2.6 Genobin-tutkimus
2.6.1 CPPED1-geeni
CPPED1-geenin tuotteen entsyymifunktion oletetaan EFICA (engl. enzyme function inference by a combined approach) -määrityksen perusteella olevan endopolyfosfataasi. Endopolyfosfa-taasiaktiivisuutta on havaittu kaikilla eukaryooteilla, niin yksisoluisilla organismeilla kuin nisäkkäilläkin. Ennen Arakakin ym. tutkimusta ihmisen CPPED1-geeniä ei ole yhdistetty tällaiseen entsymaattiseen aktiivisuuteen tai oletettu olevan endopolyfosfataasi. (Arakaki ym.
2006)
CPPED1-geeni ilmentyy melanooman esiasteissa. Tämän perusteella näyttää siltä, CPPED1:llä saattaa olla tärkeä rooli syövän aikaisissa vaiheissa. CPPED1:n oletettu endopo-lyfosfataasiaktiivisuus antaa olettaa, että tämän geenin tuote saattaa liittyä tuumorigeneesiin
26 nisäkkään rapamysiinin kohteen (mTOR, engl.mammalian target of rapamycin) kautta. (Ara-kaki ym. 2006)
mTOR-signaalinvälitysreitti yhdistää insuliinin ja ravintoaineiden signaloinnin monissa solu-tyypeissä. Tutkimukset ovat antaneet viitteitä siitä, että kyseinen signaalinvälitysreitti säätelee negatiivisesti insuliinin signalointia PI3K/proteiinikinaasi B (Akt, engl. protein kinase B) -reitissä rasva- ja lihassoluissa. On kuitenkin epäselvää lisääntyykö mTOR-signaalinvälitysreitin aktivaatio lihavuudessa ja voisiko se olla osallisena insuliiniresistenssin synnyssä. Khamzinan ym. tutkimuksessa mTOR ja S6-kinaasi-1 (engl. S6K1, engl. S6-kinase-1) -aktivaatio lisääntyi maksassa ja lihaksessa lihavilla hiirillä, joita oli ruokittu rasvapitoisella ruoalla. Tutkimuksessa insuliinin aiheuttama mTOR/S6K1 -aktivaatio lisäsi IRS-1:n seriinin fosforylaatiota, jonka seurauksena PI3K/Akt -reitin aktivaatio heikentyi maksasoluissa in vit-ro. Nämä tulokset antavat viitteitä siitä, että mTOR ja/tai S6K1 ovat mahdollisesti osallisina kudoksen insuliiniresistenssin synnyssä lihavuudessa. (Khamzina ym. 2005)
27 3 KOKEELLINEN OSA
Tämän tutkielman kokeellisen osan erityisenä tavoitteena oli selvittää tulehdustekijöiden;
TNF-α:n, IL-1β:n, TGF-β1:n ja IL-6:n, vaikutusta CPPED1-geenin ilmentymiseen SGBS-rasvasoluviljelymallissa. Tavoitteena oli myös selvittää CPPED1-geenin ja glukoosiaineen-vaihdunnan välistä yhteyttä.
28 3.1 Materiaalit ja menetelmät
3.1 SGBS-rasvasoluviljely
Työssä käytettiin SGBS (Simpson-Golabi-Behmel -syndrooma) -rasvasoluja, jotka on alun perin eristetty ihmisen ihonalaisesta rasvakudoksesta (Wabitsch ym. 2001). SGBS-rasvasoluilla on erinomainen kyky erilaistua kypsiksi rasvasoluiksi ja soluja käytetäänkin pal-jon eri tutkimuksissa (Fischer-Posovszky ym. 2008). SGBS-rasvasoluja kasvatettiin ja erilais-tettiin kypsiksi rasvasoluiksi ohjeiden mukaisesti (Wabitsch ym. 2001).
Nestetypessä säilytyksessä olleet SGBS-solut sulatettiin vesihauteella +37 °C, jonka jälkeen ne suspensoitiin 25 ml GM-mediumia (OF-medium: (DMEM/F12 Nut Mix -medium (Lonza, BE12-719F); 8 µg/ml biotiini (Sigma, B-4639); 4 µg/ml pantotenaatti (Sigma, P-5155); 100 U/ml 1 % penisilliini/streptomysiini) ja 10 % FBS 1 ml/10 ml OF-mediumia) ja sentrifugoi-tiin 200 x g, 5 minuuttia, +25 °C. Tämän jälkeen supernatantti poistetsentrifugoi-tiin, jotta ylimääräinen solujen nestetyppisäilytyksessä käytetty DMSO saatiin poistettua. SGBS-rasvasolujen preadi-posyytteja kasvatettiin yksinkertaisena kerroksena soluviljelypullossa (tilavuus 75 cm2) GM-liuoksessa (20 ml) kostutettua ilmaa (95 %) ja hiilidioksidia (5 %) sisältävässä soluviljelykaa-pissa, jonka lämpötila oli +37 °C (HERA cell, HERAEUS).
SGBS-rasvasoluja tarkasteltiin mikroskopoimalla ja rasvasolut jaettiin, kun soluviljelypullo oli 80 %:sti täyteen kasvanut (konfluentti). Rasvasolut jaettiin kolmeen soluviljelypulloon (tilavuus 175 cm2) ja tarvittaessa yhteen ylläpitokasvatuspulloon (tilavuus 75 cm2). Aluksi rasvasolut pestiin 5 ml PBS:ää (Lonza, BE17-512F). Tämän jälkeen lisättiin 2 ml trypsiiniä (0,25 % trypsiini–EDTA -liuos, SIGMA, T4049), annettiin vaikuttaa 30 s, ja ylimääräinen trypsiini poistettiin. Rasvasoluja inkuboitiin trypsiinin kanssa +37 °C inkubaattorissa 3–4 min solujen irrottamiseksi. Inkuboinnin jälkeen rasvasolut suspensoitiin 5 ml GM-mediumia, jossa oleva seerumi neutraloi trypsiinin vaikutuksen. Tämän jälkeenrasvasolususpensio siirrettiin falcon-putkeen. Rasvasolususpensiosta tehtiin esilaimennos lisäämällä rasvasolususpensioon 35 ml lisää GM-mediumia. Lopullinen laimennos tehtiin steriiliin lasipulloon (tilavuus 250 ml), johon lisättiin 70 ml GM-mediumia ja 40 ml rasvasolususpensiota. Rasvasolususpensiota jaettiin 35 ml kolmeen soluviljelypulloon (tilavuus 175 cm2). Loppuun 5 ml
rasvasolususpen-29 siota lisättiin 15 ml GM-mediumia, jonka jälkeen laimennos siirrettiin yhteen ylläpitokasva-tuspulloon (tilavuus 75 cm2). SGBS-soluja inkuboitiin +37 °C soluviljelykaapissa ja GM-medium vaihdettiin kahdesti viikossa.
SGBS-solut jaettiin kokeita varten 12-kuoppalevyille. SGBS-rasvasolut pestiin ensin 10 ml PBS:ää, jonka jälkeen solut trypsinoitiin 4 ml trypsiiniä, kuten edellä. Tämän jälkeen solut suspensoitiin 10 ml GM-mediumia ja kaikista kolmesta 175 cm2 soluviljelypullosta saadut solususpensiot yhdistettiin (yht. 30 ml) falcon-putkeen ja sentrifugoitiin 200 x g, 5 min, +25
°C. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti poistettiin ja solut suspensoitiin 5 ml GM-mediumia, josta tehtiin 1:5 solulaimennos (200 µl solususpensiota, 800 µl GM-mediumia) solutiheyden laskemista varten. Solutiheys laskettiin laimennetusta solususpensionäytteestä Bürkerin kam-miolla neljästä A-ruudusta. Neljän ruudun keskiarvo kerrottiin laimennoskertoimella (5) ja 10 000, jolloin saatiin solujen lukumäärä/ml. Solususpensiolaimennosta tarvittiin 6 x 12-kuoppalevyille 1 ml/kuoppa, joten solulaimennosta tarvittiin vähintään 75 ml.
Kuoppalevyjen kuopissa solususpensiota on 1 ml, joten solutiheys eli solujen lukumäärä/cm2 laskettiin jakamalla valmiissa liuoksessa oleva solujen lkm/ml kuopan pinta-alalla, joka on 3,8 cm2. Soluja haluttiin olevan noin 20 000 – 30 000 solua/cm2. Solususpension solutiheys laskettiin verrannolla seuraavasti:
(solujen lkm/ml) x 5 ml = 75 ml x (solujen lkm valmiissa liuoksessa/ml) Solujen lkm valmiissa liuoksessa/ml = (solujen lkm/ml x 5 ml): 75 ml
Solususpensiosta (5 ml) tehtiin esilaimennos lisäämällä solususpensioon 35 ml GM-liuosta ja lopullinen laimennos lisäämällä edelleen 35 ml GM-mediumia, jolloin yhteistilavuus oli 75 ml. Solulaimennos jaettiin 6 x 12-kuoppalevyille, siten että jokaiseen kuoppaan tuli solu-laimennosta 1 ml. Kuoppalevyjä inkuboitiin +37 °C soluviljelykaapissa.
30 3.2 SGBS-rasvasolujen erilaistaminen
Kuoppalevyn ollessa 80 %:sti konfluentti aloitettiin preadiposyyttien erilaistaminen kypsiksi rasvasoluiksi pesemällä solut 2 kertaa PBS:llä, lisäämällä soluille 1 ml QuickDiff-mediumia (3FC-mediumia (OF-medium; 0,01 mg/ml transferriini (Sigma, T8158); 20 nM insuliini (Sigma, I9278); 1 µM hydrokortisoni (Sigma, H0888); 0,2 nM T3 (Sigma, T6397)); 25 nM deksametasoni (Sigma, D-4902); 0,5 µM IBMX (Sigma, I5879); 2 µM rosiglitatsoni (Cayman Chemical, CAT 71740)) jainkuboimalla +37 °C soluviljelykaapissa.
Erilaistuville SGBSrasvasoluille vaihdettiin neljäntenä päivänä 3FC/deksametasoni/IBMX -medium (3FC; 25 nM deksametasoni; 0,5 µM IBMX) poistamalla osa vanhasta -mediumista ja pipetoimalla varovasti 1 ml uutta mediumia kuopan reunaa pitkin.
Erilaistumisen neljännen päivän jälkeen soluille vaihdettiin uusi 3FC-medium noin kolmen päivän välein poistamalla varovasti osa vanhasta mediumista ja pipetoimalla 1 ml uutta 3FC-mediumia. Preadiposyytit erilaistuivat kypsiksi rasvasoluiksi noin 14 päivässä.
3.3 Kypsien rasvasolujen tulehdustekijäaltistus
Kypsiä rasvasoluja altistettiin tulehdustekijöillä (TNF-α, TGF-β1, IL-6, IL-1β) eri pitoisuuk-silla (0, 0,1, 1 ja 10 ng/ml), jonka jälkeen solut lysoitiin eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 h). Sytokiinialtistukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena kustakin altistuskonsentraatiosta.
Kypsille rasvasoluille vaihdettiin ”Sytokiinialtistusmedium rasvasoluille” -medium (DMEM/F-12 Nut Mix -medium; 0,01 mg/ml transferriini; 8 µg/ml biotiini; 4 µg/ml pantote-naatti) poistamalla vanha medium ja lisäämällä uutta esilämmitettyä (+37 °C) mediumia so-luille 1 ml. Rasvasoluja esi-inkuboitiin 24 tuntia +37 °C soluviljelykaapissa.
Sytokiinialtistus tehtiin esi-inkuboiduille kypsille rasvasoluille vaihtamalla medium sytokiinia sisältävään sytokiinialtistusmediumiin. Sytokiinialtistusmedium tehtiin laimentamalla sytokii-ni ”Sytokiisytokii-nialtistusmedium rasvasoluille” -mediumiin. Sytokiisytokii-nilaimennosta lisättiin
kaivoi-31 hin 1 ml/kaivo siten, että sytokiinin lopullinen pitoisuus kaivossa oli 0; 0,1; 1,0 tai 10 ng/ml.
Kontrollisolut altistettiin sytokiinin sijasta kyseisen sytokiinin liuottimelle, jolloin kontrolli-kaivoon lisättiin 1 ml mediumia, jossa oli kyseisen sytokiinin liuotinta 2 µl/20 ml ”Syto-kiinialtistusmedium rasvasoluille” (TGF-β1: (50 mM Tris-asetaatti, pH 7,5; 1 mM EDTA; 20
% glyseroli), IL-6: 5 mM etikkahappo, TNF-α: steriloituH2O, IL-1β: ster. H2O). Rasvasolut lysoitiin eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 tuntia altistuksen aloittamisesta). Lyysaus teh-tiin pipetoimalla kuopan medium pois ja lisäämällä 350 µl RLT-puskuria (RNeasy Mini Kit, Qiagen), johon oli lisätty β-merkaptoetanolia (10 µl β-merkaptoetanoli/1 ml RLT-puskuri).
Solulysaatti saatiin kerättyä talteen pipetoimalla edestakaisin ja raaputtamalla kuopan pohjaa, jonka jälkeen lysaatti siirrettiin eppendorf-putkeen ja säilytykseen pakkaseen -20 °C.
3.4 Totaali RNA:n eristys
Tulehdustekijöille altistetuista SGBS-rasvasoluista eristettiin totaali RNA kaupallisella kitillä (RNeasy Mini Kit, Qiagen). Totaali RNA:n eristys tehtiin kitin mukana tulevan ohjeen mu-kaisesti (Protocol: Purification of Total RNA from Animal Cells Using Spin Technology, RNeasy Mini Handbook 04/2006). Soluille oli lisätty lyysaysvaiheessa 350 µl RLT-puskuria, johon oli lisätty β-merkaptoetanolia (10 µl β-merkaptoetanoli/1 ml RLT-puskuri).
Rasvasolu-lysaatit homogenisoitiin sentrifugoimalla rasvasolunäytteet kitin mukana tulevassa QIAshredder spin -kolonnissa 16 250 g x 2 min. Homogenisoituun rasvasolunäytteeseen lisät-tiin sama tilavuus 70 % etanolia RNA:n saostamiseksi. Suspensio siirretlisät-tiin kitin mukana tul-leeseen RNeasy Mini -kolonniin ja sitä sentrifugoitiin täydellä nopeudella (16 250 g) 15 s, jolloin RNA sitoutui kolonnin membraaniin. Membraanin läpitullut liuos poistettiin keräys-putkesta kaatamalla, jonka jälkeen kolonniin lisättiin 700 µl kitin mukana tullutta RW1-puskuria, jonka jälkeen suspensiota sentrifugoitiin 15 s kolonnin pesemiseksi. Kolonni siirret-tiin uuteen keräysputkeen, johon lisätsiirret-tiin 500 µl kitin mukana tullutta RPE-puskuria, minkä jälkeen näytettä sentrifugoitiin 15 s. Tämän jälkeen RPE-pesu toistettiin ja näytettä sentrifu-goitiin ohjeesta poiketen 3 min (ohjeessa 2 min). Kolonni siirrettiin keräysputkeen ja siihen lisättiin 30 µl RNaasi vapaata vettä ja annettiin inkuboitua 1 min huoneenlämmössä. RNA eluoitiin keräysputkeen sentrifugoimalla näytettä ohjeesta poiketen 2 min (ohjeessa 1 min).
32 RNA-näytteen puhtaus ja pitoisuus mitattiin NanoDrop-spektrofotometrillä (NanoDrop Tech-nologies, Wilmington, DE, USA), joka mittasi näytteiden absorbanssit (260, 280 & 230 nm) ja RNA:n puhtauden(260/280 nm, 260/230 nm) sekä RNA:n kontsentraation (ng/µl). RNA:n puhtauden raja-arvoina pidettiin A=1,8–2,1.
3.5 cDNA-synteesi
Eristetystä RNA:sta syntetisoitiin komplementaarista cDNA:ta kaupallisella cDNAsynteesi -kitillä (iScriptTM cDNA synthesis Kit, BIORAD, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ohjeen mukaisesti (Protocol for cDNA synthesis, catalog 170-8891) ja PCR-laitteella (Ther-moHybaid, UK) seuraavalla ajo-ohjelmalla: 5 min 25 °C, 30 min 42 °C, 5 min 85 °C, hold 4
°C). cDNA-näytteistä tehtiin laimennokset 2 ng/µl DEPC dietyylipyrokarbonaatti eli DEPC-käsiteltyyn veteen kvantitatiivista PCR:ää varten.
3.6 Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR)
Tulehdustekijäaltistusten vaikutusta CPPED1-geenin ilmentymistasoon tutkittiin kvantitatii-visella polymeraasiketjureaktio- eli PCR-menetelmällä (ABI Prism 7500, Applied Biosys-tems®, Foster City, CA, USA) käyttäen kaupallisia kittejä (TaqMan/Applied Biosystems®).
Endogeenikontrollina käytettiin PPIA-geeniä eli syklofiliini A -geeniä.
Kohdegeenin ilmentyminen SGBS-rasvasoluissa normalisoitiin endogeenikontrollin, PPIA, ilmentymiseen käyttäen kaavaa: 2(Ct kohdegeenin kalibraattori – Ct kohdegeenin näyte)
/2(Ct PPIA kalibraattori – Ct PPIA näyte)
(Livak & Schmittgen, 2001), jossa kalibraattori on satunnainen näyte, jolla on maksimi Ct-arvo, ja Ct on threshold-sykli.
33 3.7 siRNA-hiljentäminen
CPPED1-geenin roolia ja toimintaa tutkittiin hiljentämällä geenin ilmentyminen käyttämällä RNAi-teknologiaa, jossa kypsiin rasvasoluihin transfektoitiin CPPED1-geenin siRNA:ta (small interfering RNA) käyttämällä kaupallista HiPerFect-transfektioreagenssia (Qiagen).
Lämmitettyä (+37 °C) siRNA-altistusmediumia (DMEM/F-12 -medium, 20 nM insuliini, 10 µg/ml transferriini, 33 µM biotiini, 17 µM pantotenaatti) ja CPPED1-siRNA:ta (20 µM)/ ne-gatiivikontrollia (Scrambled) pipetoitiin eppendorf-putkiin, siten että lopullinen siR-NA/Scrambled -kontsentraatio oli kaivossa 50 nM (1 x reaktioseos: 88 µl siRNA-medium; 3 µl 20 µM siRNA/Scrambled). Putkia sekoitettiin koeputkisekoittimella varovasti. Jokaiseen putkeen lisättiin HiPerFect-reagenssia (1 x reaktioseos: 9 µl HiPerFect) pipetoiden edestakai-sin ja napsutellen putkea. Putkia inkuboitiin 12 min huoneenlämmössä. 12-kuoppalevyille vaihdettiin siRNA-altistus -medium 1,1 ml mediumia/kaivo. Jokaiseen kuoppalevyn kaivoon lisättiin 100 µl CPPED1-siRNA tai Scrambled -seosta koskematta pipetillä mediumiin.
Kuoppalevyjä inkuboitiin 72 tuntia +37 °C soluviljelykaapissa, jonka jälkeen aloitettiin Glu-cose uptake -koe.
3.7.1 Glucose uptake -koe
CPPED1-geenin hiljentymisen vaikutusta rasvasolun insuliiniherkkyyteen tutkittiin Glucose uptake -kokeella, jossa kypsät altistamattomat SGBS-rasvasolut sekä siRNA-altistetut että Scrambled-kontrollisolut, altistettiin insuliinille (1 µM) tai insuliinille (1 µM) ja Wortmannin-reagenssille (100 nM) ja glukoosiseokselle, jossa oli 0,5 µCi/ml radioaktiivista 2-Deoksi-D-[3H]-glukoosia (Amersham TRK672, GE Healthcare, UK) ja 0,2 mM D-glukoosia.
SGBS-rasvasolut pestiin kaksi kertaa esilämmitetyllä KRH-puskurilla (Krebs-Ringer-Hepes-puskurilla: 118 mM NaCl; 4,8 mM KCl; 2,5 mM CaCl2; 1,2 mM MgSO4; 20 mM HEPES; pH säädetty 7,4 NaOH). Insuliinikaivoihin lisättiin 0,5 ml ja basaalikaivoihin 1 ml esilämmitettyä KRH-puskuria, jonka jälkeen kuoppalevyjä inkuboitiin 2 tuntia +37 °C soluviljelykaapissa.
34 Wortmannin reagenssia (100 nM, Sigma) lisättiin 15 µl sille tarkoitettuihin insuliinikaivoihin 30 minuuttia ennen työn seuraavaa vaihetta.
Insuliinikaivoihin lisättiin 0,5 ml KRH-puskuria, jossa oli insuliinia (0,6 µl insuliinia/1 ml KRH -puskuria eli 1 µM insuliinia/kaivo). Tämän jälkeen levyjä sekoitettiin varovasti ja in-kuboitiin 20 min +37 °C soluviljelykaapissa. Tämän jälkeen kaikkiin kaivoihin lisättiin 0,5 ml glukoosiseosta (1 µl/ml 2-deoksi-D-[3H]-glukoosi (0,5 µCi/ml/kaivo) ja 10 µl/ml esilämmitet-ty D-glukoosi (0,2 mM/kaivo); KRH -puskuri) ja inkuboitiin 15 min huoneenlämmössä.
Reaktio pysäytettiin laittamalla kuoppalevyt jäille ja pesemällä rasvasolut kaksi kertaa jää-kylmällä PBS:llä. Pesujen jälkeen rasvasoluille lisättiin 200 µl 0,2 N NaOH ja inkuboitiin 1,5 h huoneenlämmössä sekoittelijalla.
Inkuboinnin jälkeen rasvasolut raaputettiin irti kuopista ja näytettä otettiin 100 µl eppendorf-putkeen ja siihen lisättiin 1 ml OptiPhase Hisafe 2 -reagenssia (PerkinElmer, USA). Näytteis-tä määritettiin radioaktiivisuudet tuikelaskurilla (1450 MicroBeta® TriLux, Wallack). Määri-tetyt näytteiden radioaktiivisuudet normalisoitiin näytteiden proteiinipitoisuudella.
3.7.2 Proteiinipitoisuuden määrittäminen
Glucose uptake -kokeen näytteiden totaaliproteiinikontsentraatiot mitattiin käyttäen DC pro-tein assay -kittiä (BIORAD). Valmistettiin standardit pipetoimalla 0,2 N NaOH:ia tarvittava määrä valmiiksi eppendorf-putkiin jaettuihin proteiinilaimennoksiin (40 µl, 10 mg/ml) siten että saatiin seuraavat standardit: 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5 ja 2 mg/ml. Proteiinimääritys tehtiin 96-kuoppalevyllä (ELISA microplate, Greiner bio-one, Saksa) pipetoimalla kaivoihin 5 µl standardeja ja näytteitä duplikaatteina levylle. Jokaiseen levyn kuoppaan lisättiin 25 µl reagenssi A*:ta (20 µl reagenssi S/ 1 ml reagenssi A) ja 200 µl reagenssi B:tä ja inkuboitiin huoneenlämmössä sekoittelijalla 5 min. Tämän jälkeen levyä inkuboitiin huoneenlämmössä vielä 10 min, jonka jälkeen mitattiin absorbanssit 650–750 nm (Wallac Viktor 1420, Perkin Elmer).
35 3.8 Tulosten analysointi ja tilastointi
Tulosten analysointi suoritettiin ΔΔCtmenetelmän avulla Microsoft Office Excel 2007 -ohjelmalla. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Windowsin GraphPad Prism 5 -ohjelmaa (GraphPad Software, San Diego California USA), jonka avulla määritettiin tulosten keskiar-vot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet. Tilastolliset merkitsevyydet analy-soitiin ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastollisen merkitsevyy-den rajana pidettiin P < 0,05.
36 4 TULOKSET
4.1 Tulehdustekijäaltistus
Lihavuuteen liittyvän matala-asteinen tulehdustilan tiedetään vaikuttavan geenien ilmentymi-seen (Wellen & Hotamisligil, 2003) ja näin ollen haluttiin tutkia tulehdustekijöiden vaikutusta CPPED1-geenin ilmentymiseen kypsissä SGBS-rasvasoluissa.
4.1.1 TNF-α -altistus
TNF-α vaikutti CPPED1-geenin ilmentymiseen merkitsevästi, kun TNF-α -altistusaika oli 24, 48 ja 72 h (Kuva 2). TNF-α -altistusajan ollessa 24 tuntia sytokiinipitoisuudella 0,1 ng/ml (P=0,0947) geenin ilmentyminen lisääntyi, mutta koska vaihtelu oli niin suurta, tulos ei ollut tilastollisesti merkitsevä (Kuva 2D). TNF-α -altistusajan ollessa 24 h CPPED1-geenin ilmen-tyminen lisääntyi 21,9 % 1 ng/ml sytokiinipitoisuudella (P=0,0197) ja 20,9 prosenttia 10 ng/ml sytokiinipitoisuudella (P=0,013). Altistuajan ollessa 48 tuntia, CPPED1-geenin ilmen-tyminen näytti lisääntyvän sytokiinipitoisuuden kontsentraation mukaan (0,1; 1 & 10 ng/ml), mutta CPPED1-geenin ilmentymisen lisääntyminen oli tilastollisesti merkitsevä vain 1 ng/ml TNF-α -pitoisuudella (P=0,0484), jolloin ilmentyminen lisääntyi 15 % (Kuva 2F). CPPED1:n ilmentyminen lisääntyi 72 tunnin TNF-α -altistuksen kaikilla pitoisuuksilla. Tilastollisesti merkitsevästi CPPED1:n ilmentyminen lisääntyi 10 ng/ml sytokiinipitoisuudella (P=0,0059), jolloin ilmentyminen lisääntyi 34 %. CPPED1-geenin ilmentymisessä ei tapahtunut muutok-sia 3, 6 ja 12 tunnin TNF-α -altistusajoilla (Kuvat 2A, 2B ja 2C).
37 Kuva 2. TNF-α -altistuksen vaikutus CPPED1-geenin mRNA:n ilmentymiseen SGBS-rasvasoluissa eri pitoisuuk-silla (0; 0,1; 1 ja 10 ng/ml) ja eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 h). Tulokset ovat CPPED1 mRNA:n ilmen-tymistasoja,jotka on saatu suhteuttamalla geenin ilmentymistaso endogeenikontrollin (PPIA) ilmentymis-tasoon. Kuvassa on esitetty keskiarvot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on ana-lysoitu ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P < 0,05
** P <0,01 *** P < 0,001.
4.1.2 TGF-β1 -altistus
Kuvassa 3D näkyy, että CPPED1-geenin ilmentyminen laski 15,3 prosenttia 10 ng/ml TGF-β1-pitoisuudella altistusajan ollessa 24 h (P=0,0245). CPPED1-geenin ilmentymisessä ei ta-pahtunut tilastollisesti merkitseviä muutoksia muilla altistusajoilla (Kuva 3).
38 Kuva 3. TGF-β1 -altistuksen vaikutus CPPED1-geenin mRNA:n ilmentymiseen SGBS-rasvasoluissa eri pitoi-suuksilla (0; 0,1; 1 ja 10 ng/ml) ja eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 h). Tulokset ovat CPPED1 mRNA:n ilmentymistasoja, jotka on saatu suhteuttamalla geenin ilmentymistaso endogeenikontrollin (PPIA) ilmen-tymistasoon. Kuvassa on esitetty keskiarvot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on analysoitu ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P <
0,05 ** P <0,01 *** P < 0,001.
4.1.3 IL-6 -altistus
CPPED1geenin ilmentymisessä ei tapahtunut tilastollisesti merkitseviä muutoksia IL6 -sytokiinialtistuksessa (Kuva 4). Kuvasta 4C näkyy, että pitoisuudella 1 ng/ml oli tapahtunut pudotus ilmentymistasossa. Sytokiinipitoisuudella 1 ng/ml replikaattien välillä ei ollut suurta vaihtelua, kun taas muilla pitoisuuksilla vaihtelu oli suurta.
39 Kuva 4. IL-6 -altistuksen vaikutus CPPED1-geenin mRNA:n ilmentymiseen SGBS-rasvasoluissa eri pitoisuuksil-la (0; 0,1; 1 ja 10 ng/ml) ja eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 h). Tulokset ovat CPPED1 mRNA:n ilmenty-mistasoja,, jotka on saatu suhteuttamalla geenin ilmentymistaso endogeenikontrollin (PPIA) ilmentymis-tasoon. Kuvassa on esitetty keskiarvot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on ana-lysoitu ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P < 0,05
** P <0,01 *** P < 0,001.
4.1.4 IL-1β -altistus
CPPED1-geenin ilmentyminen lisääntyi 9,9 % IL-1β -altistuksessa altistusajan ollessa 48 tuntia pitoisuudella 1 ng/ml (P=0,0377) (Kuva 5E). CPPED1-geenin ilmentyminen ei muut-tunut tilastollisesti merkitsevästi muilla altistusajoilla (Kuva 5).
40 Kuva 5. IL-1β -altistuksen vaikutus CPPED1-geenin mRNA:n ilmentymiseen SGBS-rasvasoluissa eri pitoisuuk-silla (0; 0,1; 1 ja 10 ng/ml) ja eri aikapisteissä (3, 6, 12, 24, 48 ja 72 h). Tulokset ovat CPPED1 mRNA:n ilmen-tymistasoja,jotka on saatu suhteuttamalla geenin ilmentymistaso endogeenikontrollin (PPIA) ilmentymis-tasoon. Kuvassa on esitetty keskiarvot, keskiarvon keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on ana-lysoitu ei-parametrisellä kahden riippumattoman otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P < 0,05
** P <0,01 *** P < 0,001.
4.2 Glucose uptake -koe
CPPED1-geenin hiljentymisen vaikutusta rasvasolujen insuliiniherkkyyteen tutkittiin solun glukoosin sisäänottoa tutkivalla Glucose uptake -kokeella, jossa kypsät SGBS-rasvasolut al-tistettiin insuliinille ja sitten radioaktiiviselle 2-Deoksi-D-[3H] -glukoosille. Rasvasoluja altis-tettiin myös Wortmannin reagenssille, joka estää PI3K:n toiminnan insuliinisignaloinnissa (Tsakiridis ym. 1995).
41 Kontrollisolujen insuliinilla stimuloitu glukoosin sisäänotto oli kaksinkertainen (P=0,0003) verrattuna basaaliin (stimuloimattomat solut) ja Wortmannin käsittely vähensi insuliinin vai-kutuksen lähes basaalin tasalle (P=0,0168) (Kuva 6).
CPPED1-siRNA -altistus lisäsi insuliinikäsiteltyjen solujen glukoosin sisäänottoa 277 %:lla (P=0,0001) verrattuna CPPED1-siRNA -basaaliin (Kuva 6). CPPED1-siRNA käsiteltyjen solujen Wortmannin käsittely vähensi insuliinin vaikutuksen CPPED1-siRNA:n basaalin ta-salle (-24,6 %, P=0,0002).
CPPED1-geenin hiljentäminen, verrattuna kontrollisoluihin, lisäsi insuliinilla käsiteltyjen solujen glukoosin sisäänottoa 18,9 prosenttia (P=0,0348) (Kuva 6).
Kuva 6. CPPED1-siRNA (50 nM, 72 h) -käsittelyn vaikutus insuliinilla stimuloituun glukoosin sisäänottoon kypsissä rasvasoluissa. Kuvassa on esitetty kontrollisolujen ja CPPED1-siRNA -altistettujen solujen insuliini-stimuloitu glukoosin sisäänotto suhteutettuna näytteiden proteiinipitoisuuteen. Kypsät rasvasolut altistet-tiin insuliinille (1 µM) ja Wortmannin reagenssille (100 nM) ja glukoosiseokselle (0,5 µCi/ml 2-Deoksi-D-[3H]
glukoosille (Amersham TRK672, GE Healthcare, UK) + 0.2 mM D-glukoosi). Kuvassa näkyy keskiarvot, keskiar-von keskivirheet ja tilastolliset merkitsevyydet, jotka on analysoitu ei-parametrisellä kahden riippumatto-man otoksen t-testillä. Tilastolliset merkitsevyydet: * P < 0,05 ** P <0,01 *** P < 0,001.
42 5 POHDINTA
Tavoitteena oli selvittää tulehdustekijöiden (TNF-α, IL-1β, TGF-β1 ja IL-6) vaikutusta CPPED1-geenin ilmentymiseen SGBS-rasvasolumallissa ja CPPED1-geenin ja glukoosiai-neenvaihdunnan välistä yhteyttä.
CPPED1-geenin ilmentyminen lisääntyi tilastollisesti merkitsevästi TNF-α -altistuksen olles-sa 24, 48 ja 72 tuntia. Lyhyemmät altistuolles-sajat eivät vaikuttaneet CPPED1-geenin ilmentymi-seen tilastollisesti merkittävästi. Pitkien altistusaikojen vaikutukset ilmentymiilmentymi-seen saattavat viitata siihen, että tulehdustekijöiden vaikutukset eivät ole suoria, vaan toissijaisia vasteita sytokiinialtistukselle. TNF-α -altistus vaikutti siis eniten CPPED1-geenin ilmentymiseen.
Lihavien rasvakudos yli-ilmentää TNF-α:ta ja tämä korreloi voimakkaasti hyperinsulemian tason kanssa, joka on merkki insuliiniresistenssistä (Hotamisligil ym. 1995). TNF-α aktivoi JNK ja NF-κB -signalointireittejä. TNF-α vaikuttaa insuliinin signalointia heikentävästi myös MAPK/ERK -välitteisen reitin kautta (Bastard ym. 2002). JNK -signalointireitin aktivaatio johtaa IRS-1:n seriinin fosforylaatioon, joka heikentää insuliinin signalointia (Gil ym. 2007).
TNF-α aktivoi IKKβ:ta ja tämä johtaa insuliinisignaloinnin heikentymiseen ja insuliinistimuloidun IRSproteiinien tyrosiinin fosforylaation inhibitioon. IKKβ aktivoi myös NFκB -signalointireittiä, jonka aktivaatio aiheuttaa insuliiniresistenssiä. (Le Roith ym. 2003)
Se, että CPPED1:n ilmentyminen lisääntyi TNF-α:n vaikutuksesta vahvistaa oletusta siitä, että CPPED1 liittyisi lihavuuteen liittyvään tulehdukseen ja mahdollisesti insuliiniresistenssin kehittymiseen rasvasolussa. CPPED1-geenin oletetaan olevan endopolyfosfataasi, jonka taas oletetaan aktivoivan mTOR:n toimintaa ja mTOR:n puolestaan tiedetään inhiboivan insuliinin signalointia PI3K/Akt -signaalinvälitysreitin kautta. Näin ollen CPPED1 saattaa olla mukana insuliinisignaloinnin heikentymisessä ja insuliiniresistenssin kehittymisessä mTOR:n aktivaa-tion ja PI3K/Akt -signaalinvälitysreitin kautta.
CPPED1-geenin hiljentäminen lisäsi insuliinilla käsiteltyjen solujen glukoosin sisäänottoa verrattuna kontrollisoluihin. Wortmannin reagenssi estää PI3K:n toiminnan
insuliinisigna-43 loinnissa (Tsakiridis ym. 1995) ja tuloksista näkyi, että CPPED1-siRNA:lla altistettujen solu-jen Wortmannin käsittely vähensi insuliinin vaikutuksen täysin basaalisolusolu-jen tasolle glukoo-sin sisäänoton suhteen. Tämä vahvistaa oletusta siitä, että CPPED1 liittyy insuliinisignalointiin rasvasolussa ja että sen vaikutukset mahdollisesti välitettäisiin PI3K/Akt -signaalinvälitysreitin kautta.
Lihavuuteen liittyvä matala-asteinen tulehdustila lisää mahdollisesti CPPED1 ilmentymistä rasvasolussa. Laihtumisen on todettu myös vähentävän CPPED1 ilmentymistä (Kolehmainen ym. 2008), ja tuloksissa havaittiin CPPED1 vähentymisen parantavan insuliinistimuloitua glukoosin sisäänottoa ja näin ollen olevan yhteydessä parantuneeseen glukoosiaineenvaihdun-taan. Painonpudotus ja elintapojen muutos voi siis mahdollisesti vähentää CPPED1-geenin ilmentymistä ja tämä voi mahdollisesti olla osatekijänä glukoosiaineenvaihdunnan parantumi-sessa.
Muut sytokiinit vaikuttivat CPPED1:n ilmentymiseen vähemmän kuin TNF-α. IL-6 -altistus ei vaikuttanut tilastollisesti merkitsevästi CPPED1-geenin ilmentymiseen millään muilla altis-tusajoilla kuin 12 tunnin altistusajalla ja 1 ng/ml sytokiinipitoisuudella, jossa oli yllättävä CPPED1:n ilmentymistason pudotus. Muilla 12 tunnin IL-6 -altistuksen sytokiinipitoisuuksil-la tulosten vaihtelu oli hyvin suurta. Ilmentymistason pudotus saattaa johtua siitä, että solut ovat reagoineet eri tavalla muilla kuin 1 ng/ml sytokiinipitoisuudella. Se, että CPPED1 ilmen-tyminen ei muuttunut IL-6 -altistuksen vaikutuksesta voi johtua siitä, että TNF-α ja IL-6 vaik-kuttavat todennäköisesti osaksi eri signalointireittien kautta.
TGF-β1 -altistuksessa CPPED1-geenin ilmentyminen laski tilastollisesti merkitsevästi altis-tusajan ollessa 24 tuntia ja sytokiinipitoisuuden ollessa 10 ng/ml, mutta muilla altistusajoilla ja sytokiinipitoisuuksilla CPPED1geenin ilmentymisessä ei tapahtunut muutoksia. IL1β -altistuksessa CPPED1-geenin ilmentyminen lisääntyi tilastollisesti merkitsevästi altistusajan ollessa 48 tuntia ja sytokiinipitoisuuden ollessa 1 ng/ml. CPPED1-geenin ilmentyminen ei muuttunut tilastollisesti merkitsevästi muilla altistusajoilla. Tulosten vaihtelu oli suurta erityi-sesti 3 ja 12 tunnin altistusajoilla.
44 Pitkäaikaiset altistukset sytokiineille demonstroi kroonista matala-asteista tulehdustilaa. Pit-käaikaisten sytokiinialtistusten vaikutus CPPED1-geenin ilmentymiseen kertoo siitä, että vas-teet ovat toissijaisia. Altistuksissa käytetyt sytokiinikonsentraatiot olivat kuitenkin kymmen-kertaisia verrattuna elimistössä tavattaviin määriin eli käytetyt määrät olivat suprafysiologisia eli liian suuria. Vasteet eivät siis välttämättä kerro biologisista vasteista, vaan biologiset vas-teet saattavat jäädä käytettyjen pitoisuuksien väliin. Pienemmät sytokiinipitoisuudet eli fysio-logiset pitoisuudet saattaisivat kertoa todellisista biologisista vasteista.
45 6 YHTEENVETO
Tämän tutkielman tulokset vahvistavat oletusta siitä, että CPPED1 liittyy insuliinisignaloin-tiin rasvasolussa. Tulosten perusteella näyttäisi siltä, että TNF-α lisää CPPED1:n ilmentymis-tä rasvasolussa. CPPED1 saattaa heikenilmentymis-tää insuliinin signalointia mTOR:n aktivaation ja siilmentymis-tä kautta PI3K/Akt -signalointireitin inhibition kautta. Saattaa myös olla, että CPPED1 ilmen-tyminen lisääntyy lihavuudesta johtuvassa matala-asteisessa tulehdustilassa.
Koska CPPED1-geenistä ei ole juurikaan aiempaa tietoa, niin tämän tutkielman tulokset ovat vain suuntaa antavia ja tarvitaan lisätutkimuksia CPPED1-geenin toiminnan tarkempaan sel-vittämiseen. Sytokiinialtistuksen voisi tehdä pienemmillä sytokiinipitoisuuksilla, jotta tulokset kertoisivat enemmän todellisista biologisista vasteista. Tulehdustekijät vahvistavat myös tois-tensa vaikutuksia ja usein ne toimivat yhdenaikaisesti, näin ollen altistukset eri sytokiiniyhdis-telmillä olisivat saattaneet vaikuttaa CPPED1:n ilmentymiseen eri tavalla. Koska CPPED1-geenin hiljentäminen vaikutti rasvasolujen glukoosin sisäänottoon, niin CPPED1-geenin hiljentämisen vaikutuksia voisi tutkia myös proteiinitasolla.
46 LÄHDELUETTELO
Alberti KGMM, Zimmet P, Shaw J, 2006. Metabolic syndrome – a new world-wide defini-tion. A Consensus Statement from the International Diabetes Federadefini-tion. Diabet Med 23:
469–480.
Alexandraki K, Piperi C, Kalafoutis C, Singh J, Alaveras A, Kalafoutis A, 2006. Inflammato-ry process in type 2 diabetes: the role of cytokines. Ann N Y Acad Sci 1084: 89–117.
Arakaki AK, Tian W, Skolnick J, 2006. High precision multi-genome scale reannotation of enzyme function by EFICAz. BMC Genomics 7: 315.
Bastard JP, Maachi M, Van Nhieu JT, Jardel C, Bruckert E, Grimaldi A, Robert JJ, Capeau J, Hainque B, 2002. Adipose tissue IL-6 content correlates with resistance to insulin
Bastard JP, Maachi M, Van Nhieu JT, Jardel C, Bruckert E, Grimaldi A, Robert JJ, Capeau J, Hainque B, 2002. Adipose tissue IL-6 content correlates with resistance to insulin