LYHYTAIKAISEN HIILIDIOKSIDILISÄYKSEN VAIKUTUS VEDEN INDIKAATTORIBAKTEERIEN KASVUUN PMEU
SPECTRION™ -LAITTEESSA
Matti Heitto Lyhytaikaisen hiilidioksidilisäyksen vaikutus veden indikaattorimikrobien kasvuun PMEU Spectrion™ -laitteessa
Pro Gradu -tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, Ympäristö- ja biotieteiden laitos Kesäkuu 2019
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristötiede
Matti Heitto: Lyhytaikaisen hiilidioksidilisäyksen vaikutus veden indikaattorimikrobien kasvuun PMEU Spectrion™ -laitteessa
Pro Gradu -tutkielma 52 sivua, 1 liite (1 sivu)
Tutkielman ohjaajat: Anna-Maria Veijalainen ja Elias Hakalehto Kesäkuu 2019
avainsanat: indikaattori, E. coli, PMEU, talousvesi, mikrobien havaitseminen TIIVISTELMÄ
Talousveden puhtauden valvonnan kannalta on tärkeää, että talousveden mikrobiologisia uhkatekijöitä kyetään havaitsemaan mahdollisimman nopeasti. Hiilidioksidin vaikutukset mikrobien kasvuun ja selviytymiseen ovat moninaiset. Osa tutkimuksista osoittaa, että hiilidioksidi on kasvua haittaava tekijä, kun taas osassa todistetaan, että hiilidioksidin lisääminen kasvun aikana voi jopa nopeuttaa mikrobien kasvua. Tässä tutkimuksessa selvitettiin, kuinka lyhyt hiilidioksidilisäys vaikutti veden indikaattorimikrobien, Escherichia colin ja Pseudomonas aeruginosan, sekä Clostridium butyricumin, kasvun alkuun ja eksponentiaalisen kasvun kestoon PMEU Spectrion™ -laitteessa. Tarkoituksena oli kartoittaa, kannattaako Coliline PMEU -laitteeseen kehittää kaasunlisäyssysteemi.
Mikrobeja kasvatettiin PMEU Spectrion™ -laitteessa, ja lyhytaikaisen typpi- hiilidioksidikaasun (55 %/45 %) lisäyksen vaikutuksia tarkkailtiin eri pituisilla lisäysjaksoilla (20 min ja 60 min). Kaasunlisäys aloitettiin joko ajan hetkellä 0 tai 90 minuuttia. PMEU laitteen optiset detektorit tarkkailivat sameuden ja värin muutosta nestefaasissa, joka kertoi mikrobien kasvusta.
Tuloksista nähdään, että E. colin kasvun alku hidastui hiilidioksidikaasunlisäyksen myötä, mutta eksponentiaalisen kasvuvaiheen kesto lyheni, kun kaasua lisättiin 60 minuuttia. P.
aeruginosan kasvun alku oli nopeimmillaan, kun kaasua lisättiin 20 minuuttia, ja hitaimmillaan, kun kaasua lisättiin 60 minuuttia. Eksponentiaalisen kasvun kesto taas oli nopeimmillaan 60 minuutin kaasunlisäyksen kanssa. C. butyricumilla kaasunlisäys nopeutti sekä kasvun alkua että eksponentiaalisen kasvun kestoa.
Saatujen tulosten perusteella voidaan todeta, etteivät hiilidioksidin vaikutukset bakteereissa ole yksiselkoiset. Eri mikrobilajit kykenevät sietämään tai hyödyntämään hiilidioksidia eri lailla.
Tämän lisäksi monet muut seikat voivat vaikuttaa hiilidioksidin vaikutuksiin, esimerkiksi bakteerien kokema ulkoinen stressi liikkeen tai lämpötilan muodossa. Lisää tutkimuksia tarvitaan, jotta hiilidioksidikaasun todellinen vaikutus voitaisiin ymmärtää veden indikaattorimikrobien kasvuun. Saatujen tulosten valossa kaasunlisäyksen kehittämistä Coliline PMEU -laitteeseen ei voida suositella.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Forestry and Science Environmental Sciences
Matti Heitto: Effects of short time CO2 gas addition on the growth of drinking water indicator bacteria in PMEU Spetcrion™ -device
Master’s thesis 52 pages, 1 appendix (1 page)
Supervisors: Anna-Maria Veijalainen and Elias Hakalehto June 2019
keywords: indicator, E. coli, PMEU, drinking water, detection of microbes Abstract
It is important that microbial hazards could be detected from drinking water as soon as possible.
The effects of carbon dioxide on growth and survival of different microbes are evident but variable. Some researches prove that carbon dioxide inhibits growth whereas in other studies it has been demonstrated that the addition of carbon dioxide has enhanced the growth. In this study, the effects of short time carbon dioxide addition on the beginning of growth and the duration of exponential growth were tested with Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Clostridium butyricum in the PMEU Spectrion™ -device. The goal was to examine the benefits of modifying Coliline PMEU -device with built-in gas addition system.
Microbes cultivated in the PMEU Spectrion™ -device were exposed to different lengths (20 min and 60 min) of nitrogen - carbon dioxide (55 %/45 %) gas mixture. This gas addition was started at either 0 minutes or 90 minutes from the onset of the experiment. Optical detectors in the PMEU Spectrion™ measured the turbidity and color of samples which indicated the growth of bacteria.
Prolonged growth initiation was measured with facultative E. coli with the addition of the nitrogen-carbon dioxide gas, but the duration of the exponential growth phase was shortened when 60 minutes of gas addition was used. Aerobic P. aeruginosa grew the fastest when gas addition was 20 minutes long and slowest when this addition lasted for 60 minutes. The length of exponential growth was the shortest with 60 minutes of gas addition. Gas addition accelerated both the beginning of growth and the duration of exponential growth in the strictly anaerobic C. butyricum.
Different microbes can tolerate carbon dioxide in differently. External circumstances can also affect the endurance of microbes to carbon dioxide. For example, stirring or temperature conditions can modify microbial responses. More research is needed in order to understand all these processes and dependencies. Modifications of the Coliline PMEU -device cannot be recommended based on the current results only.
ESIPUHE
Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli selvittää, kuinka tavalliset veden indikaattorimikrobit reagoivat lyhytaikaiseen hiilidioksidikaasun lisäykseen kasvun alkuvaiheessa. Työssä selvitettiin kannattaako Finnoflag Oy:n kehittämään Coliline PMEU -laitteeseen rakentaa kaasunlisäyssysteemi nopeuttamaan veden indikaattorimikrobien havaitsemista. Työn kokeellinen osio suoritettiin Finnoflag Oy:n laboratoriossa Siilinjärven Innocumissa osoitteessa Isoharjantie 6 kesällä ja alkusyksystä 2018. Kirjallinen työ tehtiin kevään ja alkukesän 2019 aikana. Kiitoksia ohjaajille Anna-Maria Veijalaiselle ja Elias Hakalehdolle työn valvomisesta ja auttamisesta kaikissa työnvaiheessa, opinnäytetyön tarkastajalla Eila Torviselle sekä Finnoflag Oy:n laboratoriopäällikkö Anneli Heitolle varsinaisen laitteiston ja laboratorion käytön ohjeistuksesta ja avusta.
SISÄLLYSLUETTELO
ESIPUHE
1. JOHDANTO 7
2. KIRJALLISUUSKATSAUS 8
2.1. TALOUSVESI 8
2.1.1. Talousveden määritelmä ja lähteet 8
2.1.2. Talousveden mekaaninen ja kemiallinen puhdistaminen 9 2.1.3. Talousveden mikrobiologinen puhdistaminen 10 2.1.4. Talousveden mikrobiologiset laatuvaatimukset
ja -suositukset 13
2.1.5. Mikrobien tunnistusmenetelmät vedessä 14
2.2. VEDEN INDIKAATTORIBAKTEERIT 15
2.2.1. Indikaattoribakteerien käyttö ja merkitys 15
2.2.2. Indikaattoribakteerit 17
2.3. PMEU 21
2.3.1. PMEU Spectrion™ 21
2.3.2. Muut PMEU -laitteet 23
2.3.3. Colilert® 24
2.4. KAASUJEN VAIKUTUS BAKTEERIEN KASVUUN 26
2.4.1. Happi 26
2.4.2. Hiilidioksidi 28
3. TYÖN TAVOITTEET 31
4. AINEISTO JA MENETELMÄT 32
4.1. BAKTEERIT 32
4.2. KOEAJOT 32
4.3. TULOSTEN KÄSITTELY 34
5. TULOKSET 35
5.1. ESCHERICHIA COLI 35
5.2. PSEUDOMONAS AERUGINOSA 40
5.3. CLOSTRIDIUM BUTYRICUM 42
6. TULOSTEN TARKASTELU 42
7. YHTEENVETO 46
LÄHDELUETTELO
LIITTEET
LIITE 1 KASVATUSALUSTAT
1. JOHDANTO
”Vesi on elämää”, julisti Yhdistyneiden kansakuntien pääsihteeri Ban Ki-moon kansainvälisen Vesipäivän puheessaan vuonna 2013. Vesi on todella elämän lähtökohta maapallolla. Ihmisestä suuri osa on vettä, ja solumme tarvitsevat sitä toimiakseen. Yhdistyneet kansakunnat on julistanut puhtaan juomaveden olevan jokaisen ihmisen perusoikeus, mutta siltikin Maailman terveysjärjestö (WHO) on todennut, että maailman laajuisesti vain 71 % ihmisistä saa jokapäiväiseen käyttöönsä puhdasta juomavettä, ja 884 miljoonaa ihmistä elää ilman minkäänlaista juomaveden käsittelyä.
Saastunut juoma- ja käyttövesi on yksi suurimmista uhista ihmisten terveydelle ja hyvinvoinnille. Vuosittain noin 2,2 miljoonaa ihmistä kuolee saastuneesta vedestä peräisin oleviin mikrobiperäisiin tauteihin, suurimmaksi osaksi ripuliin, joka on vaarallista erityisesti lapsille köyhemmissä ja kehittyvissä maissa. Mikrobit päätyvät useimmiten talousveteen ulosteperäisen saastumisen takia, ja ilman talousveden puhdistusta nämä mikrobit pääsevät ihmisten suolistoon aiheuttaen moninaisia terveysuhkia.
Nämä terveysuhkat eivät kuitenkaan rajoitu pelkästään kehittyviin maihin. Terveyden- ja hyvinvoinninlaitos tarkkailee Suomessa talousvesiepidemioita. Vuosien 1998 ja 2017 välillä Suomessa on todettu yli sata mikrobiperäistä talousvesiepidemiaa. Vaikka nämä tapaukset ovatkin olleet pieniä ja koskeneet vain hyvin paikallisia populaatioita, ei silti voida vähätellä mikrobien aiheuttamaa terveysuhkaa talousveden käyttäjille. Suomessa talousveden puhtauden tarkkailu on tiukkaa, ja kaikkiin häiriötilanteisiin puututaan mahdollisimman nopeasti. Siltikin on tärkeää kehittää metodeja, jotta kaikki vaaratilanteet voidaan tunnistaa mahdollisimman nopeasti, ja korjaavat toimenpiteet voidaan suorittaa ennen kuin saastunut vesi pääsee aiheuttamaan terveyshaittoja.
Uudenlaisia metodeja mikrobien nopeaan havainnointiin ja tunnistamiseen kehitetään kaiken aikaa. Yksi vaihtoehto tähän on Finnoflag Oy:n kehittämä portable microbe enrichment unit (PMEU). PMEU-tekniikka pyrkii mikrobien nopeaan ja tarkkaan tunnistamiseen paikan päällä ilman monimutkaisia ja suuria laitteistoja tai reaktioita.
Tämän Pro Gradu -tutkielman tarkoituksena oli selvittää, nopeuttaako kasvatuksen alkuvaiheessa lisätty lyhyt hiilidioksidikaasulisäys mikrobien kasvua PMEU-Spectrion™ - laitteessa. Tutkimuksen taustalla on ajatus PMEU-laiteperheen muiden laitteiden kehittämisestä kaasunlisäykselle sopiviksi, mikäli kaasunlisäyksen todetaan nopeuttavan kasvun havainnointia.
2. KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1. TALOUSVESI
2.1.1. Talousveden määritelmä ja lähteet
Talousvesi on vettä, joka on tarkoitettu kotitalouksien yleiseen veden käyttöön, juomiseen, peseytymiseen ja ruuanlaittoon. Talousvedeksi luokitellaan myös vesi, jota käytetään elintarvikkeiden käsittelyyn tai valmistamiseen teollisuuslaitoksissa. Talousveden puhtaudesta huolehtii vedenpuhdistuslaitos, joita on Suomessa noin 1500 kappaletta. Suomessa talousveden puhtautta on määritelty Sosiaali- ja terveysministeriön asetuksissa 401/2001 ja 1352/2015.
Vuoden 2001 asetus koskee pieniä talousveden puhdistamoja, ja vuoden 2015 päivitetty asetus koskee suurempia laitoksia. Pienen talousvesilaitoksen määritelmänä toimii se, että se toimittaa vettä päivittäin enintään 50 henkilölle.
Talousvettä valmistetaan luonnon vesilähteistä, kuten pinta- ja pohjavedestä, poistamalla siitä terveydelle vaaralliset tai haitalliset ainekset. Suomessa käytettävistä vesivaroista 75 % on pohjavettä tai tekopohjavettä, ja loput pintavettä. Useassa vesilaitoksella voidaan myös käyttää molempia, sekä pohja- että pintavettä. Talousvedelle tehtävät puhdistustoimenpiteet vaihtelevat riippuen lähteestä. (Katko ym. 2006).
Pohjavesi muodostuu, kun vesi valuu maakerrostumien läpi maan alle. Maakerrokset suodattavat vedestä epäpuhtauksia, ja näin ollen pohjavesi on lähtökohtaisesti sellaisenaan käyttökelpoista talousvetenä. Pohjavesi voi kuitenkin saastua esimerkiksi teollisuuden tai raskaan maanviljelyn tai metsänhakkuun seurauksena (Kløvel ym. 2017). Pohjavettä syntyy sopivilla alueilla luonnollisesti, tai sitä voidaan myös tehdä tarkoituksenmukaisesti.
Tekopohjavettä valmistetaan niin, että pintavesilähteestä kerätään vettä, joka imeytetään maaperään allasimeytyksen, rantaimeytyksen tai sadetuksen avulla. (Katko yms. 2006).
Useimmiten pohjavettä puhdistetaan kevyesti tai ei ollenkaan (Gerba ja Pepper 2015).
Tavallisin pohjaveden puhdistusmenetelmä on UV-desinfiointi tai klooraus. Näillä menetelmillä pyritään takaamaan veden mikrobiologinen laatu. Lähtökohtaisesti pohjavesi on puhdasta. (Kløve1 yms. 2017).
Pintavesi on luonnostaan likaisempaa kuin pohjavesi, sillä se ei ole kulkeutunut samojen luonnollisten puhdistusmenetelmien läpi. Näinpä pintaveden käyttäminen talousvedeksi vaatii enemmän puhdistusvaiheita. Pintavedestä pitää poistaa suuret roskat, orgaaniset ja epäorgaaniset epäpuhtaudet sekä biologiset uhkatekijät, kuten alkueläimet, bakteerit ja virukset.
2.1.2. Talousveden mekaaninen ja kemiallinen puhdistaminen
Suuret roskat, esimerkiksi oksat tai ihmisten aiheuttamat muovijätteet poistetaan vedenkäsittelyn alussa välppäämällä. Välppäyksessä iso ratas kerää suuret epäpuhtaudet pois vedestä, jotteivat ne pääse aiheuttamaan ongelmia vedenpuhdistuksen seuraavilla vaiheille.
Toinen laajasti käytettävä vaihtoehto on siivilöinti, jossa vesi ohjataan siivilän läpi, joka kerää suuret roskat pois vedestä.
Veden epäorgaanisia ja orgaanisia epäpuhtauksia voidaan puhdistaa monella tavalla.
Tavallisimmat epäorgaaniset epäpuhtaudet ovat metalleja kuten mangaani, ja tehokas tapa näiden poistoon on hapettaminen, jolloin metallit sakkautuvat vesimassan pohjalle, ja ne voidaan kerätä pois. Tämä hapetus voidaan tehdä ilmalla tai hapetuskemikaalilla. Hapetus voidaan tehdä jo ennen kuin vesi päätyy talousvesilaitokselle, tai sitten se voidaan tehdä talousvesilaitoksella hyvin varhaisessa vaiheessa. Epäorgaaniset epäpuhtaudet voivat häiritä muita vedenpuhdistuksen vaiheita.
Orgaaninen aines on usein pieninä hiukkasina veden seassa. Orgaanisen aineksen poistamiseksi nämä pienet hiukkaset kootaan isommiksi partikkeleiksi. Tätä työvaihetta talousveden puhdistamisesta kutsutaan koagulaatioksi. Koagulaatiossa veteen lisätään kemikaaleja, esimerkiksi rautahydroksidia, jotka neutraloivat orgaanisen aineksen luontaisia negatiivisia
varauksia. Näin orgaaninen aines ei enää hyli itseään, ja hiukkaset kykenevät muodostamaan sidoksia keskenään. Hiukkasten tarttumista toisiinsa edistetään hitaalla sekoittamisella.
Koagulaation jälkeen kasvaneet orgaaniset hiukkaset poistetaan vedestä. Tätä vedenpuhdistuksen vaihetta kutsutaan selkeytykseksi. Selkeytykseen käytetään yleensä joko hiekkasuodatusta tai flotaatiota. Hiekkasuodatuksessa vesimassa ohjataan useiden eri hiekkakerrosten läpi, ja orgaaniset epäpuhtaudet tarttuvat kerroksiin samalla tavalla, kuin luonnossa pohjaveden kulkeutuessa eri maakerrosten läpi. Flotaatiossa taas puhdistettavan veden sekaan johdetaan paineistettua vettä, joka suurempaan säiliöön saapuessaan vapauttaa liuennutta ilmaa mikroskooppisen pieninä ilmakuplina. Nämä ilmakuplat kulkeutuvat vesimassan läpi tarttuen veden seassa oleviin orgaanisiin epäpuhtauksiin kuljettaen ne vesimassan pinnalle. Pinnalta epäpuhtaudet kerätään pois.
2.1.3. Talousveden mikrobiologinen puhdistaminen
Viimeisenä vaiheena talousveden puhdistuksessa on mikrobiologinen puhdistaminen, eli desinfiointi. Desinfioinnin tarkoituksena on poistaa vedestä mikrobiologiset epäpuhtaudet, jotka ihmiskehoon joutuessaan voivat aiheuttaa sairauksia tai jopa kuolemantapauksia.
Talousvesi ei ole ihanteellinen kasvupaikka monille patogeenisille mikrobeille, jotka ovat tottuneet elämään lämminveristen kehossa, mutta monet bakteerit kykenevät selviytymään myös vähemmän optimaalisissa olosuhteissa. (AWWA 2009).
Desinfiointia tarvitaan, koska jotkin bakteerit kykenevät selviytymään puhtaassakin talousvedessä. Cookin ja Bolsterin (2006) tutkimuksessa E. coli säilyi parhaiten vedessä, jossa oli korkea typpipitoisuus, ja matala liuenneen orgaanisen hiilen määrä. Kyseinen vesi oli typpipitoisuuksiltaan Sosiaali- ja terveysministeriön talousvedelle määräämien raja-arvojen sisällä (STM 1352/2015). Ainakin typen puolesta E. colin on siis mahdollista selvitä talousvedessä. Samassa tutkimuksessa havaittiin myös E. colin yllättävän hyvä kyky säilyä tislatussa vedessä, vaikkei artikkelissa kyettykään selittämään, mistä tämä johtuu. E. colin läsnäolo talousvedessä indikoi yleensä veden suolistoperäistä saastumista. Joillakin patogeenisilla bakteereilla voi myös olla kyky muodostaa itiöitä, joiden avulla bakteerit kykenevät selviytymään pitkiäkin aikoja epäotollisissa olosuhteissa. Hyvä esimerkki itiöitä muodostavasta patogeenisestä bakteerista, jota saattaa ilmentyä talousvedessä ovat Clostridium perfringens ja muut Clostridium-suvun bakteerit (Stanier ym. 1980c, STM 1352/2015).
Suomessa kaikilla vesilaitoksilla on oltava valmius desinfiointiin, vaikkei veden laatu sitä vaatisikaan. Jokaisen talousvettä toimittavan laitoksen on kyettävä desinfiointitoimiin kuuden tunnin sisällä siitä, kun huomautus asiasta tulee (STM 1352/2015). Tämä koskee myös pienempiä vesiosuuskuntia. Suurimmalla osalla talousvesilaitoksista desinfiointi on kuitenkin jatkuvatoiminen prosessi, ja vain joillain pohjavesilaitoksilla jatkuva desinfiointi ei ole tarpeellista.
Mikrobien poistamiseen voidaan käyttää useita eri keinoja. Osa mikrobeista poistuu vedestä jo muiden epäpuhtauksien puhdistamiseen tarkoitettujen alkuvaiheiden aikana. Usein käytetyt koagulaatio, flotaatio ja laskeutus poistavat osan veden mikrobeista. Ennen varsinaista desinfiointia olevista vedenpuhdistuksen vaiheista tehokkain mikrobiologinen puhdistaja on hiekkasuodatus. (Gerba 2015c).
Varsinaiseen veden desinfiointiin käytetään useampia metodeja. Yleisimmin käytetyt metodit ovat kemiallinen desinfiointi ja ultraviolettivalolla tehtävä desinfiointi. Näitä metodeja voidaan käyttää erikseen, mutta paras puhdistustulos saadaan käyttämällä niitä molempia yhdessä.
Muita käytettyjä metodeja on muun muassa veden kuumentaminen ja veden seisottaminen, mutta nämä ovat kalliimpia ja vaikeammin toteutettavissa olevia metodeja, joita ei voida käyttää suuren mittakaavan talousveden puhdistuksessa.
Kemiallinen desinfiointi
Kemiallinen desinfiointi perustuu kemikaalien kykyyn hapettaa bakteereja. Hapettavat kemikaalit vahingoittavat solujen metabolisia entsyymejä ja proteiinisynteesireittejä. Useita erilaisia kemikaaleja voidaan käyttää veden desinfiointiin. Yleisimmin käytettyjä desinfiointikemikaaleja ovat klooripohjaiset yhdisteet, kuten klooriamiinit ja klooridioksidi, ja kaikkein eniten käytetty kemikaali on hypokloriitti. Kemiallisen desinfioinnin erityinen vahvuus on se, että kemikaalit kulkeutuvat veden mukana vedenpuhdistuslaitokselta myös vedenjakeluverkostoon. Näin ollen kemikaalien desinfioiva vaikutus ei rajoitu pelkästään siihen hetkeen, jolloin kemikaali lisätään. Tällä pitkäkestoisella vaikutuksella on suuri merkitys esimerkiksi putkistoihin kertyvien biofilmien aiheuttamien terveysuhkien pienentämisessä.
(AWWA 2009, Gerba 2015c).
Desinfiointiin käytettävät kemikaalit reagoivat vahvoina hapettajina mikrobien lisäksi myös muiden vedessä olevien aineiden ja yhdisteiden kanssa. Tätä hapetusreaktiota voidaan käyttää hyödyksi veden puhdistuksen muissa vaiheissa. Esimerkiksi monet klooriyhdisteet poistavat tehokkaasti vedestä ei-toivottuja makuja tai hajuja. Ne myös saostavat rautaa ja mangaania, joiden pitoisuudet voivat helposti olla raakavedessä liian suuria. Toisaalta desinfiointikemikaalit reagoivat myös vedessä olevan orgaanisen aineksen kanssa muodostaen desinfioinnin sivutuotteiksi kutsuttuja yhdisteitä. Nämä yhdisteet ovat kloorijohdannaisia orgaanisia yhdisteitä, joista hyvänä esimerkkinä toimii trihalometaani. Nämä aineet ovat haitallisia ihmisen terveydelle, ja useat niistä on määritelty karsinogeeneiksi. (AWWA 2009).
Näiden sivutuotteiden takia orgaanista ainesta sisältävän pintaveden mikrobiologinen puhdistus on mietittävä kemiallista desinfiointia käytettäessä. Paras desinfiointi tulos saavutetaan silloin, kun muut veden epäpuhtaudet on jo poistettu siinä vaiheessa, kun desinfiointikemikaalia lisätään (Gerba 2015c).
Uv-desinfiointi
Ultravioletti-desinfioinnissa puhdistettavaan veteen johdetaan UV-C-säteilyä, joka on aallonpituudeltaan 100 – 280 nm. UV-valon mukanaan kuljettama energia imeytyy mikrobien geneettiseen materiaaliin, kuten DNA:han tai RNA:han vahingoittaen tymiinejä, jotka ovat elintärkeitä bakteerien selviytymisen ja lisääntymisen kannalta (Gerba 2015c). Näin ollen mikrobit muuttuvat toimintakyvyttömiksi ja vaarattomiksi. UV-säteily on nopea tapa tehdä mikrobeja toimintakyvyttömiksi. (AWWA 2009).
UV-desinfiointiin liittyy myös heikkouksia. UV-valo vaikuttaa mikrobeihin vain siinä käsittelynvaiheessa, jossa säteily tunkeutuu soluihin. UV-valolla ei siis ole minkäänlaista desinfioivaa vaikutusta enää verkostossa, toisin kuin kemiallisella desinfioinnilla. Käytettävän UV-annostuksen määrää on myös vaikeampi arvioida kuin kemiallisessa desinfioinnissa. Tämä johtuu siitä, että vedessä olevat muut yhdisteet, sekä käytettävä laitteisto vaikuttavat suuresti UV-annoksen määrään. UV-desinfiointiin käytettävät laitteet ovat myös suhteellisen kalliita (Gerba 2015c).
On myös tärkeää, että UV-valolla desinfioitava vesi on jo muuten puhdistettua. Monet veteen liuenneet aineet ja epäpuhtaudet voivat vaikuttaa negatiivisesti UV-desinfioinnin tehoon. Paras desinfiointitulos saavutetaan, kun UV-valo pääsee kulkeutumaan koko vesimassan läpi
tasaisesti. Mikäli epäpuhtaudet aiheuttavat väriä tai veden samenemista, heikkenee puhdistusteho. Hyvä esimerkki UV-desinfiointia haittaavista epäpuhtauksista on orgaaninen materiaali. Myös veden sameus, kovuus ja mineraalipitoisuus voivat heikentää UV-valolähteen toimintaa. (AWWA 2009).
Nykyisin käytössä on useita erilaisia tekniikoita, joilla UV-desinfiointia tehdään. Näistä hyvinä esimerkkeinä toimivat matalapaineiset jatkuva-aaltoiset kaarilamput, keskipaineiset jatkuva- aaltoiset kaarilamput ja sykkivä mustarunkoinen ultravioletti. Kussakin tavassa on hiukan erilainen valon spektri, ja kukin toimii omalla tavallaan eri mikrobeihin. Matalapaineiset lamput lähettävät tasaisesti säteilynä aallonpituudella 253,7 nm, joka tuhoaa tehokkaasti solujen DNA:ta ja RNA:ta. Keskipaineisilla ja sykkivillä lampuilla aallonpituus vaihtelee, ja ne voivat vaikuttaa myös solujen muihin rakenteisiin. Matalapaineiset lamput ovat pitkäikäisempiä, tutkitumpia ja energiatehokkaampia muihin lamppuihin verrattuna, mutta muilla lampuilla UV- valon yksittäiset annostukset voivat olla pienempiä, ja laajempi spektri takaa laajempialaisen bakteerien tuhoamisen. (AWWA 2009, Gerba 2015c). Kaikki näistä menetelmistä käyttävät hyväkseen elohopealamppuja.
Elohopealamppujen lisäksi nykyään on käytössä myös UV-LED-valaisimia, joita käytetään UV-desinfioinnissa. LED-tekniikka on monissa suhteissa parempi kuin perinteiset elohopea lamput. LED-valaisimet käyttävät huomattavasti vähemmän energiaa elohopealamppuihin verrattuna, eikä niiden käytössä synny vaarallisia elohopeapohjaisia ongelmajätteitä. Tämän lisäksi LED-valaisimet syttyvät välittömästi ilman viivettä toisin kuin elohopealamput, ja niiden elinikä on pitkä. UV-LED-valaisimet lähettävät UV-säteilyä aallonpituudella 265 nm – 405 nm. (Crawford ym. 2005).
2.1.4. Talousveden mikrobiologiset laatuvaatimukset ja -suositukset
Talousvedelle on asetettu tiettyjä mikrobiologisia laatuvaatimuksia, jotka veden tulen täyttää, jotta sitä saa käyttää ja myydä talousvetenä (Valvira 2018). Maailman terveysjärjestö World Health Organization (WHO) määrittelee talousveden mikrobiologisen puhtauden määritelmäksi sen, ettei 100 ml näytteistä löydy yhtään E. colia (WHO 2017). Suomessa käytössä on Sosiaali- ja terveysministeriön asetukset (1352/2015 ja 401/2001), joiden mukaan talousveden vaatimukset ovat E. colille ja enterokokeille 0 pmy/100 ml. Nämä asetukset on laadittu Euroopan Unionin direktiivin 98/83/EY pohjalta. Tämän lisäksi Suomessa on asetettu
talousveden laatusuositukset, joihin vedenpuhdistamoiden tulee pyrkiä. Mikäli laatusuositukset ylittyvät, on vesilaitoksen ryhdyttävä muokkaaviin toimenpiteisiin. Nämä laatusuositukset koskevat koliformisia bakteereja ja Clostridium perfringensejä. Laatusuosituksen näitä mikrobeja tulee olla 0 pmy/100 ml, joka koskee myös Clostridiumin itiöitä. (STM 1352/2015).
Kokonaispesäkkeiden lukuarvossa ei saa myöskään olla epätavallisia muutoksia. Talousvetenä käytettävälle kaivovedelle on asetettu tämän lisäksi omat raja-arvonsa, joka on koliformeille
<100 pmy/ 100 ml (STM 401/2001).
Pullotetulle vedelle on myös asetettu omat laatuvaatimuksensa, jotka eroavat hiukan talousveden vaatimuksista. Pullotetun veden vaatimuksissa huomioon otetaan useampia mikrobeja. STM:n asetuksen (1352/2015) mukaan 250 ml näytteessä pullotettua vettä ei saa olla yhtään E. colia, P. aeruginosaa, eikä enterokokkeja. Tämän lisäksi bakteerien kokonaispesäkemäärä saa enintään olla 100 pmy/ml +22 oC.ssa ja 20 pmy/ml +37 oC:ssa.
Näiden laatuvaatimusten lisäksi pullotetulle vedelle on myös voimassa laatusuositus, jonka mukaan koliformisia bakteereja ei tulisi olla lainkaan 250 ml näytteessä.
Yhdysvalloissa talousveden mikrobiologiset laatuvaatimukset ovat hiukan erilaisia kuin Suomessa. Yhdysvaltojen ympäristönsuojeluvirasto (Environmental Protection Agency -EPA) määrittelemissä standardeissa muun muassa E. colia ei ole eroteltu lainkaan, vaan selvitettävänä bakteereina riittää koliformisten bakteerien kokonaislukumäärä. EPA:n standardien mukaan koliformisia bakteereja saa ilmaantua kuukauden sisällä tehtyjen mittausten aikana enintään 5
% näytteitä, ja kaikki nämä näytteet on tarkastettava mahdollisten suolistoperäisten koliformien varalta, joita ei saa ilmaantua laisinkaan. Muita EPA:n vaatimia tarkkailtavia mikrobeja ovat Cryptosporidium, Giardia lamblia, Legionella sekä heterotrofisten bakteerien kokonaislukumäärä. Cryptosporidiumin kanssa saavutettava puhdistusteho on oltava 99 % ja Giardian kanssa 99,99 %. EPA:n ohjeiden mukaan, mikäli nämä saavutetaan, niin myös Legionellan puhdistusteho on riittävän hyvä. Heterotrofisia bakteeripesäkkeitä ei saa ilmaantua millilitran näytteessä yli 500. (EPA 2018).
2.1.5. Mikrobien tunnistusmenetelmät vedessä
Bakteerien määrittämiseen talousvedestä on määrätty standardien mukaiset menetelmät Sosiaali- ja terveysministeriön asetuksessa (1352/2015). Nämä standardit ovat kansainvälisen standardointiyhdistyksen (ISO) laatimia. Kansainvälisesti yleisin käytetty metodi mikrobien
laskemiseen talousvedestä on MPN (most propable number) -menetelmä. MPN-menetelmää käytetään standardeissa E. colin (ISO 9308-2:2012), P. aeruginosan (ISO 16266-2:2018) ja enterokokkien (ISO 7899-1:1998) määrittämiseen vesinäytteistä. MPN-menetelmä perustuu bakteerien kasvattamiseen kullekin lajille ominaisella nestemäisellä kasvatusalustalla useissa eri laimennoksissa ja useina rinnakkaisina. Kasvatuksen jälkeen jokaisesta laimennoksesta määritetään, onko kasvua tapahtunut vai ei, ja saatuja tuloksia verrataan olemassa oleviin MPN- referenssitaulukoihin, joiden avulla saadaan selville kuinka paljon alkuperäisessä näytteessä oli bakteereja. MPN-menetelmä on hyvä esimerkiksi, kun yritetään selvittää tiettyjen bakteeripopulaatioiden selviytymistä tietynlaisissa kasvuympäristöissä. MPN-menetelmä on kuitenkin isotöinen ja usein epätarkempi kuin esimerkiksi suorat maljaviljelyt vastaavista näytteistä. (Pepper ja Gerba 2015).
Toinen laajassa käytössä oleva standardimenetelmä mikrobien havaitsemiseen vesinäytteissä on kalvosuodatusmenetelmä. Kalvosuodatusta voidaan käyttää, E. colin ja koliformisten bakteerien (ISO 9308-1:2014), suolistoperäisten enterokokkien (ISO 7899-2:2000) sekä C.
perfringensin (ISO 14189:2013) havaitsemiseen vesinäytteistä. Kalvosuodatuksessa 100 ml näyte johdetaan hyvin pienireikäisen (0,45 µm) suodatinkalvon läpi. Kalvo on niin pieni, että bakteerit eivät kykene läpäisemään sitä. Suodatuksen jälkeen kalvo siirretään tutkittavalle bakteerilajille erityisesti sopivalle kasvatusalustalle ja inkuboidaan. Inkubointi aika riippuu tutkittavasta bakteerilajista. E. coli ja muut koliformiset bakteerit inkuboidaan 36 ± 1 oC lämpötilassa 24 ± 3 tuntia, enterokokit inkuboidaan 36 ± 1 oC lämpötilassa 44 ± 3 tuntia, ja C.
perfringens inkuboidaan 44 ± 1 oC lämpötilassa anaerobisissa olosuhteissa 24 ± 3 tuntia.
Inkuboinnin jälkeen maljoilla kasvaneet pesäkkeet tunnistetaan, lasketaan, ja varmistetaan jatkokokeilla. Tulokset kerrotaan aina näytetilavuutta kohden.
2.2. VEDEN INDIKAATTORIBAKTEERIT
2.2.1. Indikaattoribakteerien käyttö ja merkitys
Kaikki bakteerit ovat erilaisia, ja jokainen niistä vaati tietynkaltaiset olosuhteet voidakseen kasvaa. Tämä vaikeuttaa tiettyjen, esimerkiksi patogeenisten bakteerien löytämistä ympäristönäytteistä ja niiden kasvattamista. Tämän lisäksi patogeeneja voi olla näytteessä vain hyvin pieni pitoisuus, joka ei välttämättä näy tutkimuksissa, mutta silti ne voivat kulkeutua ympäristön kautta ihmisiin esimerkiksi veden mukana ja olla haitallisia ihmisten terveydelle.
Patogeenisten mikrobien analysointi on myös vaikea, kallista ja hidasta. Näiden haasteiden takia esimerkiksi talousveden ulosteperäisen saastumisen tutkimuksissa käytetään usein indikaattoribakteereja. (Gerba 2015b). Joissain tilanteissa patogeenejakin voidaan käyttää indikaattoreina. Noble ym. (2003) todistivat tutkimuksessaan, että indikaattoribakteerien tutkimisen yhdistäminen patogeenien tutkimiseen täydensi saatuja tuloksia. Molempien metodien käyttämisellä kyettiin entistä varmemmin todentamaan, että kyseessä ollut saastuminen oli todella ihmisten ulosteista peräisin, eikä jostain muusta ympäristölähteestä.
Tämä tieto on hyödyllistä, kun yritetään määrittää saastumisen aiheuttajia esimerkiksi vesilaitoksella.
Indikaattoribakteerit ovat bakteerilajeja, joiden avulla pystytään päättelemään samasta lähteestä peräisin olevien, harvinaisempien ja patogeenisten bakteerien, läsnäoloa. Talousveden ulosteperäisen saastumisen indikoimiseen sopivilta bakteereilta vaaditaan seuraavanlaisia ominaisuuksia: (Gerba 2015b, Payment ym. 2003, Yost ym. 2011)
1) Indikaattorien tulee kyetä kasvamaan samanlaisissa olosuhteissa kuin patogeenit
2) Indikaattorien tulisi selvitä huomattavasti pidempään ympäristössä, kuin patogeenien
3) Indikaattoribakteerin tulee ilmaantua luonnostaan samoissa ympäristöissä kuin indikoitavat patogeenitkin
4) Indikaattorit eivät saa lisääntyä kohdeympäristössä luonnostaan
5) Indikaattorien havainnointi tulee olla kohtuullisen helppoa ja halpaa
Indikaattorien avulla kyetään siis ulosteperäisen saastumisen lisäksi tutkimaan patogeenien säilymistä ja kulkeutumista ympäristössä turvallisemmin kuin suoraan patogeeneilla. Yleisesti käytettyjä indikaattoribakteereja suolistoperäiselle saastumiselle ovat muun muassa Escherichia coli (Yates 2007) ja Pseudomonas aeruginosa (Renkonen 1996) joita ilmenee ihmisten ja tasalämpöisten eläinten suolistoissa, ja näin ollen ne ovat hyviä indikaattoreja suolistoperäiseen kontaminaatioon. Myös enterokokit ja Clostridium perfringens ovat vedenpuhtaudessa käytettyjä indikaattoribakteereja, joita muun muassa Sosiaali- ja
terveysministeriö vaatii tarkkailemaan vesihuollossa (STM 1352/2015). Myös bakteerien virukset, bakteriofagit, ovat yleisesti käytettyjä indikaattoreja.
Indikaattorien käytössä on myös omat haasteensa ja vaikeutensa. Indikaattorilaji ei koskaan ole itse tutkittava patogeeni, eli vaikka lajit olisivatkin toiminnallisesti hyvin lähellä toisiaan, voi olla joitain tekijöitä, jotka kuitenkin toimivat eri tavalla lajien välillä. Sen lisäksi indikaattoreita käytettäessä on oltava tarkkana, että käyttää oikeita indikaattoreita oikeita patogeeneja varten.
Esimerkiksi useimmin käytössä oleva veden indikaattoribakteeri, E. coli, toimii indikaattorina vain suolistoperäisille mikrobeille, mutta ei luonnostaan vedessä ilmaantuvilla bakteereille, kuten esimerkiksi Legionellalle. Kaikille patogeeneille ei ole myöskään vielä löydetty sopivia indikaattoreita, joten näille lajeille ei voi käyttää indikaattorimenetelmää ollenkaan. (Yates 2007). Indikaattorit ovat siis hyviä työkaluja bakteerien tutkimiseen ympäristössä, mutta niiden käytössä on osattava oltava tarkkana, jotta tulokset ovat totuudellisia (Gerba 2015b).
2.2.2. Indikaattoribakteerit
Escherichia coli
Escherichia coli on noin 2 µm pitkä sauvamainen gram-negatiivinen Enterobacteria-heimoon kuuluva bakteeri, joka ei muodosta itiöitä. Useimmilla kannoilla on liikkumisen mahdollistavia flagelloja. Useilla E. coleilla on ulkokuorellaan helposti tunnistettava polysakkaridikalvo.
(Vaara ym. 1996). E. coli on hyvin yleinen ihmisten ja eläinten suolistoissa, ja tämän takia se sopii hyvin käyttöön veden indikaattoriksi kertomaan suolistoperäisestä saastumisesta. E. coli on normaalin suolistoflooran hallitseva fakultatiivinen aerobinen bakteeri, joten ne kykenevät menestymään myös anaerobisissa olosuhteissa. (Stanier ym. 1981a). Anaerobisissa olosuhteissa E. coli käyttää energian lähteenään hiilihydraatteja, mutta aerobisissa olosuhteissa ne pystyvät käyttämään useita erilaisia orgaanisia yhdisteitä.
Fermentoidessaan sokereita energianlähteekseen E. coli tuottaa hiilidioksidikaasua. Tämä kaasun muodostus on hyvä tapa tunnistaa E. coli muista gram-negatiivisista enteerisista bakteeriryhmistä, kuten Shigella ja Salmonella-bakteereista. E. coli voidaan tunnistaa muista samankaltaisista bakteereista myös sen laktoosin fermentoinnin avulla. E. colit omaavat kaksi tarvittavaa entsyymiä laktoosin fermentoimiseen: permeaasin ja β-galaktosidaasin. Yhdessä nämä entsyymit mahdollistavat laktoosin pilkkomisen. Laktoosin pilkkominen on tavallista E.
colille ja enterobakteeri -ryhmille, mutta muilta samankaltaisilta bakteereilta tämä kyky puuttuu. Huomioitavaa on, että laktoosin fermentoimiseen ja kaasun muodostamiseen tarvittavat mekanismit eivät ole E. colille elintärkeitä, joten on olemassa kantoja, joista nämä tekijät ovat mutaation takia poistuneet. Suurimmassa osassa E. colilla nämä ominaisuudet ovat kuitenkin aktiivisia. (Stanier ym. 1981a). E. coli omaa myös β-D-galaktosidaasi- ja β- glukuronidaasientsyymit, joita voidaan myös käyttää sen tunnistamiseen muista enteerisistä bakteereista sekä myös muista koliformisista bakteereista (Rompre ym. 2002).
E. colista, niin kuin muistakin koliformisista bakteereista, on olemassa erilaisia muotoja.
Indikaattorien kannalta merkittäviä muotoja ovat tavallinen E. coli ja fekaalinen E. coli.
Fekaalinen E. coli kykenee kasvamaan suuremmissa lämpötiloissa (44,5 oC), kuin tavallinen muoto (35-37 oC). Fekaalinen E. coli ilmenee useammin lämminveristen suolistossa, ja tästä syystä sitä voidaan käyttää ulosteperäisten saastumisten indikaattorina tavallisen E. colin sijasta.
Vaikka E. coli kuuluukin osaksi suoliston normaaliflooraan ja toimii siellä isäntäeliön hyödyksi estäen patogeenisia bakteereja pääsemästä kasvamaan ja tuottamalla K-vitamiinia, niin joissain tilanteissa E. coli saattaa aiheuttaa myös infektioita. Nämä infektiot syntyvät useimmin E. colin päästessä kosketuksiin vioittuneiden limakalvojen kanssa ja ovat kantakohtaisia. Yleisimpiä E.
colin aiheuttamia infektioita ovat virtsatietulehdukset. Myös infektiot munuaisissa ovat mahdollisia. Jotkin E. coli kannat kykenevät myös erittämään ympärilleen myrkyllisiä aineita, kuten veroktoksiineja (Gerba 2015b). Tällaisia kantoja ovat muun muassa STEC(Shiga toksiinia tuottava E. coli)-, EHEC(enterohemorraaginen E. coli)- ja ETEC(enterotoksigeeninen E. coli)-kannat. Nämä myrkyt aiheuttavat ihmisissä ripulia ja muita kolerankaltaisia oireita. E.
coli on yksi yleisimmistä ”matkustajan ripulin” aiheuttajista. (Vaara ym. 1996, Sonnenwirth 1980a).
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa on gram-negatiivinen polaarinen, 1-5 µm mittainen sauvamainen ja ehdottoman aerobinen bakteeri. Se tuottaa energiansa metaboloimalla lukuisia eri hiiltä sisältäviä yhdisteitä. (Stanier ym. 1981b). Verrattuna muihin ryhmänsä bakteereihin P.
aeruginosa on parempia selviämään hankalissa olosuhteissa. Se muun muassa kykenee kasvamaan + 41 oC lämmössä (Stanier ym. 1981b) ja tislatussa vedessä (Renkonen 1996). Ne
ovat myös hyvin kestokykyisiä useita bakteerilääkkeitä ja desinfiointiaineita vastaan (Renkonen 1996). P. aeruginosa selviää hyvin kemikalisoituneissa vesissä, ja tämän takia sitä käytetäänkin paljon myös teollisuuden vesien indikaattorina.
P. aeruginosa kuuluu fluoresoiviin pseudomonadeihin, joille kaikille on tyypillistä kellertävän vesiliukoisen pigmentin, pyosyaanin, tuottaminen. Tämä pigmentti erittyy kasvatusalustaan muokaten sen keltaiseksi ja saa alustan fluoresoimaan UV-valossa. Keltaista väriä aiheuttavan pigmentin lisäksi P. aeruginosalla on lisäksi vielä sinertävää väriä aiheuttava phenaziini- pigmentti. Yhdessä nämä kaksi pigmenttiä aiheuttavat sen, että P. aeruginosa värjää kasvatusalustansa vihreäksi. (Stanier ym. 1981b).
P. aeruginosa on hyvin yleinen bakteeri maaperässä (Sonennwirth 1980). Niitä tavataan kuitenkin myös lämminveristen suolistossa, jossa ne normaalitilanteessa eivät toimi taudinaiheuttajina. P. aeruginosa on opportunistinen taudinaiheuttaja, minkä takia se aiheuttaakin infektioita eniten sairaalapotilaille ja muille jollain tavalla alentuneesta immuniteetistä tai kehon stressitiloista kärsiville. Tavallisia tällaisia tiloja ovat esimerkiksi vakavat palovammat tai syöpäpotilaat. (Renkonen 1996).
Tavallisimpia P. aeruginosan aiheuttamia infektioita ovat virtsatietulehdukset, sekä haavojen tulehdukset. P. aeruginosa kykenee aiheuttamaan myös vakavampia infektioita kuten sarveiskalvon tulehdusta ja verenmyrkytyksiä. P. aeruginosan aiheuttamat verenmyrkytykset ovat hyvin vakavia, ja johtavat usein kuolemantapauksiin hoitojen suuren epäonnistumistodennäköisyyden takia. (Sonnenwirth 1980b).
Enterokokit
Enterokokit ovat ryhmä gram-positiivisia kokkimaisiabakteereja, joita yhdistää tietyt biokemialliset reaktiot. Enterokokit ovat fakultatiivisia anaerobeja. Enterokokkeja löytyy useasta eri ympäristöstä, mutta vesihuollon yhteydessä puhuttaessa kyseessä on yleensä Streptococcus-suku, joka ilmenee vain lämminveristen suolistosta. Sukuun kuuluu useita eri mikrobeja, joista osa on yleisempiä ihmisissä ja osa taas yleisempiä eläimissä. Enterokokeista onkin ajateltu, että eri lajien tunnistamisen perusteella voidaan päätellä, onko kyseessä eläin- vai ihmisperäinen ulostelähde. Tätä teoriaa on kuitenkin kritisoitu laajasti, eikä varmuutta sen toimimisesta ole saatu. (Gerba 2015b).
Enterokokkeja pidetään muutamasta syystä parempina indikaattoreina kuin koliformisia bakteereja. Ne kasvavat harvoin vedessä, eli niiden havaitseminen kertoo ulkoisesta lähteestä.
Ne kestävät myös koliformeja paremmin ympäristön stressiä ja desinfiointimenetelmiä, esimerkiksi kloorausta. (Gleeson ja Gray 1997).
Clostridium perfringens
Clostridium perfringens on sauvamainen gram-positiivinen, sulfaattia pelkistävä anaerobinen bakteeri. C. perfringens kykenee muodostamaan itiöitä, jotka sietävät hyvin lämpöä ja desinfiointiaineita (Gerba 2015b). Toisin kuin useat muut Clostridium-suvun jäsenet, kykenee C. perfringens kasvamaan lukuisilla erilaisilla alustoilla, muun muassa peptoni- tai hiivauutealustoilla. Huomattavaa on, ettei C. perfringens tarvitse käymiseen soveltuvia hiilihydraatteja, vaan ne voivat käyttää aminohappoja energianlähteenään (Stanier ym. 1981c).
C. perfringens ja muut samankaltaiset Clostridium-suvun jäsenet kuten C. botylinum ja C.
tetanus ovatkin pääasiallisia hajottajia proteiinien hapettomassa hajoamisessa.
C. perfringens ilmenee ainoastaan ulosteperäisissä lähteissä (Gerba 2015b), toisin kuin monet muut Clostridium-suvun jäsenet, jotka ovat yleisiä bakteereja maaperässä (Stanier ym 1981b).
C. perfringensin itiöt kuitenkin hankaloittavat tätä jakoa, sillä ne ovat hyvin kestäviä, ja usein niitä löytyy myös ympäristönäytteistä kuten maaperästä ja vesistöistä (Gerba 2015b). C.
perfringens kykenee aiheuttamaan ihmisissä ja eläimissä botulismin kaltaisia ruokamyrkytysoireita. Oireet eivät johdu itsessään bakteerin läsnäolosta, vaan bakteerin muodostamista eksotoksiineista. Näin ollen on mahdollista sairastua C. perfringensin aiheuttamiin oireisiin, vaikkei suoranaisesti olisikaan altistunut bakteerille itsessään. Bakteerit ovat voineet jossain vaiheessa kasvaa ruoka-aineessa, ja erittää myrkkyjään siihen (Stanier 1981b).
Bakteriofagit
Bakteriofagit ovat bakteerien viruksia, joita on ihmisten ja muiden lämminveristen suolistossa, ja näin ollen niitä löytyy runsain määriin viemäreistä ja saastuneista vesistä, ja niitä käytetään virusten indikaattoreina. Bakteriofagien muoto, rakenne ja käyttäytyminen muistuttavat patogeenisten enteeristen virusten ominaisuuksia. Tämän takia niitä pidetään hyvinä enteeristen
virusten indikaattoreita. Bakteriofageja käytetään myös virusten selviämisen ja desinfioinnin tehokkuuden tarkkailuun. (Gerba 2015b).
Bakteriofageja voidaan käyttää myös ulosteperäisten bakteerien indikaattoreina. Kun saastuneessa vedessä on bakteriofageja ja bakteereja, bakteriofagit tappavat spesifisiä patogeenisia isäntäbakteerejaan, ja lisääntyvät tehokkaasti. Esimerkkejä bakteriofageista, joita käytetään, E. colin kanssa ovat somaattiset kolifaagit ja F-spesifiset RNA kolifaagit.
Kolifaagien tunnistaminen on yksinkertainen ja halpa menetelmä moneen muuhun veden indikaattorien havaitsemiseen verrattuna. Mahdollisia käytettäviä metodeja ovat MPN- menetelmä tai perinteinen maljaviljelmä. Tuloksia voidaan saada 8-18 tunnissa kasvatuksen alkamisesta. (Gerba 2015b).
2.3. PMEU
2.3.1. PMEU Spectrion™
Portable microbe enrichement unit (PMEU) Spectrion™ on suomalaisen Finnoflag Oy:n kehittämä mikrobien kasvatus- ja tunnistuslaitteisto. PMEU Spectrion™ kuuluu PMEU- laiteperheeseen, jonka muut jäsenet ovat PMEU, PMEU Scentrion ja Coliline PMEU (Kuva 1 ja 2).
PMEU Spectrionin™ toiminta perustuu mikrobien kasvatusalustalla aiheuttaman samenemisen tai värinmuutoksen optiseen mittaamiseen. Mikrobit kasvatetaan näyteruiskuissa, joihin valitaan kullekin mikrobille sopiva nestemäinen kasvatusalusta. Laitteessa olevat LED:it lähettävät valoa ruiskun läpi ja mittaavat läpi tulleen valon. Käytössä voi olla infrapuna-LED- lamppuja, ultravioletti-LED-lamppuja tai tiettyjä värin aallonpituuksia lähettäviä LED- lamppuja. PMEU-laite mittaa suhteellista sameutta tai värinmuodostusta suhteutettuna kuluvaan aikaan. Laite piirtää näiden tulosten pohjalta kuvaajaa ajan funktiona, jonka avulla bakteerien kasvamista kyetään seuraamaan. Käyrän avulla seurataan, kuinka mikrobien aiheuttama kasvualustan sameneminen etenee. Sameneminen kertoo mikrobien kasvusta, ja eri kasvun vaiheet nähdään käyrältä. (Hakalehto ja Heitto, 2012). Huomioitavaa on, että PMEU laite ei mittaa suoraan bakteerien kasvua, vaan sen indikaattoria: sameutta tai värinmuodostusta.
Laitteen piirtämiä kuvaajia ei voi siis suoraan verrata muihin mikrobien kasvatusmenetelmiin, esimerkiksi maljaviljelymenetelmään, joissa seurataan suoraan bakteerien kasvua. PMEU-
laitteen antamat tulokset eivät ole aivan reaaliaikaisia, sillä samentumista ja värinmuodostusta ei tapahdu välittömästi niin voimakkaana, että laitteen LED-sensorit kykenisivät sitä havaitsemaan. Näin ollen PMEU-laitteella saatuja tuloksia tulee verrata vain muihin samalla tai samoihin periaatteisiin perustuviin tuloksiin.
PMEU-menetelmä on nopea tapa havaita mikrobeja (Wirtanen ja Salo 2010). Perinteisillä viljelymenetelmillä bakteerit havaitaan kasvatusalustalla noin 18-24 tunnin päästä kasvatuksen aloittamisesta, kun taas PMEU-menetelmällä samoja bakteereja on pystytty havaitsemaan 10- 18 tunnin kasvatuksen jälkeen (Hakalehto ym. 2013, Pitkänen ym. 2009).
PMEU Spectrionissa™ kyetään säätelemään kasvatuslämpötilaa, jolloin olosuhteet saadaan ihanteellisiksi kasvatettaville mikrobeille. Laitteen avulla on myös mahdollista syöttää ruiskuun haluttua kaasua. Näin saadaan mahdollistettua myös ehdottomien aerobinen ja anaerobinen kasvatus laitteessa. PMEU-laitteessa voidaan käyttää lukuisia erilaisia kasvatusalustoja riippuen kasvatettavasta bakteerista. Tavallisia käytettäviä nestemäisiä kasvatusalustoja voivat olla esimerkiksi tryptiini-hiiva-glukoosi (THG) -alusta (E. coli ja P. aeruginosa), fastidious anaerobe broth (FAB) -alusta (C. butyricum) tai Colilert®-alusta (E. coli).
PMEU Spectrion™ -laitteessa on kuitenkin myös omat heikkoutensa. Esimerkiksi liian voimakas kaasunlisäys saattaa aiheuttaa kuplintaa ruiskuissa, joka voi haitata LED-lamppujen kykyä lukea ruiskuissa tapahtunutta samentumista tai värinmuodostusta. Kuplinta voi myös aiheuttaa vaahdonmuodostumista ruiskuissa, joka voi pahimmassa tapauksessa tukkia ruiskuissa olevat suodattimet pysäyttäen laitteen toiminnan väliaikaisesti.
2.3.2. Muut PMEU laitteet
PMEU Spectrionin™ lisäksi PMEU-tuoteperheeseen kuuluvat myös PMEU Scentrion ja Coliline PMEU -laitteet. Kaikki nämä laitteet perustuvat samaan periaatteeseen, jossa mikrobeja kasvatetaan kasvatusalustoilla pienessä mittakaavassa. Käytettävät näytetilavuudet vaihtelevat välillä 10-100 ml. Scentrionissa on myös mahdollista analysoida kasvatusprosessin aikana syntyviä haihtuvia yhdisteitä (Hakalehto ja Heitto 2012).
Coliline PMEU on kehitetty pääasiallisesti mikrobiologisen laadun tarkkailumenetelmäksi, ei tutkimuskäyttöön. Sen vahvuuksia ovat automaattinen näytteenotto sekä tulosten etäseuranta.
Coliline PMEU käyttää hyödykseen IDEXX Oy:n Colilert®-kasvatusalustaa. Coliline PMEU:lla seurataan koliformisten bakteerien ja erityisesti E. colin kasvua. Coliline PMEU:ta käytetään muutamilla vesilaitoksilla puhdistetun veden mikrobiologisen puhtauden seurannassa. Laite kyetään yhdistämään suoraan vesilaitoksen linjastoon. Vesi virtaa jatkuvasti laitteen läpi, ja tästä virtauksesta Coliline PMEU ottaa näytteen ennalta määrätyin väliajoin.
Kuva 1 PMEU-tuoteperhe on Finnoflag Oy:n kehittämä ja Samplion Oy:n valmistama mikrobien kasvatukseen ja tunnistukseen tehty laiteryhmä. Kuvassa oikealta vasemmalla PMEU, PMEU Spectrion™ ja PMEU Scentrion. (Hakalehto ja Heitto 2012)
Mikrobien kasvatus alkaa välittömästi laitteen sisällä, ja mikäli kasvua havaitaan, lähettää laita automaattisesti hälytyksen vesilaitoksen valvomoon. Coliline PMEU:ssa ei ole mahdollisuutta kaasunlisäykseen. (Hakalehto ym. 2013).
2.3.3. Colilert®
Colilert®-kasvatusalusta on IDEXX-yhtiön (Maine, USA) tuote, jota käytetään koliformisten bakteerien ja erityisesti E. colin tunnistukseen näytteestä. Kansainvälinen standardisointiyhdistys (ISO) on hyväksynyt kvantitatiivisen Colilert®-metodin standardoiduksi menetelmäksi määrittää koliformisia bakteereja ja E. colia.
Colilert®-alusta on hyvin selektiivinen. Alusta sisältää kahta tiettyä ravintoindikaattoria, joita koliformiset bakteerit kykenevät käyttämään aineenvaihdunnassaan. Nämä ravintoindikaattorit ovat o-nitrofenyyli-β-d-galaktopyranosidi (ONPG) ja 4-metyyliumbelliferyyli-β-glukuronidi
Kuva 2 Coliline PMEU -laitteen sisäosa. (Hakalehto ja Heitto 2012)
(MUG). Kaikki koliformiset bakteerit omaavat β-D-galaktosidaasientsyymin, jonka avulla ONPG hajotetaan bakteerien tarvitsemaksi hiileksi. Samalla siitä irtoaa o-nitrofenoli, joka on väriltään keltainen. Tämän lisäksi E. colin β-glukuronidaasientsyymi reagoi MUG:n kanssa toimien bakteerin hiilen lähteenä. Tässä reaktiossa syntyy sivutuotteena 4-metyyli- umbelliferonia, joka fluoresoi UV-valossa (λ=365 nm). Näyte muuttuu keltaiseksi, mikäli koliformisia bakteereja on läsnä, ja fluoresoi, mikäli näytteessä on myös E. colia. (Rompre ym.
2002, Gerba 2015b, IDEXX 2018)
Vain harvoilla bakteereilla koliformisten lisäksi on näitä kahta entsyymiä, joita tarvitaan metaboloimaan Colilert®-alustan ONPG- ja MUG-ravinteita. Tästä syystä Colilert®-alusta on selektiivinen alusta koliformisten bakteerien kasvattamiseen. Ravinnon selektiivisyyden lisäksi alusta sisältää myös valikoivia tekijöitä kuten antibiootteja, joiden tarkoituksena on rajoittaa muiden kuin koliformisten bakteerien kasvua alustalla. Colilert®-alustalla voidaan havaita 24
± 4 tunnissa 1 pmy/100 ml pitoisuuksia, vaikka samassa näytteessä olisikin kaksi miljoonaa heterotrofista bakteeria. (IDEXX 2018).
Colilert®-menetelmää on vertailtu muiden vastaavien koliformisten bakteerien tunnistamiseen käytettävien menetelmien kanssa. Warden ym. (2011) vertailivat Colilert®-menetelmää Yhdysvalloissa käytössä olevaan standardimenetelmään 9222D ulosteperäisten koliformien määrittämisessä. Standardimenetelmä 9222D (NEMI 2019) perustuu näytteen suodattamiseen kalvosuodattimella, ja sen jälkeen inkubointiin mFC-agaralustalla (Standard Methods Online, 2019). Wardenin ym. (2011) tutkimus osoitti, että käytetty Colilert18® -menetelmä toimi jossain määrin paremmin, kuin käytössä oleva standardimenetelmä. Colilert®-menetelmä kykeni tunnistamaan koliformisia bakteereja huomattavasti varmemmin ja nopeammin kaikissa näytteissä yhtä lukuun ottamatta. Tämän lisäksi he huomasivat, että Colilert®-menetelmässä valheellisten negatiivisten tulosten määrä oli huomattavasti pienempi verrattuna standardimenetelmään. Myös Pitkänen ym. (2007) tutkivat Colilert®-alustan soveltuvuutta E.
colin ja koliformisten bakteerien tunnistamiseen käytössä olevien standardimenetelmien sijaan.
Vertailukohteena he käyttivät laktoosin käymiseen LTTC agarilla perustuvaa ISO standardia 9308-1:2014. Tutkimuksen mukaan Colilert® saavutti vastaavia tai korkeampia tuloksia kuin LTTC menetelmä, eli Colilertia® voidaan käyttää vastaavana koliformisten bakteerien määrittämiseen. Tutkimuksessa kuitenkin todettiin, että mikäli näytteessä on paljon myös muita bakteereja, tarvitaan Colilert®-menetelmässä myös toinen tarkistava menetelmä, mikä on eri johtopäätös, kuin mitä IDEXX väittää.
Colilert®-menetelmässä on myös omat heikkoutensa. Yksi suurimmista ongelmista on, etteivät kaikki E. coli kannat sisällä β-glukuronidaasi-entsyymiä. Chang ym. (1989) tutkivat kyseistä entsyymiä omaavien E. colien osuutta ihmisen ulosteesta löytyvistä kannoista. Heidän tutkimuksensa osoitti, että 34 %:lla suolistoperäisistä E. coleista ei ollut β-glukuronidaasia, mikä heikentää huomattavasti Colilert®-menetelmän luotettavuutta. Samankaltaisia tuloksia on myös löydetty ympäristönäytteistä. Shadixin ja Ricen (1991) tekemän tutkimuksen mukaan noin 20 %:lla ympäristönäytteiden E. coleista ei ollut kyseistä entsyymiä. Colilertia®
käyttäessä nämä kannat eivät siis näkyisi millään tapaa tuloksissa, vaikka näytteissä olisikin E.
colia.
On myös olemassa bakteereja, jotka eivät ole koliformisia, mutta siltikin ne omaavat tarvittavat entsyymit kasvaakseen Colilert®-alustalla. Tällaiset bakteerit viihtyvät erityisesti merellisissä olosuhteissa, ja siksi erityisesti rannikkoseutujen näytteiden käsittelyssä on otettava huomioon mahdollisuus, että vaikka Colilert®-alusta muuttuisikin keltaiseksi, ei kyseessä ole koliformisia bakteereja, vaan muita bakteereja, jotka tuottavat β-glukuronidaasia tai β-D-galaktosidaasia, ja joihin Colilert®-alustan antibiootit eivät vaikuta. Tällaisia bakteereja voivat olla muun muassa V. cholerae tai Providencia sp. (Pisciotta ym. 2002).
2.4. KAASUJEN VAIKUTUS MIKROBIEN KASVUUN
2.4.1. Happi
Aerobinen metabolia
Happi on elintärkeä alkuaine elämälle, sillä solujen soluhengitys tarvitsee happea raaka- aineenaan. Myös useat bakteerit kykenevät käyttämään happea energian tuotannossaan.
Yksinkertaisesti hapellisessa soluhengityksessä solu käyttää saamiaan hiilihydraatteja ja happea muodostaakseen energiaa ja sivutuotteena hiilidioksidia ja vettä (Kaava 1).
𝐶6𝐻12𝑂6+ 6 𝑂2 → 6 𝐶𝑂2+ 6 𝐻2𝑂 + 38 𝐴𝑇𝑃 (Kaava 1)
Kun tätä prosessia tutkitaan hiukan tarkemmin, huomataan että samassa reaktiossa solu kykenee muodostamaan itselleen lisää solumassaa, mutta silloin myös solun typensaanti on
varmistettava (Maier ja Pepper 2015). Hapellinen soluhengitys on solulle tehokas tapa tuottaa tarvittavaa energiaa. Sen aikana solu kykenee tuottamaan 38 ATP (adenosiinitrifosfaatti)- molekyyliä yhdestä glukoosimolekyylistä. ATP-molekyyleihin on sitoutuneena paljon energiaa, ja niitä purkamalla solut vapauttavat energian käyttöönsä. Soluhengityksestä tehokkaan energiantuottotavan tekee se, että siinä happi toimii elektroninvastaanottajana. Happi on kaikkein tehokkain elektroninvastaanottaja. (Pepper ja Gentry 2015)
Anaerobinen metabolia
Vaikka happea on ilmakehässä, löytyy maapallolta myös paikkoja, joissa happea ei ole.
Hapettomia olosuhteita löytyy lähinnä vesistöjen pohjasedimenteistä, ja joistain maaperän mikroelinympäristöistä. Myös ihmisen ja muiden tasalämpöisten eliöiden suolistoista löytyy anaerobisia alueita. Näissä paikoissa organismit eivät voi käyttää hyväkseen aerobisia metaboliareittejä. Mahdollisia hapettomia metaboliareittejä ovat käyminen ja hapeton soluhengitys. Nämä ovat molemmat paljon tehottomampia kuin hapellinen soluhengitys, esimerkiksi käyminen tuottaa vain kaksi ATP-molekyyli yhdestä glukoosimolekyylistä (Pepper ja Gentry 2015). Sekä käymisessä että hapettomassa soluhengityksessä mikrobit joutuvat käyttämään hapen sijaan muita elektronin vastaanottajia saadakseen reaktion energian käyttöönsä. Elektronin vastaanottajat riippuvat ympäristön tekijöistä sekä kyseessä olevista mikrobeista. Muutamia mahdollisia elektronin vastaanottajia ovat nitraatti-, sulfaatti- ja karbonaatti-ionit. Myös eräät metallit, kuten rauta, arsenaatti, arseniitti ja mangaani voivat toimia elektronin vastaanottajina. (Maier ja Pepper 2015).
Anaerobisia bakteereja on olemassa monenlaisia, kuten oblikaatit anaerobit, mikroaerofiilit, aerotolerantit anaerobit ja fakultatiiviset anaerobit. Oblikaateille anaerobeille, kuten C.
butyricumille, happi on myrkyllistä, kun taas aerotolerantit anaerobiset bakteerit kykenevät selviytymään myös hapen ollessa läsnä. Mikroaerofiilit taas tarvitsevat happea, mutta ilmakehän happipitoisuudet ovat niille liian suuria. Fakultatiivisia anaerobeja, jotka kykenevät tarpeen mukaan hyödyntämään sekä happea että vaihtoehtoisia metaboliareittejä ympäristön olosuhteiden mukaan. E. coli ja enterobakteerit ovat hyviä esimerkkejä fakultatiivisista anaerobeista. (Maier ja Pepper 2015).
Kaikilla bakteereilla löytyy entsyymejä, jotka kykenevät reagoimaan hapen kanssa. Näiden entsyymien tyypit määräävät, voiko bakteeri hyödyntää happea energian tuotannossaan. Lähes
kaikissa soluissa hapen käsittelyn ensimmäinen vaihe on muokata siitä vetyperoksidia H2O2, joka on myrkyllinen aine. Aerobisissa mikrobeissa vetyperoksidi hajotetaan katalaasi-entyymin avulla hapeksi ja vedeksi. Reaktioissa, joissa vetyperoksidia syntyy, voi syntyä myös pieniä määriä vielä vetyperoksidiakin vaarallisempia hapettavia yhdisteitä kuten superoksidia tai happiradikaaleja. Aerobisissa ja aerotoleranteissa mikrobeissa superoksidaasidismutaasi - entsyymi kuitenkin muokkaa nämä vielä vaarallisemmat hapettajat vetyperoksidiksi, joka jatkokäsitellään vedeksi ja hapeksi. Anaerobisilla bakteereilla nämä entsyymit kuitenkin puuttuvat, joten vetyperoksidi ja happiradikaalit pääsee kertymään soluihin ja tuhoamaan niitä.
(Stanier ym. 1981a)
2.4.2. Hiilidioksidi
Hiilidioksidia on aina ympäristössä, sillä sitä syntyy kaikkien solujen energiantuotannossa hapellisen soluhengityksen kautta. Erityisesti viime aikoina, ilmakehän hiilidioksidipitoisuuden kaiken aikaa noustessa, on alettu kiinnittää huomiota hiilidioksidin vaikutuksiin ympäristössä.
Kasveille ja muille yhteyttävillä organismeille kohonneet hiilidioksidi pitoisuudet tarjoavat lisää lähtöaineita yhteytykselle näin vahvistaen biomassan tuotantoa. Hiilidioksidin vaikutukset eivät kuitenkaan ole positiivinen kaikille mikrobeille (Chen ym. 2017).
Hiilidioksidin vaikutuksia mikrobeihin on tutkittu jo viime vuosisadan alulla. Valley ja Rettger (1927) tutkivat hiilidioksidin vaikutuksia bakteerien kasvuun. He huomasivat, että tavalliset, pienet hiilidioksidipitoisuudet ovat välttämättömiä monille mikrobilajeille, mutta kohonneet pitoisuudet aiheuttavat häiriöitä soluille. Tutkimuksessa ei kyetty selittämään, mistä tämä ilmiö johtuu. Repuske ja Clayton (1968) vahvistivat tätä käsitystä todistaessaan, että E. coli tarvitsee hiilidioksidia voidakseen kasvaa. Näiden uraauurtavien tutkimusten jälkeen hiilidioksidin vaikutuksia mikrobeille on tutkittu vielä lisää, mutta kaikkia sen vaikutuksia ei ole vieläkään kyetty osoittamaan, ja monet tulokset ovat ristiriidassa keskenään.
Superkriittisen, nestemäisen hiilidioksidin (lämpötila yli 31 oC ja paine yli 7,38 MPa) vaikutuksia on tutkittu paljon viime vuosikymmeninä. Esimerkiksi Schulz ym. (2012) ja Chen ym. (2017) ovat todenneet, että mikrobien altistaminen superkriittiselle hiilidioksidille heikentää mikrobipopulaatioiden ja yksittäisten mikrobien kykyä säilyä toimintakykyisinä.
Tutkittavina mikrobeina heillä oli muun muassa E. coli. Myös Li ym. (2017) tutkimuksen tulokset tukevat tätä johtopäätöstä. Heidän tutkimuksessaan huomattiin, että bakteerien
altistaminen superkriittiselle hiilidioksidille vähensi huomattavasti näytteistä löytyvien mikrobien geenikopioiden löytymistä. Tämä tarkoittaa, että superkriittinen hiilidioksidi on estänyt bakteereja lisääntymästä, ja toisaalta se on vahingoittanut näytteessä jo olleita bakteereja. Tutkimuksessa huomattiin myös, että eri bakteerisuvut kestävät superkriittisen hiilidioksidin vaikutuksia eri tasoisesti. Lin ym. (2017) tutkimuksessa olleista luonnossa tavallisesti esiintyvistä bakteerisuvuista superkriittistä hiilidioksidia kesti parhaiten Protobacteria-suku.
Tutkimusta on tehty vähemmän kaasumaisen hiilidioksidin kanssa, mutta tässäkin on huomattuja samanlaisia kasvua heikentäviä tuloksia kuin superkriittisellä hiilidioksidilla. Chen ym. (2017) huomasivat, että tavallinen kaasumainen hiilidioksidi ja superkriittinen hiilidioksidi toimivat kuitenkin eri lailla soluissa. Kaasumainen hiilidioksidi ajautuu tehokkaammin solunkalvon läpi sisälle soluun, jossa se alkaa sakkauttaa solun sisäistä kalsiumia ja magnesiumia pois solun käytöstä aiheuttaen näin solun toimintahäiriöitä. Tämän vaikutuksen todettiin myös tehostuvan lämpötilan noustessa. Superkriittinen hiilidioksidi taas imeytyy nopeasti solukalvoon, muttei kykene läpäisemään sitä helposti. Superkriittisen hiilidioksidin onkin todistettu vaikuttavan solukalvon rakenteeseen ja läpäisevyyteen (Garzia-Gonzales ym.
2007). Näin ollen solun toiminnan kannalta välttämättömät aineet eivät pääse kulkeutumaan solun sisälle, ja toisaalta solun sisään pääsee haitallisia aineita, kuten esimerkiksi raskasmetalleja.
Mikrobien kyky sietää hiilidioksidia vaihtelee. Muun muassa Hell ym. (2010) huomasivat tutkimuksissaan, että anaerobiset klostridit kestävät suuriakin hiilidioksidipitoisuuksia ilman suurempia soluvaurioita. Tätä voidaan verrata muun muassa aiemmin mainittuun Chen ym.
(2017) tutkimukseen, jossa tutkittu mikrobi oli fakultatiivisesti anaerobinen E. coli, tai Schulz ym. (2012) tuloksiin, joissa käytössä oli laaja skaala eri mikrobeja, aerobiset Pseudomonas putida ja Bacillus subtilis sekä anaerobiset Thaeura aromatica ja Desulfovibrio vulgaris.
Korotetuilla hiilidioksidi pitoisuuksilla oli kolmenlaisia vaikutuksia näihin neljään tutkittuun bakteerilajiin. Kaikkien lajien kasvun alku (lag phase) pidentyi hapensietokyvystä riippumatta huomattavasti. Esimerkiksi P. puptidan kasvun alku viivästyi yhdestä tunnista kahdeksaan, ja B. subtiliksella vastaava muutos oli kahdesta tunnista yhdeksään. T. aromaticalla kaasun lisäys hidasti kasvua niin paljon, ettei bakteeri aloittanut laisinkaan eksponentiaalista kasvuvaihettaan, ja D. vulgaris hidasti kasvunsa aloittamista 9 tunnista 23 tuntiin. Kaikkien tutkittujen bakteerien kasvu hidastui hiilidioksidia lisättäessä. Hiilidioksidin läsnä ollessa solujen tuotto ei ollut yhtä
suurta kuin vastaavassa kasvatuksessa, jossa ei ollut hiilidioksidia. Tuloksissaan Schulz ym.
(2012) myös painottavat, että yksittäisten bakteerien ominaisuudet ovat suurempia tekijöitä hiilidioksidin sietokyvyssä kuin esimerkiksi aerobisuus. He eivät kuitenkaan kyenneet erottelemaan, mitä nämä ominaisuudet olivat. Klostridit voivat siis olla muita bakteereja parempia sietämään hiilidioksidia jonkin vielä tuntemattoman ominaisuuden vuoksi.
Hiilidioksidilla on havaittu olevan myös positiivisia vaikutuksia mikrobien kasvulle. Monissa soluviljelyissä kasvatuksessa käytetään noin 5% hiilidioksidikaasua, koska on huomattu, että ilman tätä monet soluviljelmät eivät kasva laisinkaan (Repuske ja Clayton 1968). Hakalehto ja Hänninen (2012) havaitsivat tutkimuksessaan, että 100 % hiilidioksidin lisääminen lyhyenä kaasunlisäyksenä nopeutti huomattavasti C. butyricum kannan kasvua. C. butyricum kanta, joka sai 15 minuutin hiilidioksidikaasunlisäyksen kaksi tuntia kasvatuksen alkamisen jälkeen aloitti kasvun noin 10 tuntia kokeen alkamisen jälkeen, kun taas kanta, jolle ei annettu lainkaan hiilidioksidia ei aloittanut kasvuaan lainkaan 24 tunnin kokeen aikana. Muita mahdollisia selityksiä tähän kasvun nopeutumiseen saattoivat olla myös klostridien itsensä vapauttama hiilidioksidi, tai samassa ruiskussa kasvaneiden laktobasillien vapauttama hiilidioksidi.
Kaikissa näissä vaihtoehdoissa kasvun nopeutumisen aiheutti kuitenkin hiilidioksidi.
Tarkempia mekanismeja tälle ilmiölle Hakalehto ja Hänninen (2012) eivät osaa selittää, mutta tutkimus yhdessä Hell ym. (2010) havaintojen kanssa osoittaa, ettei hiilidioksidi kenties olekaan aivan yhtä ilmiselvä bakteereille haitallinen kaasu, kuin monet jo aiemmin esitetyt tutkimukset antavat ymmärtää (Schulz ym. 2012, Chen 2017).
Hiilidioksidikaasun tarkkoja vaikutusmekanismeja mikrobeissa ja sitä, mihin bakteerien sietokyky perustuu, on alettu tutkimaan vasta viime aikoina, ja näin ollen kaikkea tarvittavaa tietoa ei vielä ole olemassa. Tutkimuksia ei ole tehty paljoa, mutta jo tehdyt tutkimukset viittaavat, että hiilidioksidi kaasulla voi olla useita eri vaikutusmekanismeja bakteerisoluissa.
Hiilidioksidin on todettu vaikuttavan muun muassa solukalvon rakenteeseen ja mikrobien entsyymiaktiivisuuteen, mutta vielä ei ole tiedossa, mikä näistä vaikutuksista on merkitsevin, ja missä suhteessa näitä eri ilmiöitä tapahtuu missäkin olosuhteissa. (Yu ja Chen 2019).
3. TYÖN TAVOITTEET
Tämän työn tavoitteena oli jatkaa tutkimusta Hakalehdon ja Hännisen (2012) tekemien havaintojen pohjalta. He huomasivat, että hiilidioksidin lisääminen hetkellisesti C. butyricum bakteeriviljelmään nopeutti bakteerien kasvua. Tässä tutkimuksessa näitä saatuja tuloksia pyrittiin soveltamaan tavallisille veden indikaattorimikrobeille Escherichia colille ja Pseudomonas aeruginosalle. Tavoitteena oli selvittää, voidaanko samanlaisia vaikutuksia havaita PMEU-laitteessa myös näillä mikrobeilla. Kokeissa käytettiin PMEU-Spectrion™
laitetta. Tarkoituksena oli selvittää, olisiko kaasunlisäyksen mahdollistaminen Coliline PMEU -laitteessa hyödyllinen lisä.
Työn tavoitteet olivat:
1. Selvittää lyhytaikaisen hiilidioksidilisäyksen vaikutukset E. colin ja P.
aeruginosan kasvun alkamiseen ja eksponentiaalisen kasvun kestoon
2. Selvittää, kannattaako Coliline PMEU -laitetta kehittää lisäämällä siihen mahdollisuus kaasunlisäykseen.
4. AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1. BAKTEERIT
Tutkimuksessa käytettiin kolmea bakteerilajia; Escherichia colia, Pseudomonas aeruginosaa ja Clostridium butyricumia. Käytössä olleet kannat olivat Helsingin yliopiston mikrobikantakokoelma Hambista. E. coli oli Hambi 99 -kanta, ja P. aeruginosa oli Hambi 25 - kanta. C. butyricum kanta oli Hambi 482.
E. coli ja P. aeruginosa siirrostettiin nestemäisiin tryptiini-hiivauute-glukoosi (THG) putkiin (Liite 1), jotka inkuboitiin + 37 oC:ssa 12 ± 2 h. Muutamassa tapauksessa inkubointia jatkettiin enimmillään 48 h. Alkuperäinen bakteeripitoisuus määritettiin viljelemällä inkuboitua suspensiota pintalevitysmenetelmällä THG-agarmaljalle, josta pesäkkeet laskettiin 12 ± 2 tunnin inkuboinnin jälkeen. Bakteeripitoisuus vaihteli välillä 0,5 * 108 pmy/ml – 3,0 * 108 pmy/ml. E. colista ja P. aeruginosasta valmistettiin koeajoihin laimennokset (10-3 – 10-7).
Valmistetuista näytteistä tehtiin myös satunnaisesti mikrobiologisen puhtauden tarkistamiseksi pintaviljelyjä THG-agarille.
Clostridium butyricum kasvatettiin fastidious anaerobe broth (FAB) -alustalla (Liite 1).
Bakteerisuspensiota inkuboitiin anaerobisissa olosuhteissa + 37 oC:ssa 144 h ± 2 h. Koetta varten bakteerisuspensiosta valmistettiin 10-4 laimennos. C. butyricumia käytettiin kokeessa koelaitteiston ja menetelmien toimivuuden varmistamiseen.
Bakteerilaimennoksista valmistetut näytteet siirrettiin näyteruiskuihin koeajoja varten.
Näyteruiskuihin lisättiin välikappale kaasunlisäystä varten. C. butyricumin koeajot suoritettiin anaerobisesti, mikä varmistettiin syöttämällä ruiskuu koko ajon ajan typpikaasua. Muut ajot olivat aerobisia.
4.2. KOEAJOT
Koeajot suoritettiin PMEU Spectrion™ (Samplion Oy) laitteella (Kuva 3). Salkun vasemmalla puolella oli infrapunaledit, joiden avulla mitattiin sameutta, ja salkun oikealla puolella oli siniset ledit, joiden avulla mitattiin Colilert18®-alustalla tapahtuvasta entsyymitoiminnasta
