Taulukosta 2 nähdään persistoivat ja ei-persistoivat bakteerikannat. Persistoivat kannat sijoittautuivat patogeenisuudeltaan vaihtelevasti. Monistuskertoimella tarkasteltuna (kohta 7.4) puolet persistoivista kannoista oli heikosti patogeenisia ja puolet apatogeenisiä. Ei-persistoivista kannoista kaksi oli patogeenista, yksi heikosti patogeeninen ja kaksi apatogeenisia kantoja.
Kuvasta 14 huomataan, että myös adheesio- ja invaasioprosentilla tarkasteltuna ei-persistoineet kannat olivat virulentimpiä kuin persistoivat kannat.
Kahden riippumattoman otoksen t-testillä tarkasteltiin eroavatko adheesio- ja invaasioprosentit sekä monistuskerroin merkittävästi persistoivien ja ei-persistoivien kantojen välillä. Adheesio- ja invaasioprosentit eivät eronneet merkittävästi (p=0,211 ja p=0,124 vastaavasti). Myöskään monistuskertoimilla tarkasteltaessa merkittävää eroa ei havaittu (p=0,227).
Myöskään siihen miten persitoivat ja ei-persistoivat kannat reagoivat boviinilaktoferriiniin ei saatu merkittäviä eroja, kun vertailtiin kyseisten kantojen suhteellisia prosenttiosuuksia, adhesoitumisessa (p=0,155), invasoitumisessa, (p=0,087) monistumisessa (p=0,866) ja monistuskertoimilla (p=0,954) kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Persistoivien (n=7) ja ei-persitoivien (n=6) kantojen tilastollinen vertailu oli kannattamatonta pienen otoskoon takia.
Tällöin ryhmien välillä olisi täytynyt olla todella suuri ero ennen kuin olisi saatu aikaan tilastollisesti merkittäviä tuloksia. Mitä suuremmaksi otoskoko nousee, sitä pienempi ero on merkittävä.
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0,140 0,160 0,180
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
a dhe e sio %
invaasio %
KUVA 14: Pesistoivat kannat on esitetty kuvassa neliöinä ja ei-persistoivat kolmioina.
8 POHDINTA
Tutkimuksen aikana BME-solujen kasvatuksessa ei ilmennyt ongelmia. Solut säilyivät koko tutkimuksen ajan kontaminoitumattomina. Tulokset pyrittiin saamaan mahdollisimman luotettaviksi vertaamalla tuloksia saman päivän altistuksiin, jolloin altistusolosuhteista johtuvat erot saatiin poistettua. Esimerkiksi tutkittaessa laktoferriinin vaikutusta KNS-kantoihin verrattiin samana päivänä samalle kannalle tehtyjä altistuksia ilman laktoferriiniä ja sen kanssa.
Olosuhdemuutoksia ei voitu huomioida tutkittaessa yksittäisten KNS-kantojen patogeenisyyttä ja laktoferriinin vaikutusta näihin kantoihin, kuten ei myöskään positiivisella kontrollikannalla tai verrattaessa persistoivia ja ei-persistoivia kantoja keskenään. Soluviljely ja bakteerikannat ovat herkkiä muutoksille ja siksi havaittiin suurta hajontaa saman kannan eri altistuskertojen välillä.
Tämä on otettava huomioon tuloksia tarkastellessa ja todettava tulosten olevan vain suuntaa-antavia. Hajonnat ovat suurelta osin menetelmän luonteesta johtuvia.
Hajontoja tuloksiin voi tulla Van Belkumin ym. (2002) havaitsemista seikoista. Eukaryoottisolut, eli meidän tapauksessamme utare-epiteelisolut, voivat ilmentää erilaisia kasvuominaisuuksia.
Esim. kasvatusmediumin koostumus vaikuttaa solupinnan proteiinien tuottoon. Solut eivät myöskään välttämättä kasva tasaisena konfluenttina kerroksena, mikä sallii stafylokokkien sitoutumisen tyhjiin kohtiin. Sitoutumisen jälkeiset pesut voivat erota fysikaaliselta voimakkuudeltaan tai kemialliselta vahvuudeltaan. Kantojen adheesio on voimakkaasti riippuvainen bakteerin kasvuvaiheesta ja isäntäsolun erilaistumisesta. Toisistaan eroavia tuloksia saadaan myös, kun stafylokokit muodostavat lajista ja kasvuvaiheesta riippuen rykelmiä tai samalla kannalla käytetään erilaisia laimennuksia. Täytyy muistaa, että altistusvaiheet ovat kompleksisia isäntä-patogeeni vuorovaikutuksia ja tarkkaa mekanismia, joka johtaa bakteerin infektioon aiheuttamiseen ei ole vielä yksityiskohtaisesti selvitetty. Lisäksi, vaikka tutkimusolosuhteet ovat hyvin standardoidut, on huomattu bakteerien sitoutumistestien toistoissa päivien välillä eroa.
Adheesio kuvastaa bakteerin kykyä kiinnittyä utaresolun pintaan. Adhesoituneet bakteerit ovat merkittäviä tulehdusreaktioiden aiheuttajia ja adheesiota voidaan pitää merkittävänä bakteerin patogeneesin alkuvaiheena. Lisäksi, jotta kanta pystyisi invasoitumaan tulee sen ensin adhesoitua
(Hyvönen, suullinen tieto; Cifrian ym. 1994; Almeida ja Oliver 2001.) Bakteerit, jotka ovat utaresolun ulkopuolella ovat herkkiä puolustusmekanismeille, mutta toisaalta adheesio voi suojata bakteeria fagosytoosilta ja nopeasti adhesoituvat bakteerit eivät huuhtoudu utareesta maitovirran mukana (Almeida ja Oliver 2001; Hensen ym. 2000). S. aureus ja KNS-kantojen solukalvolla on havaittu laktoferriinireseptori, johon sitoutuessaan laktoferriini estää bakteerin adhesoitumisen isäntäsolun solukalvon proteiineihin, jotka ovat osallisena bakteerin invasoitumiseen (Naidu ym. 1990 ja 1991; Diarra ym. 2003.) S. uberis -bakteerilla on havaittu adhesoitumisen utare-epiteelisoluihin lisääntyvän laktoferriinin vaikutuksesta (Fang ym. 2000).
Tutkimuksessamme laktoferriini ei vaikuttanut adheesiovaiheessa tilastollisesti merkittävästi bakteerimääriin. Jos olisimme todenneet laktoferriinillä adheesiota estävää vaikutusta, bakteereja olisi invasoitunut utaresoluihin vähän, koska adheesiota pidetään invaasiota edeltävänä vaiheena.
Invasoituneet bakteerit pääsevät mikroympäristöön solun sisälle suojaan isännän puolustusmekanismeja. Invaasiota on pidetty tärkeänä patogeenisuuden merkkinä (Almeida ja Oliver 2001.) Tutkimuksessamme huomattiin hyvin invasoituneiden kantojen monistuvan hyvin (taulukko 3). Se, että S. aureus kannoilla on saatu suurempia invasoitumistuloksia kuin KNS -kannoilla, voisi johtua Almeidan ym. (1996) havainnosta, että S. aureus -bakteeri jakautuu useammin vakuoleissaan. S. aureus -kannoilla huomattiin jopa neljä bakteeria yhdessä solunsisäisessä vakuolissa, kun taas KNS-kannoilla huomattiin vakuolia kohden yleensä yksi, harvemmin kaksi bakteeria. Myös S. aureus -kantojen parempi monistuminen voisi johtua samasta syystä (Almeida ym. 1996; Almeida ja Oliver 2001.) Tilastollisesti merkittävää bakteerimäärien alenemaa ei tässä tutkimuksessa saatu myöskään invaasiovaiheessa. Tosin, kun tutkittiin laktoferriinin vaikutusta yksittäisiin kantoihin (taulukko 6, liite 3) huomattiin, että puolet tutkituista kannoista oli invaasiovaiheessa herkkiä laktoferriinikäsittelylle.
Invaasiovaiheessa laktoferriini estäisi bakteerien pääsyn solun sisään lisääntymään, jolloin tauti olisi myös parhaassa tapauksessa nujerrettu. Laktoferriini pystyy herkistämään bakteerin invaasioon osallistuvat rakenteet proteolyysille (Gomez ym. 2003).
Monistuminen kuvaa bakteerin kykyä lisääntyä ja selvitä elinkykyisenä solun sisällä. Bakteerin patogeneesin kannalta on tärkeää, että se pystyy välttämään isäntäsolun puolustusmekanismit.
Solunsisäisen kasvutilan rajallisuus ja isäntäsolun vaurioituminen ovat monistumista rajoittavia tekijöitä. Monistumisen määrä ja luonne voivat vaikuttaa utaretulehduksen luonteeseen ja
voimakkuuteen. (Hyvönen 2007, suullinen tiedonanto) Monistusvaiheessa laktoferriini vie bakteerien ympäristöstä rautaa, jolloin niiden monistuminen hidastuu tai lakkaa. Eräät virulentit bakteerit tuottavat näissä olosuhteissa rautaa sitovaa kelaattoria, jonka avulla rauta pääsee solun sisälle (Neilands 1984; Kutila 2004a). Laktoferriinin on ehdotettu pääsevän solun tumaan, jossa se voisi estää monistumista ja bakteerikantojen invasoitumiseen tarvittavien fimbrioiden kehittymistä ja täten pysäyttää infektion (Valenti ja Antonini 2005). Laktoferriinin vaikutuksesta KNS-kantojen monistumiseen ei ole tehty ennen tutkimuksia. Tässä tutkimuksessa laktoferriini alensi monistusvaiheessa merkittävästi bakteeripitoisuuksia. Jos laktoferriini alentaa vain monistumiseen, voi soluun invasoitua paljon bakteereja, jotka jo yksinään aiheuttaisivat oireita.
Verrattaessa adheesion ja invaasion bakteeripitoisuuksia Almeidan ja Oliverin (2001) tutkimuksessa saatuihin, ne olivat lähellä toisiaan. Almeidan ja Oliverin tutkimus osoitti, että S.
epidermidis, S. xylosus ja S. hyicus -bakteerit adhesoituivat puolessa tunnissa luokkaa 105 log (PMY/ml) ja invasoituivat kahdessa tunnissa 102 – 105 log (PMY/ml). Meillä KNS-kantojen adheesiopitoisuus logaritmisena vaihteli samassa ajassa 104 – 106 PMY/ml ja invaasio oli 102 -106 PMY/ml 3,5 h aikana. Anaya-López ym. (2006) tutkimuksissa käytettiin primäärisiä epiteelisoluja ja testattiin subkliinisistä utaretulehduksista eristettyjen koagulaasi-negatiivisten stafylokokkien jaS. aureus -bakteerin invaasiota soluihin. Heidän tutkimuksissaan kannat eivät juurikaan invasoituneet. Heidän kannoistaan kaksi S. aureus -kantaa ja yksiS. epidermidis -kanta invasoituivat, mutta hiukan heikommin, mitä tutkimuksemme saman lajin kannat. Erot tutkimuksissa voisivat johtua käytettyjen solujen erilaistumisesta. Almeida ym. (1996) tutkimuksessa kaksi S. aureus -kantaa invasoitui neljässä tunnissa pitoisuudella 105 log (PMY/ml) kun taas tutkimuksemme kaikki S. aureus -kannat invasoituivat 3,5 h aikana 106log (PMY/ml).
On ehdotettu, että uusiutuvien utaretulehdusten aiheuttajana olisivat sellaiset kannat, jotka jakautuvat harvoin eivätkä siten herätä isäntäsolun puolustusmekanismeja ja pysyvät pitkään elinkykyisinä vaurioittamatta isäntäsolua (Tamilselvam ym. 2006). Uusiutuvien utaretulehdusten syynä on usein bakteerien biofilmin muodostuskyky. Biofilmi luo bakteereille luontaisen suojan mm. antibiootteja desinfiontiaineita ja isännän puolustusmekanismeja vastaan. Toisaalta biofilmissä ollessaan bakteerisolut ovat vähemmän invasoituvia ja jakautuakseen sekä levitäkseen biofilmistä irtoaa hoidolle herkempiä planktonisia soluja. Ensimmäisissä utaretulehduksissa
bakteerit ovat lähinnä planktonisina soluina, kun taas kroonisissa infektioissa muodostuu biofilmejä. Liian matala antibioottikonsentraatio voi lisätä biofilmin muodostumista ja bakteerin adhesoitumista sekä toksiinien tuottoa (Melchior ym. 2006.) Boviinilaktoferriinin on todettu estävän biofilmin muodostumista (Ochoa ym. 2006).
S. aureus käyttää adheesiossa lähinnä fibronektiiniä ja KNS kollageenia. (Miedzobrodzki ym.1988) Tutkituista kannoista mikään ei erottunut toisia patogeenisemmäksi. Korkeita solupitoisuuksia aiheuttaneita kantoja oli lähinnä patogeenisiksi ja heikosti patogeenisiksi luokitelluissa kannoissa. Apatogeenisiksi luokitelluista kannoista vain yhden tiedetään aiheuttaneen oireita ja yhden kannan tämän lisäksi nostaneen maidon solupitoisuuden korkeaksi.
Muut kannat olivat oireettomia ja maidon solupitoisuus jäi matalaksi.Yksikään persistoiva kanta ei ollut luokiteltavissa patogeeniseksi monistuskertoimella tarkasteltuna. Ei-persistoivista kannoista kaksi oli patogeenisia, yksi heikosti patogeeninen ja kaksi apatogeenisia. Se, että, yksikään persistoiva kanta ei ollut patogeeninen, voisi selittyä edellisessä kappaleessa olleella Tamilselvamin havainnoilla. Dogan ym. (2006) puolestaan huomasi, että persistoivat ja transienttit E. coli -kannat adhesoituivat yhtä hyvin, mutta persistoivat kannat invasoituivat, lisääntyivät ja selvisivät solusisäisesti pidemmän ajan MAC-T-solulinjan soluissa. Otoskoko persistoivien ja ei-persistoivien kantojen osalta oli tutkimuksessamme pieni, jolloin sattumallakin voi olla merkitystä.
Tällä tutkimuksella osoitettiin, että utare-epiteelisolumallilla todetaan eroa kantojen adheesiossa, invaasiossa ja monistumisessa. Altistuksessa saadut bakteeripitoisuudet olivat samansuuntaisia aiemmin tehtyjen kokeiden tuloksien kanssa. Malli osoittautui toimivaksi boviinilaktoferriinin vaikutuksen arvioinnissa. Jotta menetelmää voisi laajemmin käyttää, tulisi saman kannan altistuskertojen välisiä hajontoja saada pienemmiksi. Jatkossa voisi tutkia kannan aiheuttamien oireiden ja solusisäisen säilymisen yhteyksiä.
LÄHTEET
Aarestrup, F.M. ja Jensen, N. E. 1997: Prevalence and duration of intramammary infection in Danish heifers during the peripartum period. J. Dairy Sci. 80:307 – 312.
Aarestrup, F.M., Larsen, H.D., Jensen N.E. 1999: Characterization ofStaphylococcus simulans strains isolated from cases of bovine mastitis. Vet. Microbiol. 66:165 – 170.
Alenius, T. ja Reinvaldt, T. 1989: Onko lehmäsi sairas? 80 s. PunaMusta, Joensuu
Almeida, R.A. ja Oliver, S.P. 1995: Invasion of bovine mammary epithelial cells by Streptococcus dysgalactiae. J. Dairy Sci. 78:1310 – 1317.
Almeida, R.A., Matthews, K.R., Cifrian, E., Guidry, A.J. ja Oliver, S.P. 1996: Staphylococcus aureus invasion of bovine mammary epithelial cells. J. Dairy Sci. 79:1021 – 126.
Almeida R.A. ja Oliver S.P. 2001: Interaction of coagulase-negative staphylococcus species with bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 31:205 – 212.
Anaya-López, J.L., Contreras-Guzmán, O.E., Cárabez-Trejo, A., Baizabal-Aguirre, V.M., López-Meza, J.E., Valdez-Alarcón, J.J. ja Ochoa-Zarzosa, A. 2006: Invasive potential of bacterial isolates associated with subclinical bovine mastitis. Res. Vet. Sci. 81:358 – 361.
Appelmelk, B.J., An, Y-Q., Geerts, M., Thijs, B.G., Boer, H.A., Maclaren, D.M. De Graaff, J. ja Nuijens, J.H. 1994: Lactoferrin is a lipid A-binding protein. Infect. Immun. 62:2628 – 2632.
Cifrian, E., Guidry, A.J., O'brien, C. N., Nickerson, S.C. ja Marquardts, W. W. 1994: Adherence ofStaphylococcus aureusto cultured bovine mammary epithelial cells. J. Dairy Sci.
77:970 – 983 .
Baker, E.N., Anderson, B.F., Baker, H.M., Day, C.L., Haridas, M., Norris, G.E., Rumball, S.V., Smith, C.A. ja Thomas, D.H. 1994: Three-dimensional structure of lactoferrin in various functional states. s. 1 – 12. Kirjassa: Lactoferrin structure and function.
Hutchens, T.W., Rumball, S.V. ja Lönnerdal, B. (toim.) Plenum press, New York.
Bayles, K.W. ja Bohach, G.A. 2001: Internalization of Staphylococcus aureus by non-professional phagocytes. s. 247 – 271. Kirjassa: Staphylococcus aureus infection and disease. Honeyman, A (toim.) Kluwer Academic Publishers, New York.
De Vliegher,S., Laevens, H., Devriese, L.A., Opsomer, G., Leroy, J.L.M., Barkema, H.W. ja de Kruif, A. 2003: Prepartum teat apex colonisation with Staphylococcus chromogenes in dairy heifers is associated with low somatic cell count in early lactation. Vet.
Microbiol. 92:245 – 252.
Diarra, M.S, Patitclerc, D. ja Lacasse, P. 2002: Response of Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis to exogenous iron sources. J. Dairy Sci. 85:2141 – 2148.
Diarra, M.S, Patitclerc, D., Deschenes, E., Lessard, N., Grondin G., Talbot, B.G. ja Lacasse P. 2003: Lactoferrin against Staphylococcus aureus mastitis. Lactoferrin alone or in combination with penicillin G on bovine polymorphonuclear function and mammary epithelial cells colonisation by Staphylococcus aureus. Vet. Immunol.
Immunopathol. 95:33 – 42.
Dogan, B., Klaessig, S., Rishniw, M., Almeida, R.A., Oliver, S.P., Simpson, K. ja Schukken, Y.H. 2006: Adherent and invasive Escherichia coli are assosiated with persistent bovine mastitis. Vet. Microbiol. 116:270 – 282.
Döpfer, D., Almeida, R.A., Lam, T.J, Nederbragt, H., Oliver, S.P. ja Gaastra, W. 2000:
Adhesion and invasion of Escherichia coli from single and recurrent clinical cases of bovine mastitis in vitro. Vet. Microbiol. 74:331 – 343.
Ellison, R.T., Giehl, T.J. ja LaForce, F.M. 1988: Damage of the outer membrane of enteric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin. Infect. Immun. 56:2774 – 2781.
Ellison, R.T. ja Giehl, T.J. 1991: Killing of gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme.
J. Clin. Invest. 88:1080 – 1091.
Fang, W., Almeida, R.A. ja Oliver, S.P. 2000: Effects of lactoferrin and milk on adherence of Streptococcus uberis to bovine mammary epithelial cells. Am. J. Vet. Res. 61:275 – 279.
Finlay, B.B. ja Falkow, S. 1997: Common themes in microbial pathogenicity revisited.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61:136 – 169.
Fox, L.K., Bayles, K.W. ja Bohach, G.A. 2001: Staphylococcus aureus mastitis. s. 271 – 294. Kirjassa: Staphylococcus aureus infection and disease. Honeyman, A (toim.) Kluwer Academic Publishers, New York.
Gomez, H.F., Ochoa, T.J., Carlin, L.G. ja Cleary, T.G. 2003: Human lactoferrin impairs virulence ofShigella flexneri.J. Infect Dis. 187:87 – 95.
Hagiwara, S., Kawai, K., Anri, A. ja Nagahata, H. 2003: Lactoferrin concentrations in milk from normal and subclinical mastitis cows. J. Vet. Med. Sci. 65:319 – 323 .
Harridas, M., Anderson, B.F., Baker, H.M., Norris, G.E. ja Baker, E.N. 1994: X-ray structural analysis of bovine lactoferrin at 2.5 Å resolution s. 235 – 238. Kirjassa:
Lactoferrin structure and function. Hutchens, T.W., Rumball, S.V., ja Lönnerdal, B.
(toim.) Plenum press, New York.
Heiskanen, S., Mäkelä, A., Kjerp, A-C., Linqvist, B. ja Pokela, H. 2002: Lypsykarjan terveys s.
35 – 41. Julkaisussa: Kansallinen elintarviketalouden laatustrategia: Meijerialan kansallisen laatutyön toimintamalli. Päivitetty: 12.6.2002. Osoitteessa:
http://www.etl.fi/files/meim020904laatu.pdf . Viitattu: 12.10.2006.
Hensen, S.M., Pavicic, M.J.A.M.P., Lohuis, J.A.C.M. ja Poutrel, B. 2000: Use of bovine primary mammary epithelial cells for the comparison of adherence and invasion ability of Staphylococcus aureus strains. J Dairy Sci 83:418 – 429.
Hyvönen, P., Suojala, L., Orro, T., Haaranen, J., Simola, O., Røntved, C. ja Pyörälä, S. 2006:
Transgenic cows that produce recombinant human lactoferrin in milk are not protected from experimentalEscherichia coliintramammary infection.Inf. Immun.74:6206 – 6212.
Kai, K., Komine, K., Komine, Y., Kuroishi, T., Kozutsumi, T., Kobayashi, J., Ohta, M., Kitamura, H. ja Kumagai, K. 2002a: Lactoferrin stimulates a Staphylococcus aureus killing activity of bovine phagocytes in the mammary gland. Microbiol. Immunol.
46:187 – 194.
Kai, K., Komine, Y., Komine, K., Asai, K., Kuroishi, T., Kozutsumi, T., Itagaki, M., Ohta, M. ja Kumagai, K. 2002b: Effect of bovine lactoferrin by the intramammary infusion in cows with staphylococcal mastitis during the early non-lactating period. J. Vet. Med.
Sci. 64:873 – 878.
Karplus, T.E., Ulevitch, R.J. ja Wilson, C.B. 1987: A new method for reduction of endotoxin contamination from protein solutions. J. Immunol. Methods 105:211 – 220.
Kimber, I., Cumberbatch, M., Dearman, D.R., Headon, D.R., Bhushan, M. ja Griffiths, C.E.M.
2002: Lactoferrin: influences on langerhans cells, epidermal cytokines, and cutaneus inflammation. Biochem. Cell Biol. 80:103 – 107.
Komine, K., Komine, Y., Kuroishi, T., Kobayashi, J., Obara, Y. ja Kumagai, K. 2005: Small molecule lactoferrin with an inflammatory effect but no apparent antibacterial activity in mastitic mammary gland secretion. J. Vet. Med. Sci.67:667 – 677.
Kutila, T. 2004a: Role of lactoferrin in treatment of bovine mastitis. Päivitetty: 12.3.2004 Osoitteessa: http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/ela/kliin/vk/kutila/roleofla.pdf. Viitattu:
25.10.2006.
Kutila, T., Suojala, L., Lehtolainen, T., Saloniemi, H., Kaartinen, L., Tähti, M., Seppälä, K. ja Pyörälä, S. 2004b: The efficacy of bovine lactoferrin in the treatment of cows with experimentally induced Escherichia coli mastitis. J. Vet. Pharmacol. Therap. 27:197 – 202.
Lee, N.Y., Kawai, K., Nakamura, I., Tanaka, T., Kumura, H. ja Shimazaki, K. 2004:
Susceptibilities against bovine lactoferrin with microorganisms isolated from mastitic milk. J. Vet. Med. Sci. 66:1267 – 1279.
Mantere-Alhonen, S. 1994: Maidon koostumus s. 31 – 38 Kirjassa: Utareen sairaudet.
Sandholm, M. ja Kaartinen, L. (toim.) Fagepaino oy, Helsinki.
Mattila, T., 1986: Utareen ja bakteerien välinen tasapaino. s. 43 – 48. Kirjassa: Utareen sairaudet. Sandholm, M. ja Kaartinen, L. (toim.) Fagepaino oy, Helsinki.
Melchior, M.B., Vaarkamp, H. ja Fink-Gremmels, J. 2006: Biofilms: A role in recurrent mastitis infections? Vet. J. 171:398 – 407.
Miedzobrodzki, J., Naidu, A.S., Watts, J.L., Ciborowski, P., Palm, K. ja Wadström, T. 1988:
Effect of milk on fibronectin and collagen type I binging to Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci isolated from bovine mastitis. J. Clin.
Microbiol. 27:540 – 544.
Moore, S.A., Anderson, B.F., Groom, C.R., Haridas, M. ja Baker, N. 1997: Three-dimensional structure of diferric bovine lactoferrin at 2.8 Å resolution. J. Mol. Biol. 274:222 – 237.
Myllys, V. 1995: Staphylococcal mastitis in heifer and dairy cows. Yliopistopaino, Helsinki.
Naidu, A.S., Miedzobrodzki, J., Andersson, M., Nilsson, L-E., Forsgren, A. ja Watts, J.L.
1990: Bovine lactoferrin binding to six species of coagulase-negative Staphylococci isolated from bovine intramammary infections. J. Clin. Microbiol. 28:2312 – 2319.
Naidu, A.S., Andersson, M., Miedzobrodzki, J., Forsgren, A. ja Watts, J.L. 1991: Bovine lactoferrin receptors in Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. J. Dairy Sci. 74:1218 – 1226.
Neilands, J.B. 1984: Siderophores of bacteria and fungi. Microbiol. Sci. 1:9 – 14.
Nevala, M., Taponen, S. ja Pyörälä, S. 2004: Naudan kliinisen utaretulehduksen bakteerietiologia – Saaren ambulatorisen klinikan aineisto vuosilta 2002 – 2003. Suom.Eläinlääkärileh.
110:363 – 369.
Niskanen, A. 1986: Mastiittipatogeenisten bakteerien virulenssitekijät. s. 59 – 63. Kirjassa:
Utareen sairaudet. Sandholm, M. ja Kaartinen, L. (toim.) Fagepaino oy, Helsinki.
Labro, M.T. 2000: Interference of antibacterial agents with phagocyte functions:
immunomodulation or “immuno-fairy tales”? Clin. Microbiol. Rev. 13:615 – 650.
Levay, P.F. ja Viljoen, M. 1995: Lactoferrin: a general review. Haematologica 80:252 – 267.
Oliver, S.P., Lewis, M.J., Gillespie, B.E., Dowlen, H.H., Jaenicke, E.C. ja Roberts, R.K. 2003:
Prepartum antibiotic treatment of heifers: milk production, milk quality and economic benefit. J. Dairy Sci. 86:1187 – 1193.
Ochoa, T.J., Brown, E.L., Guion, C.E., Chen, J.Z., McMahon, R.J. ja Cleary, T.G. 2006:
Effect of lactoferrin on enteroaggregativeE. coli(EAEC). Biochem. Cell Biol. 84:369 – 376.
Pierce, A., Colavizza, D., Benaissa, M., Maes, P., Tartar, A., Montreuil, J. ja Spik, G. 1991:
Molecular cloning and sequence analysis of bovine lactotransferrin. Eur. J. Biochem.
196:177 – 184.
Pitkälä, A., Haveri, M., Pyörälä, S., Myllys, V. ja Honkanen-Buzalski, T. 2004: Bovine mastitis in Finland 2001-Prevalence distribution of bacteria and antimicrobial resistance. J.
Dairy Sci. 87:2433 – 2441.
Pyörälä, S. ja Tiihonen, T. 2005: Utaretulehdus eli mastiitti. Julkaisussa: Nautojen sairaudet.
Päivitetty: 3.11.2006. Osoitteessa:
http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/ela/sarjat/oppimateriaalia/6/18_utaretulehdus_eli_mastiitti.pdf.
Viitattu: 25.6.2007
Raekallio, M. 1986: Utaretulehdusbakteerien alkuperä. s. 39 – 42. Kirjassa: Utareen sairaudet.
Sandholm, M. ja Kaartinen, L. (toim.) Fagepaino oy, Helsinki.
Rautala, H. 1996: Tavoitteena terve karja s. 73 – 101. Suomen kotieläinjalostusosuuskunta, Vantaa
Saloniemi, H. 1986: Tuotantoympäristön merkitys utaresairauksien synnyssä s. 251 – 255.
Kirjassa: Utareen sairaudet. Sandholm, M. ja Kaartinen, L. (toim.) Fagepaino oy, Helsinki.
Sánchez, L., Peiró, J.M., Oria, R., Castillo, J.H., Brock, J.H. ja Calvo, M. 1994: Kinetic parameters for the heat denaturation of bovine lactoferrin in milk and its effect on interaction with monocytes. s. 253 – 257. Kirjassa: Lactoferrin structure and function.
Hutchens, T.W., Rumball, S.V. ja Lönnerdal, B. (toim.) Plenum press, New York.
Sandholm, M. 1986a: Utareen puolustusreaktiot s. 49 – 57. Kirjassa: Utareen sairaudet.
Sandholm, M. ja Kaartinen, L. (toim.) Fagepaino oy, Helsinki.
Sandholm; M. 1986b: Tulehdusvaste utaretulehduksessa s. 65 – 76. Kirjassa: Utareen sairaudet Sandholm, M. ja Kaartinen, L. (toim.) Fagepaino oy, Helsinki.
Sandholm, M. ja Kaartinen L. 1990: Utaretulehduksen vaikutus maidon koostumukseen s.
38 – 47. Kirjassa: Maidon ja maitovalmisteiden mikrobit. Mantere-Alhonen, S. (toim.) Valtion painatuskeskus, Helsinki.
Simojoki, H., Taponen, S. ja Pyörälä, S. 2005: Koagulaasi-negatiivisten stafylokokkien aiheuttama utaretulehdus lehmällä. Suom. Eläinlääkärileh.111: 303 – 306.
Spik, G., Legrand, D., Leveugle, B., Mazuner, J., Mikogami, T., Montreuil, J., Pierce, A. ja Rochard, E. 1994: Characterization of two kinds of lactotransferrin (lactoferrin) receptors on different target. s. 13 – 20. Kirjassa: Lactoferrin structure and function.
Hutchens, T.W., Rumball, S.V. ja Lönnerdal, B. (toim.) Plenum press, New York.
Tamilselvam, B., Almeida, R.A., Dunlap, J.R. ja Oliver, S.P. 2006: Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40:279 – 285.
Taponen, S., Simojoki, H., Haveri, M., Larsen, H.D. ja Pyörälä, S. 2006: Clinical characteristics and persistence of bovine mastitis caused by different species of
coagulase-negative staphylococci identified with API or AFLP. Vet. Microbiol. 115:199 – 207.
Taponen, S., Koort, J., Björkroth, J., Saloniemi, H. ja Pyörälä, S. 2007: Bovine intramammary infections caused by coagulase-negative staphylococci may persist throughout lactation according to amplified fragment length polymorphism based analysis. J. Dairy Sci.
90:3301 – 3307.
Taponen, S. ja Pyörälä, S. How important is coagulase-negative staph as a cause of mastitis.
Julkaisematon.
Thorberg, B.-M., Kühn, I., Aarestrup, F.M., Brändström, B., Jonsson, P. ja Danielsson-Tham, M.-L. 2006: Pheno- and genotyping of Staphylococcus epidermidis isolated from bovine milk and human skin. Vet. Microbiol.115: 163 – 172.
Tirri, R., Lehtonen, J., Lemmetyinen, R., Pihakaski, S. ja Portin, P. 2001: Biologian sanakirja.
Otavan Kirjapaino Oy, Keuruu.
Valenti, P. ja Antonini, G. 2005: Lactoferrin: an important host defence against microbial and viral attack. Cell. Mol. Life Sci. 62:2576 – 2587.
Van Belkum, A., Kools-Sijmons, M. ja Verbrugh, H. 2002:Attachment ofStaphylococcus aureus to eukaryotic cells and experimental pitfalls in staphylococcal adherence assays: a critical appraisal. J. Microbial. Methd. 48:19 – 42.
Van Oostveldt, K., Paape, M.J. ja Burvenich, C. 2002: Apoptosis of bovine neutrophils following diapedesis through a monolayer of endothelial and mammary epithelial cells. J. Dairy Sci.
85:139 – 147.
Varnam, A.H. ja Sutherland J.P. 2001: The microbiology of milk at farm level. s. 33 – 41.
Kirjassa: Milk and milk products, technology, chemistry and microbiology. Aspen publishers inc. Gaithersbury, Maryland.
Waage, S., Mørk, T., Røros, A., Aasland, D., Hunshamar, A. ja Ødegaard, S. A. 1999: Bacteria associated with clinical mastitis in dairy heifers. J. Dairy Sci. 82:712–719.
Watts, J.L., Naidu, A.S. ja Wadström, T. 1990: Collagen binding, elastase production, and slime production associated with coagulase-negative staphylococci isolated from bovine intramammary infections. J. Clin. Microbiol. 28:580 – 583.
Zhang, S. ja Maddox, C.V. 2000: Cytotoxic activity of coagulase-negative Staphylococci in bovine mastitis. Inf. Immun. 68:1102 – 1108.
E 1. KO 4:Kontrolli- ja KNS-kantojen adheesio (ad, PMY/ml), invaasio (in, PMY/ml) ja niiden prosentti-osuudet (ad %, in %) verrattuna eerin lähtöpitoisuuteen. Kannoille on laskettu keskihajonta (SD). taAdSDAd %SDInSDIn %SD 4,80E+063,60E+063,93,24,20E+063,00E+064,04,8 1,30E+055,90E+070,861,52,30E+031,50E+030,0250,057 8,30E+053,60E+050,530,261,10E+058,70E+040,070,06 3,80E+061,20E+061,30,501,60E+061,63E+060,580,62 1,60E+060,601,30E+060,52 1,60E+068,60E+051,00,532,20E+052,20E+050,1400,1300 1,80E+051,10E+050,070,041,10E+041,50E+040,0040,0057 1,50E+068,80E+051,10,844,90E+054,10E+050,0370,3830 1,20E+050,0492,00E+030,001 1,40E+050,071,80E+030,001 3,70E+052,60E+050,150,123,80E+045,50E+040,0160,0250 1,20E+067,40E+050,940,867,30E+058,40E+050,6600,9600 1,30E+069,20E+052,11,91,90E+061,20E+063,9003,1100 2,30E+055,40E+040,091,40E+044,30E+030,0060,0033 5,70E+052,70E+050,230,129,10E+036,80E+030,0040,0029 5,00E+053,40E+050,890,981,00E+041,10E+040,0110,0075 2,90E+052,50E+053,42,90E+032,90E+030,1000,0670 3,10E+059,70E+040,520,221,30E+049,40E+020,0210,0025 6,40E+063,00E+062,21,35,80E+042,30E+040,0200,0100 6,00E+056,50E+050,190,223,40E+034,30E+020,001 1,40E+061,40E+060,890,791,40E+055,30E+040,1000,0100 1,50E+056,70E+040,440,195,00E+044,30E+040,1500,1300 8,20E+051,80E+051,10,549,00E+047,00E+040,1700,1930 1,50E+055,10E+033,62,32,00E+031,00E+030,0580,0580 9,90E+049,20E+040,800,211,10E+031,10E+030,0140,0190 2,40E+052,40E+040,590,346,20E+032,40E+030,0130,00280
aureus 298 epidermidis 808 ogenes74 aureus 228 aureus ATCC 25923 ogenes 37 simulans15 ogenes117 simulans 2 simulans 18 simulans19 ogenes 22 ogenes52 ogenes 72 epidermidis 163 epidermidis221 olyticus94 ogenes312 simulans198 simulans261 ogenes314 ogenes93 ogenes98 olyticus 224 olyticus252 cohniiurealyticus 351
E 2. KO 5:Kontrolli- ja KNS-kantojen monistuminen (mon, PMY/ml) ja monistuskerroin (mk), joka kuvaa invasoituneiden bakteerien äntymistä solunsisäisesti. Kannoille on laskettu keskihajonta (SD). antaMonSDMkSD 7,40E+086,40E+082,80E+045,00E+04 8,20E+022,70E+015,10E+011,30E+01 1,20E+068,60E+01 6,90E+051,70E+04 8,20E+042,20E+02 2,50E+052,40E+02 7,60E+047,50E+01 4,00E+065,10E+064,60E+035,60E+03 3,20E+043,00E+02 7,70E+041,80E+03 1,40E+049,60E+031,90E+028,20E+01 3,50E+054,40E+059,20E+035,90E+03 3,00E+042,50E+042,40E+021,90E+02 5,50E+043,20E+049,10E+012,00E+01 2,20E+046,10E+036,30E+029,90E+01 3,10E+054,00E+042,50E+021,20E+02 5,20E+035,30E+032,40E+013,10E+01 1,20E+041,10E+041,20E+013,00E+00 1,30E+029,00E+00 2,80E+021,30E+01 5,90E+031,60E+02 eus 298 dermidis 808 eus ATCC 25923 omogenes 37 mulans15 omogenes117 mulans19 omogenes 22 omogenes72 dermidis 163 dermidis221 emolyticus94 omogenes312 mulans198 mulans261 omogenes314 omogenes93 omogenes98 emolyticus 224 emolyticus252 ii urealyticus 351
E 3. KO 6:Laktoferriinin (lf) vaikutus (V) suhteellisina prosentteina adheesioon (ad, PMY/ml), invaasioon (in. PMY/ml), monistumiseen (mon, ) ja monistuskertoimeen (mk). Laktoferriinin vaikutus on positiivista, kun bakteeripitoisuus on laskenut ja päinvastoin. KantaAlkupit.AdAd lfVInIn lfVMonMon lfVMkMk lfV 2,0E+082,9E+061,6E+064,021,5E+062,5E+06-3,471,7E+092,2E+09-1,08157175937334,32 8,0E+073,2E+042,9E+041,111,8E+032,0E+03-1,857,9E+021,2E+0228,62421038,40 2,6E+081,5E+061,8E+06-0,971,3E+061,5E+0515,331,1E+061,2E+0516,1786772,48 1,3E+086,5E+057,4E+05-1,034,1E+031,9E+04-18,286,9E+056,5E+0420,791673734839,83 2,7E+083,1E+053,0E+050,183,7E+046,0E+04-4,608,1E+041,0E+05-2,042191714,59 1,5E+081,0E+066,0E+053,751,5E+055,3E+048,962,5E+052,0E+051,67239465-12,15 2,3E+086,5E+054,1E+053,441,0E+051,2E+05-1,207,6E+045,6E+042,6675499,86 1,5E+085,5E+052,2E+056,977,3E+042,0E+0411,513,7E+055,8E+0414,5462128512,11 1,8E+084,3E+053,5E+051,511,1E+052,3E+0413,644,2E+051,9E+055,874352456-28,49 2,9E+082,9E+053,3E+05-1,101,1E+043,2E+04-11,913,2E+042,2E+043,332957125,04 2,7E+083,8E+052,7E+052,674,4E+031,6E+04-15,387,8E+046,2E+042,04178739320,22 1,0E+082,7E+055,0E+05-5,079,5E+031,2E+04-2,512,5E+042,8E+04-1,14113846,27 3,3E+061,1E+058,5E+042,575,0E+034,8E+0227,576,6E+051,1E+0430,4113450233918,40 6,4E+072,5E+051,9E+052,221,3E+048,4E+034,731,3E+041,0E+042,441025911,84 3,3E+084,4E+067,2E+06-3,314,3E+041,1E+05-8,643,2E+047,8E+04-8,4377711,87 3,6E+081,3E+051,7E+05-2,153,7E+035,0E+03-3,642,6E+042,5E+040,687064855,72 1,1E+083,6E+051,6E+056,291,0E+055,4E+0325,403,4E+051,0E+059,403371867-29,42 3,4E+071,9E+052,0E+05-0,381,9E+043,7E+0316,788,9E+031,7E+0317,9746460,00 1,3E+089,5E+051,6E+06-3,684,1E+041,5E+049,334,0E+031,3E+0313,331094,58 7,7E+061,5E+051,3E+051,161,3E+032,0E+0226,281,3E+022,0E+02-9,529100-109,59 5,8E+063,4E+049,3E+04-9,715,1E+025,1E+020,002,8E+021,7E+0150,2013272,98 3,9E+072,3E+051,4E+054,204,8E+031,1E+04-9,635,9E+031,5E+04-11,141601038,68
298 midis 808 ATCC 25923 ogenes 37 mulans15 ogenes117 mulans19 ogenes 22 ogenes52 ogenes72 midis 163 midis221 olyticus94 ogenes312 mulans198 mulans261 ogenes314 ogenes93 ogenes98 olyticus 224 olyticus252 i urealyticus 351