Tulehdustekijäaltistusten vaikutusta CPPED1-geenin ilmentymistasoon tutkittiin kvantitatii-visella polymeraasiketjureaktio- eli PCR-menetelmällä (ABI Prism 7500, Applied Biosys-tems®, Foster City, CA, USA) käyttäen kaupallisia kittejä (TaqMan/Applied Biosystems®).
Endogeenikontrollina käytettiin PPIA-geeniä eli syklofiliini A -geeniä.
Kohdegeenin ilmentyminen SGBS-rasvasoluissa normalisoitiin endogeenikontrollin, PPIA, ilmentymiseen käyttäen kaavaa: 2(Ct kohdegeenin kalibraattori – Ct kohdegeenin näyte)
/2(Ct PPIA kalibraattori – Ct PPIA näyte)
(Livak & Schmittgen, 2001), jossa kalibraattori on satunnainen näyte, jolla on maksimi Ct-arvo, ja Ct on threshold-sykli.
33 3.7 siRNA-hiljentäminen
CPPED1-geenin roolia ja toimintaa tutkittiin hiljentämällä geenin ilmentyminen käyttämällä RNAi-teknologiaa, jossa kypsiin rasvasoluihin transfektoitiin CPPED1-geenin siRNA:ta (small interfering RNA) käyttämällä kaupallista HiPerFect-transfektioreagenssia (Qiagen).
Lämmitettyä (+37 °C) siRNA-altistusmediumia (DMEM/F-12 -medium, 20 nM insuliini, 10 µg/ml transferriini, 33 µM biotiini, 17 µM pantotenaatti) ja CPPED1-siRNA:ta (20 µM)/ ne-gatiivikontrollia (Scrambled) pipetoitiin eppendorf-putkiin, siten että lopullinen siR-NA/Scrambled -kontsentraatio oli kaivossa 50 nM (1 x reaktioseos: 88 µl siRNA-medium; 3 µl 20 µM siRNA/Scrambled). Putkia sekoitettiin koeputkisekoittimella varovasti. Jokaiseen putkeen lisättiin HiPerFect-reagenssia (1 x reaktioseos: 9 µl HiPerFect) pipetoiden edestakai-sin ja napsutellen putkea. Putkia inkuboitiin 12 min huoneenlämmössä. 12-kuoppalevyille vaihdettiin siRNA-altistus -medium 1,1 ml mediumia/kaivo. Jokaiseen kuoppalevyn kaivoon lisättiin 100 µl CPPED1-siRNA tai Scrambled -seosta koskematta pipetillä mediumiin.
Kuoppalevyjä inkuboitiin 72 tuntia +37 °C soluviljelykaapissa, jonka jälkeen aloitettiin Glu-cose uptake -koe.
3.7.1 Glucose uptake -koe
CPPED1-geenin hiljentymisen vaikutusta rasvasolun insuliiniherkkyyteen tutkittiin Glucose uptake -kokeella, jossa kypsät altistamattomat SGBS-rasvasolut sekä siRNA-altistetut että Scrambled-kontrollisolut, altistettiin insuliinille (1 µM) tai insuliinille (1 µM) ja Wortmannin-reagenssille (100 nM) ja glukoosiseokselle, jossa oli 0,5 µCi/ml radioaktiivista 2-Deoksi-D-[3H]-glukoosia (Amersham TRK672, GE Healthcare, UK) ja 0,2 mM D-glukoosia.
SGBS-rasvasolut pestiin kaksi kertaa esilämmitetyllä KRH-puskurilla (Krebs-Ringer-Hepes-puskurilla: 118 mM NaCl; 4,8 mM KCl; 2,5 mM CaCl2; 1,2 mM MgSO4; 20 mM HEPES; pH säädetty 7,4 NaOH). Insuliinikaivoihin lisättiin 0,5 ml ja basaalikaivoihin 1 ml esilämmitettyä KRH-puskuria, jonka jälkeen kuoppalevyjä inkuboitiin 2 tuntia +37 °C soluviljelykaapissa.
34 Wortmannin reagenssia (100 nM, Sigma) lisättiin 15 µl sille tarkoitettuihin insuliinikaivoihin 30 minuuttia ennen työn seuraavaa vaihetta.
Insuliinikaivoihin lisättiin 0,5 ml KRH-puskuria, jossa oli insuliinia (0,6 µl insuliinia/1 ml KRH -puskuria eli 1 µM insuliinia/kaivo). Tämän jälkeen levyjä sekoitettiin varovasti ja in-kuboitiin 20 min +37 °C soluviljelykaapissa. Tämän jälkeen kaikkiin kaivoihin lisättiin 0,5 ml glukoosiseosta (1 µl/ml 2-deoksi-D-[3H]-glukoosi (0,5 µCi/ml/kaivo) ja 10 µl/ml esilämmitet-ty D-glukoosi (0,2 mM/kaivo); KRH -puskuri) ja inkuboitiin 15 min huoneenlämmössä.
Reaktio pysäytettiin laittamalla kuoppalevyt jäille ja pesemällä rasvasolut kaksi kertaa jää-kylmällä PBS:llä. Pesujen jälkeen rasvasoluille lisättiin 200 µl 0,2 N NaOH ja inkuboitiin 1,5 h huoneenlämmössä sekoittelijalla.
Inkuboinnin jälkeen rasvasolut raaputettiin irti kuopista ja näytettä otettiin 100 µl eppendorf-putkeen ja siihen lisättiin 1 ml OptiPhase Hisafe 2 -reagenssia (PerkinElmer, USA). Näytteis-tä määritettiin radioaktiivisuudet tuikelaskurilla (1450 MicroBeta® TriLux, Wallack). Määri-tetyt näytteiden radioaktiivisuudet normalisoitiin näytteiden proteiinipitoisuudella.
3.7.2 Proteiinipitoisuuden määrittäminen
Glucose uptake -kokeen näytteiden totaaliproteiinikontsentraatiot mitattiin käyttäen DC pro-tein assay -kittiä (BIORAD). Valmistettiin standardit pipetoimalla 0,2 N NaOH:ia tarvittava määrä valmiiksi eppendorf-putkiin jaettuihin proteiinilaimennoksiin (40 µl, 10 mg/ml) siten että saatiin seuraavat standardit: 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5 ja 2 mg/ml. Proteiinimääritys tehtiin 96-kuoppalevyllä (ELISA microplate, Greiner bio-one, Saksa) pipetoimalla kaivoihin 5 µl standardeja ja näytteitä duplikaatteina levylle. Jokaiseen levyn kuoppaan lisättiin 25 µl reagenssi A*:ta (20 µl reagenssi S/ 1 ml reagenssi A) ja 200 µl reagenssi B:tä ja inkuboitiin huoneenlämmössä sekoittelijalla 5 min. Tämän jälkeen levyä inkuboitiin huoneenlämmössä vielä 10 min, jonka jälkeen mitattiin absorbanssit 650–750 nm (Wallac Viktor 1420, Perkin Elmer).
35 3.8 Tulosten analysointi ja tilastointi
Tulosten analysointi suoritettiin ΔΔCtmenetelmän avulla Microsoft Office Excel 2007 -ohjelmalla. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Windowsin GraphPad Prism 5 -ohjelmaa (GraphPad Software, San Diego California USA), jonka avulla määritettiin tulosten keskiar-vot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet. Tilastolliset merkitsevyydet analy-soitiin ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastollisen merkitsevyy-den rajana pidettiin P < 0,05.
36 4 TULOKSET
4.1 Tulehdustekijäaltistus
Lihavuuteen liittyvän matala-asteinen tulehdustilan tiedetään vaikuttavan geenien ilmentymi-seen (Wellen & Hotamisligil, 2003) ja näin ollen haluttiin tutkia tulehdustekijöiden vaikutusta CPPED1-geenin ilmentymiseen kypsissä SGBS-rasvasoluissa.
4.1.1 TNF-α -altistus
TNF-α vaikutti CPPED1-geenin ilmentymiseen merkitsevästi, kun TNF-α -altistusaika oli 24, 48 ja 72 h (Kuva 2). TNF-α -altistusajan ollessa 24 tuntia sytokiinipitoisuudella 0,1 ng/ml (P=0,0947) geenin ilmentyminen lisääntyi, mutta koska vaihtelu oli niin suurta, tulos ei ollut tilastollisesti merkitsevä (Kuva 2D). TNF-α -altistusajan ollessa 24 h CPPED1-geenin ilmen-tyminen lisääntyi 21,9 % 1 ng/ml sytokiinipitoisuudella (P=0,0197) ja 20,9 prosenttia 10 ng/ml sytokiinipitoisuudella (P=0,013). Altistuajan ollessa 48 tuntia, CPPED1-geenin ilmen-tyminen näytti lisääntyvän sytokiinipitoisuuden kontsentraation mukaan (0,1; 1 & 10 ng/ml), mutta CPPED1-geenin ilmentymisen lisääntyminen oli tilastollisesti merkitsevä vain 1 ng/ml TNF-α -pitoisuudella (P=0,0484), jolloin ilmentyminen lisääntyi 15 % (Kuva 2F). CPPED1:n ilmentyminen lisääntyi 72 tunnin TNF-α -altistuksen kaikilla pitoisuuksilla. Tilastollisesti merkitsevästi CPPED1:n ilmentyminen lisääntyi 10 ng/ml sytokiinipitoisuudella (P=0,0059), jolloin ilmentyminen lisääntyi 34 %. CPPED1-geenin ilmentymisessä ei tapahtunut muutok-sia 3, 6 ja 12 tunnin TNF-α -altistusajoilla (Kuvat 2A, 2B ja 2C).
37 Kuva 2. TNF-α -altistuksen vaikutus CPPED1-geenin mRNA:n ilmentymiseen SGBS-rasvasoluissa eri pitoisuuk-silla (0; 0,1; 1 ja 10 ng/ml) ja eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 h). Tulokset ovat CPPED1 mRNA:n ilmen-tymistasoja,jotka on saatu suhteuttamalla geenin ilmentymistaso endogeenikontrollin (PPIA) ilmentymis-tasoon. Kuvassa on esitetty keskiarvot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on ana-lysoitu ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P < 0,05
** P <0,01 *** P < 0,001.
4.1.2 TGF-β1 -altistus
Kuvassa 3D näkyy, että CPPED1-geenin ilmentyminen laski 15,3 prosenttia 10 ng/ml TGF-β1-pitoisuudella altistusajan ollessa 24 h (P=0,0245). CPPED1-geenin ilmentymisessä ei ta-pahtunut tilastollisesti merkitseviä muutoksia muilla altistusajoilla (Kuva 3).
38 Kuva 3. TGF-β1 -altistuksen vaikutus CPPED1-geenin mRNA:n ilmentymiseen SGBS-rasvasoluissa eri pitoi-suuksilla (0; 0,1; 1 ja 10 ng/ml) ja eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 h). Tulokset ovat CPPED1 mRNA:n ilmentymistasoja, jotka on saatu suhteuttamalla geenin ilmentymistaso endogeenikontrollin (PPIA) ilmen-tymistasoon. Kuvassa on esitetty keskiarvot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on analysoitu ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P <
0,05 ** P <0,01 *** P < 0,001.
4.1.3 IL-6 -altistus
CPPED1geenin ilmentymisessä ei tapahtunut tilastollisesti merkitseviä muutoksia IL6 -sytokiinialtistuksessa (Kuva 4). Kuvasta 4C näkyy, että pitoisuudella 1 ng/ml oli tapahtunut pudotus ilmentymistasossa. Sytokiinipitoisuudella 1 ng/ml replikaattien välillä ei ollut suurta vaihtelua, kun taas muilla pitoisuuksilla vaihtelu oli suurta.
39 Kuva 4. IL-6 -altistuksen vaikutus CPPED1-geenin mRNA:n ilmentymiseen SGBS-rasvasoluissa eri pitoisuuksil-la (0; 0,1; 1 ja 10 ng/ml) ja eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 h). Tulokset ovat CPPED1 mRNA:n ilmenty-mistasoja,, jotka on saatu suhteuttamalla geenin ilmentymistaso endogeenikontrollin (PPIA) ilmentymis-tasoon. Kuvassa on esitetty keskiarvot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on ana-lysoitu ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P < 0,05
** P <0,01 *** P < 0,001.
4.1.4 IL-1β -altistus
CPPED1-geenin ilmentyminen lisääntyi 9,9 % IL-1β -altistuksessa altistusajan ollessa 48 tuntia pitoisuudella 1 ng/ml (P=0,0377) (Kuva 5E). CPPED1-geenin ilmentyminen ei muut-tunut tilastollisesti merkitsevästi muilla altistusajoilla (Kuva 5).
40 Kuva 5. IL-1β -altistuksen vaikutus CPPED1-geenin mRNA:n ilmentymiseen SGBS-rasvasoluissa eri pitoisuuk-silla (0; 0,1; 1 ja 10 ng/ml) ja eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 h). Tulokset ovat CPPED1 mRNA:n ilmen-tymistasoja,jotka on saatu suhteuttamalla geenin ilmentymistaso endogeenikontrollin (PPIA) ilmentymis-tasoon. Kuvassa on esitetty keskiarvot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on ana-lysoitu ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P < 0,05
** P <0,01 *** P < 0,001.
4.2 Glucose uptake -koe
CPPED1-geenin hiljentymisen vaikutusta rasvasolujen insuliiniherkkyyteen tutkittiin solun glukoosin sisäänottoa tutkivalla Glucose uptake -kokeella, jossa kypsät SGBS-rasvasolut al-tistettiin insuliinille ja sitten radioaktiiviselle 2-Deoksi-D-[3H] -glukoosille. Rasvasoluja altis-tettiin myös Wortmannin reagenssille, joka estää PI3K:n toiminnan insuliinisignaloinnissa (Tsakiridis ym. 1995).
41 Kontrollisolujen insuliinilla stimuloitu glukoosin sisäänotto oli kaksinkertainen (P=0,0003) verrattuna basaaliin (stimuloimattomat solut) ja Wortmannin käsittely vähensi insuliinin vai-kutuksen lähes basaalin tasalle (P=0,0168) (Kuva 6).
CPPED1-siRNA -altistus lisäsi insuliinikäsiteltyjen solujen glukoosin sisäänottoa 277 %:lla (P=0,0001) verrattuna CPPED1-siRNA -basaaliin (Kuva 6). CPPED1-siRNA käsiteltyjen solujen Wortmannin käsittely vähensi insuliinin vaikutuksen CPPED1-siRNA:n basaalin ta-salle (-24,6 %, P=0,0002).
CPPED1-geenin hiljentäminen, verrattuna kontrollisoluihin, lisäsi insuliinilla käsiteltyjen solujen glukoosin sisäänottoa 18,9 prosenttia (P=0,0348) (Kuva 6).
Kuva 6. CPPED1-siRNA (50 nM, 72 h) -käsittelyn vaikutus insuliinilla stimuloituun glukoosin sisäänottoon kypsissä rasvasoluissa. Kuvassa on esitetty kontrollisolujen ja CPPED1-siRNA -altistettujen solujen insuliini-stimuloitu glukoosin sisäänotto suhteutettuna näytteiden proteiinipitoisuuteen. Kypsät rasvasolut altistet-tiin insuliinille (1 µM) ja Wortmannin reagenssille (100 nM) ja glukoosiseokselle (0,5 µCi/ml 2-Deoksi-D-[3H]
glukoosille (Amersham TRK672, GE Healthcare, UK) + 0.2 mM D-glukoosi). Kuvassa näkyy keskiarvot, keskiar-von keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on analysoitu ei-parametrisellä kahden riippumatto-man otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P < 0,05 ** P <0,01 *** P < 0,001.
42 5 POHDINTA
Tavoitteena oli selvittää tulehdustekijöiden (TNF-α, IL-1β, TGF-β1 ja IL-6) vaikutusta CPPED1-geenin ilmentymiseen SGBS-rasvasolumallissa ja CPPED1-geenin ja glukoosiai-neenvaihdunnan välistä yhteyttä.
CPPED1-geenin ilmentyminen lisääntyi tilastollisesti merkitsevästi TNF-α -altistuksen olles-sa 24, 48 ja 72 tuntia. Lyhyemmät altistuolles-sajat eivät vaikuttaneet CPPED1-geenin ilmentymi-seen tilastollisesti merkittävästi. Pitkien altistusaikojen vaikutukset ilmentymiilmentymi-seen saattavat viitata siihen, että tulehdustekijöiden vaikutukset eivät ole suoria, vaan toissijaisia vasteita sytokiinialtistukselle. TNF-α -altistus vaikutti siis eniten CPPED1-geenin ilmentymiseen.
Lihavien rasvakudos yli-ilmentää TNF-α:ta ja tämä korreloi voimakkaasti hyperinsulemian tason kanssa, joka on merkki insuliiniresistenssistä (Hotamisligil ym. 1995). TNF-α aktivoi JNK ja NF-κB -signalointireittejä. TNF-α vaikuttaa insuliinin signalointia heikentävästi myös MAPK/ERK -välitteisen reitin kautta (Bastard ym. 2002). JNK -signalointireitin aktivaatio johtaa IRS-1:n seriinin fosforylaatioon, joka heikentää insuliinin signalointia (Gil ym. 2007).
TNF-α aktivoi IKKβ:ta ja tämä johtaa insuliinisignaloinnin heikentymiseen ja insuliinistimuloidun IRSproteiinien tyrosiinin fosforylaation inhibitioon. IKKβ aktivoi myös NFκB -signalointireittiä, jonka aktivaatio aiheuttaa insuliiniresistenssiä. (Le Roith ym. 2003)
Se, että CPPED1:n ilmentyminen lisääntyi TNF-α:n vaikutuksesta vahvistaa oletusta siitä, että CPPED1 liittyisi lihavuuteen liittyvään tulehdukseen ja mahdollisesti insuliiniresistenssin kehittymiseen rasvasolussa. CPPED1-geenin oletetaan olevan endopolyfosfataasi, jonka taas oletetaan aktivoivan mTOR:n toimintaa ja mTOR:n puolestaan tiedetään inhiboivan insuliinin signalointia PI3K/Akt -signaalinvälitysreitin kautta. Näin ollen CPPED1 saattaa olla mukana insuliinisignaloinnin heikentymisessä ja insuliiniresistenssin kehittymisessä mTOR:n aktivaa-tion ja PI3K/Akt -signaalinvälitysreitin kautta.
CPPED1-geenin hiljentäminen lisäsi insuliinilla käsiteltyjen solujen glukoosin sisäänottoa verrattuna kontrollisoluihin. Wortmannin reagenssi estää PI3K:n toiminnan
insuliinisigna-43 loinnissa (Tsakiridis ym. 1995) ja tuloksista näkyi, että CPPED1-siRNA:lla altistettujen solu-jen Wortmannin käsittely vähensi insuliinin vaikutuksen täysin basaalisolusolu-jen tasolle glukoo-sin sisäänoton suhteen. Tämä vahvistaa oletusta siitä, että CPPED1 liittyy insuliinisignalointiin rasvasolussa ja että sen vaikutukset mahdollisesti välitettäisiin PI3K/Akt -signaalinvälitysreitin kautta.
Lihavuuteen liittyvä matala-asteinen tulehdustila lisää mahdollisesti CPPED1 ilmentymistä rasvasolussa. Laihtumisen on todettu myös vähentävän CPPED1 ilmentymistä (Kolehmainen ym. 2008), ja tuloksissa havaittiin CPPED1 vähentymisen parantavan insuliinistimuloitua glukoosin sisäänottoa ja näin ollen olevan yhteydessä parantuneeseen glukoosiaineenvaihdun-taan. Painonpudotus ja elintapojen muutos voi siis mahdollisesti vähentää CPPED1-geenin ilmentymistä ja tämä voi mahdollisesti olla osatekijänä glukoosiaineenvaihdunnan parantumi-sessa.
Muut sytokiinit vaikuttivat CPPED1:n ilmentymiseen vähemmän kuin TNF-α. IL-6 -altistus ei vaikuttanut tilastollisesti merkitsevästi CPPED1-geenin ilmentymiseen millään muilla altis-tusajoilla kuin 12 tunnin altistusajalla ja 1 ng/ml sytokiinipitoisuudella, jossa oli yllättävä CPPED1:n ilmentymistason pudotus. Muilla 12 tunnin IL-6 -altistuksen sytokiinipitoisuuksil-la tulosten vaihtelu oli hyvin suurta. Ilmentymistason pudotus saattaa johtua siitä, että solut ovat reagoineet eri tavalla muilla kuin 1 ng/ml sytokiinipitoisuudella. Se, että CPPED1 ilmen-tyminen ei muuttunut IL-6 -altistuksen vaikutuksesta voi johtua siitä, että TNF-α ja IL-6 vaik-kuttavat todennäköisesti osaksi eri signalointireittien kautta.
TGF-β1 -altistuksessa CPPED1-geenin ilmentyminen laski tilastollisesti merkitsevästi altis-tusajan ollessa 24 tuntia ja sytokiinipitoisuuden ollessa 10 ng/ml, mutta muilla altistusajoilla ja sytokiinipitoisuuksilla CPPED1geenin ilmentymisessä ei tapahtunut muutoksia. IL1β -altistuksessa CPPED1-geenin ilmentyminen lisääntyi tilastollisesti merkitsevästi altistusajan ollessa 48 tuntia ja sytokiinipitoisuuden ollessa 1 ng/ml. CPPED1-geenin ilmentyminen ei muuttunut tilastollisesti merkitsevästi muilla altistusajoilla. Tulosten vaihtelu oli suurta erityi-sesti 3 ja 12 tunnin altistusajoilla.
44 Pitkäaikaiset altistukset sytokiineille demonstroi kroonista matala-asteista tulehdustilaa. Pit-käaikaisten sytokiinialtistusten vaikutus CPPED1-geenin ilmentymiseen kertoo siitä, että vas-teet ovat toissijaisia. Altistuksissa käytetyt sytokiinikonsentraatiot olivat kuitenkin kymmen-kertaisia verrattuna elimistössä tavattaviin määriin eli käytetyt määrät olivat suprafysiologisia eli liian suuria. Vasteet eivät siis välttämättä kerro biologisista vasteista, vaan biologiset vas-teet saattavat jäädä käytettyjen pitoisuuksien väliin. Pienemmät sytokiinipitoisuudet eli fysio-logiset pitoisuudet saattaisivat kertoa todellisista biologisista vasteista.
45 6 YHTEENVETO
Tämän tutkielman tulokset vahvistavat oletusta siitä, että CPPED1 liittyy insuliinisignaloin-tiin rasvasolussa. Tulosten perusteella näyttäisi siltä, että TNF-α lisää CPPED1:n ilmentymis-tä rasvasolussa. CPPED1 saattaa heikenilmentymis-tää insuliinin signalointia mTOR:n aktivaation ja siilmentymis-tä kautta PI3K/Akt -signalointireitin inhibition kautta. Saattaa myös olla, että CPPED1 ilmen-tyminen lisääntyy lihavuudesta johtuvassa matala-asteisessa tulehdustilassa.
Koska CPPED1-geenistä ei ole juurikaan aiempaa tietoa, niin tämän tutkielman tulokset ovat vain suuntaa antavia ja tarvitaan lisätutkimuksia CPPED1-geenin toiminnan tarkempaan sel-vittämiseen. Sytokiinialtistuksen voisi tehdä pienemmillä sytokiinipitoisuuksilla, jotta tulokset kertoisivat enemmän todellisista biologisista vasteista. Tulehdustekijät vahvistavat myös tois-tensa vaikutuksia ja usein ne toimivat yhdenaikaisesti, näin ollen altistukset eri sytokiiniyhdis-telmillä olisivat saattaneet vaikuttaa CPPED1:n ilmentymiseen eri tavalla. Koska CPPED1-geenin hiljentäminen vaikutti rasvasolujen glukoosin sisäänottoon, niin CPPED1-geenin hiljentämisen vaikutuksia voisi tutkia myös proteiinitasolla.
46 LÄHDELUETTELO
Alberti KGMM, Zimmet P, Shaw J, 2006. Metabolic syndrome – a new world-wide defini-tion. A Consensus Statement from the International Diabetes Federadefini-tion. Diabet Med 23:
469–480.
Alexandraki K, Piperi C, Kalafoutis C, Singh J, Alaveras A, Kalafoutis A, 2006. Inflammato-ry process in type 2 diabetes: the role of cytokines. Ann N Y Acad Sci 1084: 89–117.
Arakaki AK, Tian W, Skolnick J, 2006. High precision multi-genome scale reannotation of enzyme function by EFICAz. BMC Genomics 7: 315.
Bastard JP, Maachi M, Van Nhieu JT, Jardel C, Bruckert E, Grimaldi A, Robert JJ, Capeau J, Hainque B, 2002. Adipose tissue IL-6 content correlates with resistance to insulin activa-tion of glucose uptake both in vivo and in vitro. J Clin Endocrinol Metab 87: 2084–2089.
Bełtowski J, Jamroz-Wiśniewska A, Widomska S, 2008. Adiponectin and its role in cardio-vascular diseases.Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets 8: 7–46.
Bremer AA, Devaraj S, Afify A, Jialal I, 2011. Adipose tissue dysregulation in patients with metabolic syndrome. J Clin Endocrinol Metab 96: 1782–1788.
Bruun JM, Pedersen SB, Kristensen K, Richelsen B, 2002. Effects of pro-inflammatory cyto-kines and chemocyto-kines on leptin production in human adipose tissue in vitro. Mol Cell En-docrinol 190: 91–99.
Eizirik DL & Mandrup-Poulsen, 2001. A choice of death – the signaltransduction of immune-mediated beta-cell apoptosis. Diabetologia 44: 2115–2133.
Emanuelli B, Peraldi P, Filloux C, Chavey C, Freidinger K, Hilton DJ, Hotamisligil GS, Van Obberghen E, 2001. SOCS-3 inhibits insulin signaling and is up-regulated in response to tumor necrosis factor-alpha in the adipose tissue of obese mice. J Biol Chem 276: 47944–
47949.
47 Engelman JA, Berg AH, Lewis RY, Lisanti MP, Scherer PE, 2000. Tumor necrosis factor alpha-mediated insulin resistance, but not dedifferentiation, is abrogated by MEK1/2 inhib-itors in 3T3-L1 adipocytes. Mol Endocrinol 14: 1557–1569.
Fain JN, Tichansky DS, Madan AK, 2005. Transforming growth factor beta1 release by hu-man adipose tissue is enhanced in obesity. Metabolism 54: 1546–1551.
Fasshauer M, Kralisch S, Klier M, Lossner U, Bluher M, Klein J, Paschke R, 2003. Adi-ponectin gene expression and secretion is inhibited by interleukin-6 in 3T3-L1 adipocytes.
Biochem Biophys Res Commun 301: 1045–1050.
Fischer-Posovszky P, Newell FS, Wabitsch M, Tornqvist HE, 2008. Human SGBS cells - a unique tool for studies of human fat cell biology. Obes facts 1: 184–189.
Galic S, Oakhill JS, Steinberg GR, 2010. Adipose tissue as an endocrine organ. Mol Cell En-docrinol 316: 129–39.
Gil A, María Aguilera C, Gil-Campos M, Cañete R, 2007. Altered signalling and gene ex-pression associated with the immune system and the inflammatory response in obesity. Br J Nutr 98: 121–126.
Grundy SM, 2004. Obesity, Metabolic Syndrome, and Cardiovascular Disease. J Clin Endo-crinol Metab 89: 2595–2600.
Harvey J & Ashford M L J, 2003. Leptin in CNS: much for than a satiety signal.
Neuropharmacology 44: 845–854.
Hotamisligil GS, Arner P, Caro JF, Atkinson RL, Spiegelman BM, 1995. Increased adipose tissue expression of tumor necrosis factor-alpha in human obesity and insulin resistance. J Clin Invest 95: 2409–2415.
Hotamisligil G, Shargill N, Spiegelman BM, 1993. Adipose expression of tumor
48 necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science
259: 87–91.
Iyer A, Fairlie DP, Prins JB, Hammock BD, Brown L, 2010. Inflammatory lipid mediators in adipocyte function and obesity. Nat Rev Endocrinol 6: 71–82.
Jager J, Grémeaux T, Cormont M, Le Marchand-Brustel Y, Tanti JF, 2007. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor sub-strate-1 expression. Endocrinology 148: 241–251.
Kamimura D, Ishihara K, Hirano T, 2003. IL-6 signal transduction and its physiological roles:
the signal orchestration model. Rev Physiol Biochem Pharmacol 149: 1–38.
Khamzina L, Veilleux A, Bergeron S, Marette A, 2005. Increased activation of the mammali-an target of rapamycin pathway in liver mammali-and skeletal muscle of obese rats: possible in-volvement in obesity-linked insulin resistance. Endocrinology 146: 1473–1481
Kolehmainen M, Salopuro T, Schwab US, Kekäläinen J, Kallio P, Laaksonen DE, Pulkkinen L, Lindi V I, Sivenius K, Mager U, Siitonen N, Niskanen L, Gylling H, Rauramaa R, Uusitupa M, 2008. Weight reduction modulates expression of genes involved in extracellu-lar matrix and cell death: the GENOBIN study. Int J Obes 32: 292–303.
Kristiansen OP & Mandrup-Poulsen T, 2005. Interleukin-6 and diabetes: the good, the bad, or the indifferent? Diabetes 54: 114–124.
Lagathu C, Bastard JP, Auclair M, Maachi M, Capeau J, Caron M, 2003. Chronic interleukin-6 (IL-interleukin-6) treatment increased IL-interleukin-6 secretion and induced insulin resistance in adipocyte:
prevention by rosiglitazone. Biochem Biophys Res Commun 311: 372–379.
Lebovitz HE, 1999. Type 2 Diabetes: An Overview. Clin Chem 45: 1339–1345.
49 Le Roith D, Quon MJ, Zick Y, 2003. Molecular and cellular aspects of insulin resistance:
Im-plications for diabetes. Teoksessa: T Finker, JS Gutkind (toim.), Signal transduction and human disease, s. 171–200. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey.
Luo G, Hershko DD, Robb BW, Wray CJ, Hasselgren PO, 2003. IL-1beta stimulates IL-6 production in cultured skeletal muscle cells through activation of MAP kinase signaling pathway and NF-kappa B. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 284: 1249–1254.
Mack I, BelAiba RS, Djordjevic T, Görlach A, Hauner H, Bader BL, 2009. Functional anal-yses reveal the greater potency of preadipocytes compared with adipocytes as endothelial cell activator under normoxia, hypoxia, and TNFα exposure. Am J Physiol Endocrinol Metab 297: 735–748
Mohamed-Ali V, Goodrick S, Bulmer K, Holly JMP, Yudkin JS, Coppack SW, 1999. Produc-tion of soluble tumor necrosis factor receptors by human subcutaneous adipose tissue in vivo. Am J Physiol 277: 971–975.
Mohamed-Ali V, Flower L, Sethi J, Hotamisligil G, Gray R, Humphries SE, York DA, Pinkney J, 2001. β-Adrenergic regulation of IL-6 release from adipose tissue: in vivo and in vitro studies. J Clin Endocrinol Metab 86: 5864–5869.
Nonogaki K, Fuller GM, Fuentes NL, Moser AH, Staprans I, Grunfeld C, Feingold KR, 1995.
Interleukin-6 stimulates hepatic triglyceride secretion in rats. Endocrinology 136: 2143–
2149.
Park HK, Qatanani M, Briggs ER, Ahima RS, Lazar MA, 2011. Inflammatory induction of human resistin causes insulin resistance in endotoxemic mice.Diabetes 60: 775–783.
Pedersen M, Bruunsgaard H, Weis N, Hendel HW, Andreassen BU, Eldrup E, Dela F, Peder-sen BK, 2003. Circulating levels of TNF-alpha and IL-6-relation to truncal fat mass and muscle mass in healthy elderly individuals and in patients with type-2 diabetes. Mech Age-ing Dev 124: 495–502.
50 Pereira-Lancha LO, Campos-Ferraz PL, Lancha Junior AH, 2012. Obesity: considerations about etiology, metabolism, and the use of experimental models. Diabetes Metab Syndr Obes 5: 75–87.
Popovic P & Duntas LH, 2005. Brain somatic cross-talk: Ghrelin, leptin and ultimate chal-lengers of obesity. Nutr Neurosci 8: 1–5.
Pradhan AD, Manson JE, Rifai N, Buring JE, Ridker PM, 2001. C-reactive protein, interleu-kin 6, and risk of developing type 2 diabetes mellitus. JAMA 286: 327–334.
Prasad H, Ryan DA, Celzo MF, Stapleton D, 2012. Metabolic syndrome: definition and ther-apeutic implications. Postgrad Med 124: 21–30.
Qian L, Wei SJ, Zhang D, Hu X, Xu Z, Wilson B, El-Benna J, Hong JS, Flood PM., 2008.
Potent anti-inflammatory and neuroprotective effects of TGF-beta1 are mediated through the inhibition of ERK and p47phox-Ser345 phosphorylation and translocation in microglia. J Immunol 181: 660–668.
Rotter V, Nagaev I, Smith U, 2003. Interleukin-6 (IL-6) induces insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor -alpha, overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. J Biol Chem 278: 45777–45784.
Salmenniemi U, Ruotsalainen E, Pihlajamaki J, Vauhkonen I, Kainulainen S, Punnonen K, Vanninen E, Laakso M, 2004. Multiple abnormalities in glucose and energy metabolism and coordinated changes in levels of adiponectin, cytokines, and adhesion molecules in subjects with metabolic syndrome. Circulation 110: 3842–3848.
Senn JJ, Klover PJ, Nowak IA, Zimmers TA, Koniaris LG, Furlanetto RW, Mooney RA, 2003. Suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS-3), a potential mediator of interleukin-6-dependent insulin resistance in hepatocytes. J Biol Chem 278: 13740–13746.
Senn JJ, Klover PJ, Nowak IA, Mooney RA, 2002. Interleukin-6 induces cellular insulin re-sistance in hepatocytes. Diabetes 51: 3391–3399.
51 Scheller J, Ohnesorge N, Rose-John S, 2006. Interleuk6 trans-signalling in chronic
in-flammation and cancer. Scand J Immunol 63: 321–329.
Southern C, Schulster D, Green IC, 1990. Inhibition of insulin secretion from rat islets of Langerhans by interleukin-6. An effect distinct from that of interleukin-1. Biochem J 272:
243–245.
Spranger J, Kroke A, Möhlig M, Hoffmann K, Bergmann MM, Ristow M, Boeing H, Pfeiffer AF, 2003. Inflammatory cytokines and the risk to develop type 2 diabetes: results of the prospective population-based European Prospective Investigation into Cancer and Nutri-tion (EPIC) -Potsdam Study. Diabetes 52: 812–817.
Steppan CM, Bailey ST, Bhat S, Brown EJ, Banerjee RR, Wright CM, Patel HR, Ahima RS, Lazar MA, 2001.The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature 409: 307–312.
Tsakiridis T, McDowell HE, Walker T, Downes CP, Hundal HS, Vranic M, Klip A, 1995.
Multiple roles of phosphatidylinositol 3-kinase in regulation of glucose transport, amino acid transport, and glucose transporters in L6 skeletal muscle cells. Endocrinology 136:
4315-4322.
Uysal KT, Wiesbrock SM, Marino MW, Hotamisligil GS, 1997. Protection from obesity-induced insulin resistance in mice lacking TNF-alpha function. Nature 389: 610–614.
Wabitsch M, Brenner RE, Melzner I, Braun M, Möller P, Heinze E, Debatin KM, Hauner H,
Wabitsch M, Brenner RE, Melzner I, Braun M, Möller P, Heinze E, Debatin KM, Hauner H,