Kokeessa halusimme tutkia rapujen stressigeenien aktivaatiota altistuksessa raskasmetalleille.
Geenien aktivaatiota tutkittiin Droplet Digital PCR:llä, joka mahdollistaa erittäin tarkan ja toistettavan mittauksen myös geeneistä, joiden ilmentymisen muutokset ja käsittelyvasteet voivat olla hyvinkin pieniä. Tutkittavat geenit valittiin muilla rapulajeilla saatujen tutkimustulosten perusteella. Raskasmetallialtistus tehtiin lisäämällä veteen kuparia ja sinkkiä kahdessa pitoisuudessa (5 mg/l ja 0,05 mg/l) ja näytteenotto tapahtui kahdessa eri aikapisteessä (48h ja 24 vrk). Kokeessa havaittiin, että tiettyjen geenien osalta raskasmetallistressin aiheuttamaa geenien aktivaatiota voitiin hyvin mitata hepatopankreaksesta otetusta näytteestä.
Sinkin ja kuparin altistuksissa havaittiin selvästi samankaltaisia muutoksia vasteessa, suuruusluokat vaihtelivat pitoisuudesta ja metallista riippuen. Toimivaksi osoittautuneet geenit HSP70, ferriitiini ja CuZnSOD olivatkin vasteeltaan samankaltaisia kaikissa altistuksissa.
Matalammassa sinkkialtistuksessa (Zn005) reagoivat voimakkaimmin HSP70, ferriitiini ja CuZnSOD, niistä ei yksikään erottunut vasteellaan erityisesti toisistaan. Muihin käsittelyihin verrattuna Zn005 aiheutti pienimmät ja tasaisimmat reagoinnit, mnSOD:lla ja metallotioniinilla ei havaittu juurikaan vastetta ilmentymisessä. Korkeammassa sinkkialtistuksessa (Zn5) jokaisen geenin vaste oli pienempää sinkki pitoisuutta voimakkaampaa, etenkin ferriitiinin ja CuZnSOD:n vaste oli selkeämpi kuin Zn005-pitoisuudessa. Nämä geenit siis toimivat erittäin loogisesti ja geneettinen vaste oli kytköksissä myös altistuksen pitoisuuteen. Matalammassa Zn005-pitoisuudessa havaittiin mnSOD:lla suuri vaste, mutta vastaavaa ilmentymisen nousua ei havaittu toisessa sinkkikäsittelyssä. Metallotioniinilla vaste nousi 48 h näytteessä korkeaksi ja laski pidemmällä aikavälillä. Sinkin aiheuttamaa stressiä on tutkittu pääasiassa bioakkumulaation menetelmin, esimerkiksi eurooppalaisen makean veden ravun Austropotamobius pallipes ja amerikkalaisen punaisen suoravun (P. clarkii) eri elinten pitoisuuksia vertaamalla, ja siten osoitettu ympäristössä olevan ylimääräisen sinkin kertyvän ravun kudoksiin, suurin kertymä on havaittu sinkin kulkua säätelevässä hepatopankreassa (Güner 2010, Kuklina ym. 2014). Euroopan hummerin (Homarus gammarus) on havaittu laboratorio kokeissa olevan herkkä sinkin pitoisuuden nousulle ja korkealla pitoisuudella voi olla vaikutuksia kymotrypsiinin (ruuansulatusentsyymi) aktiivisuuteen. Vähemmän selkeitä, mutta samantapaista reaktiota on havaittu isotaskuravulla (Cancer pagurus) altistuksissa, osoittaen että osa lajeista on herkempiä sinkin altistukselle kuin toiset. (Götze ym. 2014.) Herkkyydessä voi olla myös populaatioiden välisiä eroja, sillä saastuneilla alueilla on
luonnonvalintaa saastetta kestävälle yksilöille. Tämä voi vaikuttaa stressireaktioihin näillä aluilla (Klerks & Weis 1987).
Matalammassa kuparialtistuksessa (Cu005) havaitut vasteet olivat hyvin samankaltaisia, kuin Zn005-altistuksessa, sillä ilmentymiset olivat yhtä voimakaita HSP70, ferritiini ja CuZnSOD osalta. Geenin HSP70 24 vuorokauden näytteenotto pisteessä oli jostain syystä lievästi heikompi vaste muihin ryhmiin verrattuna. Mitokondriaalinen mnSOD ja metallotioniini reagoivat puolestaan voimakkaasti, mutta niiden ilmentymiset ovat ristiriidassa muiden käsittelyiden vasteisiin nähden. Aikaisemmissa kokeissa on havaittu kadmium altistuksessa, että mnSOD voi olla haastava geeni raskasmetalli altisuksesta aiheutuvan stressiin mittaamiseen. Toisaalta, samassa kokeessa metallotioniinin vaste korreloi altistuksen pitoisuuden, sekä punarapuun kertyneen kadmiumin määrään kanssa voimakkaasti. (Al Kaddissi ym. 2012.)
Tässä tutkimuksessa korkeammassa kuparialtistuksessa (Cu5) havaitut geneettiset vasteet olivat yllättävän matalia, ottaen huomioon kuparin hävikin altaissa johtuen todennäköisesti metallin akkumulaatiosta rapuihin ja koejärjestelmän biofilmiin, sekä rapujen käytöksen ja niiden kohonneen kuolleisuuden tässä koeryhmässä. Tässä käsittelyssä voimakkain vaste oli ferritiinillä ja CuZnSOD:lla, HSP70 ei vastannut muissa käsittelyissä tapahtunutta ilmentymistä, mikä voi viitata joko virheeseen tai suuren kuparipitoisuus aiheuttaa muutokseen geenin vasteessa. Myös mnSOD ja metallotioniini ilmentyivät vähemmän kuin muissa käsittelyissä. Kuparin on sinkin tavoin huomattu kertyvän suurimmaksi osaksi haitallisissa pitoisuuksissa hepatopankreaan, mutta kuparilla havaittu suurta kertymissä myös Cambarus bartoni rapujen kiduksissa. Ruosteravulla (Orconectes rusticus) on todettukin kuparin haitallisuuden johtuvansiitä, että kupari aiheuttaa häiriötä kaasujenvaihdossa hengityselimistössä. (Güner 2010.) Kuparin on löydetty olevan myös erittäin voimakas inhibiittori proteasomien (valkuaisen hajotuslaitos solussa) toiminnalle selkärangattomilla lajeilla, muun muassa Euroopan hummerilla ja isotaskuravulla havaittiin kupari altistuksessa yhteys proteasomin aktiivisuuden vähenemiseen (Götze ym. 2014). Kuparialtistuksesta johtuvaa stressiä on tutkittu myös selkärankaisilla, esimerkiksi seeprakalalla (Danio rerio) suuri kuparipitoisuus korreloi merkittävästi oksidatiiviseen stressin aiheuttamiin vahinkoihin kalan elimistössä, sekä maksan CAT-geenin vasteeseen (Craig ym. 2007).
Ferritiinillä oli havaittavissa selvä vaste, joka oli nähtävissä kaikissa käsittelyissä, lyhyellä aikavälillä sen aktivaatio kasvoi ja pidemmällä aikavälillä sen vaste laski kontrolliin verrattuna.
Vaste oli voimakkuudeltaan hyvin samanlaista eri käsittelyissä, lukuun ottamatta Cu5-altistusta jossa se oli muita heikompi. Tulos on yhdenmukainen aiempiin tutkimuksiin verrattuna, sillä punaravulla on myös havaittu suorassa sinkkialtistuksessa, että ferritiinin suurin vaste hepatopankreassa havaitaan ensimmäisen vuorokauden aikana, jonka jälkeen sen vaste vähenee. Tästä johtuen sen onkin ajateltu olevan mukana immuunipuolustuksen toiminnassa raskasmetalli altistuksessa (Liu ym. 2017). Ferritiiniä on käytetty myös oksidatiivisen stressin tutkimiseen ja on havaittu, että ferriitiini aktivoituessaan vähensi reaktiivisten happiradikaalien kertymistä ihmisen ihosoluihin (Orino ym. 2001). Oksidatiivisessa stressissä ferriitiinin kohonnut vaste on yhdistetty myös selkärangattomilla soluvaurioiden estoon, rantakotilolla (Littorina littorea) on huomattu ferritiinin estävän myrkyllisen hydroksyyliradikaalin muodostumisen ja näin lieventävän elimistön vaurioita oksidatiivisessa stressissä (Larade &
Storey 2004).
CuZnSOD aktivoitui vuorokauden aikana, mutta ilmeneminen oli kontrolliakin heikompaa 24 vuorokauden altistuksessa kaikissa käsitellyissä. Havaintoja tukee, että kromialtistuksessa punaravussa CuZnSOD on huomattu reagoivan voimakkaasti kontrolliin verrattuna ensimmäisen vuorokauden aikana (Meng ym. 2019). Punaravulla todettiinkin CuZnSOD osallistuvan kupari pitoisuuden säätelyyn ja kuparin detoksifikointiin ja sen poistamiseen hepatopankreasta. Oksidatiivisesta stressistä selviämiseen punaravun on todettu lisäävän antioksidanttisten entsyymien, kuten CuZnSOD, määrää ja käyttämällä aktiivista glutationia palauttaen elimistön tasapainon. (Zhao ym. 2019.) Isokatkaravulla (Macrobrachium rosenbergii) CuZnSOD yhdistettiin myös Lactococcus garvieae loisesta johtuvaan stressiin, loisaltistuksessakin sen vaste väheni hepatopankreassa pidemmällä aikavälillä (Cheng ym.
2006).
Lämpöshokkiproteiini HSP70:n osalta vaste raskasmetallistressiin oli päinvastainen, sillä kontrolliin verrattuna sen aktivaatio väheni kaikissa käsittelyissä vuorokauden aikana, pidemmällä aikavälillä sen ilmeneminen kasvoi ja nousi kontrollia korkeammaksi, kaikissa ryhmissä korkeampaa kuparialtistusta lukuun ottamatta. Tämä saattoi olla virhe tai kontaminaatio. On myös mahdollista että kuparialtistus aiheutti ravuissa erilaisen vasteen, sillä myös matalammassa kuparipitoisuudessa ilmentymisen kasvu oli kontrolliin verrattuna vähäisempää kuin sinkkialtistuksessa. Myös sinkillä HSP70 vasteen kasvu oli suurempaa pienemmässä pitoisuudessa. Aikaisemmissa tutkimuksissa punaravulla HSP70 on todettu
olevan toimiva mittari kromialtistuksessa, sillä punaravulla HSP70 vaste hepatopankreaksesssa on erittäin suurta 24 tunnin kromialtistuksessa (Meng ym.2019). HSP70:n on todettu olevan indikaattoriproteiini kiduksien kudosvahingosta, mutta toisaalta punaravulla on myös todettu, että sen vaste ei ole kiduksissa herkin mahdollinen mittari nitriitin aiheuttaman stressireaktiosta (Jiang ym. 2014). Punaravulla HSP70 yhdistetään sen kykyyn selviytyä monissa lämpötiloissa, HSP70 aktivoituu lämpötilan aiheuttamassa stressissä niin lihaksissa kuin päähermostossa, sillä on siis selvästi rooli punaravun elimistön tasapainon ylläpidossa eri lämpötilojen elinympäristöissä (Liang ym. 2013). Amerikan hummerilla (Homarus americanus) HSP70 onkin todettu olevan yleinen solureaktio lämpötilastressiin monissa eri kudoksissa (Spees ym 2002).
Metallotioniini ja mnSOD eivät toimineet odotetusti kokeessa, sillä niiden ilmentyminen näytti vaihtelevan satunnaisesti. Kuitenkin korkeammassa kupari- ja sinkkialtistuksessa mnSOD:lla vaste oli voimakasta, pienemmissä pitoisuuksissa sen vaste ei kuitenkaan vastaa havaittua mallia. Tässä koejärjestelyssä metallotioniinillä ei ole havaittavissa mitään pitoisuus- tai altistusvastetta. Vaikka metallotioniinia pidetään tärkeänä tekijänä sinkin, kuparin ja kadmiumin säätelyssä selkärangattoman elimistössä ja sen synteesin lisääntymisen on huomattu Crassostrea virginica simpukassa vaikuttavan tehokkaampaan metallien sidontaan (Roesijadi 1994). Toisaalta, Biomphalaria glabrata kotilolla tehdyssä tutkimuksessa ei metallotioniinin vasteen kanssa havaittu yhteyttä kadmium altistuksen tai lämpötilan muuttamisesta aiheutuvan stressin kanssa, metallotioniini voikin vaikuttaa metallien aiheuttamaan stressiin sitomalla niitä tehokkaasti metallien vaihtoreaktion kautta ja näin vähentää altistuksesta johtuvaa stressiä jo ennen sen havaintoa (Niederwanger ym. 2017). On myös mahdollista geenien toimivan paremmin jossain toisessa kudoksessa tai eri aikapisteissä. Metallotioniinin tosin tiedetään ilmentyvän parhaiten eläimillä elimien peruskudoksissa (Kaegi & Scäffer 1988).
Molemmissa tapauksissa, mutta etenkin mnSOD:lla, tuloksista poistettiin useampi saatu luku laskennallisten ongelmien takia. Tämä kavensi jo valmiiksi pientä otantaa, ja on mahdollista että heikot geneettiset vasteet ovat jääneet huomaamatta. Geenin mnSOD toimivuutta stressireaktion mittarina on aikaisemmissa kokeissa testattu sinipunaravun (Cherax quadricarinatus) immuunipuolustuksessa. Tässä tutkimuksessa sen vaste kasvoi merkittävästi loisstressin alaisena 72h tunnin sisällä Aeromonas hydrophila -bakteerin injektoimisesta rapuun (Liua ym. 2013). Sen vasteen on todettu myös nousevan Hydra vulgaris -polyyppieläimellä solun stressi reaktiossa, kuten saasteen aiheuttamassa oksidatiivisessä stressissä. Tästä syystä
MnSOD:n on ajateltu olevan potentiaalinen indikaattori vesiekosysteemin saastuneisuudelle (Dash ym. 2007).
Kokeessa oli pieni otanta, sillä yhdessä altistuksessa oli vain viisi rapua ja DNA eristettiin vain yhdestä kudoksesta, hepatopankreasta. HSP:eiden vasteessa on myös havaittu merkittäviä kudosten välisiä eroja norjan hummerissa (Nephrops norvegicus), hepatopankreassa HSP vaste on nähtävissä lihaskudosta hitaammin lämpötilastressissä (Chang 2005). Hepatopankreas on kuitenkin osoittautunut hyväksi kudokseksi stressivasteiden mittaamiseen esimerkiksi punaisella suoravulla (Shen ym. 2014). Lisäksi on todettu, että useat muut tekijät, esimerkiksi lämpötila, voivat vaikuttaa raskasmetallien toksisuuteen Orconectes immunis ravulla tehdyssä tutkimuksessa (Khan ym. 2006).
Sinkin pitoisuuden mittauskitti saapui kuparin kittiä myöhemmin ja ensimmäiset mittaukset epäonnistuivat, jonka vuoksi mittauspisteitä oli vähemmän. Sinkin äkilliset nousut ja laskut kokeen alussa johtuivat vääristä tuloksista pitoisuusmittauksissa ja niistä johtuvista lisäyksistä.
Sinkin pysyvyyden perusteella sen pitoisuus ei ole luultavasti juurikaan vaihdellut kokeen aikana mittausdatan heilunnasta huolimatta. Virhelähteenä kokeessa on myös mahdolliset epäpuhtaudet, jotka ovat tulleet rapujen alkuperäisestä hanavedestä. Koska ravuille ei haluttu aiheuttaa rasitetta, nopean olojen muutoksen takia, hanavesi vaihdettiin hitaasti vedenvaihdoissa keinotekoiseen pehmeään järviveteen. Tämän takia kokeessa on mahdollisesti kiertänyt hanavesijäämiä. Vesi arvoista voidaan kuitenkin päätellä, ettei suurempia eroavuuksia ollut allasjärjestelmien välillä.
Saamieni tulosten perusteella HSP70, ferriitiini ja CuZnSOD voisivat soveltua jokiravun raskasmetalleille altistumisesta johtuvan stressin mittaamiseen. Tulos on yhteneväinen aikaisempien tutkimusten kanssa, sillä nämä geenit ovat havaittu soveltuvan stressin mittaamiseen myös muilla rapulajeilla, kuten punaravulla. Menetelmää ja stressin mittaamista ravulla tulee kuitenkin edelleen kehittää, sillä kokeessa käytimme vain yhtä kudosta ja vaste voi olla helpommin havaittavissa jossain toisessa kudoksessa. Myös otantamme oli erittäin pieni ja voi vääristää tuloksia, niin näiden toimivaksi todettujen geenien osalta kuin huonoksi toteamamme geenien metallotioniini ja mnSODpuolesta. Geenien toimivuutta tulisikin tutkia isommalla otannalla ja useammassa aikapisteessä. Tässä koejärjestelyssä ravut mahdollisesti tottuivat raskasmetallialtistukseen ja vaste väheni kontrolliin verrattuna 24 vuorokauden näytteissä, vaikka geenit olivat aikaisemmin ilmentyneet vahvastikin. Kokeita olisi voinut myös jatkaa pidemmälle, jolloin kuolleisuus isommassa kuparipitoisuudessa olisi luultavasti noussut.
Mielenkiintoista olisi tutkia myös toisen Suomen sisävesien rapulajin täpläravun, stressireaktiota raskasmetallialtistuksessa. On myös mahdollista, että toinen laji voisi soveltua paremmin raskasmetallialtistuksesta johtuvan stressin mittaamiseen. Muita raskasmetalleja olisi myös mielenkiintoista käyttää tutkimuksessa, esimerkiksi kromin on havaittu aiheuttavan selkeästi mitattavia geenitason stressivasteita punaravulla
Kokeen tulokset antavat viitettä, että jokirapua voitaisiin käyttää bioindikaattorilajina sisävesissä mittaamaan raskasmetallien aiheuttamaa stressiä ja vaikutusta eliöihin pienissäkin pitoisuuksissa. Näin kaivostoiminnan vaikutuksia ekosysteemiin olisi mahdollista havaita kauempanakin kaivoksesta ja todeta vaikutus suoraan ekosysteemissä elävästä eliöstä.