Hypertrofiamarkkerit: NPPB ja PCNA

2.8 Tutkittavat geenit

2.8.5 Hypertrofiamarkkerit: NPPB ja PCNA

Sydänlihassolujen eli kardiomyosyyttien koko voi kasvaa, jotta niiden toimintakyky vastaa vaadittavaa lisääntyneessä sydämen toiminnassa (Akazawa & Komuro 2003). Solujen koon kasvua sanotaan hypetrofiaksi. Vaikka sydämen koon kasvu on yleensä vaste lisääntyneeseen rasitukseen kuten liikuntaan, pitkittyneenä se voi johtaa sydänsairauksiin.

NPPB eli natriureettinen peptidi B on yksi kolmesta selkärankaisilta (Vertebrate) löytyvistä natriureettisita peptideistä (Sergeeva & Christoffels 2013). Se toimii sydämessä muun muassa alentaen verenpainetta. NPPB:n ekspressio lisääntyy huomattavasti sydämen hypertrofian aikana, mutta sen pitoisuuksien nousua voidaan käyttää myös merkkinä sydämen vajaatoiminnasta. Sydämen vajaatoiminnassa verenpaine on koholla, mikä johtaa siihen, että veren pumppaamiseen tarvitaan yhä enemmän voimaa. Tämä rasittaa sydäntä ja johtaa kammion seinämän paksuuntumiseen.

Proliferoiva solun tuma-antigeeni eli PCNA on proteiini, jota löytyy runsaasti jakautuvien solujen tumasta (Nelson & Cox 2013). PCNA toimii muun muassa DNA:n synteesissä edistäen polymeraasin toimintaa ja DNA:n korjauksessa vuorovaikuttaen useiden DNA:ta korjaavien proteiinien kanssa (Boehm ym. 2016). PCNA kertoo solujen jakautumisesta eli hyperplasiasta ja sen ekspression on huomattu nousevan fyysisen harjoittelun lisääntyessä (van der Meulen ym. 2006, Castro ym. 2013).

21 2.8.6 Transkriptiotekijät: IGF1, GATA4 ja MEF2C

Insuliininkaltainen kasvutekijä 1 eli IGF1 on pieni peptidi, joka osallistuu moniin solutoimintoihin kuten kasvuun ja erilaistumiseen (Delafontaine ym. 2004, Troncoso ym.

2014). IGF1 syntetisoidaan samannimisestä geenistä pääasiassa maksassa ja sen valmistusta kontrolloi kasvuhormoni. Kasvuhormonin sitoutuminen sen reseptoreihin maksassa stimuloi peptidin ekspressiota ja sen vapautumista verenkiertoon. Myös muut kudokset tuottavat vähemmissä määrin IGF1:tä, joka vapautuessaan toimii paikallisena viestiaineena.

Elimistössä vapaanakiertävä IGF1 sitoutuu IGF1-reseptoreihin, jotka sijaitsevat solujen solukalvoilla (Troncoso ym. 2014). IGF1:n sitoutuminen sen reseptoriin aiheuttaa monimutkaisen viestintäkaskadin eli reaktiosarjan, joka johtaa solun vasteeseen kuten apoptoosiin eli solukuolemaan, solun erilaistumiseen tai solun kasvuun (Delafontaine ym.

2004). IGF1 edistää proteiinisynteesiä ja hypertrofiaa paljon energiaa kuluttavissa kudoksissa (Troncoso ym. 2014). IGF1 on myös tärkeä sikiön kehityksen ja kasvun kannalta (Puche &

Castilla-Cortázar 2012).

IGF1 toimii myös sydämessä vaikuttaen kardiomyosyyttien metaboliaan, erilaistumiseen ja hypertrofiaan (Troncoso ym. 2014). Sydämessä alentuneet IGF1-pitoisuudet ovat yhteydessä kohonneeseen sydäntauti- ja infarktiriskiin (Puche & Castilla-Cortázar 2012, Troncoso ym.

2014). Ravinnepulan aikana IGF1 auttaa ylläpitämään sydämen toimintaa, edistäen mitokondrioiden metaboliaa ja ATP:n tuottoa parantamalla mitokondrioiden kalsiumin ottoa (Troncoso ym. 2014). IGF1 suojaa myosyytteja myös oksidatiiviselta stressiltä.

Toinen Pro gradu-työssä tutkittava transkriptiotekijä oli GATA4. Selkärankaisilla (Vertebrate) on löydetty yhteensä kuusi erilaista GATA-proteiinia (GATA1-6), jotka jakautuvat kahteen alaryhmään (Molkentin ym. 1997). GATA1-3 säätelevät verisolujen tuotannosta vastaavien geenien toimintaa, kun taas GATA4-6 ekspressoituvat jo alkion soluissa ja ovat välttämättömiä sydämen kehityksessä.

GATA4 säätelee tiettyjä sydämen geenejä sitoutumalla tietyn sekvenssin omaavaan DNA:han sinkkisormiksi kutsutulla rakenteella vaikuttaen geenin ekspressioon (Molkentin ym.

1997). Geenejä, joihin GATA4 vaikuttaa ovat esimerkiksi NPPB eli natriureettinen peptidi B, NCX ja sydämen troponiini c eli TNNC1 (Akazawa & Komuro 2003). NPPB säätelee muun muassa verisuonien supistumista, NCX kuljettaa natrium- ja kalsiumioneja solun sisään ja ulos, kun taas TNNC1 vaikuttaa lihassupistukseen (UniProt). GATA4 on keskeisessä roolissa myös

kardiomyosyyttien hypertrofian säätelyssä vaikuttaen useiden geenien toimintaan yhdessä esimerkiksi MEF2-proteiinien kanssa (Liang ym. 2001, Akazawa & Komuro 2003).

Kolmas transkriptiotekijä, jota tutkittiin oli MEF2C (myocyte enhancer factor 2). MEF2-proteiinien geenejä on selkärankaisilta löydetty neljä erilaista MEF2a, -b, -c ja –d (Lin ym.

1997). MEF2-transkriptiotekijät muun muassa suojaavat hermosoluja apoptoosilta eli solukuolemalta, osallistuvat luustolihaksen ja ruston kehitykseen sekä toimivat välttämättöminä sydämen muotoutumisessa eli morfogeneesissä ( Lin ym. 1997, Potthoff &

Olson 2007). MEF2-geenit toimivat myös sydämen hypertrofian aikana säädellen muiden geenien toimintaa (Akazawa & Komuro 2003).

2.8.7 Referenssigeenit: DnaJa2 ja EF1α

Referenssigeeniksi valitun geenin ekspressiotason pitäisi pysyä tasaisena käytetyssä koeasetelmassa eri näytteiden välillä (Qiagen 2004). Monet referenssigeenit ovat niin sanottuja ylläpitogeenejä (housekeeping genes), jotka toimivat solun perustoiminnoissa (Nelson & Cox 2013). Kuitenkin jopa ylläpitogeenien ekspressiotason on todettu vaihtelevan, mistä johtuen referenssigeenin valinta on ajoittain hankalaa (Tang ym. 2007). Pro gradu-työhön valikoitui kaksi referenssigeeniä: EF1α ja DnaJA2.

DnaJA2 kuuluu lämpöshokkiproteiineihin (heat shock proteins), jotka aktivoituvat muun muassa elimistön stressitiloissa ennaltaehkäisten soluvaurioita (Beere 2004).

Lämpöshokkiproteiinien geenit ovat laajalti konservoituneita eli niitä esiintyy läpi eläinkunnan (Feder & Hofmann 1999). Hs-proteiinit jaotellaan perheisiin sekä niiden geenisekvenssin että molekyylipainon mukaan. DnaJA2 kuuluu perheeseen Hsp40 (Kotlarz ym. 2013).

Lämpöshokkiproteiinit suojaavat soluja näiden altistuessa muun muassa ultraviolettisäteilylle, äärilämpötiloille ja infektioille (Feder & Hofmann 1999, Kotlarz ym. 2013). Lisäksi ne auttavat ja säätelevät polypeptidien laskostumista (Nelson & Cox 2013). DnaJa2 valittiin referenssigeeniksi, koska sen ekspression on todettu olevan vakaa useissa eri kudoksissa ja olosuhteissa (Vornanen ym. 2005, Piironen ym. 2013).

Elongaatiofaktorit ovat laajalti konservoituneita proteiineja, jotka toimivat monissa solun toiminnoissa (Knudsen ym. 1993). Elongaatiofaktorit toimivat esimerkiksi proteiinisynteesissä auttaen polypeptidiketjua pidentymään translaatiossa (Nelson & Cox 2013). EF1α kuuluu ylläpitogeeneihin, jota ekspressoituu monissa kudoksissa muun muassa aivoissa, keuhkoissa ja

istukassa (Knudsen ym. 1993). EF1α valikoitui referenssigeeniksi, koska se on ylläpitogeeni ja sitä on käytetty myös muissa tutkimuksissa esimerkiksi Tang ym. (2007) ja Piironen ym.

(2013).

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää eri uintimatkojen vaikutusta purotaimenen (Salmo trutta fario) sydämen geenien ilmentymiseen. Tutkittavat näytteet oli kerätty kahdeltatoista taimenyksilöltä, jotka olivat uineet eri pituisia matkoja niiden luontaisen halukkuuden mukaan, joka ilmenee taimenen smolttivaiheessa. Taimenet jaettiin kahteen ryhmään uintimatkan pituuden mukaan (vähän vs paljon uineet). Pro gradu-tutkielmassa pyrittiin selvittämään sydämen geeniekspression eroja näiden kahden ryhmän väliltä. Tutkittavat geenit liittyvät muun muassa sydämen syketaajuuteen, sähköiseen ärtyvyyteen ja supistusvoimaan. Lisäksi erilaisen fyysisen aktiivisuuden vaikutusta sydämen hypertrofiaan eli solukoon kasvuun tarkasteltiin Pro gradu -työssä.

Hypoteesina oli, että mitä enemmän kala on uinut, sitä enemmän sillä ekspressoituu geenejä, jotka vaikuttavat sydämen toimintatehokkuuden paranemiseen. Eli pitkän matkan uineilla kaloilla näkyisi enemmän geeniekspressiota muun muassa sydämen supistusvoimaan, aktiopotentiaaliin, ärsytys-supistuskytkentään ja syketaajuuteen liittyvissä geeneissä.

Toisena hypoteesina oli, että enemmän uineilla kaloilla näkyisi hypertrofiaa tai –plasiaa eli pitkän matkan uineiden kalojen yksilöillä hypertrofiaa ja -plasiaa ilmentävien geenien ekspressio olisi kasvanut verrattuna lyhyen matkan uineisiin.

4 AINEISTO JA MENETELMÄT

4.1 Näytteet

Näytteet saatiin Anssi Vainikan johtamalta akvaattisen ekologian tutkimusryhmältä, jossa tutkittiin muun muassa ravinnon määrän vaikutusta smolttiutumiseen. Näytteet olivat peräisin noin viidestäkymmenestä purotaimenesta (Salmo trutta fario), jotka olivat alunperin Paltamon

Vaarainjoesta pyydettyjen yksilöiden poikasia. Kaloille oli ensimmäisen kerran tehty vaelluskoe keväällä 2016. Kalojen vaellusmatkaa oli mitattu vatsaan asetetulla PIT-sirulla (passive integrated transponder), joka rekisteröi kalan kulkua. Talveksi 2016-2017 kalat oli jaettu eri tankkeihin, joissa ravinnon määrää oli osassa rajoitettu ja osassa ei. Uusi vaelluskoe kaloille oli tehty keväällä 2017, jonka jälkeen kalat oli lopetettu ja kerätty niistä tarvittavat näytteet talteen.

Pro gradu-tutkielmassa käytetyt sydämet oli eristetty vaelluskokeen jälkeen alkukesästä 2017 ja säilytetty sen jälkeen -80 ºC pakkasessa. Näytteistä valikoitiin kahdentoista kalayksilön näytteet, jotka jaettiin tasan kahteen eri ryhmään kalan uintimatkan perusteella. Uintimatkat, kalojen painot ja sukupuolet sekä muut tiedot oli koottu laajaan Excel-taulukkoon.

Valikoiduissa kalayksilöissä oli mukana sekä koiraita että naaraita kummassakin ryhmässä.

Lyhyen matkan uineet kalat olivat uineet 2,6 kilometristä 44,5 kilometriin mittausjakson eli 81 päivän aikana. Pitkän matkan uineet kalat olivat uineet 144,4 kilometristä hieman yli 300 kilometriin (taulukko 1). Sydännäytteistä eristettiin kammiot, jotka punnittiin ja joista tämän jälkeen eristettiin RNA.

Taulukko 1. Kaloista eristettettyjen sydänten näytenumerot sekä uintimatkat Lyhyen matkan uineet Pitkän matkan uineet

Näyte Uintimatka (km) Näyte Uintimatka (km)

K22 2,6 K30 144,4

K7 10,7 K25 152,5

K8 11,2 K6 177,4

K1 20,1 K36 246,6

K13 43,8 K53 248,2

K14 44,5 K28 300,6

4.2 RNA-eristys ja pitoisuusmittaukset

Kalojen kammiot olivat painoltaan 0,02-0,19 g. RNA:n eristys kammioista tehtiin RNA Extraction –ohjeen (Thermo Scientific) mukaan käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen).

Ensin kudosnäytteet homogenisoitiin jauhamalla nestetypessä, jonka jälkeen jauhe siirrettiin 2 ml:n eppendorfputkeen. Jauheen sekaan lisättiin 1 ml Trizol-reagenssia (100 mL) ja vorteksoitiin voimakkasti. Homogeenisten näytteiden annettiin inkuboitua huoneenlämmössä 5

minuuttia, jonka jälkeen ne sentrifugoitiin +4 ºC:ssa 10 minuuttia (12 000 g). Syntyneeseen supernanttiin lisättiin 0,2 ml kloroformia ja sekoitettiin ravistelemalla 15 s. Näytteiden annettiin inkuboitua huoneenlämmössä 2 minuuttia, jonka jälkeen ne sentrifugoitiin uudelleen +4 ºC:ssa 15 minuuttia (12 000 g). Vesifaasi pipetoitiin uuteen eppendorfputkeen, jonne lisättiin 0,5 ml isopropanolia ja inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuuttia ja sentrifugoitiin 15 minuuttia +4 ºC:ssa (12 000 g). Muodostunut pelletti pestiin 1 ml:lla 75 % etanolilla ja sentrifugoitiin 5 minuuttia +4 ºC:ssa (7 500 g). RNA-sakat kuivatettiin huoneenlämmössä ja ne liuotettiin 40 µl:aan DEPC-vettä. Lopuksi näytteistä mitattiin RNA-pitoisuus käyttäen NanoDrop-mittalaitetta (taulukko 2).

Taulukko 2. Kammionäytteistä mitatut RNA-pitoisuudet

4.3 DNaasikäsittely ja cDNA

DNaasikäsittely ja cDNA:n valmistus näytteistä tehtiin DNase I, RNase-free ja Maxima cDNA synthesis kit –ohjeiden (Thermo Scientific) mukaan. DNaasikäsittelyyn tarvittiin 2 µg RNA:ta, jonka määrä saatiin jakamalla 2 µg näytteen RNA-pitoisuudella. Näytteen valmistukseen tarvittiin 2 µl 10 x DNase reaktiopuskuria, 2 µl RNase free DNase ja RiboLock RNase inhibiittoria (40 U/µl) 0,5 µl. RNA:n määrästä riippuen lisättiin DEPC-vettä, jotta lopputilavuudeksi saatiin 20 µl. Seoksia inkuboitiin 30 minuuttia +37 ºC:ssa, jonka jälkeen lisättiin EDTA Stop-liuosta 2 µl ja inkuboitiin 10 minuuttia +65 ºC:ssa.

cDNA:n valmistukseen tarvittiin 10 µl DNaasikäsiteltyä RNA:ta. Jokaiselle näytteelle valmistettiin kaksi putkea, joista toinen toimi -RT-kontrollina. RNA:n lisäksi tarvittiin sekä Oligo (dT)- (100 pmol/µl) että satunnaiseralukkeita (random hexamer, 100pmol/µl) 0,25 µl, dNTP-mix (10mM) 1 µl ja vettä 3,5 µl, jotta lopputilavuus oli 15 µl. Seokset inkuboitiin 5 minuuttia +65 ºC:ssa RNA:n sekundäärirakenteiden purkamiseksi ja jäähdytettiin jäillä. Tämän jälkeen putkiin lisättiin RT-puskuria (5x) 4 µl ja toiseen kunkin näytteen putkeen lisättiin vielä

Näyte RNA-pitoisuus (ng/µl) Näyte RNA-pitoisuus (ng/µl)

K22 634,3 K30 903,5

K7 1329,3 K25 1123,8

K8 288,3 K6 429,2

K1 1051,6 K36 511

K13 824 K53 564,7

K14 814,7 K28 724,5

1 µl Maxima H-entsyymi Mix, kun taas toiseen putkeen lisättiin sen sijaan 1 µl vettä, jolloin lopputilavuus oli kussakin putkessa 20 µl. Lopuksi näytteet ajettiin PCR-laitteessa Maxima cDNA-ohjelman mukaan 10 minuuttia +25 ºC, 30 minuuttia +65 ºC ja 5 minuuttia +85 ºC.

4.4 Alukkeiden suunnittelu ja testaus

Onnistuneeseen RT-PCR:n tekemiseen tarvitaan oikein suunnitellut alukkeet (Qiagen 2004).

Alukkeiden tulee olla spesifiset juuri tietyn geenin sekvenssille, jotta pariutuminen onnistuu.

Luukaloilla on evoluution saatossa tapahtunut genomin duplikaatio eli kahdentuminen, jonka seurauksena joistain geeneistä on useampia muotoja (Volff 2005). Tämä vaikeuttaa alukkeiden suunnittelua, koska vain muutaman nukleotidin ero sekvenssissä saattaa vaikeuttaa alukkeiden spesifistä pariutumista.

Onnistuneen qPCR:n edellytyksenä on toimivat alukkeet (Qiagen 2004). Alukkeiden pituus tulisi olla noin 20 emäsparia ja sulamislämpötila (Tm) 55-60 ˚C. Sulamislämpötilaan vaikuttaa erityisesti alukkeen pituus ja GC-nukleotidien määrä, jonka olisi hyvä olla 40-60 %. Pro gradu – työssä käytettyjen alukkeiden pituudet ja sulamislämpötilat näkyvät taulukossa 3.

Geenien sekvenssejä etsittiin NCBI:n (National Center for Biotechnology Information) geenitietokannasta (GenBank). Valmiit alukkeet löytyi DnaJA2- ja HCN3-geeneille, joten uusia ei tilattu. Geenisekvenssejä linjattiin eli vertailtiin keskenään eri sekvenssinlinjaus ohjelmien avulla (BLAST, EMBOSS Needle, Clustal Omega). Suurin osa geeneistä kuului merilohelle (Salmo salar), yksi nieriälle (Salvelinus alpinus) ja muutama purotaimenelle (Salmo trutta fario) (taulukko 3).

Alukkeiden saavuttua alukepareille tehtiin qPCR-menetelmällä monistustehokkuustestit, jossa testattiin niiden toimivuutta. Alukeparien katsottiin olevan toimivia, jos niiden tehokkuus ajoissa olisi 90-110%. Suurin osa alukepareista toimi heti ensimmäisessä monistustehokkuustestissä, jossa niitä testattiin, mutta muutaman geenin (ADRB1L, IGF1 ja CASQ2) alukepareja täytyi suunnitella ja testata uudelleen.

Monistustehokkuustestien jälkeen alukeparit ajettiin vielä agaroosigeelillä (TAE-puskuri), jotta nähtiin, vastasivatko niiden pituudet suunniteltuja. Tuotteiden pituudet vaihtelivat 103-149 bp välillä, mikä vastasi odotuksia.

Taulukko 3. Pro gradu- työssä käytetyt alukkeet ja niiden sulamislämpötilat (Tm).

4.5 qPCR-menetelmät

Kvantitatiivisiä PCR-ajoja varten seurattiin Maxima SYBR Green qPCR-ohjetta (Thermo Scientific). Ensin näytteille ja -RT-näytteille valmistettiin Master Mix-seos, jossa reaktiot tapahtuivat. Master Mix- seos sisälsi 5 µl Maxima SYBR Green qPCR –reaktioseosta, 0,5 µl sekä Forward että Reverse-aluketta ja 3 µl vettä. Master Mix-seoksia tehtiin 22-kappaletta, koska eri geenejä oli tämän verran. Seoksia pipetointiin 9 µl 96-paikkaisen kuoppalevyn kuopan pohjalle ja näytettä lisättiin 1 µl. Samaa näytettä pipetoitiin kolmeen rinnakkaiseen kuoppaan, joita seurasi –RT-kontrolli sekä nollakontrolli, jossa näytteen tilalla oli vettä. –RT-kontrollin tarkoituksena oli testata, sisälsikö RNA-näyte DNA-kontaminaatioita, kun taas nollakontrollin avulla testattiin oliko jossain reagenssissa DNA- tai cDNA-kontaminaatioita. Valmis kuoppalevy sentrifugoitiin 1 min 600 rpm ja ajettiin RT-qPCR (Agilent Aria) (kuva 5).

Ajoja tehtiin yhteensä 12 eli jokaiselle näytteelle. Jokaisessa ajossa testattiin siis kaikkien 22:n geenin ekspressiota tietyssä näytteessä eli kalayksilössä. Ajojen tehokkuudet vaihtelivat 98 ja 114 % välillä ja tuotteiden sulamislämpötilat 77 ja 86,5 ˚C:teen välillä. Alin sulamislämpötila oli GATA4-geenillä ja korkein phospholambaanilla (PLN).

Alukkeen nimi Sekvenssi 5´-3´suunnassa Tm (˚C) Alukkeen nimi Sekvenssi 5'-3' suunnassa Tm (˚C) ssSCN4ABqF1 ACGGGAGAGCAAAGAACTGA 57.3 ssPLNqF1 CCTTCACTCCCTCTCACTGC 61.4 stfDnaJqR2 GATCATGATGCGCATACCAC 57.3 ssADRB1LqR2 TAACCGTTAGCCGTGAAGGC 66.3 ssEF1AqF1 GCAGCTCATTGTTGGAGTCA 57.3 ssNPPBqF1 TCTTAAATCTGCCGCTGCTC 57.3

Kuva 5. Käytetty qPCR-ajojen lämpötilakaavio. Aluksi lämpötila nousee +95˚C:seen, joka aktivoi reaktion aloittavan polymeraasin (hot start). Alukkeiden liittyminen templaattiin tapahtui 58 ˚C:ssa. Monistumissyklien jälkeen suoritetun sulamikäyräanalyysin lämpötilat näkyvät myös kaaviossa.

4.6 Tilastolliset testit

RT-qPCR-ajoista saatdut aineistot käsiteltiin Microsoft Excel 2016- ohjelmalla, jonka avulla laskettiin eri geenien geeniekspressioiden keskiarvot kolmesta rinnakkaisesta näytteestä.

Tämän jälkeen keskiarvot jaettiin referenssigeenin ekspressioarvolla. Ryhmien sisäisistä saman geenin ekspressioista (n=6) laskettiin keskiarvot, keskihajonnat ja keskivirheet (SEM). Lopuksi lyhyen matkan uineiden ja pitkän matkan uineiden kalojen näytteitä tarkasteltiin kahtena eri ryhmänä, joita vertailtiin keskenään. Tutkittavien geenien ekspressiotasot suhteutettiin

referenssigeenin ekspressiotasoon, joten jos geenin ekspressio kuvaajassa on, sitä ekspressoitui enemmän kuin referenssigeeniä ja jos alle, niin vähemmän.

Tilastolliset menetelmät tehtiin SPSS-ohjelmalla (IBM SPSS Statistics), jolla testattiin ensin näytteiden normaalijakautumaa Shapiro-Wilk-testillä. Geenien CASQ2 ja IGF1 ekspressiot eivät olleet normaalijakauman mukaiset, joten näille tehtiin logaritmimuunnokset. Lopuksi tehtiin kahden riippumattoman otoksen t-testi.

5 TULOKSET

5.1 Geeniekspressitasot verrattuna referenssigeeniin DnaJA2

Ensimmäiseksi saatuja geeniekspressiotasoja piti verrata referenssigeeniin. Referenssigeeniksi valittujen geenien edellytyksenä oli, että niiden ekspressiotasojen piti pysyä tasaisena.

Kuitenkin toiseksi referenssigeeniksi valitun EF1α:n ekspressioero oli niin suuri ryhmien välillä (kuva 5), että se jätettiin tarkastelusta kokonaan pois, eikä sitä käytetty normalisointiin. Tästä johtuen geenien ekspressiotasoja verrattiin vain DnaJA2-referenssigeeniin.

Eniten ekspressoituvia geenejä olivat ATP2A2, NCX1 ja NPPB (kuva 6), joiden ekspressiotaso oli moninkertainen verrattuna referenssigeeniin. Eniten ekspressoitui hypertrofiamarkkerina toimivaa natriureettista peptidiä (NPPB), jonka ekspressio oli lyhyen matkan uineilla noin 19-kertainen ja pitkän matkan uineilla noin 14-kertainen verrattuna referenssigeeniin (taulukko 4). Tämä oli geeneistä ainoa, jonka ekspressiotaso oli laskenut pitkän matkan uineilla. Vaikka ekspressioero näkyi ryhmien välillä, hajontaa oli sen verran, ettei ero ollut tilastollisesti merkitsevä.

ATP2A- ja NCX1A-geenejä ilmentyi myös paljon verrattuna referenssigeeniin, mutta ekspressio ryhmien välillä oli pysynyt lähes tasaisena. Geenien korkea ekspressiotaso tarkoittaa, että sitä ilmentyy kudoksessa paljon. Vaikka geeniä ilmentyisi kudoksessa vähän, voi sen vaikutus siltikin olla tehokas. ATP2A ja NCX1A-geenit koodaavat kalsiumia siirtäviä proteiineja, jotka ovat tärkeitä muun muassa sydämen ärsytys-supistuskytkennässä ja relaksoitumisessa.

Suurimmalla osalla geeneistä ekspressiotaso oli noussut pitkän matkan uineilla, mutta suurimmalla osalla hajontaa oli myös niin paljon, että erot tasoittuivat (tarkemmat arvot taulukko 5 ja 6). Osa geeneistä ekspressoitui moninkertaisesti enemmän kuin referenssigeeni,

mutta osalla ekspressio oli vähäisempää (kuva 7 ja 8). Vähiten ekspressoituvia geenejä olivat HCN4 ja IGF1, joiden ekspressio oli moninkertaisesti pienempi kuin referenssigeenillä (kuva 8).

Kuva 6. ATP2A2-, NCX1A-, NPPB- ja EF1A-geenin ekspressio oli moninkertainen verrattuna referenssigeeniin DnaJA2. Toiseksi referenssigeeniksi valitun EF1α:n ekspressiotaso oli ryhmien välillä varsin suuri, minkä vuoksi sitä ei voitu käyttää normalisointiin. Tulokset ovat keskiarvoja ± keskivirhe (n=6/ryhmä).

Taulukko 4. Eniten ekspressoituvien geenien tarkemmat geeniekspressioarvot. Arvot ovat lyhyen (n=6) ja pitkän (n=6) matkan uineilta mitatut keksiarvot ± keskivirhe (SEM).

LYHYT ± SEM PITKÄ ± SEM ATP2A2 12,96 2,16 12,87 1,89 NCX1A 4,53 0,75 4,44 0,67 NPPB 18,98 2,83 13,85 1,61 EF1A 18,38 2,94 11,88 1,29

Kuva 7. Geenien ekspressiotasot verrattuna referenssigeeniin. Tulokset ovat keskiarvoja ± keskivirhe (n=6/ryhmä).

Taulukko 5. Tarkemmat geeniekspressioarvot kuvasta 7. Arvot ovat lyhyen (n=6) ja pitkän (n=6) matkan uineilta mitatut keksiarvot ± keskivirhe (SEM).

LYHYT ± SEM PITKÄ ± SEM

KCNJ14 1,10 0,15 1,44 0,20

KCNH6 1,39 0,19 2,07 0,37

SCN4A 0,46 0,04 0,66 0,11

SCN5LAb 0,25 0,04 0,34 0,05

CACNA1C 0,54 0,08 0,70 0,16

CASQ1 0,32 0,06 0,52 0,06

PLN 0,77 0,17 1,10 0,22

ADRB2 0,27 0,03 0,33 0,07

ADRB1L 0,18 0,02 0,25 0,02

GATA4 1,18 0,16 1,46 0,17

MEF2C 0,15 0,02 0,26 0,03

PCNA 0,11 0,01 0,15 0,03

Kuva 8. Vähiten ilmentyvien geenien ekspressiotaso oli moninkertaisesti pienempi kuin referenssigeenillä. Tulokset ovat keskiarvoja ± keskivirhe (n=6/ryhmä).

Taulukko 6. Vähiten ekspressoituvien geenien tarkat arvot, jotka ovat lyhyen (n=6) ja pitkän (n=6) matkan uineilta mitatut keksiarvot ± keskivirhe (SEM).

5.2 Geeniekspressioerot lyhyen ja pitkän matkan uineiden kalojen sydämessä

Kun geeniekspressiotasot oli normalisoitu käyttäen referenssigeeniä, niitä voitiin vertailla ryhmien välillä. Ekspressiot suhteutettiin vielä lyhyen matkan uineiden geeniekspressiotasoilla, jolloin vertaileminen oli helpompaa geenien kesken. Kaikkien lyhyen matkan uineiden ekspressioarvoksi tuli näin 1, johon pitkän matkan uineiden geeniekspressio on X-kertainen.

Kalium/natriumkanavien geeniekspressitasot olivat kaikilla geeneillä kasvaneet pitkän matkan uineilla verrattuna lyhyen matkan uineisiin (kuva 9). Kuitenkin hajontaa oli sen verran,

LYHYT ± SEM PITKÄ ± SEM KCNJ2 0,0279 0,0033 0,0688 0,0124 HCN3 0,0181 0,0038 0,0297 0,0039 CASQ2 0,0017 0,0008 0,0214 0,0113 HCN4 0,0043 0,0010 0,0074 0,0016 IGF1 0,0007 0,0001 0,0017 0,0003

että vain geenillä oli tilastollisesti merkitsevä ero ryhmien välillä (p=0,010). KCNJ2-geenin ekspressio oli 2,47- ± 0,44 kertainen pitkän matkan uineilla verrattuna lyhyen matkan uineisiin (taulukko 7).

Kuva 9. Kalium/natriumkanavien ekspressiotasot ryhmien välillä. Ekspressiot ovat keskiarvoja (n=6/ryhmä), jotka on suhteutettu lyhyen matkan uineiden keskiarvoon ± keskivirhe. *=

tilastollisesti merkitsevä ero ryhmien välillä (p < 0,05).

Kalsiumsiirtäjien geeniekspressioissa näkyi selvästi enemmän eroja (kuva 10). ATP2A2- ja NCX1A-geenien ekspressiotaso oli pysynyt lähes muuttumattomana, kun taas CASQ-geeneillä ekspressioero oli tilastollisesti merkitsevä ryhmien välillä (CASQ1 p=0,036, CASQ2 p=0,008).

CASQ2-geenin ekspressioero ryhmien välillä oli kaikista geeneistä suurin, 12,55- ± 6,64 kertanen keskivirhe (taulukko 7). Toisaalta CASQ2-geenin ekspressioissa hajontaa oli paljon.

CASQ1-geenin ekspressio oli 1,62- ± 0,18 kertainen pitkän matkan uineilla (taulukko 7).

β-adrenergisten reseptorien geenejä, ADRB3 ja ADRB2, ilmentyi kumpaakin lähes saman verran (kuva 11). Hypertrofiamarkkereiden geeneistä PCNA:n ekspressio oli kasvanut pitkän matkan uineilla, kun taas NPPB:n ekspressio oli laskenut (kuva 11). Kuitenkaan sekä

β-34

adrenergisten reseptorien että hypertrofiamarkkerien ekspressiotasoissa ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa ryhmien välillä.

Transkriptiotekijöitä oli yhteensä kolme: GATA4, IGF1 ja MEF2C. Näistä kahdella jälkimmäisellä geeniekspressioero oli tilastollisesti merkitsevä ryhmien välillä (MEF2C p=0,008, IGF1 p=0,001) (kuva 12). MEF2C-geenin ekspressio oli pitkän matkan uineilla 1,77-

± 0,17 kertainen ja IGF1-geenillä 2,54- ± 0,48 kertainen verrattuna lyhyen matkan uineisiin.

Kuva 10. Kalsiumsiirtäjien ekspressioerot ryhmien välillä. Ekspressiot ovat keskiarvoja (n=6/ryhmä), jotka on suhteutettu lyhyen matkan uineiden ekspressiotasoon ± keskivirhe. *=

tilastollisesti merkitsevä ero ryhmien välillä (p < 0,05).

Kuva 11. β-adrenergisten ja hypertrofiamarkkerien geeniekspressiot ryhmien välillä.

Ekspressiot ovat keskiarvoja (n=6/ryhmä), jotka on suhteutettu lyhyen matkan uineiden ekspressiotasoon ± keskivirhe.

Kuva 12. Transkriptiotekijöiden ekspressioerot ryhmien välillä. Ekspressiot ovat keskiarvoja (n=6/ryhmä), jotka on suhteutettu lyhyen matkan uineiden ekspressiotasoon ± keskivirhe. *=

tilastollisesti merkitsevä ero ryhmien välillä (p < 0,05).

Taulukko 7. Lyhyen (n=6) ja pitkän (n=6) matkan uineiden kalojen geeniekspressiot, jotka on suhteutettu lyhyen matkan uineiden ekspressiotasolla. Näin pitkän matkan uineiden ekspressiot ovat X-kertaiset verrattuna lyhyen matkan uineisiin ± keskivirhe (SEM). *= tilastollisesti merkitsevät erot lyhyen ja pitkän matkan uineiden välillä.

6 TULOSTEN TARKASTELU

6.1 Lyhyen ja pitkän matkan uineiden kalojen sydämen geeniekspressioerot

Tutkimuksen tavoitteena oli verrata sydämen geeniekspressioeroja lyhyen ja pitkän matkan uineiden purotaimenien välillä. Tutkittavaksi oli valittu yhteensä 20 eri geeniä. Tutkittavina oli useita ionikanavia, ioneja sitovia proteiineja ja hypertrofiasta kertovia proteiineja koodaavia geenejä. Valitut geenit vaikuttavat sydämen toimintatehokkuuteen ja kertovat sydämen hypertrofiasta.

LYHYT ± SEM PITKÄ ± SEM

KCNJ2 * 1,00 0,12 2,47 0,44

KCNJ14 1,00 0,13 1,31 0,18

KCNH6 1,00 0,14 1,49 0,26

HCN3 1,00 0,21 1,64 0,22

HCN4 1,00 0,24 1,71 0,37

SCN4A 1,00 0,09 1,43 0,24

SCN5LA 1,00 0,17 1,37 0,21

CACNA1C 1,00 0,15 1,30 0,30

ATP2A2 1,00 0,17 0,99 0,15

CASQ1 * 1,00 0,18 1,62 0,18

CASQ2 * 1,00 0,45 12,55 6,64

PLN 1,00 0,22 1,43 0,29

NCX1A 1,00 0,17 0,98 0,15

ADRB2 1,00 0,13 1,23 0,28

ADRB1L 1,00 0,14 1,36 0,12

GATA4 1,00 0,14 1,24 0,15

IGF1 * 1,00 0,11 2,54 0,48

MEF2C * 1,00 0,16 1,77 0,17

NPPB 1,00 0,15 0,73 0,08

PCNA 1,00 0,07 1,33 0,23

6.1.1 Sydämen toimintatehokkuuteen vaikuttavat geenit

Ensimmäisenä hypoteesina oli, että mitä enemmän kala on uinut, sitä enemmän, sillä ekspressoituu geenejä, jotka vaikuttavat sydämen toimintatehokkuuden paranemiseen.

Toimintatehokkuutta parantavat geenit vaikuttavat muun muassa aktiopotentiaalin kestoon, syketaajuuteen ja sydämen supistusvoimaan.

Toimintatehokkuuteen vaikuttavista geeneistä eniten ekspressoitui, sekä lyhyen että pitkän matkan uineiden kalojen sydämessä, ATP2A2- ja NCX1A-geeniä. Kaikista pienin ekspressio oli HCN4-geenillä. Suurimmalla osalla geeneistä ekspressiotaso oli korkeampi pitkän kuin lyhyen matkan uineilla kaloilla. Eroja oli kuitenkin varsin vähän, mikä saattaa johtua pienestä otannasta (n=6/ryhmä). Tilastollisesti merkitsevät erot kahden ryhmän välillä löytyivät geeneistä KCNJ2 (p=0,010), CASQ1 (p=0,036) ja CASQ2 (p=0,008).

Vaikka kaikkien ionikanavien geeniekspressio oli kasvanut pitkän matkan uineilla kaloilla, ekspressioeroja oli varsin vähän. Jänniherkkien natriumkanavien kahden eri geenin (SCN4 ja SCN5) geeniekspressiot olivat keskenään lähes samanlaiset kummassakin ryhmässä. Myös HCN3- ja HCN4-geenien ekspressiot olivat keskenään hyvin samanlaiset. Merkitsevää eroa ryhmien välillä ollut kummassakaan kanavaryhmässä, koska hajonnat kavensivat ekspressioeroa.

Ionikanavista ainoastaan kaliumkanava Kir2.1:n KCNJ2-geenin ekspressioero oli tilastollisesti merkitsevä ryhmien välillä. Kir2.1-kaliumkanava kuljettaa kaliumioneja ja ylläpitää solun lepopotentiaalia. On kuitenkin vaikeaa arvailla, miksi vain tämän ionikanavan geeniekspressio kasvoi merkitsevästi pitkän matkan uineilla kaloilla.

β-adrenerginen säätely on keskeinen mekanismi sydämen toiminnan ylläpidossa, jossa β- adrenergiset reseptorit säätelevät muun muassa sykettä ja supistusvoimaa. ADRB2- ja ADRB3-geenin ekspressio pitkän matkan uineilla oli noussut, mutta ero ei ollut merkitsevä.

Kalsiumsiirtäjillä eroja oli enemmän. Ca²⁺-ATPaasin geenin (ATP2A2) ekspressio oli pysynyt hyvin tasaisena, kuin myös NCX1A-geenin ekspressio. Myöskään phospholambaanin eikä L-tyypin kalsiumkanavan (CACNA1C) ekspressioero ei ollut merkitsevä. Tilastollisesti merkitsevä ero löytyi kuitenkin kummastakin kalsekvestriinin geenistä (CASQ1 ja CASQ2).

Kalsekvestriinit ovat sarkoplasmakalvoston kalsiumiasitovia proteiineja, jotka liittyvät sydämen ärsytys-supistuskytkentään. Kalsekvestriinien suurempi ekspressio pitkän matkan uineilla viittaa parantuneeseen sydänlihaksen supistumiskykyyn. Lisäksi ne vaikuttavat sydämen aktiopotentiaaliin ja supistusvoimaan säädellen solun sisäistä kalsiumkonsetraatiota.

Myös Castron ym. (2013) tutkimuksessa CASQ1-geenin ekspressio oli noussut tilastollisesti merkitsevästi fyysisesti aktiivisemmilla lohilla (Salmo salar). Sydämessä pääasiallinen kalsekvestriinin muoto on kuitenkin CASQ2, jota ilmentyi vähemmän kuin luustolihaksen CASQ1-geeniä (kuva 7 ja 8) (Cala & Jones 1983, Korajoki 2009).

6.1.2 Sydämen hypertrofiamarkkerit

Toisena hypoteesina tutkimuksessa oli, että pitkän matkan uineilla kaloilla hypertrofiaa ilmentävien geenien ekspressio olisi kasvanut verrattuna lyhyen matkan uineisiin. Tutkittavana oli kaksi hypertrofiamarkkeria: NPPB ja PCNA sekä kolme transkriptiotekijää (IGF1, MEF2C ja GATA4), jotka vaikuttavat hypertrofiamarkkerien ilmentymiseen.

Sekä lyhyen että pitkän matkan uineilla purotaimenilla kaikista eniten ilmentyi natriureettista peptidiä (NPPB). NPPB:n ekspressio oli hieman laskenut pitkän matkan uineilla, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Merkitsevä ero ryhmien välillä löytyi kuitenkin IGF1- (p=0,001) ja MEF2C-geeniltä (p=0,008).

Transkriptiotekijöiden, IGF1 ja MEF2C, suurempi ekspressio pitkän matkan uineilla kaloilla

In document Fyysisen aktiivisuuden vaikutus purotaimenen (Salmo trutta fario) sydämen geeniekspressioon (sivua 21-0)