereista 16 % (+/- 41 %) invasoitui. Invaasio on tärkeä patogeneesin vaihe, sillä invasoituneet bakteerisolut ovat solun sisällä turvassa esim. antibioottihoidoilta.
Kuvassa 6 on esitetty valittujen KNS-bakteerikantojen invaasioprosentit ja niiden hajonnat.
Kuvasta puuttuu positiivinen S. aureus 298, koska sen invaasioprosentti (4,0 %),oli huomattavasti muita suurempi, jolloin kuva ei olisi ollut informativiinen Kuvasta huomataan S.
chromogenes 37 invasoituvan parhaiten, sen jälkeen tulevat S. haemolyticus 224 ja S.
chromogenes 312.S. simulans -kannat invasoituivat valituista kannoista huonoiten.
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
S. epidermidis S808
S.
haemolyticus 224
S. simulans 19
S.
chromogenes 312
S.simulans 261
S.
chromogenes 37
%
KUVA 6: Valittujen KNS-bakteerikantojen invaasioprosentit ja niiden hajonnat. Kuvassa on myös negatiivinenS. epidermidis S808.
Vuorokauden (21 h) inkuboinnin jälkeen BME-solujen sisällä monistuneiden KNS-bakteerien määrät vaihtelivat 100 ja 7 000 000 välillä. Monistuskerroin vaihteli 9 ja 17 000 välillä.
Tarkastelutapojen eroa tutkittiin, kuten adheesio- ja invaasiokohdassa. Järjestyskorrelaatio oli 0,858, mikä kertoo että kantojen tulokset eivät juurikaan eroa tarkasteltiinpa niitä positiiviseen kantaan vertaamalla tai toisiin kantoihin vertailemalla. Hyvä järjestyskorrelaatio selittynee sillä, että monistuskerroin on saatu vertaamalla saman päivän invaasiota monistumiseen eli altistusolosuhteiden muutokset on molemmissa tarkastelutavoissa otettu huomioon. On tärkeää, että kanta kykenee lisääntymään ja selviämään solunsisäisesti. Toisaalta uusiutuvien utaretulehdusten aiheuttajana ovat yleensä kannat, jotka eivät lisäänny nopeasti, vaan pysyvät pitkään elinkykyisenä matalalla pitoisuudella.
Kuvassa 7 on esitetty KNS-bakteerikantojen monistuskertoimet. Kuvasta huomataan, että S.
chromogenes37 monistui parhaiten jaS. haemolyticus 224 huonoiten.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
S. au reus 298
S. epid ermidis
S808
S. haemolyticus 224
S. simulans 19
S. chromogenes 3 12
S.simulans 261
S. chromogenes 37
log mk
KUVA 7: Valittujen KNS-bakteerikantojen logaritmiset monistuskertoimet (mk) ja niiden hajonnat. Kuvassa on myös positiivinen (S. aureus 298) ja negatiivinen (S. epidermidis S808) kannat.
7.3 Korrelaatio
Eri altistusvaiheiden korrelaatiota vertailtiin suurten hajontojen takia Spearmanin järjestyskorrelaatiolla. (taulukko 3)
TAULUKKO 3:Eri altistusvaiheiden korrelaatio Spearmanin järjestyskorrelaatiolla tutkittuna.
Adheesio Invaasio Monistuminen Monistuskerroin
Adheesio 1 0,779 0,594 0,213
Invaasio 0,779 1 0,627 0,186
Monistuminen 0,594 0,627 1 0,763
Monistuskerroin 0,213 0,186 0,763 1
