FYYSISEN AKTIIVISUUDEN VAIKUTUS
PUROTAIMENEN (SALMO TRUTTA FARIO) SYDÄMEN GEENIEKSPRESSIOON
KAISU-LEENA NATUNEN
Pro gradu-tutkielma Itä-Suomen Yliopisto Ympäristö- ja biotieteiden laitos
2018
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO Ympäristö- ja biotieteiden laitos
NATUNEN, KAISU-LEENA: Fyysisen aktiivisuuden vaikutus putotaimenen (Salmo trutta fario) sydämen geeniekspressioon
Pro gradu-tutkielma (40op), 45 s Joulukuu 2018
Taimen (Salmo trutta) on lohikaloihin (Salmoniformes) kuuluva kalalaji, joka viettää ensimmäiset vuotensa joissa ja puroissa, jonka jälkeen se smolttiutuu ja lähtee vaellukselle järveen tai mereen. Kalan vaellushalukkuuteen vaikuttavat monet sekä ulkoiset että sisäiset tekijät, jotka määrittävät vaelluksen pituutta ja ajoitusta, mutta joiden seurauksena kala voi myös olla vaeltamatta kokonaan sinä vuonna. Vaellus tuottaa kaloille suurta stressiä, mutta loppujen lopuksi hyödyt vaelluksesta ovat suuremmat kuin haitat. Lohikalat ovat hyvin atleettisia kaloja, joiden energiantarve on vaelluksen aikana suuri. Myös sydämen on oltava tarpeeksi tehokas, jotta kala selviytyy vaelluksesta. Lohikalojen sydän onkin hyvin mukautuvainen vastaamaan ympäristöstä ja fysiologisista tekijöistä aiheutuviin muutoksiin kuten lämpötilaeroihin, sukukypsyyteen ja vaellukseen.
Luukalojen (Teleostei) sydän eroaa nisäkkäiden (Mammalia) sydämestä, verenkierron ollessa yksinkertainen. Sydämestä lähtevä veri virtaa kiduksiin, josta se johtuu suoraan elimistöön, käymättä uudelleen sydämessä. Sydämessä on oma verisuonistonsa, joka pitää huolen sen hapensaannista. Sydämen supistumista ylläpitävät tahdistinsolut, joista leviävä aktiopotentiaali saa sydämen supistumaan. Aktiopotentiaalin aikana solukalvon jännite muuttuu, kun ioneja virtaa soluun sisään ja ulos. Sydämen supistumista ja aktiopotentiaalin kestoa kontrolloivat useat proteiinit, jotka vaikuttavat ionien virtaukseen. β-adrenergiset reseptorit puolestaa vaikuttavat sydämen sykkeeseen ja supistusvoimaan. Lisäksi on geenejä, jotka indusoivat sydämen hypertrofiaa eli kammion seinämän paksuuntumista, jolloin sydämen iskutilavuus kasvaa.
Pro gradu-tutkielman tarkoituksena oli tutkia fyysisen aktiivisuuden vaikutusta purotaimenen (Salmo trutta fario) sydämen geeniekspressioon. Vertailtavina ryhminä olivat lyhyen matkan uineet (n=6) ja pitkän matkan uineet kalat (n=6). Tutkittavina oli useita ionikanavia, ioneja sitovia proteiineja ja hypertrofiasta kertovia proteiineja koodaavia geenejä.
Valitut geenit vaikuttavat siis sydämen toimintatehokkuuteen. Lisäksi tarkasteltiin fyysisen aktiivisuuden vaikutusta sydämen hypertrofiasta kertoviin geeneihin. Hypoteesina oli, että pitkän matkan uineilla kaloilla näkyisi kohonneita geeniekspressiotasoja sydämen toimintatehokkuutta parantavissa geeneissä verrattuna lyhyen matkan uineisiin. Toisena hypoteesina oli, että pitkän matkan uineilla kaloilla näkyisi kohonneita geeniekspressioita hypertrofiasta kertovissa geeneissä.
Geeniekspressioiden määrittämisessä käytettiin reaaliaikaista qPCR-menetelmää, jonka avulla ekspressioita voitiin vertailla keskenään. Tutkituista 20:stä geenistä 25 %:lla geeniekspressioero ryhmien välillä oli tilastollisesti merkitsevä. Eroja olisi voinut olla enemmän, jos kalamäärä olisi ollut suurempi. Kuitenkin lähes kaikkien geenien ekspressio oli jonkin verran koholla pitkän matkan uineilla. Tilastollisesti merkitsevät erot löytyvät kahdesta sydämen supistumiseen liittyvästä geenistä, yhdestä ionikanavan geenistä ja kahdesta hypertrofiasta kertovasta geenistä.
Tulokset viittaavat siihen, että fyysisellä aktiivisuudella on vaikutusta sydämen geeniekspressioon. Kohonneet geeniekspressiot pitkän matkan uineiden sydämessä viittaavat parantuneeseen sydämen supistumiskykyyn ja –voimaan sekä sydämen hypertrofiaan. Näin sydämen toimintatehokkuus on parantunut fyysisesti aktiivisemmilla kaloilla.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND
Department of Environmental and Biological Sciences
NATUNEN KAISU-LEENA: The effect of physical activity on gene expression in heart of brown trout (Salmo trutta fario)
MSc. Thesis (40 ECTS), 45 pp.
December 2018
Brown trout (Salmo trutta) is salmonid fish that spends its first years in streams and rivers after which it becomes a smolt and migrates to lake or sea. A willingness to migrate is affected by many inner and extrinsic factors which control the length and timing of migration. Fish can also decide not to migrate in that year. Migration is very stressful event but after all the benefits of migration are greater than costs. Salmonids are very athletic fish which energy demands are high during the migration. Also the heart must be strong enough that the fish survive the migration. Salmonid heart is highly plastic for environmental and physiological changes that fish experiences for example temperature differences, maturation and migration.
Heart of teleost fish is slightly different to mammalian heart. Blood circulation of teleost’s is called single circulation. In single circulation, blood leaves the heart, it first goes to gills and after that straight to the body without returning to the heart. Therefore, there is also a coronary circulation that carries oxygen to the heart. Pumping of the heart is controlled by pacemaker cells from which the action potential spreads all over the heart and induces atrial and ventricular contraction. During the action potential the membrane voltage differs because of influx and efflux of ions. Contraction of the heart and length of action potential are controlled by many proteins that have an effect on ion currents. Instead, β-adrenergic receptors have an effect on heart rate and the strength of contraction. In addition, there are genes that induce ventricular hypertrophy resulting increased stroke volume.
The aim of this master thesis was to examine the effect of physical activity on gene expression in heart of brown trout (Salmo trutta fario). Compared groups were short distance swimmers (n=6) and long distance swimmers (n=6). Studied genes encode many ion channels and ion binding proteins. Chosen genes are related to efficiency of heart. In addition, the effect of physical activity on genes involved in ventricular hypertrophy was studied. First hypothesis was that long distance swimmers have higher gene expressions than short distance swimmers in genes that improve the efficiency of the heart. Second hypothesis predicts that long distance swimmers have higher gene expressions in genes related to ventricular hypertrophy.
Differences in gene expression were examined with real-time qPCR which allows the comparison of gene expression levels. Of the 20 genes studied, 25 % had gene expression difference which was statistically significant between groups. The amount of genes could be higher if there had been more samples in the study. However, almost all of the genes experienced higher gene expression in long distance swimmers. In total, significant difference was found in two genes related to contraction of heart, in one ion channel gene and in two hypertrophic marker genes.
According to the results, the physical activity has an effect on gene expression in the fish heart. Higher gene expressions in the heart of long distance swimmers’, indicate the improvement of contraction of heart and ventricular hypertrophy. Hence, efficiency of heart has improved with greater physical activity.
SISÄLLYSLUETTELO
1 JOHDANTO ... 5
2 KIRJALLISUUSOSIO ... 5
2.1 Taimen (Salmo trutta) ... 5
2.2 Lohikalojen vaellus ja smolttiutuminen ... 6
2.3 Kalan verenkierto ja sydämen rakenne ... 8
2.4 Sydämen toiminta ... 9
2.5 Proteiinisynteesi ... 11
2.6 Geeniekspression säätely ... 12
2.7 Geeniekspression mittaaminen qPCR-menetelmällä ... 13
2.8 Tutkittavat geenit ... 16
2.8.1 Kalium- ja natriumkanavat: KCNJ2, KCNJ14, KCNH6, HCN3-4, SCN4A ja SCN5Ab... 16
2.8.2 Natrium-kalsiumvaihtaja: NCX1A ... 18
2.8.3 Kalsiumsiirtäjät: CASQ1, CASQ2, CACNA1C, ATP2A2 ja PLN ... 18
2.8.4 β-adrenergiset reseptorit: ADRB2 ja ADRB3 ... 19
2.8.5 Hypertrofiamarkkerit: NPPB ja PCNA ... 20
2.8.6 Transkriptiotekijät: IGF1, GATA4 ja MEF2C ... 21
2.8.7 Referenssigeenit: DnaJa2 ja EF1α ... 22
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ... 23
4 AINEISTO JA MENETELMÄT ... 23
4.1 Näytteet ... 23
4.2 RNA-eristys ja pitoisuusmittaukset ... 24
4.3 DNaasikäsittely ja cDNA ... 25
4.4 Alukkeiden suunnittelu ja testaus ... 26
4.5 qPCR-menetelmät ... 27
4.6 Tilastolliset testit ... 28
5 TULOKSET ... 29
5.1 Geeniekspressitasot verrattuna referenssigeeniin DnaJA2 ... 29
5.2 Geeniekspressioerot lyhyen ja pitkän matkan uineiden kalojen sydämessä ... 32
6 TULOSTEN TARKASTELU ... 36
6.1 Lyhyen ja pitkän matkan uineiden kalojen sydämen geeniekspressioerot ... 36
6.1.1 Sydämen toimintatehokkuuteen vaikuttavat geenit ... 37
6.1.2 Sydämen hypertrofiamarkkerit ... 38
6.2 Ruokinnan vaikutus kalan vaellushalukkuuteen ja geeniekspressioeroihin ... 39
7 JOHTOPÄÄTÖKSET ... 40
KIITOKSET ... 41
LÄHDELUETTELO ... 41
LYHENTEET
ADRB β-adrenerginen reseptori
ATP adenosiinitrifosfaatti
ATP2A sarkoplasmakalvoston Ca2+-ATPaasi 2 CACNA1 L-tyypin jänniteherkkä kalsiumkanava 1α
CASQ kalsekvestriini
cDNA komplementaarinen DNA
DEPC dietyylipyrokarbonaatti
DNA deoksiribonukleiinihappo
DnaJA2 dnaJ alaperhe A jäsen 2
EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo EEF1 eukaryoottinen pidentymistekijä 1
GATA4 transkriptiotekijä GATA4
HCN hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel IGF1 insuliininkaltainen kasvutekijä 1
KCNH jänniteherkkä kaliumkanava alaperhe H KCNJ jänniteherkkä kaliumkanava alaperhe J
Kir sisäänpäin suuntaava kaliumkanava
MEF2 myocyte enhancer factor-2
mRNA lähetti-RNA (eng. messenger RNA)
NCX natrium/kalsium-vaihtaja
NPPB β-tyypin natriureettinen peptidi
NTC no template control
PCNA proliferoivan solun tuma-antigeeni
PLN phospholambaani
qPCR kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio
RNA ribonukleiinihappo
SCN jänniteherkkä natriumkanava
TAE trisasetaatti-EDTA
tRNA siirtäjä-RNA (eng. transfer-RNA)
5 1 JOHDANTO
Koska lohikalat (Salmoniformes) ovat kaupallisesti tärkeitä kaloja, niiden terveyteen vaikuttavia tekijöitä kuten uintikuntoa ja sydämen toimintaa tutkitaan (Dindia ym. 2017, Robinson ym. 2017). Lisäksi lohikalojen sydämen on todettu olevan erittäin kyvykäs sopeutumaan erilaisiin muutoksiin rakenteellisesti ja toiminnallisesti. Tällaisia sydämen muutoksia aiheuttavia tekijöitä ovat muun muassa kylmyys, hapenpuute ja kalojen vaellus.
Lohikalat ovatkin ihanteellisia fysiologian tutkimuskohteita.
Kalojen terveys on yksi tärkeimpiä tekijöitä, joka vaikuttaa kalojen kasvatukseen ja siitä saataviin tuottoihin (Robinson ym. 2017). Kasvatuslaitoksissa kasvaneiden kalapoikasten kunto on yleensä huonompi kuin luonnossa eläneiden poikasten, mikä ilmenee muun muassa suurena kuolleisuutena, kun smolttipoikasia lasketaan laitoksesta mereen. Laitoksessa kasvaneilla kaloilla on usein sekä madaltunut vastustuskyky että huonompi hengitys- ja verenkiertoelimistön kestävyys (Zhang ym. 2016). Myös niiden sydän on heikompi.
Kalojen uintikestävyyden harjoittaminen kalanviljelylaitoksilla voisi parantaa smolttien eli vaeltavien poikasten selviytymistä merellä (Zhang ym. 2016). Kestävyysharjoittelun on todettu esimerkiksi vahvistavan uintilihaksia ja parantavan niiden supistumiskykyä. Harjoittelu parantaa myös sydämen toimintakykyä aiheuttamalla sydänlihaksen hypertrofiaa eli solukoon kasvua. Harjoittelu vaikuttaa myös sydämen supistumiseen ja toimintatehokkuuteen vaikuttavien geenien ilmentymiseen (Castro ym. 2013, Zhang ym. 2016).
β-adrenerginen säätely ylläpitää sydämen normaalia rytmiä ja auttaa sydäntä sopeutumaan erilaisiin muutoksiin (Vornanen 1998). Adrenaliini ja noradrenaliini vaikuttavat β- adrenergiseen säätelyyn parantaen sydämen toimintatehoa liikunnan ja stressitilojen aikana.
Tälläiset sydämen toimintakykyä parantavat tekijät puolestaan ovat apuna esimerkiksi sydänsairauksien tutkimisessa ja hoidossa (Dindia ym. 2017).
2 KIRJALLISUUSOSIO
2.1 Taimen (Salmo trutta)
Taimen (Salmo trutta) on lohikaloihin kuuluva kalalaji, jota esiintyy ihmisen toimesta nykyisin kaikissa maanosissa Antarktista lukuun ottamatta (Vainikka ym. 2012, Eldøy ym 2015).
6
Ulkonäöltään taimen muistuttaa lohta (Salmo salar), mutta sillä on enemmän täplitystä kylkiviivan alapuolella ja sen pyrstön varsi on tasapaksumpi (Lapin kalatalouskeskus 2018).
Taimen kasvaa noin 40-80 senttiseksi. Ruokatottumuksiltaan taimen on hyvin sopeutuvainen ja se usein vaeltaakin paremmille alueille ravintotilanteen mukaan (Eldøy ym. 2015). Lohikaloille vaellus on hyvin tavallista (Vainikka ym. 2012).
Taimenella on kolme alalajia tai ekologista muotoa : meritaimen (Salmo trutta morpha trutta), järvitaimen (Salmo trutta lacustris) ja purotaimen (Salmo trutta fario) (Lapin kalatalouskeskus 2018). Kaikki taimenet kutevat virtavesissä, mutta meritaimen vaeltaa kasvamaan mereen ja järvitaimen järveen. Alalajeista pienin, purotaimen eli tammukka, voi elää ja kasvaa koko elämänsä joessa, mutta saattaa silti lähteä välillä vaellukselle mereen tai järveen. Vaellusmatkan pituus, kesto sekä ajoitus vaihtelevat eri populaatioiden välillä (Eldøy ym. 2015, Garcia-Vega ym. 2017).
Kalan vaellushalukkuus riippuu ympäristötekijöistä kuten ravinnon saatavuudesta, kilpailusta, veden lämpötilasta, valon määrästä ja predaatiosta (Wedemeyer ym. 1980, Vainikka ym. 2012, Eldøy ym. 2015, Garcia-Vega ym. 2017). Merkittävää eroa muuttavan ja jokeen jäävän yksilön välillä ei täysin tiedetä, mutta yksilön vaellushalukkuus on osittain geneettistä ja osittain ympäristöstä johtuvaa. Esimerkiksi kasvunopeuden, koon, sukupuolen, geenien ja energiavarastojen tiedetään vaikuttavan kalan vaellushalukkuuteen.
2.2 Lohikalojen vaellus ja smolttiutuminen
Lohikaloilla muutosta jokipoikasesta vaelluspoikaseksi kutsutaan smolttiutumiseksi (Jones ym.
2015). Ennen vaellusta poikanen käy läpi useita morfologisia ja fysiologisia muutoksia, jotka auttavat sitä selviytymään vaelluksesta. Morfologisia muutoksia ovat esimerkiksi kehon hopeoituminen ja evien tummuminen (Wedemeyer ym. 1980). Fysiologisia muutoksia ovat suolatasapainon tehokkaampi säätely, rasvavarastojen pienentyminen ja kidusten Na+-K+- ATPaasin aktiivisuuden lisääntyminen.
Lohikalat vaeltavat, koska hyödyt siitä ovat suuremmat kuin haitat (Jones ym. 2015).
Haittoina ovat esimerkiksi energiavarastojen hupeneminen, stressi ja suuri kuolleisuus.
Hyötynä ovat kuitenkin paremmat ravintoalueet ja paremmat kasvumahdollisuudet, joista seuraa parempi lisääntymiskelpoisuus. Vaeltavat yksilöt kasvavatkin nopeammin kuin kotipuroon jäävät (Wysujack ym. 2009). Naaraiden on todettu vaeltavan todennäköisemmin
7
kuin koiraiden, mikä johtuu muun muassa siitä, että suurempi kokoisilla naarailla on suuremmat mätimunat, joista syntyneillä poikasilla on suurempi selviytymismahdollisuus.
Lohikaloilla arvellaan olevan jokin fysiologinen kynnysarvo, jonka saavuttaessaan, ne ovat valmiita vaeltamaan (Jones ym. 2015). Kuten aikaisemmin todettiin esimerkiksi koko ja energiavarastot yhdessä bioottisten eli elollisten ja abioottisten eli elottomien tekijöiden kanssa, vaikuttavat kalan vaellushalukkuuteen. Lohella (Salmo salar) smolttiutumiskynnys näyttäisi ylittyvän kalan ollessa 12-13 senttinen (Wedemeyer ym. 1980). Iältään yksilöt vaihtelevat kahden ja viiden vuoden välillä. Ikä vaihtelee, koska toiset yksilöt kasvavat nopeammin.
Nopeakasvuiset yksilöt lähtevät vaellukselle yleensä aiemmin kuin hidaskavuiset (Theriault &
Dodson 2003). Isompikokoisilla yksilöillä onkin yleensä suuremmat energiatarpeet ja paremmat mahdollisuudet selvitä vaelluksesta kuin pienillä yksilöillä (Jones ym. 2015).
Toisaalta nopeakasvuiset koiraat saavuttavat sukukypsyyden aikaisemmin, jolloin ne todennäköisesti jäävät kotipuroonsa lisääntymään (Vainikka ym. 2012).
Kalan vaellushalukkuuteen voidaan vaikuttaa positiivisesti myös ravinnon määrää rajoittamalla (Wysujack ym. 2009, Vainikka ym. 2012, Jones ym. 2015). Kuitenkaan koko talven kestävä nälkiintyminen ei ole hyväksi, vaan kalan on saatava riittävästi ravintoa kevätkuukausina, jotta vaellus onnistuu (Jones ym. 2015). Pitkäaikainen nälkiintyminen voi vaikuttaa huomattavasti muun muassa kalan vaelluksen kestoon (Martínez ym. 2003).
Ravinnon määrää rajoittamalla voidaan vaikuttaa myös koiraiden sukukypsyyteen (Vainikka ym. 2012). Kun ravinnon määrää rajoitetaan, koiraiden ennenaikainen sukukypsyys viivästyy, jolloin yhä useampi lähtee vaellukselle.
Monien lohikalojen vaelluksen esteenä on yhä enemmän ja enemmän jokien pirstaloituminen ja rakentaminen (Garcia-Vega ym. 2017). Esimerkiksi patojen rakentaminen ja veden juoksutus muuttavat ja vaikeuttavat kalojen vaelluskäyttäytymistä (Vainikka ym.
2012, Garcia-Vega ym. 2017). Vaellus aiheuttaa kaloille myös suurta stressiä ja monet yksilöt kuolevatkin vaellusmatkoillaan. Kasvattamoista lasketaan vuosittain miljoonia smoltteja vapaaksi luonnossa elävien lohikalakantojen parantamiseksi. Kasvattamoista lasketuista smolteista noin 10-20 % kuolee ensimmäisten elinkuukausiensa aikana meressä (Zhang ym.
2016, Robinson ym. 2017). Kuolleisuus johtuu monista stressitekijöistä, infektiosairauksista ja huonosta kunnosta. Kasvattamoissa nopeasti kasvavilla kaloilla on yleensä huonompi uintikestävyys, vähentynyt hypoksian eli hapenpuutteen kesto sekä heikompi sydän kuin luonnossa kasvaneilla yksilöillä (Zhang ym. 2016).
Kalojen kestävyysharjoittaminen kalanviljelylaitoksilla parantaisikin smolttien selvitymistä merellä (Zhang ym. 2016). Kestävyysharjoittelun on todettu muun muassa kasvattavan
8
uintilihaksia ja niiden supistumiskykyä, lisäävän entsyymiaktiivisuutta ja parantavan vastustuskykyä. Harjoittelu parantaa myös sydämen toimintakykyä aiheuttamalla sydänlihaksen hypertrofiaa ja -plasiaa eli solukoon ja -määrän kasvua ja lisäämällä sydämen supistumiseen ja toimintatehokkuuteen vaikuttavien geenien ekspressiota (Castro ym. 2013, Zhang ym. 2016).
2.3 Kalan verenkierto ja sydämen rakenne
Verenkierto kuljettaa ravintoaineita ja happea kehoon ja kuona-aineita ja hiilidioksidia pois kehosta (Reece ym. 2011). Luukaloilla (Teleostei), toisin kuin nisäkkäillä (Mammalia), on yksinkertainen verenkierto eli veri kulkee sydämen läpi vain kerran kierron aikana. Kaloilla onkin sydämessään vain yksi eteinen ja yksi kammio. Kammio pumppaa veren hapettumaan kiduksiin, josta runsashappinen veri virtaa dorsaalisen eli selänpuoleisen aortan kautta kaikkialle kehoon, josta vähähappinen laskimoveri palaa takaisin sydämeen.
Sydämen rakenteeseen kuuluu myös kaksi muuta osaa: sinus venosus eli laskimolaajennus ja bulbus arteriosus eli valtimokeko (kuva 1) (Randall 1968). Laskimolaajennus on ohutseinäinen pussi, joka kerää laskimoveren ennen sen siirtymistä eteiseen (Korajoki 2013).
Laskimolaajennuksen ja eteisen välissä sijaitsee sydämen sinussolmuke, jossa toimivat sydämen tahdistinsolut, jotka ylläpitävät ja kontrolloivat sydämen sykettä (Haverinen
&Vornanen 2007). Valtimokeko puolestaan tasaa kammiosta tulevan veren paineen ja yhdistää kammion ventraaliseen eli mahanpuoleiseen aorttaan. Sydämessä on lisäksi läpät laskimolaajennuksen ja eteisen, eteisen ja kammion sekä kammion ja valtimokeon välillä, jotka estävät verta virtaamasta taaksepäin (Randall 1968).
Lohikalat (Salmoniformes) ovat hyvin atleettisia ja aktiivisia kaloja, joiden sydämen rakenteen tulee olla tarpeeksi rasitusta kestävä (Pieperhoff ym. 2009). Kammion uloin kerros koostuu tiiviistä lihaskudoksesta (compactosa), kun taas sisin kerros on sienimäistä sydänlihaskudosta (spongiosa). Ulkokerroksessa lohikaloilla on sepelsuonia (koronaarisuonia), joista sydänlihassolut saavat happea (Farrell & Clutterham 2003). Sisäkerroksen solut saavat hapen sydämen ontelossa kulkevasta verestä.
Kalan kasvaessa tiivis sydänlihaskerros paksunee (Clark & Rodnick 1998). Kerroksen paksuuntuessa tapahtuu hypertrofiaa ja –plasiaa. Hypertrofia tarkoittaa solukoon kasvua ja hyperplasia solujen määrän lisääntymistä. Kerroksen paksuus vaihtelee kalalajista ja kalan aktiivisuudesta riippuen. Sydämen hypertrofiaa tapahtuu myös kalan saavuttaessa
9
sukukypsyyden (Franklin & Davie 1992). Erityisesti sukukypsillä koirailla sydän on suurempi kuin epäkypsillä koirailla tai naarailla. Tämän arvellaan johtuvan steroidien määrän noususta kutukauden aikana. Suurentunut sydänlihas kasvattaa sydämen kerralla pumpaamaa verimäärää eli sydämen iskutilavuus kasvaa.
Kuva 1. Kalan sydämen rakenne (muokattu Randall 1968). Vähähappinen veri kerääntyy laskimolaajennukseen, josta sydän pumppaa sen eteisen ja kammion kautta valtimokekoon, jonka jälkeen ventraalisen aortan kautta kiduksiin.
2.4 Sydämen toiminta
Veri kiertää kehossa, koska supistuva sydän pitää veren liikkeellä (Randall 1968). Sydämen toimintasykliin kuuluu kaksi vaihetta. Diastolisessa vaiheessa sydän rentoutuu, jolloin veri virtaa eteiseen. Systolisessa vaiheessa ensin supistuu eteinen ja sitten kammio, jonka jälkeen veri virtaa valtimokeon kautta ventraaliseen aorttaa. Sydämen supistumista ylläpitävät sinussolmukkeen tahdistinsolut, joissa syntyy aktiopotentiaali, joka leviää ensin eteiseen ja sen jälkeen kammioon, jolloin ne supistustuvat hieman eri aikaan (Haverinen & Vornanen 2007).
10
Kalium- (K+) ja natriumionien (Na+) virtaus solukalvon ionikanavien läpi on keskeisessä roolissa aktiopotentiaalin muodostumisessa (Reece ym. 2011). Kaliumionien konsentraatio eli pitoisuus liuoksessa on korkeampi solun sisäpuolella, kun taas natriumionien konsentraatio on korkeampi solun ulkopuolella. Tätä pitoisuuseroa ylläpitävät natrium-kaliumpumput. Pumput kuljettavat natriumioneja solusta ulos ja kaliumioneja solun sisään ionikonsentraation vastaisesti eli matalammasta pitoisuudesta korkeampaan. Tähän ne saavat tarvitsemansa energian ATP:n hydrolyysistä eli hajotuksesta. Jokaista ulosmenevää kolmea natriumionia kohden siirtyy kaksi kaliumionia sisään, mistä seuraa solun sisäinen negatiivinen varaus ja solun ulkopuolinen positiivinen varaus.
Ionipumppujen lisäksi solukalvolla on myös ionikanavia, jotka mahdollistavat ionien diffuusion eli siirtymisen väkevämmästä pitoisuudesta laimeampaan (Reece ym. 2011).
Lepopontentiaalin kannalta olennaista on kaliumionien diffuusio kaliumkanavien kautta.
Kaliumionien konsentraatio solun sisäpuolella on 140 mM, kun taas ulkopuolella vain 5 mM.
Konsentraatioero pyrkii tasoittumaan, mikä johtaa kaliumionien ulosvirtaukseen. Kun useat kaliumkanavat ovat lepopotentiaalin aikana auki, useimmat natriumkanavat ovat kiinni. Tämä edesauttaa, että solun sisäpuolelle muodostuu negatiivinen varaus. Samaan aikaan kuitenkin muutamat natriumkanavat ovat auki ja natriumionien virratessa soluun, tekevät siitä vähemmän negatiivisen. Sekä kalium- että natriumioneilla on tasainen, mutta vastakkainen virta solukalvon läpi.
Sydämen supistuminen johtuu siis sinussolmukkeessa syntyvästä aktiopotentiaalista, joka purkaa lepopotentiaalin (Nerbonne & Kass 2005). Aktiopotentiaali johtuu vuorottain avautuvista ja sulkeutuvista ionikanavista, jotka aiheuttavat solukalvon jännitteen de- ja repolarisaation. Aktiopotentiaali voidaan jakaa viiteen eri vaiheeseen (kuva 2).
Ensimmäisessä vaiheessa Na+-ionit virtaavat soluun avautuvien natriumionikanavien kautta aiheuttaen nopean depolarisaation eli solun sisäisen varauksen muuttumisen negatiivisesta positiiviseksi. Toisessa vaiheessa tapahtuu nopea repolarisaatio, kun Cl - ionit virtaavat solun sisään ja K+ -ionit ulos. Tämä vaihe on kuitenkin huonosti kehittynyt kalan sydämessä eikä sitä pystytä juurikaan havaitsemaan (Hassinen 2010). Kolmas vaihe on ylläpito (plateau phase), jonka aikana Ca2+ -ionit virtaavat soluun kalsiumkanavien kautta ja K+-ionit ulos kaliumkanavien kautta (Nerbonne & Kass 2005). Selkärankaisille (Vertebrate) on tyypillistä pitkä aktiopotentiaalin ylläpitovaihe, joka kaloilla voi kestää jopa 3 s (Hassinen 2010). Solun sisäinen kalsiumpitoisuuden kasvu saa aikaan kalsiumionien vapautumisen myös sydänlihassolun sarkoplasmakalvostosta, joka toimii kalsiumionien varastona. Tämä johtaa lopulta lihassäikeiden eli aktiini-myosiinisäikeiden liukumiseen toistensa lomaan ja
11
sydänlihaksen supistumiseen (Bartos ym. 2015). Neljännessä vaiheessa kalsiumia siirretään takaisin solun ulkopuolelle sekä sarkoplasmakalvostoon. Kalsiumkanavat sulkeutuvat ja aiheuttavat solukalvon repolarisaation eli solunsisäisen varauksen palautumisen positiivisesta jälleen negatiiviseksi (Nerbonne & Kass 2005). Myös kaliumionien ulosvirtaus kaliumionikanavien kautta on tärkeässä osassa solukalvon repolarisaatiossa. Viimeisessä vaiheessa osa kaliumkanavista sulkeutuu ja vielä avoinna olevat tasaavat solukalvon jännitteen lepopotentiaaliin.
Kuva 2. Aktiopotentiaalin vaiheet (muokattu Hassinen 2010). Aktiopotentiaali koostuu viidestä vaiheesta, joiden aikana solukalvon jännite muuttuu, kun ionit virtaavat solukalvon läpi.
2.5 Proteiinisynteesi
Geenit ovat DNA-jaksoista koostuvia perinnöllisyyden yksiköitä (Reece ym. 2011).
Tapahtumaa, jossa geenin nukleotidisekvenssi käännetään RNA:ksi ja josta lopulta valmistetaan toiminnallinen tuote, joka on usein proteiini, kutsutaan geeniekspressioksi.
Proteiinisynteesi jakautuu muutamaan vaiheeseen, jotka ovat transkriptio, RNA:n silmukointi ja translaatio (Reece ym. 2011). Transkriptio tapahtuu solun tumassa, kun taas translaatio ja sen jälkeiset muokkaukset solulimassa. Transkriptiossa DNA:ssa oleva informaatio käännetään RNA-polymeraasin avulla lähetti-RNA:ksi (mRNA). RNA:n silmukoinnissa esi-mRNA:sta poistetaan informaatiota sisältämättömät osat, joita kutsutaan introneiksi. Informaatiota sisältävät osat eli eksonit liitetään yhteen, josta valmistuu valmis
12
mRNA. Tässä vaiheessa voi tapahtua myös RNA:n vaihtoehtoista silmukointia, jossa eksonit voivat järjestäytyä uudelleen tai jokin niistä voi jäädä kokonaan pois valmiista mRNA:sta. Tällä ei välttämättä ole vaikutusta valmiin proteiinin toimintaan, mutta toisinaan sen rakenne ja toiminta voi muuttua. Näin samasta DNA-sekvenssistä eli geenistä voi muodostua useampaa eri proteiinimuotoa.
Kun mRNA on valmis, siitä valmistetaan translaatiossa polypeptidi (Reece ym. 2011).
Translaatio tapahtuu solun sisällä soluelimissä, jotka ovat nimeltään ribosomeja. Siellä mRNA:n nukleotidisekvenssin perusteella rakennetaan aminohappoketju. Siirtäjä-RNA (tRNA) lukee mRNA:n nukleotidisekvenssiä kolmen nukleotidin jaksoissa, jotka muodostavat kodonin. Jokainen kodoni vastaa tiettyä aminohappoa, joita useat tRNA:t kuljettavat ribosomeihin, joissa valmistuu pidentyvä aminohapposekvenssi. Kun tRNA kohtaa viimeisen eli lopetuskodonin synteesi päättyy.
Translaation jälkeen valmis aminohappokaetju eli polypeptidi käy läpi vielä translaation jälkeisiä muokkauksia, jotta siitä tulee toiminnallinen proteiini (Reece ym. 2011). Ensin polypeptidi laskoskuu kolmiulotteiseksi molekyyliksi, jonka jälkeen siihen voi liittyä sokeri-, rasva- tai fosfaattiryhmiä. Joissain tapauksissa useat polypeptidiketjut liittyvät yhteen muodostaen toimivan proteiinin. Tästä esimerkki on veren hemoglobiini ja kaikki kaliumionikanavat.
2.6 Geeniekspression säätely
Kaikkien organismien on säädeltävä, miten ja mitkä geenit ilmentyvät tiettynä aikana (Reece ym. 2011). Geenien ilmentymistä säädellään organismin ulko- ja sisäpuolelta tulevien signaalien mukaan. Vaikka melkein jokainen organismin solu sisältää saman genomin eli geneettisen materiaalin, eri solutyypit toimivat eri tavoin. Tämä johtuu erilaisesta geeniekspressiosta eri solutyypeissä. Geenien ilmentyminen väärin voi johtaa sairauksiin kuten syöpään.
Geenien ilmentymistä voidaan säädellä monessa ei vaiheessa ja monella eri tavalla esimerkiksi, kun DNA on vielä kromatiinirakenteessa (Reece ym. 2011). Tiiviisti pakkautuneessa heterokromatiinissa sijaitsevat geenit eivät pysty transkriptoitumaan.
Kromatiinissa DNA on sitoutuneena histoniproteiinin ympärille ja myös näiden histoniproteiinien muokkaus voi vaikuttaa geenien ilmentymiseen. Histoniproteiinien asetylaatio eli asetyyliryhmän (-COCH3) lisäys löysentää kromatiinirakennetta edistäen
13
transkription aloitusta. Metyyliryhmien (-CH3) lisäys histoneihin tai suoraan DNA-juosteeseen puolestaan hillitsee transkriptiota.
Geenien ilmentymistä voidaan säädellä myös transkriptiotekijöiden avulla (Reece ym.
2011). Transkriptiotekijät ovat proteiineja, jotka sitoutuvat DNA:han säädellen geenien transkriptiota. Transkriptiotekijät voivat joko kiihdyttää (aktivaattorit) tai estää (repressorit) transkriptiota.
2.7 Geeniekspression mittaaminen qPCR-menetelmällä
Polymeraasiketjureaktio (polymerase chain reaction) eli PCR on menetelmä, jolla voidaan tuottaa kopioita tietystä DNA-sekvenssistä (Nelson & Cox 2013). Menetelmä vaatii toimiakseen templaatin, joka voi olla joko kaksijuosteinen DNA tai RNA:sta käänteistranskriptaasilla valmistettu yksijuosteinen komplementaarinen DNA eli cDNA.
Reaktio vaatii myös alukkeet, jotka sitoutuvat templaattiin muodostaen synteesin aloituskohdan. Lisäksi tarvitaan vapaita nukleotidejä, jotka rakentavat syntyvää sekvenssiä eli tuotetta. Neljäntenä reaktio vaatii polymeraasin, joka aloittaa synteesin ja rakentaa DNA:n vastinjuostetta sekvenssin perusteella.
PCR koostuu kolmesta vaiheesta: denaturaatio, alukkeiden liittyminen ja juosteen pidentyminen (Nelson & Cox 2013). Ensimmäisessä vaiheessa seosta kuumennetaan, jotta DNA-juosteet eroavat toisistaan eli denaturoituvat. Toisessa vaiheessa lämpötilaa lasketaan, jotta alukkeet sitoutuvat templaattiin. Kolmannessa vaiheessa lämpötilaa nostetaan jälleen, jolloin polymeraasi aloittaa liittämään vapaina olevia nukleotideja DNA-juosteeseen liittyneeseen alukkeeseen, jolloin syntyvä vastinjuoste pidentyy. Kun sykli päättyy, se alkaa taas alusta ja sitä toistetaan yhteensä 30-40 kertaa. Jokaisella syklillä tuotteen määrä kaksinkertaistuu, joten tuotteen määrä kasvaa eksponentiaalisesti ja reaktion päättyessä seoksessa on 230-40-kertainen määrä tuotetta.
Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) on sovellus, jossa syntyvän tuotteen määrää voidaan seurata reaaliajassa tietokoneella (Qiagen 2004). Menetelmällä voidaan määrittää syntyvän tuotteen määrä alkuperäisessä näytteessä ja esimerkiksi vertailla geeniekspression määrää kahdessa eri näytteessä (Nelson & Cox 2013).
Menetelmässä käytetään fluoresoivaa merkkiainetta, joka reagoi tuotteen kanssa, jolloin fluoresenssia mittaamalla syntyvän tuotteen määrää voidaan seurata (Qiagen 2004). Yksi
14
käytetyimmistä väriaineista on SYBR Green. Alukkeiden liityttyä yksijuosteiseen cDNA:han ja polymeraasin muodostettua sille vastinjuosteen SYBR Green sitoutuu siihen, jolloin fluoresenssi voidaan havaita ja mitata. Haittana SYBR Green-merkkiaineen käytössä on, että se sitoutuu kaikkeen kaksijuosteideen DNA:han, jolloin se havaitsee myös epäspesifiset DNA- juosteet ja aluke-dimeerit.
Koska RT-qPCR on reaaliaikainen menetelmä, sen kulkua voidaan seurata tietokoneen näytölle piirtyvästä monistumiskäyrästä (kuva 3). Aluksi monistuvan tuotteen määrä on niin alhainen, ettei laite sitä havaitse (Qiagen 2004). Vähitellen tuotetta alkaa monistumaan yhä enemmän. Tätä seuraa eksponentiaalinen vaihe, jolloin kynnys (threshold) ylittyy (Ct). Ct- arvosta voidaan myöhemmin määrittää näytteessä olleen templaatin määrä. Eri näytteillä on eri Ct-arvot, koska templaatin määrä saattaa vaihdella eri näytteissä. Mitä aikaisemmin näyte ylittää kynnysarvon, sitä enemmän se sisältää templaattia. Tietokone analysoi myös ajon tehokkuuden 0-100 %. Tehokkuuden ylittäessä 100 -prosenttia reaktiossa on yleensä kontaminaatioita. Kaikki ajosta saadut tiedot voidaan esittää Excel- tiedostossa, jossa niitä voidaan jatkokäsitellä.
Menetelmässä käytetään kahdenlaista kontrollia (Qiagen 2004). NTC (no template control) ei sisällä tutkittavaa näytettä, minkä vuoksi sen ei tulisi reagoida lainkaan ajon aikana. Jos NTC reagoi ajon aikana, se voi johtua esimerkiksi syntyvistä aluke-dimeereistä eli alukkeiden muodostamista sidoksista itsensä kanssa tai kontaminaatiosta. Toinen käytettävä kontrolli on - RT-kontrollinäyte, joka ei cDNA-synteesin aikana sisällä RT-entsyymiä. Jos tämä reagoi ajon aikana, se johtuu todennäköisimmin näytteen sisältämistä genomisen DNA:n jäänteistä, joihin alukkeet ovat sitoutuneet johtaen DNA:n monistumiseen ja SYBR Greenin sitoutumiseen.
15
Kuva 3. Kvantitatiivisen PCR:n etenemistä voi seurata tietokoneen näytölle piirtyvän monistumiskäyrän avulla. Samasta näytteestä on yleensä kaksi tai kolme rinnakkaistanäytettä, mutta ne eivät välttämättä monistu samalla tavalla mahdollisten pipetointiepätarkkuuksien, kontaminaatioiden tai aluke-dimeerien vuoksi. Kuvaajassa näkyvä Ct-arvo kertoo syklin, jolloin kynnysarvo ylittyy ja tuotetta alkaa syntymään eksponentiaalisesti. Ct-arvosta voidaan määrittää alkuperäisen templaatin määrä näytteessä. Tässä tapauksessa keltaisen käyrän näytteessä olevan templaatin määrä on moninkertainen vaaleanpunaisen näytteen templaattiin verrattuna.
Monistumiskäyrän lisäksi näytölle piirtyy myös tuotteen sulamiskäyrä (kuva 4). Tämä sulamiskäyräanalyysi tehdään varsinaisen ajon jälkeen, jolloin lämpötilaa ensin lasketaan ja sitten nostetaan (Thermo Fisher Scientific 2016). Tuotteen sulamislämpötilaan vaikuttaa sen pituus sekä CG-nukleotidien suhteellinen osuus, joten näytteillä on yleensä eri sulamislämpötilat.
Lopuksi saadut ekspressiotasot täytyy normalisoida, johon voidaan käyttää referenssigeeniä.
Referenssinä toimii geeni, jonka ekspressiotaso samassa kudosnäytteessä ei olosuhteista huolimatta muutu (Qiagen 2004). Yleisimmin tällaisia geenejä ovat niin sanotut housekeeping- eli ylläpitogeenit, jotka toimivat kaikkien solujen perustoiminnoissa (Nelson & Cox 2013).
Ajettujen geenien ekspressiotasot saadaan normalisoitua jakamalla ne referenssigeenin ekspressiotasolla, jonka tulisi pysyä tasaisena eri näytteissä (Qiagen 2004). Tämän jälkeen näytteiden ekspressiotasoja voidaan verrata keskenään.
16
Kuva 4. Kvantitatiivisen PCR- ajon sulamiskäyrä. Sulamiskäyrässä tulisi olla vain yksi selkeä piikki näytettä kohden, mutta jos piikkejä on useampia, monistumisvaiheessa on syntynyt epäspesifisiä tuotteita kuten aluke-dimeerejä.
2.8 Tutkittavat geenit
2.8.1 Kalium- ja natriumkanavat: KCNJ2, KCNJ14, KCNH6, HCN3-4, SCN4A ja SCN5Ab
Kaliumkanavat ovat proteiineja, joiden kautta kaliumioneja kulkeutuu solukalvon läpi (Reece ym. 2011). Kaliumkanavia löytyy kaikista elävistä soluista ja ne ovat ionikanavarymistä kaikista monipuolisimpia (Gutman ym. 2005). Kaliumkanavat kuljettavat ioneja solukalvon läpi passiivisesti riippuen solukalvon eri puolilla vallitsevasta jännite-erosta. Ionien virtausta kanavan läpi säädellään kanavahuokosen sulkeutumisella tai avautumisella, joka tapahtuu joko proteiinin konformaatiomuutoksella tai jonkin yhdisteen sitoutumisella siihen (Hibino ym.
2010, Hassinen 2010).
Kaliumionikanavat vaikuttavat moniin solun toimintoihin muun muassa säätelemällä lihassupistusta, sydämen sykettä ja insuliinin eritystä (Nerbonne & Kass 2005, Sacco ym.
17
2015). Kaliumkanavat jakautuvat neljään eri luokkaan riippuen niiden rakenteesta (Gutman ym.
2005).
Kir-ionikanavat eli sisäänpäin suuntaava kaliumkanavat (inward rectifying) ovat ionikanavia, jotka kuljettavat kaliumioneja helpommin solun sisään kuin sieltä ulos (Nerbonne
& Kass 2005, Hibino ym. 2010, Hassinen 2010). Fysiologisesti kuitenkin tärkeämpi K+ -ionien siirto aktiopotentiaalin aikana tapahtuu solusta ulospäin (Nerbonne & Kass 2005). Kir- ionikanavat ylläpitävät lepopotentiaalia ja osallistuvat solukalvon repolarisaatioon (Bartos ym.
2015). Kir-ionikanavat jakautuvat seitsemään alaryhmään, joista Pro gradu-työhön tarkasteltaviksi kaliumkanaviksi valikoituivat Kir2.1 ja Kir2.4 (Gutman ym. 2005). Kir2.1 on pääasiallinen muoto kirjolohen (Oncorhynchus mykiss) sydämessä ( Hassinen ym. 2007).
Kir2.1-kanavaa koodaava geeni on nimeltään KCNJ2 ja Kir2.4-kanavan geeni KCNJ14 (HGNC, UniProt).
Jänniteherkät kaliumkanavat (Kv) muodostavat suurimman kaliumkanavaryhmän, joka jakautuu kahteentoista alaryhmään (Gutman ym. 2005). Tutkielmaan kuului yksi tämän ryhmän kanavista, Kv11.2 eli geeninimeltään KCNH6. Kanavalla on osansa muun muassa sydämen aktiopotentiaalin kestossa ja syketaajuudessa (Morais-Cabral & Robertson 2015).
HCN-proteiinit (potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated channels) kuuluvat solukalvojen jänniteherkkiin ionikanaviin, jotka toimivat sydämessä ja aivoissa kuljettaen natrium (Na+) ja kaliumioneja (K+) (Herrmann ym. 2015). Sydämessä HCN- kanavat toimivat erityisesti tahdistinsoluissa, joissa syntyvät sydämen aktiopotentiaalit. HCN- proteiineja koodaa neljä eri geeniä HCN1-4, joista luukaloilla (Teleostei) on lisäksi muutamia paralogeja eli geenin eri muotoja, genomin duplikaation seurauksena (Hassinen ym. 2017).
HCN3:n ja HCN4:n on todettu olevan pääasialliset muodot purotaimenen sydämessä.
Jänniteherkät natriumkanavat (Nav) ovat solukalvon ionikanavia, joita esiintyy muun muassa hermostossa, luustolihaksessa ja sydämessä (Bagal ym. 2015). Aktiopotentiaalin alkaessa ja edetessä natriumkanavat päästävät lävitseen natriumioneja, josta aiheutuu solun depolarisaatio.
Jotkin yhdisteet pystyvät estämään kanavien toiminnan, jolloin aktiopotentiaalin eteneminen estyy. Tällainen aine on esimerkiksi hermomyrkky tetrodotoksiini.
Erilaisia jänniteherkkiä natriumkanavia on yhteensä yhdeksän, Nav1.1-Nav1.9. Kanavia koodaa SCNα-geenit, joita puolestaan on yksitoista erilaista (Widmark ym. 2011). Pro gradu- tutkielmassa tutkittavat geenit olivat SCN4 ja SCN5Ab, joita ilmentyy luustolihaksessa ja sydämessä (Bagal ym. 2015). SCN5A on nisäkkäiden sydämessä kanavista runsain (Nerbonne
& Kass 2005). Luukaloilla tästä geenistä on kaksi muotoa: SCN5Aa ja SCN5Ab (Widmark ym.
2011).
18 2.8.2 Natrium-kalsiumvaihtaja: NCX1A
Na+-Ca2+-vaihtaja (NCX) on solukalvon proteiini, jolla on tärkeä rooli solun sisäisen homeostasian eli fysiologisen tasapainon säätelyssä (Xue ym. 1999, On ym. 2008). Vaihtaja kuljettaa yhtä kalsiumionia kohden kolme natriumionia sisään soluun ja ylläpitää näin solun sisäistä kalsiumtasapainoa. NCX-vaihtaja toimii useissa solutyypeissä läpi eläinkunnan, mutta parhaiten sen toiminta tunnetaan nisäkkäiden sydämen myosyyteissä eli lihassoluissa, jossa se osallistuu lihassolujen ärsytys-supistuskytkentään kuljettaen Ca2+ -ioneja solun sisään ja ulos (Xue ym. 1999, On ym. 2008, Korajoki 2013). Luukaloilla NCX-vaihtajan ekspressio on korkeampi kalan sydämen myosyyteissä kuin muilla selkärankaisilla (On ym. 2008).
NCX-vaihtajan geenejä on löydetty yhteensä neljä erilaista NCX1-4 (On ym. 2008). NCX1 ekspressoituu kaikkialla kehossa, kun taas NCX2 ja NCX3 pääasiassa aivoissa ja luustolihaksessa. NCX4-geenin on todettu olevan tärkeä sydämen kehityksessä. Pro gradu- työssä tutkittava NCX1-vaihtaja on geeninimeltään SLC8A1 (UniProt). Tutkielmassa käytetään kuitenkin nimeä NCX1A.
2.8.3 Kalsiumsiirtäjät: CASQ1, CASQ2, CACNA1C, ATP2A2 ja PLN
Kalsium on yksi tärkeimmistä solun viestimolekyyleistä, jonka vapautumista säätelevät useat kalsiumia sitovat proteiinit (Novák & Soukup 2011). Sydämen supistumista säädellään muun muassa solun sisäisellä kalsiumkonsentraatiolla (Korajoki & Vornanen 2009). Kalsekvestriini on lihas- ja sydänlihassolujen sarkoplasmakalvoston tärkein kalsiumia sitova proteiini (Korajoki & Vornanen 2009, Novák & Soukup 2011). Kalsekvestriiniä esiintyy kahta eri muotoa: lihassoluissa CASQ1 ja sydänlihassoluissa CASQ2.
L-tyypin kalsiumkanavat kuuluvat jänniteherkkiin kalsiumkanaviin, jotka aukeavat solukalvon depolarisaation aikana ja sallivat kalsiumionien virtaamisen soluun (Striessnig ym.
2014). L-tyypin kalsiumkanavia esiintyy muun muassa sydämessä, luustolihaksessa ja hermosoluissa. Kalsiumkanavien kautta tapahtuva kalsiumionien virtaus säätelee muun muassa aktiopotentiaalin kestoa ja lihaksen supistumista. Sydämessä L-tyypin kalsiumkanavia ekspressoituu kaikkialla kudoksessa, jossa ne vuorovaikuttavat useiden muiden proteiinien,
19
kuten β-adrenergisten reseptorien, kanssa (Harvey & Hell 2013). Pro gradu-työssä tutkittua kalsiumkanavaa, Cav1.2:ta, koodaa CACNA1C-geeni (Striessnig ym. 2014).
Sarkoplasmakalvoston Ca2+-ATPaasit ylläpitävät solunsisäistä kalsiumtasapainoa siirtämällä kalsiumioneja solun sarkoplasmakalvostoon, joka toimii solunsisäisenä kalsiumvarastona (Nelson & Cox 2013). Luukaloista kirjolohella (Oncorhynchus mykiss) on todettu olevan moninkertaiset kalsiumvarastot sarkoplasmakalvostossaan verrattuna nisäkkäisiin (Korajoki & Vornanen 2009). Syytä tähän ei kuitenkaan täysin tunneta (Shiels &
Galli 2014). Energian ionien siirtoon Ca2+-ATPaasit saavat ATP:n hydrolyysistä eli hajotuksesta. Sarkoplasmakalvoston Ca2+-ATPaaseja koodaa kolme geeniä SERCA1-3 (Frank ym. 2003). SERCA2-geenin koodaamat ionipumput sijaitsevat pääasiallisesti sydänlihassoluissa ja hitaissa luustolihassoluissa. Kyseiset ionipumput ovat keskeisessä asemassa sydänlihaksen relaksoitumisessa, kun kalsiumioneja virtaa sarkoplasmakalvostoon aktiopotentiaalin loppuvaiheilla. Ionipumppujen toimintaa kontrolloi phospholambaani (PLN).
Phospholambaani (PLN) on sarkoplasmakalvoston proteiini, joka säätelee Ca2+ -ATPaasien toimintaa (Simmerman & Jones 1998). Phospholambaanin fosforylaatio eli fosfaattiryhmän (P+O32−) lisäys edistää kalsiumin sitoutumista Ca2+-ATPaaseihin. Hanakampi sitoutuminen kalsiumiin auttaa kalsiumionien nopeammassa siirrossa sarkoplasmakalvostoon, mistä seuraa sydämen nopeampi relaksoituminen (Shiels & Galli 2014). Fosforyloimattomana PLN siis inhiboi eli estää ATPaasien toimintaa (Simmerman & Jones 1998).
Phospholambaanin fosforylaatioon vaikuttavat muun muassa β-adrenergiset reseptorit. β- adrenergisten reseptorien aktivaatio lisää phospholambaanin fosforylaatiota, joka lisää Ca2+- ATPaasien toimintaa, mistä seuraa sydänlihaksen nopeampi relaksaatio (Kaumann ym. 1999).
2.8.4 β-adrenergiset reseptorit: ADRB2 ja ADRB3
Solujen solukalvoilla sijaitsevat β-adrenergiset reseptorit ovat tärkeä osa sympaattista hermostoa välittäen viestejä hermoston sekä solujen että kudosten välillä (Taylor 2007).
Reseptoreihin sitoutumalla katekoliamiinit epinefriini (adrenaliini) ja norepinefriini (noradrenaliini), vaikuttavat solujen toimintaan. Lisäksi eräät lääkeaineet voivat sitoutua reseptoreihin ja vaikuttaa niiden toimintaan.
β-adrenergiset reseptorit jakautuvat kolmeen alatyyppiin 1-3, joista jokaista koodaa oma geeninsä ADRB1-3 (Taylor 2007). Geenit jakavat samanlaisen perusrakenteen. ADRB1 ja
20
ADRB2 ovat paljon tutkittuja ja ne toimivat muun muassa keuhkoissa ja sydämessä. Sydämessä toimii myös vähemmän tutkittu ADRB3 (Taylor 2007, Imbrogno ym. 2015). Sydämen β- adrenerginen säätely on keskeinen mekanismi sydämen toiminnan ylläpidossa (Vornanen 1998). β-adrenergisen säätelyn avulla sydänlihas voi mukautua fysiologisiin ja ympäristöstä johtuviin muutoksiin kuten liikuntaan tai kylmyyteen. β- adrenergiset reseptorit 1 ja 2 säätelevät muun muassa sykettä ja supistusvoimaa, jotka lisääntyvät reseptorien ärsytyksessä (Simmerman & Jones 1998). ADRB3-reseptorien aktivoituminen puolestaa nostaa sykettä, mutta vähentää iskutilavuutta ja supistusvoimaa (Petersen ym. 2013). Pro gradu-työssä tutkittiin ADRB2 ja ADRB3-reseptorien geenejä, joista käytetään alukkeille annettuja nimiä ADRB2 ja ADRB1L.
2.8.5 Hypertrofiamarkkerit: NPPB ja PCNA
Sydänlihassolujen eli kardiomyosyyttien koko voi kasvaa, jotta niiden toimintakyky vastaa vaadittavaa lisääntyneessä sydämen toiminnassa (Akazawa & Komuro 2003). Solujen koon kasvua sanotaan hypetrofiaksi. Vaikka sydämen koon kasvu on yleensä vaste lisääntyneeseen rasitukseen kuten liikuntaan, pitkittyneenä se voi johtaa sydänsairauksiin.
NPPB eli natriureettinen peptidi B on yksi kolmesta selkärankaisilta (Vertebrate) löytyvistä natriureettisita peptideistä (Sergeeva & Christoffels 2013). Se toimii sydämessä muun muassa alentaen verenpainetta. NPPB:n ekspressio lisääntyy huomattavasti sydämen hypertrofian aikana, mutta sen pitoisuuksien nousua voidaan käyttää myös merkkinä sydämen vajaatoiminnasta. Sydämen vajaatoiminnassa verenpaine on koholla, mikä johtaa siihen, että veren pumppaamiseen tarvitaan yhä enemmän voimaa. Tämä rasittaa sydäntä ja johtaa kammion seinämän paksuuntumiseen.
Proliferoiva solun tuma-antigeeni eli PCNA on proteiini, jota löytyy runsaasti jakautuvien solujen tumasta (Nelson & Cox 2013). PCNA toimii muun muassa DNA:n synteesissä edistäen polymeraasin toimintaa ja DNA:n korjauksessa vuorovaikuttaen useiden DNA:ta korjaavien proteiinien kanssa (Boehm ym. 2016). PCNA kertoo solujen jakautumisesta eli hyperplasiasta ja sen ekspression on huomattu nousevan fyysisen harjoittelun lisääntyessä (van der Meulen ym. 2006, Castro ym. 2013).
21 2.8.6 Transkriptiotekijät: IGF1, GATA4 ja MEF2C
Insuliininkaltainen kasvutekijä 1 eli IGF1 on pieni peptidi, joka osallistuu moniin solutoimintoihin kuten kasvuun ja erilaistumiseen (Delafontaine ym. 2004, Troncoso ym.
2014). IGF1 syntetisoidaan samannimisestä geenistä pääasiassa maksassa ja sen valmistusta kontrolloi kasvuhormoni. Kasvuhormonin sitoutuminen sen reseptoreihin maksassa stimuloi peptidin ekspressiota ja sen vapautumista verenkiertoon. Myös muut kudokset tuottavat vähemmissä määrin IGF1:tä, joka vapautuessaan toimii paikallisena viestiaineena.
Elimistössä vapaanakiertävä IGF1 sitoutuu IGF1-reseptoreihin, jotka sijaitsevat solujen solukalvoilla (Troncoso ym. 2014). IGF1:n sitoutuminen sen reseptoriin aiheuttaa monimutkaisen viestintäkaskadin eli reaktiosarjan, joka johtaa solun vasteeseen kuten apoptoosiin eli solukuolemaan, solun erilaistumiseen tai solun kasvuun (Delafontaine ym.
2004). IGF1 edistää proteiinisynteesiä ja hypertrofiaa paljon energiaa kuluttavissa kudoksissa (Troncoso ym. 2014). IGF1 on myös tärkeä sikiön kehityksen ja kasvun kannalta (Puche &
Castilla-Cortázar 2012).
IGF1 toimii myös sydämessä vaikuttaen kardiomyosyyttien metaboliaan, erilaistumiseen ja hypertrofiaan (Troncoso ym. 2014). Sydämessä alentuneet IGF1-pitoisuudet ovat yhteydessä kohonneeseen sydäntauti- ja infarktiriskiin (Puche & Castilla-Cortázar 2012, Troncoso ym.
2014). Ravinnepulan aikana IGF1 auttaa ylläpitämään sydämen toimintaa, edistäen mitokondrioiden metaboliaa ja ATP:n tuottoa parantamalla mitokondrioiden kalsiumin ottoa (Troncoso ym. 2014). IGF1 suojaa myosyytteja myös oksidatiiviselta stressiltä.
Toinen Pro gradu-työssä tutkittava transkriptiotekijä oli GATA4. Selkärankaisilla (Vertebrate) on löydetty yhteensä kuusi erilaista GATA-proteiinia (GATA1-6), jotka jakautuvat kahteen alaryhmään (Molkentin ym. 1997). GATA1-3 säätelevät verisolujen tuotannosta vastaavien geenien toimintaa, kun taas GATA4-6 ekspressoituvat jo alkion soluissa ja ovat välttämättömiä sydämen kehityksessä.
GATA4 säätelee tiettyjä sydämen geenejä sitoutumalla tietyn sekvenssin omaavaan DNA:han sinkkisormiksi kutsutulla rakenteella vaikuttaen geenin ekspressioon (Molkentin ym.
1997). Geenejä, joihin GATA4 vaikuttaa ovat esimerkiksi NPPB eli natriureettinen peptidi B, NCX ja sydämen troponiini c eli TNNC1 (Akazawa & Komuro 2003). NPPB säätelee muun muassa verisuonien supistumista, NCX kuljettaa natrium- ja kalsiumioneja solun sisään ja ulos, kun taas TNNC1 vaikuttaa lihassupistukseen (UniProt). GATA4 on keskeisessä roolissa myös
22
kardiomyosyyttien hypertrofian säätelyssä vaikuttaen useiden geenien toimintaan yhdessä esimerkiksi MEF2-proteiinien kanssa (Liang ym. 2001, Akazawa & Komuro 2003).
Kolmas transkriptiotekijä, jota tutkittiin oli MEF2C (myocyte enhancer factor 2). MEF2- proteiinien geenejä on selkärankaisilta löydetty neljä erilaista MEF2a, -b, -c ja –d (Lin ym.
1997). MEF2-transkriptiotekijät muun muassa suojaavat hermosoluja apoptoosilta eli solukuolemalta, osallistuvat luustolihaksen ja ruston kehitykseen sekä toimivat välttämättöminä sydämen muotoutumisessa eli morfogeneesissä ( Lin ym. 1997, Potthoff &
Olson 2007). MEF2-geenit toimivat myös sydämen hypertrofian aikana säädellen muiden geenien toimintaa (Akazawa & Komuro 2003).
2.8.7 Referenssigeenit: DnaJa2 ja EF1α
Referenssigeeniksi valitun geenin ekspressiotason pitäisi pysyä tasaisena käytetyssä koeasetelmassa eri näytteiden välillä (Qiagen 2004). Monet referenssigeenit ovat niin sanottuja ylläpitogeenejä (housekeeping genes), jotka toimivat solun perustoiminnoissa (Nelson & Cox 2013). Kuitenkin jopa ylläpitogeenien ekspressiotason on todettu vaihtelevan, mistä johtuen referenssigeenin valinta on ajoittain hankalaa (Tang ym. 2007). Pro gradu-työhön valikoitui kaksi referenssigeeniä: EF1α ja DnaJA2.
DnaJA2 kuuluu lämpöshokkiproteiineihin (heat shock proteins), jotka aktivoituvat muun muassa elimistön stressitiloissa ennaltaehkäisten soluvaurioita (Beere 2004).
Lämpöshokkiproteiinien geenit ovat laajalti konservoituneita eli niitä esiintyy läpi eläinkunnan (Feder & Hofmann 1999). Hs-proteiinit jaotellaan perheisiin sekä niiden geenisekvenssin että molekyylipainon mukaan. DnaJA2 kuuluu perheeseen Hsp40 (Kotlarz ym. 2013).
Lämpöshokkiproteiinit suojaavat soluja näiden altistuessa muun muassa ultraviolettisäteilylle, äärilämpötiloille ja infektioille (Feder & Hofmann 1999, Kotlarz ym. 2013). Lisäksi ne auttavat ja säätelevät polypeptidien laskostumista (Nelson & Cox 2013). DnaJa2 valittiin referenssigeeniksi, koska sen ekspression on todettu olevan vakaa useissa eri kudoksissa ja olosuhteissa (Vornanen ym. 2005, Piironen ym. 2013).
Elongaatiofaktorit ovat laajalti konservoituneita proteiineja, jotka toimivat monissa solun toiminnoissa (Knudsen ym. 1993). Elongaatiofaktorit toimivat esimerkiksi proteiinisynteesissä auttaen polypeptidiketjua pidentymään translaatiossa (Nelson & Cox 2013). EF1α kuuluu ylläpitogeeneihin, jota ekspressoituu monissa kudoksissa muun muassa aivoissa, keuhkoissa ja
23
istukassa (Knudsen ym. 1993). EF1α valikoitui referenssigeeniksi, koska se on ylläpitogeeni ja sitä on käytetty myös muissa tutkimuksissa esimerkiksi Tang ym. (2007) ja Piironen ym.
(2013).
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET
Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää eri uintimatkojen vaikutusta purotaimenen (Salmo trutta fario) sydämen geenien ilmentymiseen. Tutkittavat näytteet oli kerätty kahdeltatoista taimenyksilöltä, jotka olivat uineet eri pituisia matkoja niiden luontaisen halukkuuden mukaan, joka ilmenee taimenen smolttivaiheessa. Taimenet jaettiin kahteen ryhmään uintimatkan pituuden mukaan (vähän vs paljon uineet). Pro gradu-tutkielmassa pyrittiin selvittämään sydämen geeniekspression eroja näiden kahden ryhmän väliltä. Tutkittavat geenit liittyvät muun muassa sydämen syketaajuuteen, sähköiseen ärtyvyyteen ja supistusvoimaan. Lisäksi erilaisen fyysisen aktiivisuuden vaikutusta sydämen hypertrofiaan eli solukoon kasvuun tarkasteltiin Pro gradu -työssä.
Hypoteesina oli, että mitä enemmän kala on uinut, sitä enemmän sillä ekspressoituu geenejä, jotka vaikuttavat sydämen toimintatehokkuuden paranemiseen. Eli pitkän matkan uineilla kaloilla näkyisi enemmän geeniekspressiota muun muassa sydämen supistusvoimaan, aktiopotentiaaliin, ärsytys-supistuskytkentään ja syketaajuuteen liittyvissä geeneissä.
Toisena hypoteesina oli, että enemmän uineilla kaloilla näkyisi hypertrofiaa tai –plasiaa eli pitkän matkan uineiden kalojen yksilöillä hypertrofiaa ja -plasiaa ilmentävien geenien ekspressio olisi kasvanut verrattuna lyhyen matkan uineisiin.
4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 Näytteet
Näytteet saatiin Anssi Vainikan johtamalta akvaattisen ekologian tutkimusryhmältä, jossa tutkittiin muun muassa ravinnon määrän vaikutusta smolttiutumiseen. Näytteet olivat peräisin noin viidestäkymmenestä purotaimenesta (Salmo trutta fario), jotka olivat alunperin Paltamon
24
Vaarainjoesta pyydettyjen yksilöiden poikasia. Kaloille oli ensimmäisen kerran tehty vaelluskoe keväällä 2016. Kalojen vaellusmatkaa oli mitattu vatsaan asetetulla PIT-sirulla (passive integrated transponder), joka rekisteröi kalan kulkua. Talveksi 2016-2017 kalat oli jaettu eri tankkeihin, joissa ravinnon määrää oli osassa rajoitettu ja osassa ei. Uusi vaelluskoe kaloille oli tehty keväällä 2017, jonka jälkeen kalat oli lopetettu ja kerätty niistä tarvittavat näytteet talteen.
Pro gradu-tutkielmassa käytetyt sydämet oli eristetty vaelluskokeen jälkeen alkukesästä 2017 ja säilytetty sen jälkeen -80 ºC pakkasessa. Näytteistä valikoitiin kahdentoista kalayksilön näytteet, jotka jaettiin tasan kahteen eri ryhmään kalan uintimatkan perusteella. Uintimatkat, kalojen painot ja sukupuolet sekä muut tiedot oli koottu laajaan Excel-taulukkoon.
Valikoiduissa kalayksilöissä oli mukana sekä koiraita että naaraita kummassakin ryhmässä.
Lyhyen matkan uineet kalat olivat uineet 2,6 kilometristä 44,5 kilometriin mittausjakson eli 81 päivän aikana. Pitkän matkan uineet kalat olivat uineet 144,4 kilometristä hieman yli 300 kilometriin (taulukko 1). Sydännäytteistä eristettiin kammiot, jotka punnittiin ja joista tämän jälkeen eristettiin RNA.
Taulukko 1. Kaloista eristettettyjen sydänten näytenumerot sekä uintimatkat Lyhyen matkan uineet Pitkän matkan uineet
Näyte Uintimatka (km) Näyte Uintimatka (km)
K22 2,6 K30 144,4
K7 10,7 K25 152,5
K8 11,2 K6 177,4
K1 20,1 K36 246,6
K13 43,8 K53 248,2
K14 44,5 K28 300,6
4.2 RNA-eristys ja pitoisuusmittaukset
Kalojen kammiot olivat painoltaan 0,02-0,19 g. RNA:n eristys kammioista tehtiin RNA Extraction –ohjeen (Thermo Scientific) mukaan käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen).
Ensin kudosnäytteet homogenisoitiin jauhamalla nestetypessä, jonka jälkeen jauhe siirrettiin 2 ml:n eppendorfputkeen. Jauheen sekaan lisättiin 1 ml Trizol-reagenssia (100 mL) ja vorteksoitiin voimakkasti. Homogeenisten näytteiden annettiin inkuboitua huoneenlämmössä 5
25
minuuttia, jonka jälkeen ne sentrifugoitiin +4 ºC:ssa 10 minuuttia (12 000 g). Syntyneeseen supernanttiin lisättiin 0,2 ml kloroformia ja sekoitettiin ravistelemalla 15 s. Näytteiden annettiin inkuboitua huoneenlämmössä 2 minuuttia, jonka jälkeen ne sentrifugoitiin uudelleen +4 ºC:ssa 15 minuuttia (12 000 g). Vesifaasi pipetoitiin uuteen eppendorfputkeen, jonne lisättiin 0,5 ml isopropanolia ja inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuuttia ja sentrifugoitiin 15 minuuttia +4 ºC:ssa (12 000 g). Muodostunut pelletti pestiin 1 ml:lla 75 % etanolilla ja sentrifugoitiin 5 minuuttia +4 ºC:ssa (7 500 g). RNA-sakat kuivatettiin huoneenlämmössä ja ne liuotettiin 40 µl:aan DEPC-vettä. Lopuksi näytteistä mitattiin RNA-pitoisuus käyttäen NanoDrop- mittalaitetta (taulukko 2).
Taulukko 2. Kammionäytteistä mitatut RNA-pitoisuudet
4.3 DNaasikäsittely ja cDNA
DNaasikäsittely ja cDNA:n valmistus näytteistä tehtiin DNase I, RNase-free ja Maxima cDNA synthesis kit –ohjeiden (Thermo Scientific) mukaan. DNaasikäsittelyyn tarvittiin 2 µg RNA:ta, jonka määrä saatiin jakamalla 2 µg näytteen RNA-pitoisuudella. Näytteen valmistukseen tarvittiin 2 µl 10 x DNase reaktiopuskuria, 2 µl RNase free DNase ja RiboLock RNase inhibiittoria (40 U/µl) 0,5 µl. RNA:n määrästä riippuen lisättiin DEPC-vettä, jotta lopputilavuudeksi saatiin 20 µl. Seoksia inkuboitiin 30 minuuttia +37 ºC:ssa, jonka jälkeen lisättiin EDTA Stop-liuosta 2 µl ja inkuboitiin 10 minuuttia +65 ºC:ssa.
cDNA:n valmistukseen tarvittiin 10 µl DNaasikäsiteltyä RNA:ta. Jokaiselle näytteelle valmistettiin kaksi putkea, joista toinen toimi -RT-kontrollina. RNA:n lisäksi tarvittiin sekä Oligo (dT)- (100 pmol/µl) että satunnaiseralukkeita (random hexamer, 100pmol/µl) 0,25 µl, dNTP-mix (10mM) 1 µl ja vettä 3,5 µl, jotta lopputilavuus oli 15 µl. Seokset inkuboitiin 5 minuuttia +65 ºC:ssa RNA:n sekundäärirakenteiden purkamiseksi ja jäähdytettiin jäillä. Tämän jälkeen putkiin lisättiin RT-puskuria (5x) 4 µl ja toiseen kunkin näytteen putkeen lisättiin vielä
Näyte RNA-pitoisuus (ng/µl) Näyte RNA-pitoisuus (ng/µl)
K22 634,3 K30 903,5
K7 1329,3 K25 1123,8
K8 288,3 K6 429,2
K1 1051,6 K36 511
K13 824 K53 564,7
K14 814,7 K28 724,5
26
1 µl Maxima H-entsyymi Mix, kun taas toiseen putkeen lisättiin sen sijaan 1 µl vettä, jolloin lopputilavuus oli kussakin putkessa 20 µl. Lopuksi näytteet ajettiin PCR-laitteessa Maxima cDNA-ohjelman mukaan 10 minuuttia +25 ºC, 30 minuuttia +65 ºC ja 5 minuuttia +85 ºC.
4.4 Alukkeiden suunnittelu ja testaus
Onnistuneeseen RT-PCR:n tekemiseen tarvitaan oikein suunnitellut alukkeet (Qiagen 2004).
Alukkeiden tulee olla spesifiset juuri tietyn geenin sekvenssille, jotta pariutuminen onnistuu.
Luukaloilla on evoluution saatossa tapahtunut genomin duplikaatio eli kahdentuminen, jonka seurauksena joistain geeneistä on useampia muotoja (Volff 2005). Tämä vaikeuttaa alukkeiden suunnittelua, koska vain muutaman nukleotidin ero sekvenssissä saattaa vaikeuttaa alukkeiden spesifistä pariutumista.
Onnistuneen qPCR:n edellytyksenä on toimivat alukkeet (Qiagen 2004). Alukkeiden pituus tulisi olla noin 20 emäsparia ja sulamislämpötila (Tm) 55-60 ˚C. Sulamislämpötilaan vaikuttaa erityisesti alukkeen pituus ja GC-nukleotidien määrä, jonka olisi hyvä olla 40-60 %. Pro gradu – työssä käytettyjen alukkeiden pituudet ja sulamislämpötilat näkyvät taulukossa 3.
Geenien sekvenssejä etsittiin NCBI:n (National Center for Biotechnology Information) geenitietokannasta (GenBank). Valmiit alukkeet löytyi DnaJA2- ja HCN3-geeneille, joten uusia ei tilattu. Geenisekvenssejä linjattiin eli vertailtiin keskenään eri sekvenssinlinjaus ohjelmien avulla (BLAST, EMBOSS Needle, Clustal Omega). Suurin osa geeneistä kuului merilohelle (Salmo salar), yksi nieriälle (Salvelinus alpinus) ja muutama purotaimenelle (Salmo trutta fario) (taulukko 3).
Alukkeiden saavuttua alukepareille tehtiin qPCR-menetelmällä monistustehokkuustestit, jossa testattiin niiden toimivuutta. Alukeparien katsottiin olevan toimivia, jos niiden tehokkuus ajoissa olisi 90-110%. Suurin osa alukepareista toimi heti ensimmäisessä monistustehokkuustestissä, jossa niitä testattiin, mutta muutaman geenin (ADRB1L, IGF1 ja CASQ2) alukepareja täytyi suunnitella ja testata uudelleen.
Monistustehokkuustestien jälkeen alukeparit ajettiin vielä agaroosigeelillä (TAE-puskuri), jotta nähtiin, vastasivatko niiden pituudet suunniteltuja. Tuotteiden pituudet vaihtelivat 103- 149 bp välillä, mikä vastasi odotuksia.
27
Taulukko 3. Pro gradu- työssä käytetyt alukkeet ja niiden sulamislämpötilat (Tm).
4.5 qPCR-menetelmät
Kvantitatiivisiä PCR-ajoja varten seurattiin Maxima SYBR Green qPCR-ohjetta (Thermo Scientific). Ensin näytteille ja -RT-näytteille valmistettiin Master Mix-seos, jossa reaktiot tapahtuivat. Master Mix- seos sisälsi 5 µl Maxima SYBR Green qPCR –reaktioseosta, 0,5 µl sekä Forward että Reverse-aluketta ja 3 µl vettä. Master Mix-seoksia tehtiin 22-kappaletta, koska eri geenejä oli tämän verran. Seoksia pipetointiin 9 µl 96-paikkaisen kuoppalevyn kuopan pohjalle ja näytettä lisättiin 1 µl. Samaa näytettä pipetoitiin kolmeen rinnakkaiseen kuoppaan, joita seurasi –RT-kontrolli sekä nollakontrolli, jossa näytteen tilalla oli vettä. –RT-kontrollin tarkoituksena oli testata, sisälsikö RNA-näyte DNA-kontaminaatioita, kun taas nollakontrollin avulla testattiin oliko jossain reagenssissa DNA- tai cDNA-kontaminaatioita. Valmis kuoppalevy sentrifugoitiin 1 min 600 rpm ja ajettiin RT-qPCR (Agilent Aria) (kuva 5).
Ajoja tehtiin yhteensä 12 eli jokaiselle näytteelle. Jokaisessa ajossa testattiin siis kaikkien 22:n geenin ekspressiota tietyssä näytteessä eli kalayksilössä. Ajojen tehokkuudet vaihtelivat 98 ja 114 % välillä ja tuotteiden sulamislämpötilat 77 ja 86,5 ˚C:teen välillä. Alin sulamislämpötila oli GATA4-geenillä ja korkein phospholambaanilla (PLN).
Alukkeen nimi Sekvenssi 5´-3´suunnassa Tm (˚C) Alukkeen nimi Sekvenssi 5'-3' suunnassa Tm (˚C) ssSCN4ABqF1 ACGGGAGAGCAAAGAACTGA 57.3 ssPLNqF1 CCTTCACTCCCTCTCACTGC 61.4 ssSCN4ABqR1 GATGACAAATGGGGCAGAGT 57.3 ssPLNqR1 GAGCTCCTGCAAGTTCTGCT 59.4 ssSCN5LAbqF2 GATCCCTTCCTGGACCTAGC 61.4 ssGATA4qF1 TCTATTCGGCGAAGAAGGAA 55.3 ssSCN5LAbqR2 ACCAGGTTGCCTATGGACAG 59.4 ssGATA4qR1 TCCTCGCTAACGTGTGAATG 57.3 ssCACNA1CqF1 GCTCCACACAGAGGAAGAGG 61.4 ssIGF1qF2 ACTGTGCCCCTGTCAAGTCT 64.2 ssCACNA1CqR1 GGGTTCTTGAGGGTGAGACA 59.4 ssIGF1qR2 CTGTGCTGTCCTACGCTCTG 64.3 ssATP2A2qF1 CCTGCAGTGTTCTCCTGACA 59.4 ssADRB2_3101qF1 AGCCCTGAGTTCAGATACGC 59.4 ssATP2A2qR1 ACAGGCTGTTAAGGGCATTG 57.3 ssADRB2_3101qR1 CCCTTACTCCTCCCTCCTTG 61.4 stfDnaJqF2 TGCAGCTGAGCAAGAATGTT 55.3 ssADRB1LqF2 GCTGAGCCACAACAGTAACA 62.1 stfDnaJqR2 GATCATGATGCGCATACCAC 57.3 ssADRB1LqR2 TAACCGTTAGCCGTGAAGGC 66.3 ssEF1AqF1 GCAGCTCATTGTTGGAGTCA 57.3 ssNPPBqF1 TCTTAAATCTGCCGCTGCTC 57.3 ssEF1AqR1 ATCCAGAGATGGGCACAAAG 57.5 ssNPPBqR1 CGCTCAGGAATGGACTCTTC 59.4 ssKCNJ2AqF1 CGACCGTATCTTCCTGGTGT 57.3 ssPCNAqF1 CAGGGATCCATCCTGAAGAA 57.3 ssKCNJ2AqR1 CCTTCCAGGATCACCACAAT 55.3 ssPCNAqR1 GACGTGGGACGAATCCATAC 59.4 saKCNJ14qF1 TTCGTCAACATGAGCGAGAG 57.3 ssMEF2CqF1 TGTTCCCTCCTCCAACTACG 59.4 saKCNJ14qR1 GGAAGGAGAGGCAGAAGATG 59.4 ssMEF2CqR1 ATGCTGTTCCTCTGCATGTG 57.3 stfKCNH6qF1 CAGAGTCGCAGGCTGAAGTT 59.4 ssNCX1AqF1 CATGTTCCTGGGGGTCTCTA 59.4 stfKCNH6qR1 GGGCTGTAGGTAGTCCACCA 61.4 ssNCX1AqR1 CACTTTTTCGCCATTTGGTT 53.2 stfHCN3qF1 ATCATACGGGAGGGGACACT 59.4 ssCASQ1AqF1 ACATTCACTCCCAAGGTTGC 57.3 stfHCN3qR1 AGGCTCCATCGCTAAGCTGT 59.4 ssCASQ1AqR1 AGGGTTTTCCAGGGATGACT 57.3 stfHCN4qF1 AATGGGAGGGGCTATAGGTG 59.4 ssCASQ2qF1 TAGCCTTTGCTGAGGAGGAA 57.3 stfHCN4qR1 GCTGAATGTTGCTGGATGAA 55.3 ssCASQ2qR1 GGTCAGCAGTGGGAAGTCAT 59.4
28
Kuva 5. Käytetty qPCR-ajojen lämpötilakaavio. Aluksi lämpötila nousee +95˚C:seen, joka aktivoi reaktion aloittavan polymeraasin (hot start). Alukkeiden liittyminen templaattiin tapahtui 58 ˚C:ssa. Monistumissyklien jälkeen suoritetun sulamikäyräanalyysin lämpötilat näkyvät myös kaaviossa.
4.6 Tilastolliset testit
RT-qPCR-ajoista saatdut aineistot käsiteltiin Microsoft Excel 2016- ohjelmalla, jonka avulla laskettiin eri geenien geeniekspressioiden keskiarvot kolmesta rinnakkaisesta näytteestä.
Tämän jälkeen keskiarvot jaettiin referenssigeenin ekspressioarvolla. Ryhmien sisäisistä saman geenin ekspressioista (n=6) laskettiin keskiarvot, keskihajonnat ja keskivirheet (SEM). Lopuksi lyhyen matkan uineiden ja pitkän matkan uineiden kalojen näytteitä tarkasteltiin kahtena eri ryhmänä, joita vertailtiin keskenään. Tutkittavien geenien ekspressiotasot suhteutettiin
29
referenssigeenin ekspressiotasoon, joten jos geenin ekspressio kuvaajassa on, sitä ekspressoitui enemmän kuin referenssigeeniä ja jos alle, niin vähemmän.
Tilastolliset menetelmät tehtiin SPSS-ohjelmalla (IBM SPSS Statistics), jolla testattiin ensin näytteiden normaalijakautumaa Shapiro-Wilk-testillä. Geenien CASQ2 ja IGF1 ekspressiot eivät olleet normaalijakauman mukaiset, joten näille tehtiin logaritmimuunnokset. Lopuksi tehtiin kahden riippumattoman otoksen t-testi.
5 TULOKSET
5.1 Geeniekspressitasot verrattuna referenssigeeniin DnaJA2
Ensimmäiseksi saatuja geeniekspressiotasoja piti verrata referenssigeeniin. Referenssigeeniksi valittujen geenien edellytyksenä oli, että niiden ekspressiotasojen piti pysyä tasaisena.
Kuitenkin toiseksi referenssigeeniksi valitun EF1α:n ekspressioero oli niin suuri ryhmien välillä (kuva 5), että se jätettiin tarkastelusta kokonaan pois, eikä sitä käytetty normalisointiin. Tästä johtuen geenien ekspressiotasoja verrattiin vain DnaJA2-referenssigeeniin.
Eniten ekspressoituvia geenejä olivat ATP2A2, NCX1 ja NPPB (kuva 6), joiden ekspressiotaso oli moninkertainen verrattuna referenssigeeniin. Eniten ekspressoitui hypertrofiamarkkerina toimivaa natriureettista peptidiä (NPPB), jonka ekspressio oli lyhyen matkan uineilla noin 19-kertainen ja pitkän matkan uineilla noin 14-kertainen verrattuna referenssigeeniin (taulukko 4). Tämä oli geeneistä ainoa, jonka ekspressiotaso oli laskenut pitkän matkan uineilla. Vaikka ekspressioero näkyi ryhmien välillä, hajontaa oli sen verran, ettei ero ollut tilastollisesti merkitsevä.
ATP2A- ja NCX1A-geenejä ilmentyi myös paljon verrattuna referenssigeeniin, mutta ekspressio ryhmien välillä oli pysynyt lähes tasaisena. Geenien korkea ekspressiotaso tarkoittaa, että sitä ilmentyy kudoksessa paljon. Vaikka geeniä ilmentyisi kudoksessa vähän, voi sen vaikutus siltikin olla tehokas. ATP2A ja NCX1A-geenit koodaavat kalsiumia siirtäviä proteiineja, jotka ovat tärkeitä muun muassa sydämen ärsytys-supistuskytkennässä ja relaksoitumisessa.
Suurimmalla osalla geeneistä ekspressiotaso oli noussut pitkän matkan uineilla, mutta suurimmalla osalla hajontaa oli myös niin paljon, että erot tasoittuivat (tarkemmat arvot taulukko 5 ja 6). Osa geeneistä ekspressoitui moninkertaisesti enemmän kuin referenssigeeni,
30
mutta osalla ekspressio oli vähäisempää (kuva 7 ja 8). Vähiten ekspressoituvia geenejä olivat HCN4 ja IGF1, joiden ekspressio oli moninkertaisesti pienempi kuin referenssigeenillä (kuva 8).
Kuva 6. ATP2A2-, NCX1A-, NPPB- ja EF1A-geenin ekspressio oli moninkertainen verrattuna referenssigeeniin DnaJA2. Toiseksi referenssigeeniksi valitun EF1α:n ekspressiotaso oli ryhmien välillä varsin suuri, minkä vuoksi sitä ei voitu käyttää normalisointiin. Tulokset ovat keskiarvoja ± keskivirhe (n=6/ryhmä).
Taulukko 4. Eniten ekspressoituvien geenien tarkemmat geeniekspressioarvot. Arvot ovat lyhyen (n=6) ja pitkän (n=6) matkan uineilta mitatut keksiarvot ± keskivirhe (SEM).
LYHYT ± SEM PITKÄ ± SEM ATP2A2 12,96 2,16 12,87 1,89 NCX1A 4,53 0,75 4,44 0,67 NPPB 18,98 2,83 13,85 1,61 EF1A 18,38 2,94 11,88 1,29
