Kromatiinin rakenneyksikkö on nukleosomi, joka muodostuu 147:stä DNA:n emäsparista kiertyneenä 1,7 kierrosta oktameerisen ydinpartikkelin ympärille (Alberts ym. 2015).
Nukleosomit ovat sijoittuneet kromatiinille noin 160-200 emäsparin välein (Ventres & Pugh 2009). Nukleosomi sisältää kaksi kopiota jokaisesta neljästä oktameerin muodostavasta histonimolekyylistä H2A, H2B, H3 ja H4. Viides histonimolekyyli, H1, yhdistää vierekkäiset nukleosomit toisiinsa ja edistää siten kromatiinin tiiviimpää pakkausta (Govin ym. 2004).
Ihmisen genomista arviolta noin 1,5 prosenttia koodaa noin 22 000 geeniä (Ioannou &
Tempest 2018). Geenien ilmentämiseksi DNA:n sisältämä geneettinen informaatio on ensin kopioitava lähetti-RNA:ksi (mRNA), ennen kuin siitä voidaan tuottaa translaatiolla toiminnallinen proteiini (Alberts ym. 2015).
Geenien ilmentymisen epigeneettinen säätely tapahtuu usealla eri tasolla (Sonenberg &
Hinnebusch 2009): erinäisillä histonien translaation jälkeisillä muokkauksilla, DNA:n metylaatiolla ja ei-koodaavien RNA-molekyylien kautta (Miller ym. 2010). Epigeneettisen säätelyn avulla rajoitetaan tai edistetään transkriptiotekijöiden sitoutumista DNA:han, säätelemällä DNA:n kondensoitumisastetta. DNA:n metylaatiolla tarkoitetaan sytosiinin 5’-paikan peruutettavissa olevaa metylaatiota, joka muodostaa 5-metyyli-sytosiinin (Gibney &
6
Nolan 2010). DNA:n metylaatio yhdistetään usein metyloidulla alueella olevien geenien hiljentämiseen, mutta joissakin tapauksissa se voi myös edistää proteiinien sitoutumista DNA:han. Noin kolme prosenttia sytosiineista on metyloitu ihmisen DNA:ssa (Nafee ym.
2008). Ei-koodaavat RNA:t (ncRNA) sisältävät lukuisia lopetuskodoneita ja niiltä puuttuu laajalti avoimia lukukehyksiä eli translaatioon tarvittavia ohjeita (Biermann & Steger 2007).
ncRNA:t osallistuvat geenien ilmentymisen hiljentämiseen muokkaamalla kromatiinin järjestäytymistä tai vaikuttamalla mRNA:iden stabiiliuteen ja kontrolloimalla proteiinisynteesiä.
2.1.1 Geenien ilmentymisen säätely histonimuokkauksilla
Histonit eivät ainoastaan auta DNA:n pakkaamisessa, vaan osallistuvat myös geenien ilmentymisen säätelyyn (Bannister & Kouzarides 2011). Nukleosomeja muodostavilla histoneilla on niin kutsuttu häntä niiden N-terminaalisessa päässä, joka työntyy nukleosomin ulkopuolelle ja voi olla kontaktissa viereisiin nukleosomeihin. Histonien N-terminaalinen häntä on kohde useille translaation jälkeisille muokkauksille (Rathke ym. 2013). Nämä epigeneettiset muokkaukset sisältävät muun muassa histonien asetylaation, metylaation ja fosforylaation, joiden läsnäolosta seuraa kromatiinin avoimempi tai sulkeutuneempi tila. Jokaisella histonilla on useampi mahdollinen kohta muokkauksille (Govin ym. 2004). Histonien muokkaukset voivat vaikuttaa suoraan kromatiinin rakenteeseen, häiritä proteiinien sitoutumista tai edistää muita kuin histoniproteiineja sitoutumaan kromatiiniin (Kouzarides 2007).
Geenien aktiiviset promoottorialueet sisältävät usein muokattuja histoneita, mikä viittaa siihen, että jotkin muokkaukset voivat olla välttämättömiä transkription aloittamiseksi (Kimura 2013). Histonien asetylaatiolla on positiivinen vaikutus transkriptioon (Gibney & Nolan 2010).
Asetylaatio kohdistuu histonien lysiineihin, mikä neutralisoi niiden positiivisesti varautuneet sivuryhmät, heikentäen histonien sitoutumisen voimakkuutta DNA:han ja avaamalla siten kromatiinin rakennetta. Histonien metylaatio on ainoa muokkaus, joka ei muuta histonien kokonaisvarausta (Bannister & Kouzarides 2011). Metylaatio kohdistuu pääsääntöisesti lysiineihin ja arginiineihin. Lysiinit voidaan joko mono-, di- tai trimetyloida, kun taas arginiinit voidaan monometyloida tai dimetyloida symmetrisesti tai epäsymmetrisesti. Metylaation vaikutus transkriptioon voi olla joko negatiivinen tai positiivinen, riippuen metyloitavasta kohdasta ja metylaatioasteesta (Barski ym. 2007).
7 2.1.2 Transkriptio
Geenien ilmentymisen alussa DNA:n kaksoisjuosteeseen koodattu informaatio kopioidaan sitä vastaavaksi RNA-kopioksi, jota kutsutaan geenien transkriptioksi (Gibney & Nolan 2010).
molekyylien synteesistä vastaa polymeraasientsyymi (Han & He 2016). RNA-polymeraaseja on kolmea alatyyppiä, joista jokainen syntetisoi eri RNA-molekyylejä.
Polymeraasi I syntetisoi suurten ribosomaalisten RNA:iden (rRNA) esiasteita, polymeraasi II syntetisoi kaikkia mRNA:ita ja polymeraasi III katalysoi pieniä RNA:ita, kuten siirtäjä-RNA:ita (tRNA). RNA-polymeraasi II muodostuu kahdentoista alayksikön polymeraasista, joka syntetisoi RNA:ta ja oikolukee muodostuvaa transkriptiä (Boeger ym. 2005).
Transkription alussa aktivaattorit sitoutuvat geenin ilmentymisen aktivoivalle ei-koodaavalle DNA-alueelle, joka tunnetaan tehostaja-alueena (Panigrahi & O'Malley 2021).
Tehostaja-alueelle sitoutuneet aktivaattorit edistävät transkriptiokoneistoon kuuluvien tekijöiden sitoutumista promoottorialueelle (Li ym. 2007). Promoottorialue sisältää transkription aloituskohdan ja siitä noin 30-60 emäsparin päässä olevan TATA-laatikon (Ventres & Pugh 2009). Transkriptiokoneistoon kuuluvat tekijät tunnistavat promoottorialueen ja sitoutuvat TATA-laatikkoon (Han & He 2016). Vastaavat tekijät avaavat DNA:n kaksoiskierteen promoottorin kohdalta ja avustavat RNA-polymeraasi II sitoutumaan siihen aloituskompleksin muodostamista varten (Boeger ym. 2005, Wade & Struhl 2008).
Sitouduttuaan transkription aloituskohtaan RNA-polymeraasi II alkaa syntetisoimaan mRNA:ta, joka on komplementaarinen mallina käytettävälle DNA-juosteelle (Gibney & Nolan 2010). mRNA:n syntetisointi tapahtuu sen 5’-päästä kohti 3’-päätä, jolloin mallijuosteen lukeminen tapahtuu vastakkaiseen suuntaan (Alberts ym. 2015). RNA-polymeraasi II:n liikkuessa pois promoottorialueelta RNA siirtyy pitenemisvaiheeseen ja samalla irrottautuu transkriptiokoneistoon kuuluvista tekijöistä (Wade & Struhl 2008). RNA-polymeraasi II:n karboksyylipään fosforylointi siirtymävaiheessa johtaa osan transkriptiokoneistoon kuuluvien tekijöiden vaihtamiseen muihin tekijöihin, jotka ovat tärkeitä pitenemisen ja mRNA:n prosessoinnin kannalta (Pokholok ym 2002). Transkription päätyttyä mRNA:n 5’-päähän liitetään sitä suojaava metyloitu guanosiini-rakenne (eng. cap) ja silmukoinnilla poistetaan juosteen intronisekvenssit sekä eksonit liitetään toisiinsa (Gibney & Nolan 2010). Silmukoinnin jälkeen mRNA:n 3’-pää leikataan pois ja tilalle liitetään mRNA:n kuljettamiselle tumasta sytoplasmaan välttämätön adenosiinitähde, joka tunnetaan poly-A häntänä. Muodostetun mRNA:n 3’-pään muokkaus tapahtuu geenin kohdissa (Soles & Shi 2021). Eri
poly-A-8
kohtia käyttämällä voidaan tuottaa erilaisia mRNA:n isoformeja. Metyloidun guanosiini-rakenteen ja poly-A hännän liittämisen jälkeen mRNA on valmis translaatioon.
2.1.3 Translaatio
Translaatio voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen: aloitus, piteneminen ja lopetus (Gibney &
Nolan 2010). Sen aikana syntetisoidaan polypeptidejä N-terminaalisesta päästä C-terminaaliseen päähän mRNA:n kuljettaman geneettisen koodin mukaan. mRNA:n sisältämä geneettinen koodi luetaan kodoneina eli kolme nukleotidia kerrallaan (Alberts ym. 2015).
Translaatio alkaa aloituskodonin tunnistamisella, joka on tavallisesti ensimmäinen AUG-tripletti mRNA:n 5’-pään metyloidusta guanosiini-rakenteesta lukien (Pestova ym. 2001).
Aloituskodoni sijaitsee noin 50-100 nukleotidin päässä guanosiini-rakenteesta. Aloituskodonin tunnistaminen tapahtuu pienen (40S) ribosomaalisen alayksikön, translaation aloitukseen erikoistuneen siirtäjä-RNA-metioniini kompleksin (Met-tRNAi) ja eukaryoottisten aloitustekijöiden (eIF) muodostaman esialoituskompleksin toimesta (Sonenberg & Hinnebusch 2009). Esialoituskompleksi sitoutuu lähelle mRNA:n 5’-päätä eIF:en tunnistettua guanosiini-rakenteen ja skannaa transloimattoman alueen AUG-kodonin varalta (eng. 5’ untranslated region, 5’UTR). Aloituskodonin tunnistamisen jälkeen eIF:t avustavat suuren (60S) ribosomaalisen alayksikön liittämisessä osaksi aloituskompleksia, jonka jälkeen aloitustekijät irtautuvat kompleksista (Pestova ym. 2001). Muodostetussa kahden alayksikön ribosomissa on sitoutumiskohdat aminoasyyli-tRNA:lle (A-paikka), peptidyyli-tRNA:lle (P-paikka) ja deasyloidulle tRNA:lle (E-paikka) (Wilson & Doudna Cate 2012). Met-tRNAi sitoutuu suoraan ribosomin P-paikkaan ja sen antikodoni emäspariutuu aloituskodonin kanssa (Dever & Green 2012). Avoimen lukukehyksen toinen kodoni on ribosomin A-paikassa odottamassa sitä vastaavan aminoasyyli-tRNA:n sitoutumista.
Translaation pitenemisvaihe alkaa toisen kodonin kanssa emäspariutuvan aminoasyyli-tRNA:n kuljettamisella ribosomin A-paikkaan (Dever ym. 2018). Aminoasyyli-aminoasyyli-tRNA:n sitoutumisen jälkeen peptidyylitransferaasi muodostaa peptidisidoksen P- ja A-paikassa olevien tRNA:iden kuljettamien aminohappojen välille (Dever & Green 2012). Sidoksen muodostuminen saa aikaan konformaation muutoksen ribosomissa, mikä liikuttaa tRNA:n P-paikasta E-paikkaan ja A-P-paikasta P-paikkaan, vapauttaen A-paikan seuraavalle aminoasyyli-tRNA:lle. Sidoksen muodostamisen yhteydessä aluilla oleva peptidi siirretään peptidyyli-tRNA:lta aminoasyyli-tRNA:n aminoryhmälle (Dever ym. 2018). Translaatio jatkuu, kunnes yksi kolmesta lopetuskodonista (UAA, UAG tai UGA) päätyy ribosomin A-paikkaan ja
9
signaloi ribosomille translaation lopetuksesta (Gibney & Nolan 2010). Valmis polypeptidiketju vapautetaan ja ribosomaaliset alayksiköt irrotetaan toisistaan, jolloin myös mRNA ja deasyloitu tRNA vapautetaan uuteen translaatioon tarvittavien komponenttien kasausta varten.
3 IHMISEN SIITTIÖT