Kaikkien DNA-kontaminoituneiden näytteiden ilmentymisarvoja verrattiin mies 3 näytteistä tuotetun kontaminaatiovapaan näyteparin kanssa. Lasketut korrelaatiokertoimet osoittivat näytteiden RPKM-arvojen välillä olevan lineaarista riippuvuutta (taulukko 4). Mies 3 näytteiden väliset Pearsonin korrelaatiokertoimet viittasivat vahvaan positiiviseen lineaariseen riippuvuuteen geenien ilmentymisessä aineistojen välillä. Progesteronikäsitellyistä näytteistä laskettu korrelaatio (n=5 geeniä) erilailla ilmentyneiden geenien välillä oli ainoa, jonka kohdalla riippuvuus oli vahvasti negatiivinen (r=-0,9407). Mies 2 näytteet ja kontaminaatiovapaa näytepari eivät osoittaneet vahvaa lineaarista riippuvuutta kontrolli- tai käsittelynäytteiden välillä (kontrolli: r=0,65; progesteroni: r=0,57). Mies 4 näytteiden ja kontaminaatiovapaan näyteparin välinen korrelaatio osoitti ainoastaan heikkoa positiivista lineaarista riippuvuutta (kontrolli: r=0,14; progesteroni: r=0,12).
Taulukko 4. DNA-kontaminoituneiden näytteiden ja kontaminaatiovapaan näyteparin RPKM-arvojen väliset Pearsonin korrelaatiokertoimet.
DE-geenien ilmentymisarvot DNA-kontaminoituneessa ja kontaminaatiovapaassa aineistossa olivat ristiriitaisia (taulukko 5). DNA-kontaminoituneesta aineistosta tulkittuna DBT oli ainoa geeni, jonka ilmentyminen kasvoi progesteronikäsittelyn seurauksena.
Kontaminaatiovapaan aineiston perusteella progesteroni aktivoi sekä SESN1 että LRRC6
28
geenien ilmentymistä. DBT ja SIK3 ilmentymiseen progesteronikäsittelyllä ei ollut vaikutusta kontaminaatiovapaan aineiston perusteella, mutta PMS1-geenin ilmentyminen väheni.
Kontrollikäsittelyjen ilmentymisarvot olivat lähellä toisiaan. Progesteronikäsittelyjen kohdalla geenien, joiden ilmentymistä ei ollut havaittu DNA-kontaminoituneessa näytteessä, havaittiin ilmentyneiksi kontaminaatiovapaassa näytteessä.
Taulukko 5. DE-geenien RPKM-arvot DNA-kontaminoituneissa ja kontaminaatiovapaissa siittiönäytteissä.
7 TULOSTEN TARKASTELU
Tutkimuksessa analysoidussa aineistossa havaittiin genomisen DNA:n aiheuttama kontaminaatio, joka vääristi geenien ilmentymisarvoja (liite 6). Kontaminaation aiheuttamaa virheellistä geenien ilmentymisen tulkintaa pyrittiin vähentämään huomioimalla geenien alueille rinnastuneista sekvensseistä ainoastaan 75 prosenttia. Kontaminaation aiheuttamasta ongelmasta huolimatta suoritettiin DE-analyysi (liite 7), joka havaitsi viisi geeniä (DBT, PMS1, SESN1, SIK3 ja LRRC6), joiden ilmentyminen oli muuttunut merkitsevästi progesteronikäsittelyn myötä. Havaitut geenien ilmentymisen muutokset saattavat siten indikoida progesteronin mahdollisista geenitason vaikutuksista siittiöihin ja siittiöissä tapahtuvasta RNA tuotannosta. Viidestä DE-geenistä kahden alueella havaittiin RNA:n aktiiviseen tuotantoon viittaava H3K36me3-muokkaus, mikä on yhdenmukainen löydös aikaisemmin tehtyjen tutkimusten kanssa siittiöiden epätäydellisestä protaminaatiosta (Hammoud ym. 2009, Hammoud ym. 2011).
Toistaiseksi ei ole aikaisempia tutkimuksia, joissa olisi tehty vastaavanlainen taustankorjaus DNA-kontaminoituneelle RNA-seq aineistolle. Toisaalta esimerkiksi ChIP-seq analyyseissä ongelmana usein on vasta-aineiden epäspesifinen sitoutuminen, jonka aiheuttamaa taustan vaikutusta pystytään korjaamaan (Nakato & Sakata 2021). Ilmentyvää taustaa on siten mahdollista ainakin teoriassa huomioida myös RNA-seq aineistossa.
29
DE-analyysilla havaittiin viisi geeniä, joiden ilmentymisen muutos oli tilastollisesti merkitsevä korjaamattoman p-arvon perusteella. Tilastollinen voima havaita eroja oli heikko korjatun p-arvon osalta. Tuloksiin vaikutti mitä todennäköisimmin näytteiden luovuttaneiden miesten välinen geneettinen vaihtelu. Ihmisten välinen geneettinen vaihtelu pohjautuu suurelta osin meioosin aikana tapahtuvaan kromosomien rekombinaatioon eli geenienvaihduntaan (Chowdhury ym. 2009). Jopa yhden nukleotidin erot geenien alueilla voivat vaikuttaa transkriptioon osallistuvien tekijöiden sitoutumiseen ja siten geenien ilmentymiseen. Ihmisten yksilöllisyys on siten ainakin yksi mahdollinen selittävä tekijä näytteiden välisiin eroavaisuuksiin.
Geneettisen vaihtelun vaikutuksen lisäksi näytteiden välinen vaihtelu on voinut lisääntyä näytteiden käsittelyn aikana. Näytteiden kirjastojen kokoerot kertovat eristettyjen ja sekvensoitujen RNA-määrien vaihdelleen näytteiden välillä. Tämän tutkimuksen näytteiden kirjastokoot olivat huomattavasti pienemmät verrattuna aikaisemmin julkaistuihin RNA-seq-analyyseihin. Esimerkiksi Flegel ym. (2016b) tutkimuksessa näytteiden sekvenssimäärät jokaisessa näytteessä oli noin 15 miljoonaa, joista noin 11 miljoonaa (70-80 %) rinnastui genomiin. Vastaavasti tämän tutkimuksen kirjastokoot vaihtelivat näytteittäin noin 500 000-1,5 miljoonan genomiin rinnastuneen sekvenssin välillä. Zakharov ym. (2015) tutkimus hiiristä tuotetulla RNA-seq aineistolla osoitti esimerkiksi, että kirjastokoon ollessa 10-15 miljoonaa sekvenssiä, havaitaan suurin osa DE-geeneistä. Kirjastokoon laskiessa 10 miljoonan alapuolelle, heikkenee kyky DE-geenien havaitsemiseksi tilastollisen voiman heiketessä.
Kirjastokoon vaikutus on kuitenkin tutkimuskohtainen, eikä samalla kirjastokoolla saavuteta välttämättä yhtä hyviä tuloksia eri tutkimuksissa (Conesa ym. 2016). Tämän tutkimuksen osalta pienten kirjastokokojen vaikutus saattoi kuitenkin johtaa suuriin korjattuihin p-arvoihin.
Viidestä DE-geenistä yhden ilmentyminen oli lisääntynyt progesteronikäsittelyn myötä (DBT) ja neljän vähentynyt (PMS1, SESN1, SIK3 ja LRRC6). Mitokondriaalinen kompleksi, jossa DBT:n koodaama proteiini on osana, katalysoi alpha-ketohapon muuttamista asyyli-CoA:ksi ja hiilidioksidiksi, jossa DBT:n tehtävänä on vastaanottaa asyyliryhmät ja siirtää ne koentsyymi A:lle (The UniProt Consortium 2021). Kompleksi on siten yhteydessä solun energiantuotantoon, sillä asyyli-CoA tuottaa rasvahapoista asetyyli-CoA:ta, jota tarvitaan sitruunahappokierrossa (Pietrocola ym. 2015). DBT:n ilmentymisen lisääntyminen saattaa edistää siittiön energiantuotantoa ja siten olla yhteydessä siittiön liikkuvuuteen. Progesteronin tiedetään edistävän siittiöiden hyperaktivaatiota, joka kuluttaa runsaasti energiaa (Lishko ym.
2011). Siittiöiden progesteronikäsittelyn seurauksena lisääntynyt energiantarve saattaisi siten olla yksi syy siittiön energiantuotantoon liittyvien geenien lisääntyneeseen ilmentymiseen.
30
PMS1-, SESN1- ja SIK3-geenien ilmentyminen puolestaan vähentyi tai loppui kokonaan progesteronille altistamisen jälkeen. PMS1:n koodaama proteiini kuuluu DNA:n väärinpariutuneita emäksiä korjaavaan MutL-beta kompleksiin (The UniProt Consortium 2021). Mikäli siittiöissä tapahtuu RNA:n tuotantoa, tarkoittaisi se sitä, että aktiiviset transkription alueet olisivat avoimempia kromatiinin alueita, jolloin ne olisivat myös alttiimpia DNA:ta vahingoittaville tekijöille (Huang & Li 2018). Tällöin DNA:ta korjaavan kompleksin ilmentyminen mahdollistaisi DNA:n emäsvirheiden korjaamisen ennen transkription aloittamista. Toimivan DNA:n korjauskoneiston esiintymisen etuna olisi myös isänpuoleisen genomin pääsy mahdollisimman ehjänä munasoluun ja sitä myöten jälkeläiseen. Smith ym.
(2013) tutkimus osoitti, että kypsillä siittiöillä on hapettuneiden DNA:n emästen poistamiseen erikoistunut entsyymi, jonka poistama emäs korvataan uudella tosin vasta hedelmöittämisen jälkeen. Vaikka PMS1:n ilmentyminen vähentyi progesteronikäsittelyn jälkeen, voisi kuitenkin olla mahdollista, että siittiöillä olisi myös muunlaisia toimivia DNA:n korjausmekanismeja, joiden komponentteja koodaavien geenien ilmentymistä ei havaittu DNA-kontaminaatiosta johtuen.
SESN1-geenin koodaama Sestrin-1-proteiini säätelee TORC1 signalointireittiä GATOR-kompleksin kautta (The UniProt Consortium 2021). Leusiinin sitoutuessa Sestrin-1:en, se irrottautuu GATOR-kompleksin GATOR2-alayksiköstä ja TORC1 signalointireitti aktivoituu, jolloin TORC1 pystyy säätelemään solun metaboliaa solun kasvun edistämiseksi. Ilman leusiinin sitoutumista Sestrin-1 pysyy sitoutuneena GATOR2:en ja estää siten TORC1 signaloinnin. Sestrin-1 on herkkä soluun kohdistuvalle stressille, kuten aminohappojen puutteelle (Lee ym. 2017). Jokin solustressin muoto voi käynnistää Sestrin-1:n aktiivisemman tuotannon, jolloin TORC1 proteiinikompleksia inhiboidaan ja solun energiantuotanto vähenee.
SESN1-geenin ilmentymisen loppuminen osassa progesteronikäsitellyistä näytteistä viittaisi siten TORC1 signaloinnin toimintaan, mikä saattaisi tukea siittiön normaalia energiantuotantoa.
SIK3:n koodaama proteiini seriini/treoniini proteiinikinaasi SIK3 puolestaan säätelee positiivisesti mTOR signalointireittiä, ohjaamalla sen inhibiittorin (DEPTOR) hajotettavaksi (The UniProt Consortium 2021). mTOR säätelee muun muassa solun proteiinisynteesiä (Saxton
& Sabatini 2018), joten SIK3 ilmentymisen vähentyminen tai loppuminen progesteronille altistamisen jälkeen saattaisi siten rajoittaa jollakin tavalla siittiössä mahdollisesti tapahtuvaa proteiinisynteesiä. Yleisesti voisi ajatella, että SESN1-, SIK3 ja PMS1-geenin ilmentymisen vähentyminen tai loppuminen kokonaan progesteronikäsittelyn jälkeen saattaisi indikoida sitä, että vastaavien geenien koodaamia proteiineja on tuotettu tarpeeksi, jolloin niiden ilmentämiselle ei ole enää tarvetta.
31
g:Profilerin hakutuloksiin vaikuttaa annetun geenilistan koko (Raudvere ym. 2019). Pienelle geenilistalle, joka ei sisällä suoraan toisiinsa liittyviä geenejä, hakutulokset eivät välttämättä näytä merkitseviä toiminnallisia ryhmiä kaikille geeneille. Tästä johtuen LRRC6:lle ei saatu näkyviin toiminnallista ryhmää. Hakuparametrejä laajentamalla pystyttiin selvittämään, että LRRC6 osallistuu muun muassa proteiinien lokalisoimiseen siittiön häntään. LRRC6 koodaama leusiini-rikkaan toistojakson sisältävä proteiini on keskeisessä roolissa siittiön hännän muodostamisessa ja sen liikkumisessa, osallistumalla dyneiinin komponenttien kuljettamiseen solulimasta siittiön häntään (The UniProt Consortium 2021). Kott ym. (2012) ja Li ym. (2021) tutkimukset ovat osoittaneet, että mutaatio LRRC6-geenin alueella aiheuttaa siittiön hännässä rakennemuutoksia ja sen epänormaalia toimintaa, jotka ovat yhteydessä miesten hedelmättömyyteen. Kyseisissä tutkimuksissa mutaation seurauksena LRRC6 ei ilmentynyt lainkaan, joka aiheutti siittiön hännän poikkeavan rakenteen dyneiinin komponenttien puutteen takia. Siittiöiden sisältämien RNA:iden on ajateltu olevan jäänteitä siittiöiden kehityksen ajalta (Ren ym. 2017). LRRC6:en ilmentyminen kontrollinäytteissä saattaisi siten olla jäänne siittiöiden kehityksen aikaisesta RNA:sta, josta on tuotettu proteiinia siittiön hännän normaalin rakenteen saavuttamiseksi. Sen ilmentymisen vähentyminen tai loppuminen progesteronikäsittelyn myötä voisi tarkoittaa sitä, ettei dyneiinin komponenttien kuljettamiselle ole enää yhtä suurta tarvetta progesteronille altistuneessa siittiössä, progesteronin indusoidessa fysiologisia muutoksia siittiössä, jotka johtavat siittiön kapasitoituneeseen tilaan. Progesteronin aikaansaama muutos siittiössä, kuten kalsiumpitoisuuden kohoaminen, tai sen sitoutuminen tumareseptoriin saattaisi siten toimia merkkinä siittiön hännän toimintaan vaikuttavien proteiineja koodaavien geenien hiljentämiselle.
Hammoud ym. (2018) tutkimuksen määritykset histonimuokkausten rikastumisalueista ihmisen siittiön genomissa oli tehty altistamattomille kypsille siittiöille. Määritykset jo itsessään viittaavat siihen, että kyseisiä muokkauksia esiintyy kypsien siittiöiden genomissa, vaikka niissä ei uskota tapahtuvat RNA:n aktiivista tuotantoa. Histonimuokkausten esiintyminen siittiöiden genomissa viittaa siten histonien olemassaoloon protamiinien sijaan, jolloin näillä alueilla genomi olisi myös pakkautunut somaattisten solujen tapaan väljemmin histonien ympärille, mikä voisi mahdollistaa transkription käynnistämisen.
H3K36me3-muokkaus assosioituu somaattisissa soluissa geenin alueella aktiivisen RNA:n tuotannon kanssa (Barski ym. 2007). Tässä tutkimuksessa kyseisen muokkauksen havaittiin esiintyvän SESN1- ja LRRC6-geenin alueilla, joiden ilmentyminen oli kuitenkin vähentynyt progesteronikäsittelyn jälkeen. Transkription aktiivisuuteen ja inaktiivisuuteen viittaavien
32
histonimuokkausten on havaittu esiintyvän samanaikaisesti alkion kantasolujen geenien promoottorialueilla ja myöhemmin myös siittiöissä samojen geenien promoottorialueilla (Bernstein ym. 2006, Hammoud ym. 2011, Hammoud ym. 2014). Tällaisista promoottorialueista puhutaan niin sanottuina poised/bivalent promoottorialueina, jotka ajatellaan olevan ”alustettu” RNA:n tuotantoon siten, että sopivan signaalin seurauksena inaktiivisuutta ylläpitävän muokkauksen poistamisen jälkeen jäljelle jäisi aktiivisuuteen viittaava muokkaus. Esimerkiksi ihmisen siittiöiden genomissa on havaittu inaktiivisuuteen viittaavan muokkauksen H3K27me3 lokalisoituvan samoille alueille kuin aktiivisuuteen viittaavan muokkauksen H3K4me3 (Hammoud ym. 2011). H3K36me3 voisi mahdollisesti olla samalla periaatteella SESN1- ja LRRC6-geenin alueilla. Mies 4 kohdalla kyseisten geenien ilmentymistä ei enää havaittu progesteronikäsittelyn jälkeen ja mies 3 kohdalla myös SESN1:n ilmentyminen loppui. Progesteroni saattaisi siten stimuloida aktiivisuuteen viittaavan muokkauksen poistamista spesifisiltä geenien alueilta, paljastaen transkription inaktiivisuuteen viittaavan histonimuokkauksen. Tällöin DNA:n ja histonien välisessä vuorovaikutuksessa saattaisi tapahtua muutos, joka johtaisi histonien vahvempaan sitoutumiseen ja estäisi siten transkriptiotekijöiden tai RNA-polymeraasi II:den sitoutumisen. H3K36me3-muokkauksen esiintyminen saattaisi mahdollistaa myös muiden DNA:ta sitovien proteiinien sitoutumisen, jotka voisivat hiljentää RNA:n tuotantoa. Progesteronilla voisi täten olla stimuloiva vaikutus näiden tekijöiden sitoutumiseen. Ottaen huomioon, että SESN1 ja LRRC6 geenien alueella havaittiin H3K36me3-muokkausta ja niiden ilmentyminen lisääntyi perustuen näytepariin, jossa ei havaittu DNA-kontaminaatiota, voi hyvinkin olla, että RNA:n tuotannon aktivoituminen niiden alueelta perustuukin ”alustetun” geenialueen hypoteesiin. Toisin sanoen, todellisuudessa mekanismi voi olla päinvastainen kuin yllä kuvattu DNA-kontaminoituneesta aineistosta tehty päätelmä.
Aktiivisuuteen viittaavien histonimuokkausten säilyminen siittiöiden spesifisillä geenien alueilla voisi liittyä useasti toistuviin sekvenssialueisiin, jotka muun muassa transkriptiotekijät tunnistavat. Ngo ym. (2019) osoittivat useasti toistuvien DNA-sekvenssijaksojen säätelevän histonimuokkausten säilymistä somaattisissa soluissa. Vastaavasti Berneviste ym. (2014) olivat aikaisemmin vahvistaneet DNA-sekvenssin ja transkriptiotekijöiden sitoutumiskohtien ennustavan histonimuokkausten sijoittumista ihmisten eri solulinjoissa. DNA-sekvenssissä usein toistuvat jaksot, kuten juuri transkriptiotekijöiden tunnistamat kohdat, voisivat siten mahdollisesti vaikuttaa histonien ja histonimuokkausten säilymiseen myös siittiöiden genomin spesifisillä alueilla.
33
Taustakorjatun ja kontaminaatiovapaan aineiston välillä havaittiin positiivinen lineaarinen riippuvuus. Pearsonin korrelaatiokertoimet olivat lähellä yhtä, mikä osoitti näytteiden olevan vahvasti positiivisesti lineaarisesti riippuvia. Progesteronikäsitellyistä näytteistä DE-geenien välinen korrelaatiokerroin oli vahvasti negatiivinen, mutta koska korrelaatio perustui ainoastaan viiden geenin RPKM-arvoihin, korrelaation suunnasta ja voimakkuudesta ei voida tehdä kovin pitkälle meneviä johtopäätöksiä. Eri miesten näytteiden väliset korrelaatiot eivät osoittaneet yhtä vahvaa riippuvuutta, mikä on odotettavissa, sillä yksilöiden välillä esiintyy geneettistä vaihtelua. Mies 4:n ja kontaminaatiovapaan näyteparin välinen korrelaatio oli erityisen heikko, mikä on mahdollisesti osittain selitettävissä sillä, että kyseisen miehen näytteiden kirjastokoot olivat kaikista pienimmän, jolloin sekvenssejä ei ole välttämättä rinnastunut yhtä monen geenin kanssa ja ilmentymisarvoiksi oli määritetty nolla. Yleisesti on todettu, että kirjastokoon ollessa suurempi, havaitaan enemmän ja samalla tarkemmin transkriptejä (Conesa ym. 2016).
Saaduista tuloksista on huomioitava se, että ne ovat peräisin DNA-kontaminoituneista näytteistä. Ei ole varmaa, saatiinko aineistolle tehdyllä taustankorjauksella poistettua riittävästi kontaminaation aiheuttamaa ongelmaa, jotta rinnastuneet sekvenssit edustaisivat ainoastaan transkripteistä peräisin olevia sekvenssejä. Epävarmuustekijöistä johtuen saadut tulokset eivät välttämättä edusta progesteronin todellisia vaikutuksia siittiöiden geenien ilmentymiseen.
8 JOHTOPÄÄTÖKSET
Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään siittiöiden geenien ilmentymisessä tapahtuvia muutoksia progesteronille altistamisen jälkeen. Näytteissä havaitusta DNA-kontaminaatiosta huolimatta geenien ilmentymisarvojen ja yhden miehen näytteistä tuotetun aineiston välillä, jossa ei ollut DNA-kontaminaatiota, oli vahva positiivinen lineaarinen riippuvuus, kun geenien ilmentymisarvoista huomioitiin 75 prosenttia. DNA-kontaminaation vaikutuksen riittävästä poistamisesta ei kuitenkaan voida olla varmoja. Tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että progesteronilla voisi olla myös geenitason vaikutuksia siittiöihin geenien ilmentymisessä havaittujen muutosten perusteella. Progesteronin todellista vaikutusta, eli millaisen toiminnan omaaviin geeneihin vaikutukset kohdistuisivat eniten, ei kuitenkaan voida varmuudella arvioida tämän tutkimuksen tulosten pohjalta.
Tarkasteltujen histonimuokkausten esiintyminen geenien alueilla viittaa siittiöiden kromatiinin epätäydelliseen protaminaatioon. Histonien säilyminen osana kromatiinin
34
rakennetta voisi siten mahdollistaa transkription käynnistämisen protamiineista vapailla kromatiinialueilla. Tämä tukee oletusta siitä, että siittiöissä vastoin yleistä oletusta tapahtuisikin RNA:n tuotantoa tai se voisi aktivoitua sopivan stimulaation seurauksena.
KIITOKSET
Kiitos ohjaajilleni Jukka Kekäläiselle ja Tanja Turuselle tutkielman tekemiseen saamastani avusta. Kiitos myös tutkimusryhmälle, jonka tuottamaa julkista aineistoa hyödynnettiin tässä tutkielmassa.
LÄHDELUETTELO
Alavioon G, Hotzy C, Nakhro K, Rudolf S, Scofield DG, Zajitschek S, Makalov AA, Immler S. 2017. Haploid selection within a single ejaculate increases offspring fitness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 114 (30): 8053-8058.
Alberts B, Johnson A, Lewis J, Morgan D, Raff M, Roberts K, Walter P. 2015. Molecular Biology of the Cell. Sixth Edition. 1342 s. Garland Science, Taylor & Francis Group. New York.
Bailey JL. 2010. Factors Regulating Sperm Capacitation. System Biology in Reproductive Medicine 56: 334-348.
Baldi E, Luconi M, Muratori M, Marchiani S, Tamburrino L, Forti G. 2009. Nongenomic activation of spermatozoa by steroid hormones: Facts and fictions. Molecular and Cellular Endocrinology 308: 39-46.
Bannister AJ, Kouzarides T. 2011. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research 21: 381-395.
Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schones DE, Wang Z, Wei G, Chepelev I, Zhao K.
2007. High-Resolution Profiling of Histone Methylations in the Human Genome. Cell 129:
823-837.
Berneviste D, Sonntag HJ, Sanguinetti G, Sproul D. 2014. Transcription factor binding predicts histone modifications in human cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111 (37): 13367-13372.
Bernstein BE, Mikkelsen TS, Xie X, Kamal M, Huebert DJ, Cuff J, Fry B, Meissner A, Wernig M, Plath K, Jaenisch R, Wagschal A, Feil R, Schreiber SL, Lander ES. 2006. A Bivalent Chromatin Structure Marks Key Developmental Genes in Embryonic Stem Cells.
Cell 125: 315-326.
Biermann K, Steger K. 2007. Epigenetics in Male Germ Cells. Journal of Andrology 28 (4):
466-480.
Bioconductor Core Team (2015). Homo.sapiens: Annotation package for the Homo.sapiens object. R package version 1.3.1.
Boeger H, Bushnell DA, Davis R, Griesenbeck J, Lorch Y, Strattan JS, Westover KD, Kornberg RD. 2005. Structural basis of eukaryotic gene transcription. FEBS Letters 579:
899-903.
Brown SG, Publicover SJ, Barratt CLR, Martins da Silva SJ. 2019. Human sperm ion channel (dys)function: implications for fertilization. Human Reproduction Update 25 (6): 758-776.
35
Chen H, Mruk D, Xiao X, Cheng Y. 2017. Human Spermatogenesis and Its Regulation.
Teoksessa: Winters S, Huhtaniemi I (eds.), Male Hypogonadism, Contemporary Endocrinology 49-72. Humana Press, Cham.
Chowdhury R, Bois PRJ, Feingold E, Sherman SL, Cheung VG. 2009. Genetic Analysis of Variation in Human Meiotic Recombination. PLoS Genetics 5 (9): e1000648.
Cohen-Dayag A, Tur-Kaspa I, Dor J, Mashiach S, Eisenbach M. 1995. Sperma capacitation in humans is transient and correlates with chemotactic responsiveness to follicular factors.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92:
11039-11043.
Conesa A, Madrigal P, Taranzona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, PcPherson A, Szczesniak MW, Gaffney DJ, Elo LL, Zhang X, Mortazavi A. 2016. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology 17:13.
Das PJ, McCarthy F, Vishnoi M, Paria N, Gresham C, Li G, Kachroo P, Sudderth AK, Teague S, Love CC, Varner DD, Chowdhary BP, Raudsepp T. 2013. Stallion Sperm Transcriptome Comprises Functionally Coherent Coding and Regulatory RNAs as Revealed by Microarray Analysis and RNA-seq. PLoS ONE 8 (2): e56535.
Dever TE, Green R. 2012. The Elongation, Termination, and Recycling Phases of Translation in Eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 4:a013706.
Dever TE, Dinman JD, Green R. 2018. Translation Elongation and Recording in Eukaryotes.
Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 10:a032649.
Firman RC, Gasparini C, Manier MK, Pizzari T. 2017. Postmating Female Control: 20 Years of Cryptic Female Choice. Trends in Ecology & Evolution 32 (5): 368-382.
Fitzpatrick JL, Willis C, Devigili A, Young A, Carroll M, Hunter HR, Brison DR. 2020.
Chemical signals from eggs facilitate cryptic female choice in humans. Proceedings of Royal Society B 287:20200805.
Flegel C, Manteniotis S, Osthold S, Hatt H, Gisselmann G. 2013. Expression Profile of Ectopic Olfactory Receptors Determined by Deep Sequencing. PLoS ONE 8 (2):e55368.
Flegel C, Vogel F, Hofreuter A, Wojcik S, Schoeder C, Kieć-Kononwicz K, Brockmeyer NH, Müller CE, Becker C, Altmüller J, Hatt H, Gisselmann G. 2016a. Characterization of non-olfactory GPCRs in human sperm with a focus on GPR18. Scientific Reports 6:32255.
Flegel C, Vogel F, Hofreuter A, Schreiner BSP, Osthold S, Veitinger S, Becker C,
Brockmeyer NH, Muschol M, Wennemuth G, Altmüller J, Hatt H, Gisselmann G. 2016b.
Characterization of the Olfactory Receptors Expressed in Human Spermatozoa. Frontiers in Molecular Biosciences 2:73.
Gaucher J, Reynoird N, Montellier E, Boussouar F, Rousseaux S, Khochbin S. 2010. From meiosis to postmeiotic events: The secrets of histone disappearance. The FEBS Journal 277: 599-604.
Gaucher J, Boussouar F, Montellier E, Curtet S, Bochou T, Bertrand S, Hery P, Jounier S, Depaux A, Vitte AL, Guardiola P, Pernet K, Debernardi A, Lopez F, Holota H, Imbert J, Wolgemuth DJ, Gérard M, Rousseaux S, Khochbin S. 2012. Bromodomain-dependent stage-specific male genome programming by Brdt. The EMBO Journal 31 (19): 3809-3820.
Gellersen B, Fernandes MS, Brosens JJ. 2009. Non-genomic progesterone actions in female reproduction. Human Reproduction Update 15 (1): 119-138.
Gibney ER, Nolan CM. 2010. Epigenetics and gene expression. Heredity 105: 4-13.
Goudarzi A, Shiota H, Rousseaux S, Khochbin S. 2014. Genome-Scale
Acetylation-Dependent Histone Eviction during Spermatogenesis. Journal of Molecular Biology 426:
3342-3349.
36
Govin J, Caron C, Lestrat C, Rousseaux S, Khochbin S. 2004. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. European Journal of Biochemistry 271: 3459-3469.
Gu Z, Eils R, Schlesner M. 2016. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics 32 (18): 2847-2849.
Hammoud SS, Nix DA, Zhang H, Purwar J, Carrell DT, Cairns BR. 2009. Distinctive
chromatin in human sperm packages genes for embryo development. Nature 460: 473-478.
Hammoud SS, Nix DA, Hammoud AO, Gibson M, Cairns BR, Carrell DT. 2011. Genome-wide analysis identifies changes in histone retention and epigenetic modifications at
developmental and imprinted gene loci in the sperm of infertile men. Human Reproduction 26 (9): 2558-2569.
Hammoud SS, Low DHP, Yi C, Carrell DT, Guccione E, Cairns BR. 2014. Chromatin and Transcription Transition of Mammalian Adult Germline Stem Cells and Spermatogenesis.
Cell 15: 239-253.
Hammoud SS, Nix DA, Oler AJ, Carrell D, Cairns BR. 2018. Human Sperm Epigenomes and Transcriptomes Reveal Novel Features of Enhancers, Sex Chromosomes, piRNAs,
Gametogenesis, and Inherited Small RNAs (ChIP-Seq).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE40195
Han Y, He Y. 2016. Eukaryotic transcription initiation machinery visualized at molecular level. Transcription 7 (5): 203-208.
Hosken DJ, Hodgson DJ. 2014. Why do sperm carry RNA? Relatedness, conflict, and control.
Trends in Ecology & Evolution 29 (8): 451-455.
Huang Y, Li GM. 2018. DNA Mismatch Repair Preferentially Safeguards Actively Transcribed Genes. DNA Repair 71: 82-86.
Ioannou D, Tempest HG. 2018. Does genome organization matter in spermatozoa? A refined hypothesis to awaken the silent vessel. Systems Biology in Reproductive Medicine 64 (6):
518-534.
Jaiswal BS, Tur-Kaspa I, Dor J, Mashiach S, Eisenback M. 1999. Human Sperm Chemotaxis:
Is Progesterone a Chemoattractant? Biology of Reproduction 60: 1314-1319.
Jodar M, Selvaraju S, Sendler E, Diamond MP, Krawetz SA. 2013. The presence, role and clinical use of spermatozoal RNAs. Human Reproduction Update 19 (6): 604-624.
Jokiniemi A, Kuusipalo L, Ritari J, Koskela S, Partanen J, Kekäläinen J. 2020a. Gamete-level immunogenetic incompatibility in humans – towards deeper understanding of fertilization and infertility? Heredity 125: 281-289.
Jokiniemi A, Magris M, Ritari J, Kuusipalo L, Lundgren T, Partanen J, Kekäläinen J. 2020b.
Post-copulatory genetic matchmaking: HLA-dependent effects of cervical mucus on human sperm function. Proceedings of Royal Society B 287: 20201682.
Kekäläinen J, Evans JP. 2018. Gamete-mediated mate choice: towards a more inclusive view of sexual selection. Proceedings of Royal Society B 285: 20180836.
Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, Roskin KM, Pringle TH, Zahler AM, Haussler D. 2002. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research 12: 996-1006.
Kimura H. 2013. Histone modifications for human epigenome analysis. Journal of Human Genetics 58: 439-445.
Kott E, Duquesnou P, Copin B, Legendre M, Moal FDL, Montantin G, Jeanson L, Tamalet A, Papon JF, Siffroi JP, Rives N, Mitchell V, de Blic J, Coste A, Clement A, Escalier D, Touré A, Excudier E, Amselem S. 2012. Loss-of-Function Mutation in LRRC6, a Gene Essential for Proper Axonemal Assembly of Inner and Outer Dynein Arms, Cause Primary Ciliary Dyskinesia. The American Journal of Human Genetics 91: 958-964.
Kouzarides T. 2007. Chromatin Modifications and Their Function. Cell 128: 693-705.
37
Law CW, Alhamdoosh M, Su S, Dong X, Tian L, Smyth GK, Ritchie ME. 2018. RNA-seq analysis is easy as 1-2-3 with limma, Glimma and edgeR [version 3; peer review: 3 approved]. F1000Research 5:1408.
Lee JH, Cho US, Karin M. 2017. Sestrin Regulation of TORC1: Is Sestrin a Leucine Sensor.
Science Signaling 9 (431): re5.
Li B, Carey M, Workman JL. 2007. The Role of Chromatin during Transcription. Cell 128:
707-719.
Li Y, Jiang C, Zhang X, Liu M, Sun Y, Yang Y, Shen Y. 2021. The effect of a novel LRRC6 mutation on the flagellar ultrastructure in primary ciliary dyskinesia patient. Journal of
Li Y, Jiang C, Zhang X, Liu M, Sun Y, Yang Y, Shen Y. 2021. The effect of a novel LRRC6 mutation on the flagellar ultrastructure in primary ciliary dyskinesia patient. Journal of