Droplet digital PCR stressivasteen mittaamisessa jokiravulla (Astacus astacus)
Essi Haapasalo Jokiravun (Astacus astacus) stressigeenien aktivaatio raskasmetalli altistuksessa Pro Gradu –tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, Ympäristö- ja biotieteiden laitos
Lokakuu 2019
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristötiede
Haapasalo Essi: Droplet digital PCR stressivasteen mittaamisessa jokiravulla (Astacus astacus) Pro gradu -tutkielma (40 op), 32 sivua, 3 liitettä (4 sivua)
Tutkielman ohjaajat: Jenny Makkonen ja Japo Jussila Lokakuu 2019
Avainsanat: Astacus astacus, raskasmetallit, stressigeeniaktivaatio, dd-PCR, bioindikaattori
TIIVISTELMÄ
Ravut on todettu hyviksi bioindikaattoreiksi vesiekosysteemeissä, koska ne ovat pitkä ikäisiä pohjaeläimiä ja ovat herkkiä vedensaasteille. Raskasmetallit kerääntyvät helposti ravun kudoksiin ja aiheuttavat stressireaktiota, joita voidaan mitata PCR:n avulla tunnettujen sressigeenien vasteen kautta. Kokeen tarkoituksena oli kartoittaa jokiravun (Astacus astacus) stressigeenien toimintaa ja lajispesifisiä vasteita, sekä kehittää Droplet Digital PCR- menetelmää stressin mittauksen välineeksi ja näin huomioida kaivostoiminnan vaikutuksia vesiekosysteemissä tarkemmin. Tavoitteena on myös arvioida stressigeeniaktivaation mittauksen toimivuutta kaivostoiminnan ympäristövaikutusten tarkkailuun.
Kokeessa tehtiin raskasmetallialtistus sinkillä ja kuparilla kahta pitoisuutta käyttäen (0,05 mg/l ja 5 mg/l). Kokeessa käytettiin jokirapuja (n=50), jotka olivat yksittäisaltaissa kymmenen altaan systeemeissä. Eli kupari- sekä sinkkialtistusten molemmat pitoisuudet ja kontrolli. Näytteenotto tapahtui kahdessa aikapisteessä (48 h ja 24 vrk.). Näytteet otettiin kiduksesta, hemolymfasta ja hepatopankreasta. Hepatopankreasta otetuille näytteille tehtiin RNA:n eristys ja cDNA-synteesi. Tutkimuksessa käytettiin digitaalista PCR- menetelmää, jonka toistettavuus kvantitatiiviseen PCR:ään verrattuna on parempi ja näytteiden välinen hajonta pienempi.
Kokeen tuloksissa havaittiin, että geenien ferriitiini, HSP70 ja CuZnSOD vasteet raskasmetallistressiin olivat selkeästi havaittavia ja mitattavia. Niiden vasteet seurasivat loogisesti kuparin ja sinkin altistusten pitoisuuksien ja aikavälien kanssa. Vastaavia havaintoja on aiemmin tehty myös muilla lajeilla.
Tulokset osoittavat, että jokirapua voitaisiin käyttää bioindikaattorilajina kaivostoiminnan vaikutuksia arvioitaessa. Tuloksia tarkastellessa tulee huomioida pieni otanta, joka on lisännyt sattuman vaikutusta tuloksissa.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND
Department of Environmental and Biological Sciences, Environmental science
Haapasalo Essi: Using Droplet Digital PCR to measure the stress response of noble crayfish (Astacus astacus)
Supervisors: Jenny Makkonen and Japo Jussila
Master’s thesis (40 cp) 32 pages, 3 attachment (4 pages) October 2019
Keywords: Astacus astacus, heavy metals, stress gene activity, dd-PCR, bioindicator ABSTRACT
Crayfish are excellent bioindicators in water ecosystems as they are long living bottom feeders and sensitive to pollution. For example, heavy metals bioaccumulate in the tissues of the crayfish and cause stress reactions. Some of these reactions can be measured, polymerase chain reaction (PCR) being one possible method for it. This experiment aims to study noble crayfish (Astacus astacus) gene level stress reactions in heavy metal exposure. The aim was also to develop Droplet Digital PCR as a method to measure crayfish gene activity. Goal of the study was also to estimate if stress gene activity could be used as reliable indicator to harmful mining activity.
In the study we conducted a copper and zinc exposure experiment using two different concentrations (0,05 mg/l and 5 mg/lThe experimental animals, noble crayfish (n=50), were held in individual tanks, forming five experimental systems each having ten interconnected crayfish tanks. The five systems were then used for copper and zinc exposure in two concentrations and one system was employed as a control group. The sampling was conducted in two time points (48 h and 24 d). The collected tissues were gills, haemolymph and hepatopankreas. The RNA isolation and cDNA synthesis were done to the samples taken from hepatopankreas. Droplet Digital PCR was used to analyse the samples.
The ferritin, HSP70 and CuZnSOD genes gave detectable responses in heavy metal stress. The responses were connected to the concentration, exposure and measuring points. The results were in line with previous studies conducted with other. Result indicate that noble crayfish could be used as bioindicator species to heavy metal pollution. However, further studies are needed to confirm the results.
LYHENTEET JA MÄÄRITELMÄT
Bioindikaattori Luonnonvaraisia eliötä, joiden perusteella voidaan arvioida ympäristön tilaa.
DNA Deoksiribonukleiinihappo, muodostaa solujen geneettisen koodin.
ddPCR Droplet digital polymerase chain reaction, kvantitatiivinen menetelmä nukleiinihapposekvenssien absoluuttisen määrän määrittämiseen.
Geenin ilmentyminen Geneettisen informaation lukeminen DNA:sta, tietyllä ajanhetkellä aktiivisia geenejä voidaan mitata RNA:n tuottaman proteiinin kautta.
cDNA Komplementaarinen DNA, keinotekoisesti RNA:sta rakennettu
DNA.
qPCR Kvantitatiivinen PCR, polymeraasiketjureaktio jossa monistuvan tuotteen määrää seurataan fluoresoivien väriaineiden avulla reaaliajassa.
RT–PCR Käänteiskopioijaentsyymi (reverse transcriptase) -PCR.
Käänteiskopioijaentsyymillä RNA-juosteesta valmistetaan komplementaarinen cDNA-juoste. Tämän jälkeen DNA:ta voidaan monistaa PCR:llä.
PCR Polymeraasiketjureaktio, yksittäinen geeni tai DNA:n pätkä monistaan eksponentiaalisesti käyttäen PCR-laitetta.
RNA Ribonukleiinihappo, osallistuu soluissa proteiinien synteesiin.
Sekvenssi DNA:n/RNA:n emäsjärjestys sekä proteiinin aminohappojärjestys Transkriptio DNA:n perusteella tuotettu RNA-sekvenssi, että ks. RT-PCR.
SISÄLLYSLUETTELO
1. JOHDANTO... 6
2. KIRJALLISUUSKATSAUS... 6
2.1.Jokirapu... 6
2.2 Raskasmetalleja Suomen Järvissä........ 7
2.3. Ravut saastumisen indikaattoreina... 8
2.4. Geenien aktiivisuuden mittaaminen kvantitatiivisella PCR:llä... 9
2.5. QX200 Droplet Digital PCR (Bio-Rad)... 10
3. TYÖN TAVOITTEET... 11
4 AINEISTO JA MENETELMÄT... 12
4.1 Ravut... 12
4.2 Koejärjestelmä... 12
4.2.1. Keinotekoinen järvivesi... 12
4.2.2. Järjestelmän seuranta ja ylläpito... 13
4.3. Raskasmetallialtistukset... 14
4.4. Näytteenotto... 15
4.5. Näytteiden käsittely... 16
4.5.1. RNA:n eristys... 16
4.5.2. cDNA-Synteesi... 16
4.5.3. Digitaalinen PCR... 16
5. TULOKSET ... 17
5.1 Altistuskoe... 17
5.2. Stressigeenien aktivaatio raskasmetallialtistuksessa... 19
6. TULOSTEN TARKASTELU ... 22
7. JOHTOPÄÄTÖKSET... 27
LÄHDELUETTELO... 28
LIITTEET
1 Spectroquant® ohjeet
2 Alukesarjan testiajon tulokset
3 Tiivistelmätaulukko työtä varten suunnitelluista PCR-alukepareista
1. JOHDANTO
Suomessa on 11 toiminnassa olevaa malmikaivosta, ja niillä tiedetään olevan suuriakin ympäristöhaittoja, muun muassa maisemamuutokset, kasvillisuuden poistaminen, päästöt vesistöön ja maaperään, sekä melu (Kaiva.fi 2019). Sulkemisen jälkeenkin niiden vaikutukset ympäristössä on nähtävillä jopa vuosikymmenten kuluttua (Tornivaara ym. 2018).
Kaivostoiminnan tiedetään vapauttavat raskasmetalleja ympäristöön. Raskasmetallipäästöt ovat erityisen vaarallisia, sillä niiden myrkyllisyydestä ja kertymisestä johtuvat haittavaikutukset koskettavat koko eliöstöä, että ihmisiä. (Duffus 2002.)
Bioindikaattoreiden käyttö raskasmetallien vaikutuksesta vesiympäristöön on todettu hyödylliseksi, sillä eliöihin kertyy koko elinajalta metalleja. Tähän tarkoitukseen ravut ovat toimivia eliöitä, sillä niissä kertyminen ympäristöstä on tehokasta. (Kuklina ym. 2014.) Kertyneet metallit aiheuttavat ravussa stressireaktioita, joita voidaan mitata PCR:llä kun valitulle rapulajille toimivat geenit on paikannettu (Meng ym. 2019).
Tämän pro-gradu tutkielman tarkoituksena on ymmärtää kaivostoiminnan vaikutuksia vesiekosysteemissä paremmin, kartoittaa stressigeenien toimintaa ja lajispesifisiä vasteita jokiravulla, sekä kehittää digitaalista PCR-menetelmää stressin mittauksen välineeksi Suomessa. Tutkimuksen lopullisena tavoitteena on arvioida ravun stressigeeniaktivaation mittauksen soveltuvuutta kaivostoiminnan vaikutusten tarkkailuun käytännössä yhtenä bioindikaattori metodina.
2. KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1. Jokirapu
Jokirapu (Astacus astacus) on Suomessa elävä pohjaeläin (kuva 1), jota tavataan luonnonvaraisena Euroopan alueella. Jokirapu elää makeissa vesissä, kaikkiruokaisena pohjaeläimenä sillä on tärkeä rooli hajottamisessa ja vesistön pohjan puhdistajana. Hämärän aikaan ravut ovat aktiivisimmin liikkeellä. (Kilpinen, 2003).
Rapurutto on jokiravun suurin uhka, helposti tarttuva oomykeetti voi tuhota koko vesistön jokirapukannan. Jokiravun kilpailijana ja rapuruton levittäjänä toimii Suomeen Pohjois- Amerikasta istutettu täplärapu (Pacifastacus leniusculus), joka on suurikokoisempi ja
rapuruttoa paremmin kestävä laji. Tämä aiheuttaa sille kilpailussa etulyöntiaseman, täplärapu onkin asettunut moniin vesistöihin, joissa jokiravut ennen menestyivät. (Kilpinen 2003).
Kuva 1. Jokirapu (Astacus astacus), kuva Jenny Makkonen.
2.2. Raskasmetalleja Suomen järvissä
Raskasmetallit ovat tiheydeltään, massaltaan ja järjestysluvultaan suuria metalleja tai puoli metalleja, esimerkiksi lyijy, kupari ja sinkki. Raskasmetalleilla on havaittu olevan haitallisia vaikutuksia niin ihmisen terveyteen kuin ympäristölle. Raskasmetalleja esiintyy luonnollisesti ympäristössä, mutta ihmisen toiminta vapauttaa niitä ympäristöön haitallisia määriä. (Duffus 2002.)
Kaivoksista siirtyy vesistöihin raskasmetalleja, esimerkiksi Talvivaaran läheisyydessä on vedessä ja sedimentissä mitattu normaalia suurempi pitoisuus muun muassa elohopeaa, nikkeliä, kuparia ja sinkkiä (Loukola-Ruskeeniemi ym. 2002). Kaivosonnettomuuksissa puolestaan aiheutuu äkillinen mahdollisesti hyvinkin suuri kuormitus, jonka aiheuttamia ympäristöongelmia voidaan havaita vuosienkin jälkeen. Esimerkiksi Talvivaaran vuoden 2012 kipsialtaan vuodossa pääsi ympäristöön jäteveteen sitoutuneita raskasmetalleja (Turpeinen &
Rainio 2013).
Kaivostoiminnan tiedetään myös lisäävään sulfaattipäästöjä, sillä monien kaivoksien maaperässä on rikkiä, koska malmi esiintyy monesti metallisulfideina. Kaivosvesien mukana kulkeutuukin sulfaatteja ympäröivään vesistöön, jossa ne painuvat raskaampana pohjaan aiheuttaen hapettomia alueita estäessään kaasujen liukenemista. Hapettomassa ympäristössä sulfaatin pelkistäjäbakteerit muuttavat sulfaattia rikkivedyksi ja samalla elohopeaa metyylielohopeaksi. Metyylielohopea on epäorgaanista elohopeaa vaarallisempi, sillä se siirtyy vesieliöihin helpommin, metyylielohopeapitoisuus kaivosalueiden läheisyydessä elävissä kaloissa onkin havaittu korkeaksi.
(
Heinonen-Tanski 2015.)Kaivoksen lopetettua sen ympäristövaikutukset voivat jatkua vielä vuosikymmeniä.
Esimerkiksi 1989-vuonna lopetetun Pohjois-Karjalan Outokummun kaivosalueen pohjavesi on edelleen käyttökiellossa, vaikka pintavesien metalli- ja sulfaattipitoisuudet ovat hitaasti alkaneet laskea kaivoksen lopettamisen jälkeen. Leppävirran Oravikosken kaivos Kotalahti toimi vuosina 1959–1987, sen alueen vesiä ohjataan edelleen vedenpuhdistamoon ennen niiden laskua järveen ja 2016 tehdyn kartoituksen mukaan puhdistamokaan ei riitä poistamaan sulfaattia, rautaa, mangaania ja nikkeliä riittävästi vedestä. (Tornivaara ym. 2018.)
Suomessa toiminnassa olevia malmikaivoksia on kaikkiaan 11, kaivoksien ympäristöhaitat ovat riippuvaisia kaivoksen laajuudesta ja tyypistä. Ympäristöhaittoihin kuuluu muun muassa maisemamuutokset, päästöt vesistöön ja maaperään, kasvillisuuden poistaminen sekä melu.
(Kaiva.fi 2019.) Suljettuja kaivoksia on rekisteröity 37 ympäri maata ja niiden päästöt ovat muun muassa riippuvaisia kaivoksen perustamis- ja sulkemisajan käytännöistä, kaivetusta malmista ja mahdollisista myöhemmistä varatoimista päästöjen estämiseksi. (Tornivaara ym.
2018).
2.3. Ravut saastumisen indikaattoreina
Raskasmetalleilla on huomattu oleva yhteys muun muassa kivirapujen (Austropotamobius torrentium) ja jokirapujen joukkokuolemiin Klabava-joessa Tšekin tasavallassa, johtuen luultavasti metallien kertymisestä kiduksiin ja lihaksiin, sekä siitä johtuvaan immuunipuolustuksen heikkenemiseen. (Svobodá ym. 2017.) Myös punaravulla (Procambarus clarkii) on havaittu kromialtistuksessa antioksidanttisysteemeissä muutoksia, jotka johtivat muun muassa immuunipuolustuksen heikkenemiseen (Meng ym. 2019). Klabava-joen joukkokuolemissa ravuista löydettiin esimerkiksi sinkkiä, kuparia, alumiinia ja rautaa merkittävästi suurempia määriä kiduksista, kuin valitulla kontrollialueella pyydetyistä ravuista (Svobodá ym. 2017).
Ravut on todettu kaloja paremmiksi bioindikaattoreiksi metalleille, kuten sinkille ja kuparille, koska niiden kertyminen rapuun on tehokkaampaa. Suurin osa metalleista on havaittu kertyvän ravuissa hepatopankreakseen (maksa-haima), näitä metalleja on muun muassa kupari, sinkki ja nikkeli. (Kuklina ym. 2014.)
Metallien konsentraation on todettu olevan ravuissa suurempi kaivosalueiden lähellä, kuin vertailualueilla ja alavirtaa kaivoksesta mentäessä pitoisuudet ravuissa pienenevät (Beeser ym.
2007). Kertyneen metallin määrä ravussa kuvastaa ympäristön metallipitoisuutta, kertyminen kuitenkin riippuu myös metallista ja analysoitavasta ravun elimestä (Svobodá ym. 2017).
Jokiravuilla tehdyissä tutkimuksissa on havaittu, että tiettyihin kudoksiin, kuten pyrstölihakseen, kertynyttä rautaa ja elohopeaa voidaan käyttää kuvamaan vesistön raskasmetallipitoisuuksia (Halonen 2000).
2.4. Geenien aktiivisuuden mittaaminen kvantitatiivisella PCR:llä
Polymeraasiketjureaktio (PCR) mahdollistaa halutun deoksiribonukleiinihappo (DNA)-jakson kopioimisen eksponentiaalisesti. PCR on kolmivaiheinen ja vaiheita toistetaan sykleittäin 20- 35 kertaa. Ensimmäisessä aloitusvaiheessa DNA denaturoidaan, eli irrotetaan juosteet toisistaan, korkeassa lämpötilassa. Toisessa vaiheessa alukkeet sitoutetaan yksijuosteisiin DNA-molekyyleihin laskemalla lämpötilaa, viimeisessä vaiheessa DNA-polymeraasi rakentaa alukkeiden välille uuden DNA-juosteen. (Solunetti.fi 2019.)
Ribonukleiinihappo -näytteestä (RNA) saadaan DNA:ta käänteiskopioijaentsyymi-tekniikalla (reverse transcriptase (RT)-PCR), käyttämällä käänteiskopioijaentsyymiä ja tuottamalla kaksijuosteisen RNA-DNA-hybridin yksijuosteisesta RNA:sta. PCR:ssä tästä hybridistä muodostuu DNA-juoste, niin kutsuttua komplementaarista DNA:ta (cDNA). Tämän tekniikan avulla PCR-reaktiota voidaan hyödyntää geenien ilmentymisen mittaamisessa, eli RNA:n kautta saadaan monistumaan tietyssä altistuksessa tai käsittelyssä aktivoituvat geenit, jolloin päästään seuraamaan erilaisten tekijöiden vasteita solutasolla. (Solunetti.fi 2019.)
Kvantitatiivisen RT-PCR:n avulla voidaan mitata geenien aktivoitumista erilaisissa rasituksissa sekä käsittelyissä. Ravuilla geneettisiä vasteita eri tekijöille on tutkittu vasta hyvin vähän. On kuitenkin havaittu muun muassa, että sen avulla voidaan huomata geenien aktivoitumista raskasmetallialtistuessa. Esimerkiksi qRT-PCR:llä on todettu kromialtistuksessa punaravun immuunipuolustuksessa olevan normaalia vähemmän aktivisuutta. (Meng ym. 2019.) Punaravulla on löydetty ferriitiini-geenin olevan yhteydessä raskasmetallialtistuksesta johtuvaan stressireaktioon ja immuunivasteeseen (Liu ym. 2017). HSP70 (heat shock protein
70) on tunnettu stressimittari useilla lajeilla. Geenin tiedetään aktivoituvan useista erilaisista ärsykkeestä, esimerkiksi lämpöstressistä ja muutoksista ympäristössä. Tämän vuoksi se on yleisesti käytetty markkeri kaikenlaisen akuutin stressin tunnistukseen (Jiang ym. 2014).
Muita käytettyjä geenejä ovat esimerkiksi metallotioniini, jonka transkription on huomattu mukailevan metallialtistuksen määrää ja kestoa (Al Kaddissi ym. 2012) ja superoksidaasidismutaasi, jonka toiminta liittyy detoksifikatioon. Oksidatiiviseen stressiin liittyviä geenejä ovat esimerkiksi mitokondriaalinen mnSOD ja solun ulkopuolinen sinkkiriippuvainen superoksidin pilkkoja CuZnSOD, molempia geenejä on käytetty stressimarkkereina punaravulla (Meng ym. 2013).
Proteiinisynteesireitin geeni EIF (eukaryotic translation initiation factor), on stabiilisuuden vuoksi osoitettu punaravulla toimivaksi referenssigeeniksi kvantitatiivisella PCR:llä mitattujen aktiivisuuksien normalisoimiseen (Jiang ym. 2015). Mitokondriaalinen 12S on ravuilla käytetty mitokondrionaalinen referenssigeeni (Al Kaddissi ym. 2012).
2.5. QX200 Droplet Digital PCR (Bio-Rad)
Droplet Digital PCR (ddPCR) on emulsio PCR menetelmä, jolla voidaan määrittää DNA:n absoluuttinen kopiomäärä. Laitteistoon kuluu emulsiopisaroiden valmistuslaite (Droplet Generator) jolla emulsiopisarat muodostetaan ja lukulaite (Droplet Reader) joka lukee fluoresenssin yksittäisistä emulsiopisaroista (kuva 2). PCR reaktio voidaan tehdä tavallisella PCR laitteella. (Hindson ym. 2011).
Kuva 2. QX200 Droplet Digital PCR. Oikealla Droplet Generator, jolla pisarat muodostetaan ja vasemmalla Droplet Reader, joka lukee yksittäiset pisarat. (Bio-Rad.com 2019.)
Digitaalinen PCR perustuu reaktioseoksen muuttamiseen vesi-öljy emulsiopisaroiksi. PCR reaktio tapahtuu jokaisessa näissä pisaroissa erikseen, reaktion jälkeen ddPCR:n lukulaite lukee jokaisen emulsiopisaran fluoresenssin yksitellen ja määrittelee sen positiiviseksi tai negatiiviseksi kynnysarvon mukaan (kuva 3). Positiivisten ja negatiivisten pisaroiden suhteesta laite määrittää näytteessä olleen kohde-DNAn pitoisuuden, tarkemmin ottaen sen absoluuttisen kopiomäärän näytteessä. Absoluuttisen kopioluvun määrittäminen perustuu Poissonin jakaumaan. Verrattuna kvantitatiiviseen PCR:ään (qPCR), ddPCR:än toistettavuus on parempi ja näytteiden välinen hajonta pienempi. Digitaalisella PCR:llä voidaan tutkia joko DNA:ta tai RNA:ta, mutta RNA tulee kääntää ennen analyysia cDNA:ksi. (Hindson ym. 2011).
Kuva 3. Droplet Reader:in muodostamat positiivisten (siniset) ja negatiivisten (harmaat) emulsiopisaroiden pilvet. (Bio-Rad Laboratories PDF. Luettu 5.5.2019.)
Positiivisten ja negatiivisten emulsiopisaroiden erottelu perustuu fluoresenssiin, positiivisilla emulsiopisaroilla on voimakkaampi fluoresenssi negatiivisiin emulsiopisaroihin verrattuna.
Fluoresenssin mittaamiseen voidaan käyttää joko EvaGreen-väriainetta, joka sitoutuu kaikkeen kaksijuosteiseen DNA:han tai TaqMan-tunnistimeen perustuvaa mittausta, jolloin fluoresoiva signaali muodostuu tunnistimen pään irrotessa monistumisen aikana sille spesifisestä DNA- juosteesta. (Bio-Rad Laboratories PDF. Luettu 5.5.2019).
3. TYÖN TAVOITTEET
Tutkimuksen tarkoituksena on ymmärtää paremmin kaivostoiminnan vaikutuksia vesiekosysteemissä. Lisäksi haluttiin arvioida, voisiko stressigeeniaktivaation mittausta mahdollisesti soveltaa kaivostoiminnan vaikutusten tarkkailuun käytännön olosuhteissa. Ravut ovat tunnetusti erittäin herkkiä kaivostoiminnan päästöille ja siitä syystä erinomaisia eläimiä raskasmetallistressin mallintamiseen. Tutkimuksen tavoitteena oli:
1. Soveltaa ja kehittää digitaalista PCR -menetelmää stressin mittauksen välineeksi jokiravulla.
2. Arvioida mahdollisuuksia ddPCR menetelmän soveltamiseen vesiekosysteemien monitoroinnissa.
3. Tutkia jokiravun stressigeenien toimintaa jokiravulla ja etsiä mahdollisia lajispesifisiä vasteita sekä sietokyvyn raja-arvoja.
4. AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1. Ravut
Kokeessa käytettiin jokirapuja, jotka oli ravustettu Kuopion Rytkyjärvestä ja tuotu laboratorioon säilytykseen viileään ja pimeään kylmiöön (+6 °C) ennen kokeen aloitusta.
Ravuista valittiin sattumanvaraisesti 25 koirasta ja 25 naarasta, jotka nostettiin kylmiöstä lämpimään akklimaatioon ryhmäaltaissaan vuorokaudeksi ennen yksittäisiin rapualtaisiin laittoa, koska koealtaiden lämpötila oli 17,0 °C. Ravut sijoitettiin sattumanvaraisesti altaisiin 1- 50 ja niistä otettiin ylös sukupuoli, paino ja pituus sekä mahdolliset vauriot tai muut huomattavat asiat. Rapujen keskipituus oli 7,4 (± 1) cm ja keskipaino 12.2 (± 8,2) g.
4.2. Koejärjestelmä
4.2.1. Keinotekoinen järvivesi
Hana- sekä järviveden epätasaisen laadun vuoksi kokeessa ei voitu käyttää niitä, vaan järjestelmään valmistettiin keinotekoista makeaa pehmeää vettä. (Smith ym. 2002) Keinotekoinen vesi tehtiin siten, että valmistettiin ensin 1 L (S1) ja (S2) liuoksia (taulukko 1).
S3 liuos valmistettiin niin, että 50 l tislattua vettä haettiin saaviin päivää ennen veden vaihtoa ja siihen lisättiin 0,93g Kalsiumkarbonaattia (CaCO3), jotta CaC03 liukenemisen varmistamiseksi johdimme saaviin paineilmaa ja asetimme Eheimin 600 l/h nostopumpun tuottamaan virtausta saaviin. Ennen veden vaihtoa saaviin lisättiin molempia alkuperäisliuoksia (S1 ja S2) 50 ml. Paineilmalla ja pumpulla saatu virtaus jätettiin päälle, jotta liuokset sekoittuisivat koko vesi määrään.
Ennen kokeen alkua rapuja oli säilytetty hanavedessä, joten järjestelmässä käytettiin aluksi hanavettä ja vain kolmasosa vedenvaihdosta tehtiin keinotekoisella vedellä. Näin pyrittiin välttämään ylimääräisen stressin aiheuttamista ravuille.
Taulukko 1. Keinotekoisen pehmeän järviveden stokkiliukset: S1, S2 ja S3 (Smith ym. 2002).
S1 1 L MilliQvettä MgCl2 6H2O 12,16 g CaCl2 6H2O 17,5 g Ca(NO3)2 4H2O 3,542 g
S2 1 L MilliQvettä Na2SO4 16,334 g
KHCO3 2,50 g
NaHCO3 1,67 g
S3 50 L tislattuavettä CaCO3 0,936 g
4.2.2. Järjestelmän seuranta ja ylläpito
Koejärjestelmässä oli viisi allasyksikköä, joissa vesi virtasi kymmenen 2,9 litran rapualtaan läpi 7,5 litran ala-altaaseen. Yhden allassysteemin vesimäärä oli siis 37 l. Rapualtaiden pohjat olivat noin 90 cm ylempänä ala-altaiden pohjasta. Paitsi allasyksikössä 41-50, jossa välimatka oli noin 60 cm koska se siirrettiin ylemmäs ahtaan käsittelytilan tuottamien ongelmien vuoksi. Ala- altaissa Eheimin 600 l/h pumput pumppasivat vettä ylös tuloletkussa rapualtaisiin ja vesi palasi altaista lappoutumalla poistoletkua pitkin ala-altaisiin. Ala-altaan vettä ilmastettiin paineilmalla riittävän happipitoisuuden varmistamiseksi. Yhden koejärjestelmän kymmenen rapualtaan systeeminen esitys kuvassa 4 ja koko järjestelmä kuvassa 5.
Järjestelmän veden laatua seurattiin maanantaista-perjantaihin päivittäin mittaamalla yhdestä rapualtaasta veden lämpötila, pH ja hapen määrä sekä prosentti. Sähkönjohtavuus tarkistettiin viikoittain. Ravut ruokittiin kolme kertaa viikossa ja 50% vedestä vaihdettiin kaksi kertaa viikossa, tyhjentämällä ala-allas ja täyttämällä allas vaihtopäivänä valmistetulla synteettisellä järvivedellä. Ravuille oli asetettu laboratorion valot 12 tunniksi päälle ajastimella.
Kuva 4. Koejärjestelmä koostui kymmenestä pienemmästä rapualtaasta, jonne ravut oli sijoitettu kokeen ajan, ja ala-altaasta, josta vesi pumpattiin rapualtaisiin ja jonne poistoletkua pitkin vesi valui rapualtaista takaisin. Ala-altaisiin johdettiin paineilmaa
Kuva 5. Koko koejärjestelmässä oli viisi kymmenen altaan systeemiä, joissa jokaisessa toi oma veden kierto ja ilmastus. Tulovesiputki oli altaiden yläpuolella ja poisto letku oli tuettu samalle tasolle altaiden pohjan kanssa.
4.3. Raskasmetallialtistukset
Altistukset tehtiin kuparilla ja sinkillä, ravut halutiin altistaa 5 mg/l ja 0,05 mg/l kuparille ja samoille pitoisuuksille sinkille. Metallialkuperäisliuokset (kantaliuokset) CuSO4 + 5 H2O ja ZnSO4 + 7 H2O, joissa halutun metallin pitoisuus oli 3,55 g/l. Kantaliuokset valmistettiin 1000 ml Milli-Q veteen punnitsemalla metalliyhdisteitä taulukon 2 mukaan.
Metalliliuoksia lisättiin altistuksen alkaessa ja vedenvaihtojen yhteydessä taulukon 2 mukaisesti.
Taulukko 2. Kuparin ja sinkin alkuperäisliuokset ja lisätyt altistukset.
Raskasmetalli Kupari (Cu) Sinkki (Zn)
CuSO4 x 5 H2O ZnSO4 x 7 H2O
Stokki (3,55 g/l) 13,948 g 15,606 g
Pitoisuus 5 mg/l 0,05 mg/l 5 mg/l 0,05 mg/l
Alkuperäinen altistus 53 ml 520 µl 53 ml 520 µl
Vedenvaihdossa lisätty 10,6 ml 106 µl 10,6 ml 106 µl
Metallipitoisuuksia ja vesiarvoja tarkkailtiin päivittäin ja tarvittaessa lisättiin hävinnyt määrää kuparia ja sinkkiä pitoisuusvaihtelujen tasaamiseksi. Metallien pitoisuus tarkistettiin vedestä kuparin ja sinkin pitoisuuden mittaamiseen tarkoitetuilla reagenssi Spectroquant®:in Sinkki- ja Kuparitesteillä, niille annettujen ohjeiden (liite 1) mukaan spektrofotometrillä (Ultrospec 2000 UV/Visible Spectrophotometer).
4.4. Näytteenotto
Näytteenotto tapahtui kahdessa 25 ravun erässä, 48 tunnin ja 24 vuorokauden jälkeen altistuksen aloittamisesta. Ravut valittiin näytteenottoon sattumanvaraisesti Googlen random number generator:n avulla, että saatiin saman verran molempia sukupuolia kaikista pitoisuuksista.
Näytteenotto aloitettiin ottamalla elävästä ravusta 500 µl hemolymfaa, hemolymfan talteenoton jälkeen rapu lopetettiin välittömästi ja kuolleesta ravusta irrotettiin muut kudosnäytteet.
Kudokset (kidus, hepatopankreas ja hemolymfa) säilöttiin RNAlateriin (Invitrogen) -20 C RNA:n eristystä varten, RNAlater inhiboi RNA:n hajoamista näytteen käsittelyn ja säilönnän aikana.
4.5. Näytteiden käsittely 4.5.1. RNA:n eristys
RNA eristettiin Nucleospin RNA eristyskittiä (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG) käyttäen, kitin ohjetta noudattaen. Ensimmäisenä näytteet homogenoitiin ja solujen rakennetta rikottiin mekaanisesti homogenoimalla ja kemiallisesti β-merkaptoetanolilla sekä kitin hajotuspuskurilla. Näytteet suodatettiin NucleoSpin suodatuskolonnin lävitse ja näyte käsiteltiin ja siirrettiin ohjeen mukaan NucleoSpin RNA kolonnille.
RNA:n sitouduttua kolonnin silikaatti kalvoon, kalvolta poistettiin siihen jääneet suolat ohjeita seuraten. Näyte puhdistettiin ohjeen mukaan ja eluoitiin (liuotettiin) silikamembraanilta eluutiopuskuria käyttäen puhtaaseen nukleaasivapaaseen eppendorf-keräysputkeen.
RNA:n pitoisuus ja näytteen puhtaus tarkistettiin eristyksen jälkeen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä
4.5.2. cDNA-synteesi
cDNA-synteesiin käytettiin Verso cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) cDNA synteesikittiä. cDNA synteesi tehtiin valmistajan ohjeen mukaan PCR-laiteessa (MJ Research PTC-200).
4.5.3. Digitaalinen PCR
Tähän kokeeseen valittiin nämä viisi geeniä (ferriitiini, HSP70, metallotioniini, mnSOD ja CuZnSOD), kokeessa oli käytössä myös näille referenssigeenit (EIF ja 12S), niiden sekvenssit ja funktiot taulukoituna liitteessä 3. Alukkeet geenien monistamiseen oli suunniteltu ennalta jokiravun transkriptomidatan perusteella, tätä koetta varten. Käytetyt alukkeet oli varmistettu toimiviksi ja optimoitiin ennen varsinaista koetta (liite 2).
Digitaalista PCR-reaktiota varten näytteille valmistettiin mastermix, Evergreen ohjeen mukaan lisäämällä 2 x QX200 ddPCR Supermix (Bio-Rad EvaGreen, aluke, näyte ja nukleaasivapaata vettä), tämän jälkeen reaktioseos jaettiin 96 kuoppalevylle.
PCR:ää varten näyte piti muuttaa vielä emulsiopisaroiksi, ne muodostettiin siirtämällä koko näyte emulsiopisaroiden muodostuslaitteeseen (Droplet Generator, Bio-Rad QX100), laitteen kahdeksankuoppaiselle levylle, johon lisättiin emulsiopisaran muodostus öljyä (Droplet Generation Oil, Bio-Rad), levy suljettiin kumitiivisteellä ja syötettiin laitteeseen. Käsittelyn jälkeen emulsiopisaroita sisältävä näyte siirrettiin 96-kuoppalevylle, joka oli yhteen sopiva emulsiopisaroiden lukulaitteen (Droplet Reader, PX-100 Bio-Rad) kanssa. Kuoppalevy suljettiin lämpökäsiteltävällä foliolla kuoppalevyn lämpösulkijalaitteella (PCR Plate Sealer, Bio-Rad PX1), ja syötettiin PCR:ään (MJ Research PTC-200) ohjelma ohjeen (QX200 ddPCR EvaGreen Supermix) mukaan.
Emulsiopisaroiden fluopresenssi mitattiin emulsiopisaroiden lukulaitteella ja tulokset siirrettiin taulukointiohjelmaan myöhempiä analyyseja varten.
5. TULOKSET 5.1. Altistuskoe
Kaikkiaan 50 ravusta yksi piti lopettaa ennen viimeistä näytteenottoa, sen kunnon äkillisen huonontumisen takia. Tämä teki kokeen kokonaiskuolleisuudeksi 2%. Kuollut rapu oli isommassa kuparialtistuksessa, Cu5-pitoisuudessa olleet ravut olivat käytökseltään kokeen loppua kohden muita rapuja passiivisempia ja ruokahaluttomampia.
Kuparin vaihtelu molemmissa altistuksissa oli suurta koko kokeen ajan, kupari pitoisuus vedessä väheni vuorokauden sisällä lisäämisestä huomattavasti ja kuparin kantaliuosta lisättiin useamman kerran viikossa. Sinkin vaihtelu ei ollut yhtä suurta ja sen lisääminen tapahtui harvemmin, usein vain vedenvaihdon yhteydessä. Vaihteluiden ero näkyy kuvasta 6 pistediagrammilla merkitty mittausten tulokset vuorokautena altistuksen aloittamisesta, mittausten jälkeen pitoisuus altaissa tasattiin haluttuun pitoisuuteen (5 mg/l tai 0,05 mg/l).
Veden ominaisuuksien vaihtelu oli pientä kokeen ajan ja altaiden väliset erot olivat myös minimaaliset, keskiarvot ja keskihajonta nähtävillä taulukossa 4. Veden pH pysyi joka altaassa neutraalina ja vesi oli happirikasta, sähkönjohtavuudessakaan ei havaittu suuria eroja ja lämpötila pysyi altaissa 17 °C:ssa.
Kuva 6. Kuparin ja sinkin vaihtelu ala-altaissa kokeen ajan. Molempien altisteiden pitoisuudet tasattiin tarvittaessa haluttuihin 0,05 mg/l tai 5mg/l (vahvistettu viiva) testin jälkeen. Mittauspisteet (x-akselilla) on nimetty altistuksen aloittamisesta kuluneiden vuorokausien (24 h) mukaan.
Taulukko 3. Veden ominaisuuksien päivittäisten mittausten keskiarvot kokeen aikana.
Altistus pH O2 (%) EC (µS/cm) Lämpötila (°C)
CTRL 7,28 (± 0,22) 98,61 (± 1,13) 140,50 (± 9,55) 17,03 (± 0,20) Cu5 7,43 (± 0,32) 98,69 (± 0,77) 130,46 (± 7,50) 17,08 (± 0,16) Cu005 7,08 (± 0,18) 99,26 (± 0,73) 136,62 (± 4,51) 17,14 (± 0,23) Zn5 7,55 (± 0,39) 99,19 (± 0,54) 137,16 (± 8,48) 17,11 (± 0,25) Zn005 7,45 (± 0,43) 98,04 (± 2,86) 132,60 (± 5,47) 17,06 (± 0,18)
5.2. Stressigeenien aktivaatio raskasmetallialtistuksessa
Zn005-pitoisuudessa ferritiinin vaste ravuissa kasvoi ensin vuorokauden sisällä altistuksesta, mutta pidemmällä aikavälillä se väheni kolmanneksella. Samanlainen muutos on nähtävillä pistediagrammissa esitettynä CuZnSOD:lla, sekä myös metallotioniinilla (kuva 7a). HSP70 aktiivisuus puolestaan laski 48 tunnin kuluessa altistuksesta, mutta pidemmällä aikavälillä sen ilmentyminen kolminkertaistui. 48 tunnin näytteenotossa mnSOD ilmentyi vähäisesti, jonka jälkeen sen ilmentyminen laski vielä alhaisemmaksi.
Samanlainen tulos havaittiin myös Zn5-pitoisuudessa (kuva 7b). Ferritiini, metallotioniini ja CuZnSOD nousivat vuorokauden sisällä, mutta laskivat 24 vuorokauden aikana. Lasku oli lievin metallotioniinilla. HSP70 käyttäytyi samalla tavalla kuin Zn005-pitoisuudessa, ensin vaste laski, josta seurasi pidemmällä aikavälillä kohonnut vaste kontrolliin (Kuva 7c) verrattuna. Laskua nähtiin myös mnSOD:in ilmentymisessä jo ensimmäisellä näytteenotolla ja se väheni lisää pidemmällä aikavälillä.
Ferritiinin, HSP70 sekä CuZnSOD vasteet olivat Cu005-pitoisuudessa samantapaiset, kun sinkki altistuksissa (kuva 8A), erona oli mnSOD:n vaste; se käyttäytyi HSP70 kanssa samoin, mutta ilmentyminen oli moninkertaista. Metallotioniinin arvot puolestaan eivät juurikaan muutuneet pidemmällä aikavälillä.
Cu5-pitoisuudessa (Kuva 8B) ferritiini ja CuZnSOD käyttäytyvät pistediagrammissa edelleen samoin. Samanlainen vaste kuin Zn5-pitoisuudessa havaittiin mnSOD:ssa, sen vaste laskee 48 tunnissa ja lasku jatkui myös pidemmällä aika välillä. Tässä altistuksessa HSP70 vaste laski myös pidemmällä aika välillä mnSOD tapaisesti, mutta lievemmin. Metallotioniini ei aktivoitunut Cu5-käsittelyssä kontrollia (Kuva 8C) enempää ja sen ilmentyminen laski pidemmällä aika välillä.
Kuva 7. Altistuskokeen tulokset sinkin (A) 0,05 mg/l (Zn005) pitoisuudessa ja (B) 5 mg/l (Zn5) pitoisuudessa, sekä kontrollissa (C). Katkoviiva erottaa näytteenottopisteet 48 h ja 24 vrk. Tutkitut geenit järjestyksessä CuZnSOD, ferritiini (Fer.), HSP70, metallotioniini (Meth.) ja mnSOD.
A
B
C
Kuva 8. Altistuskokeen tulokset kuparin (A) 0,05 mg/l (Cu005) pitoisuudessa ja (B) 5 mg/l (Cu5) pitoisuudessa, sekä (C) kontrollissa. Katkoviiva erottaa näytteenottopisteet 48 h ja 24 vrk. Tutkitut geenit järjestyksessä CuZnSOD, ferritiini (Fer.), HSP70, metallotioniini (Meth.) ja mnSOD.
A
B
C
6. TULOSTEN TARKASTELU
Kokeessa halusimme tutkia rapujen stressigeenien aktivaatiota altistuksessa raskasmetalleille.
Geenien aktivaatiota tutkittiin Droplet Digital PCR:llä, joka mahdollistaa erittäin tarkan ja toistettavan mittauksen myös geeneistä, joiden ilmentymisen muutokset ja käsittelyvasteet voivat olla hyvinkin pieniä. Tutkittavat geenit valittiin muilla rapulajeilla saatujen tutkimustulosten perusteella. Raskasmetallialtistus tehtiin lisäämällä veteen kuparia ja sinkkiä kahdessa pitoisuudessa (5 mg/l ja 0,05 mg/l) ja näytteenotto tapahtui kahdessa eri aikapisteessä (48h ja 24 vrk). Kokeessa havaittiin, että tiettyjen geenien osalta raskasmetallistressin aiheuttamaa geenien aktivaatiota voitiin hyvin mitata hepatopankreaksesta otetusta näytteestä.
Sinkin ja kuparin altistuksissa havaittiin selvästi samankaltaisia muutoksia vasteessa, suuruusluokat vaihtelivat pitoisuudesta ja metallista riippuen. Toimivaksi osoittautuneet geenit HSP70, ferriitiini ja CuZnSOD olivatkin vasteeltaan samankaltaisia kaikissa altistuksissa.
Matalammassa sinkkialtistuksessa (Zn005) reagoivat voimakkaimmin HSP70, ferriitiini ja CuZnSOD, niistä ei yksikään erottunut vasteellaan erityisesti toisistaan. Muihin käsittelyihin verrattuna Zn005 aiheutti pienimmät ja tasaisimmat reagoinnit, mnSOD:lla ja metallotioniinilla ei havaittu juurikaan vastetta ilmentymisessä. Korkeammassa sinkkialtistuksessa (Zn5) jokaisen geenin vaste oli pienempää sinkki pitoisuutta voimakkaampaa, etenkin ferriitiinin ja CuZnSOD:n vaste oli selkeämpi kuin Zn005-pitoisuudessa. Nämä geenit siis toimivat erittäin loogisesti ja geneettinen vaste oli kytköksissä myös altistuksen pitoisuuteen. Matalammassa Zn005-pitoisuudessa havaittiin mnSOD:lla suuri vaste, mutta vastaavaa ilmentymisen nousua ei havaittu toisessa sinkkikäsittelyssä. Metallotioniinilla vaste nousi 48 h näytteessä korkeaksi ja laski pidemmällä aikavälillä. Sinkin aiheuttamaa stressiä on tutkittu pääasiassa bioakkumulaation menetelmin, esimerkiksi eurooppalaisen makean veden ravun Austropotamobius pallipes ja amerikkalaisen punaisen suoravun (P. clarkii) eri elinten pitoisuuksia vertaamalla, ja siten osoitettu ympäristössä olevan ylimääräisen sinkin kertyvän ravun kudoksiin, suurin kertymä on havaittu sinkin kulkua säätelevässä hepatopankreassa (Güner 2010, Kuklina ym. 2014). Euroopan hummerin (Homarus gammarus) on havaittu laboratorio kokeissa olevan herkkä sinkin pitoisuuden nousulle ja korkealla pitoisuudella voi olla vaikutuksia kymotrypsiinin (ruuansulatusentsyymi) aktiivisuuteen. Vähemmän selkeitä, mutta samantapaista reaktiota on havaittu isotaskuravulla (Cancer pagurus) altistuksissa, osoittaen että osa lajeista on herkempiä sinkin altistukselle kuin toiset. (Götze ym. 2014.) Herkkyydessä voi olla myös populaatioiden välisiä eroja, sillä saastuneilla alueilla on
luonnonvalintaa saastetta kestävälle yksilöille. Tämä voi vaikuttaa stressireaktioihin näillä aluilla (Klerks & Weis 1987).
Matalammassa kuparialtistuksessa (Cu005) havaitut vasteet olivat hyvin samankaltaisia, kuin Zn005-altistuksessa, sillä ilmentymiset olivat yhtä voimakaita HSP70, ferritiini ja CuZnSOD osalta. Geenin HSP70 24 vuorokauden näytteenotto pisteessä oli jostain syystä lievästi heikompi vaste muihin ryhmiin verrattuna. Mitokondriaalinen mnSOD ja metallotioniini reagoivat puolestaan voimakkaasti, mutta niiden ilmentymiset ovat ristiriidassa muiden käsittelyiden vasteisiin nähden. Aikaisemmissa kokeissa on havaittu kadmium altistuksessa, että mnSOD voi olla haastava geeni raskasmetalli altisuksesta aiheutuvan stressiin mittaamiseen. Toisaalta, samassa kokeessa metallotioniinin vaste korreloi altistuksen pitoisuuden, sekä punarapuun kertyneen kadmiumin määrään kanssa voimakkaasti. (Al Kaddissi ym. 2012.)
Tässä tutkimuksessa korkeammassa kuparialtistuksessa (Cu5) havaitut geneettiset vasteet olivat yllättävän matalia, ottaen huomioon kuparin hävikin altaissa johtuen todennäköisesti metallin akkumulaatiosta rapuihin ja koejärjestelmän biofilmiin, sekä rapujen käytöksen ja niiden kohonneen kuolleisuuden tässä koeryhmässä. Tässä käsittelyssä voimakkain vaste oli ferritiinillä ja CuZnSOD:lla, HSP70 ei vastannut muissa käsittelyissä tapahtunutta ilmentymistä, mikä voi viitata joko virheeseen tai suuren kuparipitoisuus aiheuttaa muutokseen geenin vasteessa. Myös mnSOD ja metallotioniini ilmentyivät vähemmän kuin muissa käsittelyissä. Kuparin on sinkin tavoin huomattu kertyvän suurimmaksi osaksi haitallisissa pitoisuuksissa hepatopankreaan, mutta kuparilla havaittu suurta kertymissä myös Cambarus bartoni rapujen kiduksissa. Ruosteravulla (Orconectes rusticus) on todettukin kuparin haitallisuuden johtuvansiitä, että kupari aiheuttaa häiriötä kaasujenvaihdossa hengityselimistössä. (Güner 2010.) Kuparin on löydetty olevan myös erittäin voimakas inhibiittori proteasomien (valkuaisen hajotuslaitos solussa) toiminnalle selkärangattomilla lajeilla, muun muassa Euroopan hummerilla ja isotaskuravulla havaittiin kupari altistuksessa yhteys proteasomin aktiivisuuden vähenemiseen (Götze ym. 2014). Kuparialtistuksesta johtuvaa stressiä on tutkittu myös selkärankaisilla, esimerkiksi seeprakalalla (Danio rerio) suuri kuparipitoisuus korreloi merkittävästi oksidatiiviseen stressin aiheuttamiin vahinkoihin kalan elimistössä, sekä maksan CAT-geenin vasteeseen (Craig ym. 2007).
Ferritiinillä oli havaittavissa selvä vaste, joka oli nähtävissä kaikissa käsittelyissä, lyhyellä aikavälillä sen aktivaatio kasvoi ja pidemmällä aikavälillä sen vaste laski kontrolliin verrattuna.
Vaste oli voimakkuudeltaan hyvin samanlaista eri käsittelyissä, lukuun ottamatta Cu5-altistusta jossa se oli muita heikompi. Tulos on yhdenmukainen aiempiin tutkimuksiin verrattuna, sillä punaravulla on myös havaittu suorassa sinkkialtistuksessa, että ferritiinin suurin vaste hepatopankreassa havaitaan ensimmäisen vuorokauden aikana, jonka jälkeen sen vaste vähenee. Tästä johtuen sen onkin ajateltu olevan mukana immuunipuolustuksen toiminnassa raskasmetalli altistuksessa (Liu ym. 2017). Ferritiiniä on käytetty myös oksidatiivisen stressin tutkimiseen ja on havaittu, että ferriitiini aktivoituessaan vähensi reaktiivisten happiradikaalien kertymistä ihmisen ihosoluihin (Orino ym. 2001). Oksidatiivisessa stressissä ferriitiinin kohonnut vaste on yhdistetty myös selkärangattomilla soluvaurioiden estoon, rantakotilolla (Littorina littorea) on huomattu ferritiinin estävän myrkyllisen hydroksyyliradikaalin muodostumisen ja näin lieventävän elimistön vaurioita oksidatiivisessa stressissä (Larade &
Storey 2004).
CuZnSOD aktivoitui vuorokauden aikana, mutta ilmeneminen oli kontrolliakin heikompaa 24 vuorokauden altistuksessa kaikissa käsitellyissä. Havaintoja tukee, että kromialtistuksessa punaravussa CuZnSOD on huomattu reagoivan voimakkaasti kontrolliin verrattuna ensimmäisen vuorokauden aikana (Meng ym. 2019). Punaravulla todettiinkin CuZnSOD osallistuvan kupari pitoisuuden säätelyyn ja kuparin detoksifikointiin ja sen poistamiseen hepatopankreasta. Oksidatiivisesta stressistä selviämiseen punaravun on todettu lisäävän antioksidanttisten entsyymien, kuten CuZnSOD, määrää ja käyttämällä aktiivista glutationia palauttaen elimistön tasapainon. (Zhao ym. 2019.) Isokatkaravulla (Macrobrachium rosenbergii) CuZnSOD yhdistettiin myös Lactococcus garvieae loisesta johtuvaan stressiin, loisaltistuksessakin sen vaste väheni hepatopankreassa pidemmällä aikavälillä (Cheng ym.
2006).
Lämpöshokkiproteiini HSP70:n osalta vaste raskasmetallistressiin oli päinvastainen, sillä kontrolliin verrattuna sen aktivaatio väheni kaikissa käsittelyissä vuorokauden aikana, pidemmällä aikavälillä sen ilmeneminen kasvoi ja nousi kontrollia korkeammaksi, kaikissa ryhmissä korkeampaa kuparialtistusta lukuun ottamatta. Tämä saattoi olla virhe tai kontaminaatio. On myös mahdollista että kuparialtistus aiheutti ravuissa erilaisen vasteen, sillä myös matalammassa kuparipitoisuudessa ilmentymisen kasvu oli kontrolliin verrattuna vähäisempää kuin sinkkialtistuksessa. Myös sinkillä HSP70 vasteen kasvu oli suurempaa pienemmässä pitoisuudessa. Aikaisemmissa tutkimuksissa punaravulla HSP70 on todettu
olevan toimiva mittari kromialtistuksessa, sillä punaravulla HSP70 vaste hepatopankreaksesssa on erittäin suurta 24 tunnin kromialtistuksessa (Meng ym.2019). HSP70:n on todettu olevan indikaattoriproteiini kiduksien kudosvahingosta, mutta toisaalta punaravulla on myös todettu, että sen vaste ei ole kiduksissa herkin mahdollinen mittari nitriitin aiheuttaman stressireaktiosta (Jiang ym. 2014). Punaravulla HSP70 yhdistetään sen kykyyn selviytyä monissa lämpötiloissa, HSP70 aktivoituu lämpötilan aiheuttamassa stressissä niin lihaksissa kuin päähermostossa, sillä on siis selvästi rooli punaravun elimistön tasapainon ylläpidossa eri lämpötilojen elinympäristöissä (Liang ym. 2013). Amerikan hummerilla (Homarus americanus) HSP70 onkin todettu olevan yleinen solureaktio lämpötilastressiin monissa eri kudoksissa (Spees ym 2002).
Metallotioniini ja mnSOD eivät toimineet odotetusti kokeessa, sillä niiden ilmentyminen näytti vaihtelevan satunnaisesti. Kuitenkin korkeammassa kupari- ja sinkkialtistuksessa mnSOD:lla vaste oli voimakasta, pienemmissä pitoisuuksissa sen vaste ei kuitenkaan vastaa havaittua mallia. Tässä koejärjestelyssä metallotioniinillä ei ole havaittavissa mitään pitoisuus- tai altistusvastetta. Vaikka metallotioniinia pidetään tärkeänä tekijänä sinkin, kuparin ja kadmiumin säätelyssä selkärangattoman elimistössä ja sen synteesin lisääntymisen on huomattu Crassostrea virginica simpukassa vaikuttavan tehokkaampaan metallien sidontaan (Roesijadi 1994). Toisaalta, Biomphalaria glabrata kotilolla tehdyssä tutkimuksessa ei metallotioniinin vasteen kanssa havaittu yhteyttä kadmium altistuksen tai lämpötilan muuttamisesta aiheutuvan stressin kanssa, metallotioniini voikin vaikuttaa metallien aiheuttamaan stressiin sitomalla niitä tehokkaasti metallien vaihtoreaktion kautta ja näin vähentää altistuksesta johtuvaa stressiä jo ennen sen havaintoa (Niederwanger ym. 2017). On myös mahdollista geenien toimivan paremmin jossain toisessa kudoksessa tai eri aikapisteissä. Metallotioniinin tosin tiedetään ilmentyvän parhaiten eläimillä elimien peruskudoksissa (Kaegi & Scäffer 1988).
Molemmissa tapauksissa, mutta etenkin mnSOD:lla, tuloksista poistettiin useampi saatu luku laskennallisten ongelmien takia. Tämä kavensi jo valmiiksi pientä otantaa, ja on mahdollista että heikot geneettiset vasteet ovat jääneet huomaamatta. Geenin mnSOD toimivuutta stressireaktion mittarina on aikaisemmissa kokeissa testattu sinipunaravun (Cherax quadricarinatus) immuunipuolustuksessa. Tässä tutkimuksessa sen vaste kasvoi merkittävästi loisstressin alaisena 72h tunnin sisällä Aeromonas hydrophila -bakteerin injektoimisesta rapuun (Liua ym. 2013). Sen vasteen on todettu myös nousevan Hydra vulgaris -polyyppieläimellä solun stressi reaktiossa, kuten saasteen aiheuttamassa oksidatiivisessä stressissä. Tästä syystä
MnSOD:n on ajateltu olevan potentiaalinen indikaattori vesiekosysteemin saastuneisuudelle (Dash ym. 2007).
Kokeessa oli pieni otanta, sillä yhdessä altistuksessa oli vain viisi rapua ja DNA eristettiin vain yhdestä kudoksesta, hepatopankreasta. HSP:eiden vasteessa on myös havaittu merkittäviä kudosten välisiä eroja norjan hummerissa (Nephrops norvegicus), hepatopankreassa HSP vaste on nähtävissä lihaskudosta hitaammin lämpötilastressissä (Chang 2005). Hepatopankreas on kuitenkin osoittautunut hyväksi kudokseksi stressivasteiden mittaamiseen esimerkiksi punaisella suoravulla (Shen ym. 2014). Lisäksi on todettu, että useat muut tekijät, esimerkiksi lämpötila, voivat vaikuttaa raskasmetallien toksisuuteen Orconectes immunis ravulla tehdyssä tutkimuksessa (Khan ym. 2006).
Sinkin pitoisuuden mittauskitti saapui kuparin kittiä myöhemmin ja ensimmäiset mittaukset epäonnistuivat, jonka vuoksi mittauspisteitä oli vähemmän. Sinkin äkilliset nousut ja laskut kokeen alussa johtuivat vääristä tuloksista pitoisuusmittauksissa ja niistä johtuvista lisäyksistä.
Sinkin pysyvyyden perusteella sen pitoisuus ei ole luultavasti juurikaan vaihdellut kokeen aikana mittausdatan heilunnasta huolimatta. Virhelähteenä kokeessa on myös mahdolliset epäpuhtaudet, jotka ovat tulleet rapujen alkuperäisestä hanavedestä. Koska ravuille ei haluttu aiheuttaa rasitetta, nopean olojen muutoksen takia, hanavesi vaihdettiin hitaasti vedenvaihdoissa keinotekoiseen pehmeään järviveteen. Tämän takia kokeessa on mahdollisesti kiertänyt hanavesijäämiä. Vesi arvoista voidaan kuitenkin päätellä, ettei suurempia eroavuuksia ollut allasjärjestelmien välillä.
Saamieni tulosten perusteella HSP70, ferriitiini ja CuZnSOD voisivat soveltua jokiravun raskasmetalleille altistumisesta johtuvan stressin mittaamiseen. Tulos on yhteneväinen aikaisempien tutkimusten kanssa, sillä nämä geenit ovat havaittu soveltuvan stressin mittaamiseen myös muilla rapulajeilla, kuten punaravulla. Menetelmää ja stressin mittaamista ravulla tulee kuitenkin edelleen kehittää, sillä kokeessa käytimme vain yhtä kudosta ja vaste voi olla helpommin havaittavissa jossain toisessa kudoksessa. Myös otantamme oli erittäin pieni ja voi vääristää tuloksia, niin näiden toimivaksi todettujen geenien osalta kuin huonoksi toteamamme geenien metallotioniini ja mnSODpuolesta. Geenien toimivuutta tulisikin tutkia isommalla otannalla ja useammassa aikapisteessä. Tässä koejärjestelyssä ravut mahdollisesti tottuivat raskasmetallialtistukseen ja vaste väheni kontrolliin verrattuna 24 vuorokauden näytteissä, vaikka geenit olivat aikaisemmin ilmentyneet vahvastikin. Kokeita olisi voinut myös jatkaa pidemmälle, jolloin kuolleisuus isommassa kuparipitoisuudessa olisi luultavasti noussut.
Mielenkiintoista olisi tutkia myös toisen Suomen sisävesien rapulajin täpläravun, stressireaktiota raskasmetallialtistuksessa. On myös mahdollista, että toinen laji voisi soveltua paremmin raskasmetallialtistuksesta johtuvan stressin mittaamiseen. Muita raskasmetalleja olisi myös mielenkiintoista käyttää tutkimuksessa, esimerkiksi kromin on havaittu aiheuttavan selkeästi mitattavia geenitason stressivasteita punaravulla
Kokeen tulokset antavat viitettä, että jokirapua voitaisiin käyttää bioindikaattorilajina sisävesissä mittaamaan raskasmetallien aiheuttamaa stressiä ja vaikutusta eliöihin pienissäkin pitoisuuksissa. Näin kaivostoiminnan vaikutuksia ekosysteemiin olisi mahdollista havaita kauempanakin kaivoksesta ja todeta vaikutus suoraan ekosysteemissä elävästä eliöstä.
7. JOHTOPÄÄTÖKSET
Stressigeeniaktivaatiokoe onnistui jokiravuilla ja jokiravulle pystyttiin paikantamaan muutamia stressigeenejä. Havaittiinkin, että useat kokeeseen valituista geeneistä ilmensivät raskasmetallialtistusta. Kupari ja sinkki altistukset selvästi aiheuttivat kuormitusta jokiravun elimistössä, joka ilmeni niin käytöksessä isomassa kupari pitoisuudessa kuin stressigeenien ilmentymisessä kaikissa pitoisuuksissa. Ferriitiini, CuZnSOD ja HSP70 osoittautuivat kokeen perusteella jokiravulla raskasmetallialtistuksesta johtuvalle stressille soveltuviksi indikaattoreiksi, jopa pienemmissä pitoisuuksissa.
Droplet digital PCR osoittautui herkäksi ja toistettavaksi menetelmäksi raskasmetallialtistuksen stressivasteen mittaamiseen. Käyttämällä ddPCR saatiin selvät ja tarkat vasteet useimmista valituista alukkeista ja saadut tulokset vastasivat toisiaan käsittelyiden välillä. Tätä PCR- menetelmää voitaisiin kokeen perusteellä käyttää havaitsemaan stressigeenien aktivaatiota pienemissäkin pitoisuuksissa jokiravulla.
Menetelmä voisikin toimia mahdollisen raskasmetalli saastumisen ilmaisijan jokiravun elinympäristössä ja tuloksia voisivat toimia pohjana jatkotutkimuksille luonnonoloissa.
Jatkotutkimuksia tulisi tehdä kuitenkin lisää, muun muassa tämän tutkimuksen pienen otannan takia.
LÄHDELUETTELO
Al Kaddissi S., Legeay A, Elia A.C., Gonzalez P., Floriani M., Cavalie I., Massabuau J.C., Gilbin R., Simon O. 2012. Mitochondrial gene expression, antioxidant responses, and histopathology after cadmium exposure. Environmental Toxicology. 29(8):893-907.
Beeser J.M., Brumbaugh W.G., May T.W., Schmitt C.J. 2007. Biomonitoring of Lead, Zinc, and Cadmium in Streams Draining Lead-Mining and Non-Mining Areas, Southeast Missouri, USA. Environmental Monitoring and Assessment. 129:227–241.
Bio-Rad Laboratories. Droplet Digital™ PCR Applications Guide. Pdf-tiedosto. <www.bio- rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf> Luettu 5.5.2019.
Bio-Rad www-sivusto. ”QX200 Droplet Digital PCR System”. <http://www.bio-rad.com/en- fi/product/qx200-droplet-digital-pcr-system?ID=MPOQQE4VY>. Luettu 18.6.2019.
Chang E.S. 2005. Stressed-out lobsters: crustacean hyperglycemic hormone and stress proteins.
Integrative and Comparative Biology. 45(1): 43–50.
Cheng W., Tung Y.-H., Liu C.-H., Chen J.-C. 2006. Molecular cloning and characterisation of copper/zinc superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) from the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Fish & Shellfish Immunology. 21(1): 102-112.
Craig P.M., Wood C.M., McClelland G.B. 2007. Oxidative stress response and gene expression with acute copper exposure in zebrafish (Danio rerio). the American Physiological Society.
293 (5): R1882-R1892.
Dash B., Metz R., Huebner H.J., Porter W., Phillips T.D. 2007. Molecular characterization of two superoxide dismutases from Hydra vulgaris. Gene. 31(387(1-2)): 93-108.
Duffus J.H. 2002.International union of pure and applied chemistry chemistry and human health division clinical chemistry section, commission on toxicology: ”heavy metals”-meaningless term? (IUPAC Technical Report). Pure and Applied Chemistry. 74(5):793–807.
Güner U. 2010. “Bioaccumulation of Some Heavy Metals in Freshwater Crayfish”, In Impact, Monitoring and Management of Environmental Pollution ed. Ahmed El Nemr Chapter ISBN: 978-1-60876-487-7. Nova Science Publishers. Hauppauge Newyork.
USA.
Götze S., Bose A., Sokolova I.M., Abele D., Saborowski R. 2014. The proteasomes of two marine decapod crustaceans, European lobster (Homarus gammarus) and edible crab (Cancer pagurus), are differently impaired by heavy metals. Comparative Biochemistry and Physiology.
Part C (162):62-69.
Halonen T. 2000. Jokirapu raskasmetallien kerääjänä ja bioindikaattorina musteliuskealueiden vesissä. Pro gradu. Kuopion yliopisto.
Hindson B.J., Ness K.D., Masquelier D.A., Belgrader P., Heredia N.J., Makarewicz A.J., Bright I.J., Lucero M.Y., Hiddessen A.L., Legler T.C., Kitano T.K., Hodel M.R., Petersen J.F., Wyatt P.W., Steenblock E.R., Shah P.H., Bousse L.J., Troup C.B., Mellen J.C., Wittmann D.K., Erndt N.G., Cauley T.H., Koehler P.T., So A.P., Dube S., Rose K.A., Montesclarosn L., Wang S., Stumbo D.P., Hodges S.P., Romine S., Milanovich F.P., White H.E., Regan J.F., Karlin- Neumann G.A., Hindson C.A., Saxonov S., Colston B.W. 2011. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry.
83:8604–8610.
Heinonen -Tanski H. 2015. Sulfaatti, elohopea ja kala. Ympäristö ja terveys. 1:54-60.
Jiang Q.-C., Pan D.-M., Tian J., Jiang G.-Z., Yang J.-X., Ren Q. 2014. Effect of nitrite stress on gene expression of antioxidant enzymes, heat shock protein 70, and metabolic enzymes in gill tissue of adult red swamp crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Crustacean Biology.
34(6):754-759.
Jiang H., Qian Z., Lu W., Ding H., Yu H., Wang H., Li J. 2015. Identification and characterization of reference genes for normalizing expression data from red swamp crawfish Procambarus clarkii. International Journal of Molecular Sciences. 16(9):21591-605.
Kaegi J.H.R., Schaeffer A. 1988. Biochemistry of metallothionein. Biochemistry. 27(23):8509- 8515.
Kaiva.fi www-sivusto. 2019. “Kaivostoiminta”. <
https://kaiva.fi/kaivannaisala/kaivostoiminta/ >. Luettu 11.7.2019
Kaiva.fi www-sivusto. 2019. “Ympäristövaikutukset”. < https://kaiva.fi/vastuullinen- toiminta/ymparistovaikutukset/ >. Luettu 11.7.2019
Khan M. A. Q., Ahmed S. A., Catalin B., Khodadoust A., Ajayi O., Vaughn M. 2006. Effect of temperature on heavy metal toxicity to juvenile crayfish, Orconectes immunis (Hagen).
Environmental Toxicology. 21:513-520.
Kilpinen K., 2003. Suomen Rapu: Ravun nousu, tuho ja tulevaisuus. Helsinki. Edita Publishing Oy.
Klerks P.L., Weis J.S. 1987. Genetic adaptation to heavy metals in aquatic organisms: A review.
Environmental Pollution. 45(3):173-205.
Kuklina I., Kouba A., Burlic M., Horka I., Duris Z., Kozak P. 2014. Accumulation of heavy metals in crayfish and fish from selected Czech reservoirs. BioMed Research International.
2014, 306103. https://doi.org/10.1155/2014/306103.
Larade K. Storey K.B. 2004. Accumulation and translation of ferritin heavy chain transcripts following anoxia exposure in a marine invertebrate. The Journal of Experimental Biology. 207:
1353-1360.
Loukola-Ruskeeniemi K., Kantola M., Halonen T., Seppänen K., Henttonen P., Kallio E., Kurki H., Savolainen H. 2002. Mercury-bearing black shales and human Hg intake in eastern Finland:
impact and mechanisms. Environmental Geology. 43:283-297.
Liang S., Yu X., Wood D.E., Jolly E.R. 2013. Hsp70 and Hsp90 are differentially expressed in crayfish muscle and neurons after heat stress. Research and Reports in Biology. 4:41-50.
Liu Q.-N., Xin Z.-Z., Liu Y., Wang Z.-F-, Chen Y.-J., Zhang D.-Z., Jiang S.-H., Chai X.-Y., Zhou C.-L., Tang B.-P. 2017. A ferritin gene from Procambarus clarkii, molecular characterization and in response to heavy metal stress and lipopolysaccharide challenge. Fish
& Shellfish Immunology. 63:297-303.
Liua Y.-T., Chang C.-I, Hseuc J.-R., Liu K.-F., Tsai J.-M. 2013. Immune responses of prophenoloxidase and cytosolic manganese superoxide dismutase in the freshwater crayfish Cherax quadricarinatus against a virus and bacterium. Molecular Immunology. 56(1-2):72-80.
Meng Q., Chen J., Xu C., Huang Y., Wang Y. T., Zhai X., Gu W., Wang W. 2013. The characterization, expression and activity analysis of superoxide dismutases (SODs) from Procambarus clarkii. Aquaculture. 406-407:131-140.
Meng X., Hong L., Yang T.-T., Liu Y., Jiao T., Chu X.-H., Zhang D.-Z., Wang J.-L., Tang B.- P., Liu Q.-N., Zhang W.-W., He W.-F., 2019. Transcriptome-wide identification of differentially expressed genes in Procambarus clarkii in response to chromium challenge. Fish and Shellfish Immunology. 87:43-50.
Niederwanger M., Dvorak M., Schnegg S., Pedrini-Martha V., Bacher K., Bidoli M., Dallinger R. 2017. Challenging the Metallothionein (MT) gene of Biomphalaria glabrata: unexpected response patterns due to cadmium exposure and temperature sStress. International Journal of Molecular Sciences. 18:1747; doi:10.3390/ijms18081747.
Orino K., Lehman L., Tsuji Y., Ayaki H., Torti S.V., Torti F.M. 2001. Ferritin and the response to oxidative stress. Biochemical Journal. 357(Pt 1): 241-247.
Roesijadi G. 1994. Metallothionein induction as a measure of response to metal exposure in aquatic animals. Environmental Health Perspectives. 102:91-95.
Shen H., Hu Y., Ma Y., Zhou X., Xu Z., Shui Y. 2014. In-Depth transcriptome analysis of the red swamp crayfish Procambarus clarkii. Plos One 9(10):e110548.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110548.
Smith E.J., Davison W., Hamilton-Taylor J. 2002. Methods for preparing synthetic freshwater.
Water Research. 36:1286-1296.
Solunetti.fi www-sivustot. 2019. “Nukleiinihappojen Monistaminen.”
<http://www.solunetti.fi/fi/solubiologia/nukleiinihappojen_monistaminen/2/> Luettu 10.6.2019.
Solunetti.fi www-sivustot. 2019. “RT-PCR”. <http://www.solunetti.fi/fi/solubiologi/rtpc/2//>.
Luettu 10.6.2019.
Spees J.F., Chang S.A., Snyder M.J., Chang E.S. 2002. Thermal acclimation and stress in the American lobster, Homarus americanus: equivalent temperature shifts elicit unique gene expression patterns for molecular chaperones and polyubiquitin. Cell Stress & Chaperones.
7(1):97-106.
Svobodá J., Douda K., Fischer D., Lapsanka N., Vlach P. 2017. Toxic and heavy metals as a cause of crayfish mass mortality from acidified headwater streams. Ecotoxicology. 26:261-270.
Tornivaara A., Räisänen M.L., Kovalainen H., Kauppi S. 2018. Suljettujen ja hylättyjen kaivosten kaivannaisjätealueiden jatkokartoitus (KAJAK II). Suomen ympäristökeskuksen raportteja 12/2018. Suomen ympäristökeskus. Kulutuksen ja tuotannon keskus.
Turpeinen A., Rainio R. 2013. Talvivaaraselvitys. Ympäristöministeriön raportteja. 2/2013.
Ympäristöministeriö.
Zhao D., Zhang X., Liu D., Ru S. 2019. Cu accumulation, detoxification and tolerance in the red swamp crayfish Procambarus clarkii. Ecotoxicology and Environmental Safety. 175:201- 207.
LIITE 1 1(1) Spectroquant® ohjeet
Spectroquant® Cu-ohje
Näytettä* 5,0 ml Pipetoi koeputkeen
Cu-1 Reagenssia 1 mittaluskikallinen (kitissä) Vorteksoi hyvin Cu-2 Reagenssi 5 tippaa (pullo vaakatasossa) Vorteksoi 5 minuutin reaktio aika,
Kaada kyvettiin
Aallonpituus 605 nm spektrofotometria (Ultorspec 2000) laskepitoisuus: factor 4,44 Cu-5 ja factor 1 Cu-005
* nollana käytettiin 5,0 ml tislattua vettä
Spectroquant® Zn-ohje
Näytettä* 5,0 ml Pipetoi koeputkeen
Zn-1 Reagenssia 5 tippaa (pullo vaakatasossa) Vorteksoi Zn-2 Reagenssi 2 tippaa (pullo vaakatasossa) Vorteksoi Zn-3 Reagenssi 5 tippaa (pullo vaakatasossa) Vorteksoi Zn-4 Reagenssi 3 tippaa (pullo vaakatasossa) Vorteksoi 3 minuutin reaktio aika,
Zn-5 Reagenssi 1 mittaluskikallinen (kitissä) Sekoita kunnes kokonaan liuennut
Isobutyyli metyyli ketoni 5,0 ml Pipetoi
Sekoita 30 s ja jätä seisomaan 2 min.
Siirrä pasteurpipetillä orgaaninen faasi päältä kyvettiin (Eppendorfin UVette®-kyvetti), jätä seisomaan 3 min
Aallonpituus 565 nm spektrofotometria (Ultrospec 2000) laskepitoisuus: factor: 1 Cu-5 ja Cu-005
* nollana käytettiin 5,0 ml tislattua vettä
LIITE 2 1(1) Alukesarjan testiajon tulokset
LIITE 3 1(2) Tiivistelmätaulukko työtä varten suunnitelluista PCR-alukepareista
Taulukko 1. Geenipankkisekvenssi, jonka perusteella sopiva ortologi etsittiin alukesuunnittelun pohjaksi transkriptomidatasta.
Alukkeen nimi
Sekvenssi 5’-3’ Geenipankkisekvenssi1 (laji)
Geenin nimi / funktio
EIF
156F: ACACGGACATGCAAAAGTTCA
KR135170 (P. clarkii)
Eukaryotic translation initiation factor 5 alpha
/ref. gene 275R: TGGTAGTCAGCACGCTTCAC
18S
561F: ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG
AF235959 (A. astacus) 18S ribosomal RNA / ref.
699R: ACGTGACAGTAAGCACCAGG gene
12S
164F: AGATCAAGGTGCAGCTTATGAGT
AY151525 (A. astacus) 12S ribosomal RNA /mitoch. ref. gene 340R: CACCTTAAATGAAAGCGACGGG
Meth
95F: TTCTCGTTCCATCGTCCTGC
AF199482 (P. leniusculus)
Metallothionein /heavy metal binding and
detoxification 251R: CTTGCACCCAGACGTACACT
Ferr
18F: TGAAGACACTGAAGCTGCCA
X90566 (P. leniusculus)
Ferritin/ Iron storage, detoxification and immune response 134R: CTCATCCCTGGAAGTGCTGT
2(2) Taulukko 2. Geenipankkisekvenssi (mMnSOD, Hsp70 ja exCuZnSOD), jonka perusteella sopiva
ortologi etsittiin alukesuunnittelun pohjaksi transkriptomidatasta.
mMnSOD
212F: TTCAAGTACAGCAGCCAGGT DQ866921 (P.
leptodactylus)
Mitochondrial manganese superoxide
dismutase /detoxification and
oxidative stress 314R: GCACCTCTAGCCTCACCAAG
Hsp70
4F: AGGTGTTGGACAGTCTTGGC
KU613104 (A. astacus)
Heat Shock Protein 70 kDA /stress reactions caused by heat or toxic
chemicals 108R: GGTTCCCAGGTCAATGCCAA
exCuZnSOD
387F: ACATCTCACTGGACCCCTCA
AF122900 (P. leniusculus)
Extracellurar copper/zinc superoxide dismutase
/detoxification and oxidative stress 529R: GATACCACATCCTGAGCGGG
