AUTOFAGIAN HÄIRIÖT C9ORF72-TOISTOJAKSOMONISTUMAN AIHEUTTAMASSA OTSALOHKODEMENTIASSA
Miiro Angerpuro Opinnäytetyö
Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen Yliopisto
Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos
Marraskuu 2019
TIIVISTELMÄ
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos
Lääketieteen koulutusohjelma
ANGERPURO, MIIRO O.: Autofagian häiriöt C9orf72-toistojaksomonistuman aiheuttamassa otsalohkodementiassa
Opinnäytetutkielma, 30 sivua, 2 liitettä
Tutkielman ohjaajat: Annakaisa Haapasalo (Tutkimusjohtaja, FT, dosentti), Stina Leskelä (Nuorempi tutkija, FM)
Marraskuu 2019
Asiasanat: C9orf72-geeni, toistojaksomonistuma, autofagia, otsalohkodementia
Heksanukleotiditoistojaksomonistuma C9orf72-geenissä on tärkein geneettinen tekijä otsa- lohkodementian ja amyotrofisen lateraaliskleroosin taustalla. Toistojaksomonistuman haitallisuuden on ehdotettu kumpuavan haploinsuffienssin aiheuttamasta normaalien C9orf72-proteiinien toiminnan menetyksestä ja toistojaksomonistuman itsensä tuottaman RNA:n ja dipeptiditoistojakso-proteiinien sakkautumisesta. C9orf72-proteiinien normaaleja toimintoja ei ole vielä täysin ymmärretty, mutta viimeaikaiset raportit viittaavat siihen, että C9orf72:n translaatiotuotteella isoformi A:lla on rooli vesikkelien kuljetuksen, ja erityisesti autofagian, sääntelyssä. Täten tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia C9orf72-proteiini isoformi A:n vaikutuksia autofagiaan NSC-34-solulinjassa.
Tutkimuksessa mallinsimme soluviljelmissä C9orf72-toistojaksomonistuman aiheuttamaa C9orf72-proteiinien toiminnanmenetystä vähentämällä C9orf72-geenin ilmentymistä RNA- interferenssitekniikalla käyttämällä shRNA:ta (short hairpin RNA). Soluviljelmiä käsiteltiin erilaisilla autofagiaa muokkaavilla yhdisteillä, jolloin pystyimme tutkimaan eri vaiheita autofagisessa hajotusreitissä ja tunnistamaan sen mahdollisia häiriöitä. Tutkimusmenetelmä- nä käytimme Western blot-menetelmää, jonka avulla mittasimme autofagiaan liittyvien proteiinien tasoja. Emme saaneet merkitseviä eroja todennettua muussa kuin C9orf72-geenin koodaamien proteiinien määrässä, joka kuitenkin todisti transfektion ja shRNA:n toimineen.
Kokeen toistamisella useamman kerran olisi muistakin testatuista proteiineista voinut mahdollisesti saada merkitseviä tuloksia.
ABSTRACT
UNIVERSITY OFEASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences School of Medicine
Medicine
ANGERPURO, MIIRO O: Impairments of autophagy in C9orf72-repeat expansion induced frontotemporal dementia
Thesis, 30 pages, 2 appendixes
Tutors: Annakaisa Haapasalo, (Research Director, PhD, Adjunct Professor), Stina Leskelä, (Early Stage Researcher, MSc)
November 2019
Keywords: C9orf72-gene, repeat expansion, autophagy, frontotemporal dementia
Hexanucleotide repeat expansion in C9orf72 gene is the major genetic contributor to frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Repeat expansion mediated toxicity has been suggested to arise from haploinsufficiency i.e. loss of function of normal C9orf72 proteins and production of RNA and dipeptide repeat protein aggregates directly from the repeat itself. The normal functions of C9orf72 proteins are not fully understood but recent reports suggest that C9orf72 isoform A has a role in regulating vesicular trafficking and especially autophagy. Thus, the aim of this study was to examine the effects of C9orf72 protein isoform A on autophagic pathway in NSC-34 cell line.
In the study, we modeled loss of C9orf72 proteins, caused by the repeat expansion, in neuronal cell cultures by reducing the expression of the C9orf72 gene by RNA interference technique using shRNA (short hairpin RNA). Cell cultures were treated with various autophagy-modifying compounds, allowing us to investigate the various steps in the autophagosomal degradation pathway and identify potential differences. As a research method, we used Western blot to measure the levels of autophagy-related proteins. We did not detect significant differences in the levels of other than the C9orf72 proteins, which nevertheless proved that transfection and shRNA-mediated knockdown worked. Replicating the experiment several times could have yielded significant results for other tested proteins.
ESIPUHE
Päätin tarttua jo lääketieteellisten opintojen aikaisessa vaiheessa opinnäytetyön tekemiseen.
Löysinkin sopivan tutkimusryhmän ensimmäisen opintovuoden keväällä ja suoritin labora- toriotöitä touko-kesäkuun. Toisen lukuvuoden alussa aloin kirjoittamaan tätä raporttia opis- kelujeni ohessa.
Haluan kiittää tutkimusjohtaja Annakaisa Haapasaloa ja hänen tutkimusryhmäänsä, erityisesti ohjaajaani FM Stina Leskelää, tämän opinnäytetyön tekemisen mahdollistamisesta ja kaikesta heidän antamastaan avusta. Stina Leskelä on ollut myös mukana tekemässä opinnäytetyöni laboratorio-osuutta vähäisestä laboratoriotyöskentely- kokemuksestani johtuen. He ovat raottaneet minulle tutkimuksen tekemisen kiinnostavaa maailmaa.
SISÄLLYS
1 JOHDANTO
2 TEOREETTINEN TAUSTA
2.1 Yleistä otsa-ohimolohkorappeumista
2.2 C9orf72-toistojaksomonistuman mekanismit 2.3 LC3
2.4 P62
4.2 NSC-43 solut 3 TUTKIMUSONGELMA
4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 Soluviljely, transfektiot ja autofagian modulaatio 4.2 Proteiinien eristys ja Western blot
4.3 Analyysi ja statistiikka 5 TULOKSET
6 POHDINTA LÄHTEET LIITTEET
LYHENTEET
AD: Alzheimerin tauti
ALS: Amyotrofinen lateraaliskleroosi bvFTD: käytösoireinen otsalohkodementia C9orf72: Chromosome 9 open read frame 72
DPR-proteiini: Dipeptidi toistojakso-proteiini FTD: Otsalohkodementia
FTLD: otsa-ohimolohkorappeuma RNA: ribonukleiinihappo
shRNA: short hairpin RNA
JOHDANTO
Otsalohkodementia on Alzheimerin taudin jälkeen länsimaiden toiseksi yleisin hermorappeumasairaus alle 65-vuotiailla, eli työikäisellä väestöllä (1). Väestön vanhetessa ja elinajanodotteen pidetessä on näiden sairauksien määrä pelkästään lisääntynyt ja odotet- tavissa on, että kehitys jatkuu samansuuntaisena. Taudin diagnoostiikka on haastavaa, sillä sen oireet ja mekanismit risteävät monien muiden hermostollisten sairauksien kanssa, pääl- limmäisenä amyotrofinen lateraaliskleroosi, johon perehdymme myöhemmin tämän tekstin yhteydessä. Eri sairaudet sekoittuvat helposti keskenään tässä luokassa.
Otsalohkodementialle on löydetty monia eri aiheuttajia ja on selvää, ettei se johdu vain yhdestä tekijästä vaan on monen tekijän summa. Niin tau-proteiini kuin TDP-43:kin, jotka molemmat nousevat esille monissa aivojen patologisissa tiloissa, on liitetty tähänkin sairau- teen, samoin kuin perimän muutokset kuten MAPT-geenimutaatiot liittyen tau-patologiaan.
Suurimmaksi yksittäiseksi tekijäksi on kuitenkin hiljattain noussut C9orf72-geenin GGGGCC-toistojaksomonistuma, joka on erityisen yleinen suomalaisissa potilaissa (2).
Myös C9orf72-toistojaksomonistuman aiheuttama patologia on monimuotoinen eikä sen vaikutusreiteistä, normaalien C9orf72-proteiinien toiminnan menetyksestä, toistojakso- monistuman tuottaman RNA:n sakkautumisesta ja sen tuottamien dipeptiditoistojakso- proteiinien sakkaumisesta, tiedetä vielä tarpeeksi. Halusin selvittää toistojaksomonistuman merkitystä solujen autofagiassa, joka on mekanismi tarpeettoman tai haitallisen aineksen hajotukseen solun sisä- tai ulkopuolelta. Oletettavasti autofagia vähentyisi soluissa toistojak- somonistuman seurauksena sen aiheuttamien solun normaalin toiminnan häiriöiden kautta.
Toteutus tehtiin mittaamalla autofagiassa toimivien proteiinien; p62, LC3BI ja LC3BII, tasoja soluissa, joissa C9orf72-toistojaksomonistuman seurauksia mallinnettiin kokeellisesti alentamalla C9orf72:n ilmentymistä. Mittaukset tehtiin Western blot-tekniikalla.
C9orf72:n roolia autofagiassa on jo tutkittu aiemmin useaan otteeseen ja on havaittu niiden välistä korrelaatiota, geenin toiminnan estäminen näyttäisi vähentävän autofagiaa (3, 4, 5, 6). Tässä tutkimuksessa ei kuitenkaan tätä tukevia tuloksia saatu. Testiryhmän arvot eivät
eronneet merkitsevissä määrin kontrolleista. Tutkimuksessa kokeen toistojen määrä kuiten- kin oli alhainen, joka voidaan nähdä tutkimuksen ongelmana. Muilta osin tutkimus oli onnistunut, vaikka hypoteesin mukaisia tuloksia ei saatukaan. Autofagian häiriöitä ei ole otsalohkodementiassa C9orf72-geeniin liittyen tutkittu tarpeeksi, osittain sen takia, että gee- nin merkittävyys taudissa ymmärrettiin vasta 2011, kun sen osoitettiin olevan suuressa osassa otsalohkorappeuma- ja amyotrofinen lateraaliskleroosi-tapauksissa taudinsynnyn taustalla (1, 7). Lisätutkimuksia asian tiimoilta tarvitaan varmuudella.
TEOREETTINEN TAUSTA
Yleistä otsa-ohimolohkorappeumista
Otsalohkodementia (frontotemporal dementia, FTD) on otsa-ohimolohkorappeumasta (fron- totemporal lobar degeneration, FTLD) aiheutuva tauti, joka ilmenee muutoksina käyttäy- tymisessä, toiminnanohjauksessa ja kielellisissä toiminnoissa (8). Se alkaa yleisimmin 45–
65-vuotiailla, mutta niin nuorempia kuin vanhempiakin tapauksia on (9). Sukupuoli-jakau- ma taudilla on neutraali (10). Diagnoosi on vaikeaa, koska oireet usein ovat samankaltaisia muiden hermostollisten sairauksien kanssa.
Otsalohkodementia voidaan jakaa pääasiassa kolmeen alaluokkaan: käytösoireiseen otsa- lohkodementiaan (behavioral variant of frontotemporaldementia, bvFTD), semanttiseen dementiaan (semantic variant primary progressive aphasia, svPPA) ja etenevään sujumat- tomaan afasiaan (non-fluent variant primary progressive aphasia, nfvPPA) (11, 12). Näistä kaksi viimeistä luokitellaan primaarisen etenevän afasian (primary progressive aphasia, PPA) alaluokiksi, jonka kolmas alaluokka on logopeeninen afasia (logopenic variant primary progressive aphasia, lvPPA), joka kuitenkin on yhdistetty vahvemmin Alzheimerin tautiin (Alzheimers disease, AD) (kuva 1) (13). Muita FTD:hen liitettyjä oireyhtymiä ovat FTD-MND- (Frontotemporal Dementia with Motor Neuron Disease), CBD- (Corticobasal Degeneration) ja PSP-oireyhtymät (Progressive Supranuclear Palsy), joiden oireenkuvat ovat hyvin päällekkäisiä (14).
KUVA 1. Otsa-ohimolohkorappeumien jako kliinisiin alatyyppeihin (Remes ym. 2018).
Otsa-ohimolohkorappeumalla on kaksi alaluokkaa: otsalohkodementia ja primaarinen etene- vä afasia, joka jakutuu vielä kolmeen alaluokkaan. Logopeeninen afasia on yhdistetty vahvemmin Alzheimerin tautiin.
Käytökseen vaikuttava otsalohkodementia on kaikista esiintymismuodoista yleisin, Rascovskyn ym. mukaan bvFTD on kyseessä jopa 76% kaikista FTLD tapauksista (12).
BvFTD oireina esiintyy käytöksen hallitsemattomuutta, apaattisuutta, sympatian ja empatian puutetta, pakonomaisesti toistuvaa käytöstä, suun liikkeiden ja ruokailun häiriöitä sekä muis- tin ja paikkasidonnaisen hahmotuksen huonontumista. Toisessa oireryhmässä, semanttisessa
dementiassa, tyypillisiä oireita ovat sanojen ja asioiden merkitysten menetys ja lukihäiriön tapaiset oireet. Asioiden toistaminen ja vähentynyt puheen tuotto eivät kuulu tähän ja ovat erottavia tekijöitä verraten seuraavaan. Kolmannessa oireryhmässä, etenevässä sujumat- tomassa afasiassa, esiintyy puheen sujuvuuden heikentymistä sekä apraksiaa eli puheen motorisen järjestelmän ongelmia ja pidempien lauseiden ymmärtämättömyyttä, mutta ei yksittäisten sanojen ja objektien ymmärtämättömyyttä mikä puolestaan erottaa sitä edellises- tä. Taudin edetessä ja vaikuttaessa suurempaan alueeseen otsa- ja ohimolohkoissa eri taudin- kuvat voivat alkaa sekoittua keskenään. Taudin edetessä myös kognitiiviset kyvyt voivat heikentyä ja potilailla saattaa esiintyä liikehermoihin liittyviä ongelmia. Tauti johtaa kuole- maan tyypillisesti noin kahdeksan vuoden päästä sairauden puhkeamisesta. Sairauden loppu- puolella syöminen, liikkuminen ja nieleminen voivat aiheuttaa hankaluuksia ja lopullinen kuolinsyy voikin olla heikentyneelle potilaalle jokin toinen tauti, kuten esimerkiksi keuhkokuume (8).
Aikaisemmin mainittujen kolmen kliinisen fenotyypin lisäksi otsalohkodementian kaltaisia oireita tavataan myös amyotrofista lateraaliskleroosia (amyotrophic lateral sclerosis, ALS) sairastavissa potilaissa. ALS:ssa aivoissa ja selkäytimessä kulkevat sekä ylemmät että alem- mat liikehermot rappeutuvat (15). Oireet tyypillisesti alkavat yhdestä raajasta ilmeten lihasten surkastumisena ja heikkoutena (16). Jalkapöydän laahaaminen kävellessä on jaloissa helposti tunnistettava merkki mahdollisesta sairaudesta. Oireiden alkaminen nielun alueelta on noin puolet raajoista alkavia oireita harvinaisempaa (17). Tyypillisiä ensioireita nielun alueella ovat puhumisen ja nielemisen vaikeudet. Tauti etenee ajan myötä ja muuttuu vakavammaksi vaikuttaen suurimpaan osaan lihaksista. Potilaat kuolevat tyypillisesti noin 3–5 vuoden sisällä taudin puhkeamisesta pallean toiminnan pettämiseen liittyvän hengitys- elimistön halvauksen seurauksena.
Vaikka FTD:ssä ja ALS:ssa keskushermoston eri osa-alueet ovat vaurioituneet, ovat sai- raudet kuitenkin vahvasti linkittyneet toisiinsa. ALS-potilaista Noin 5–10%:lla on myös kliinisesti todennettu FTD diagnoosi, yleisimpänä käytökseen vaikuttava muoto. Lisäksi 50%:lla ALS-potilaista on otsalohkodementialle ominaisia kognitiivisia ja käytöksellisiä oireita. Toisinpäin FTD-potilaista 12,5% diagnosoidaan ALS:a sairastaviksi ja 40% kärsii
liikehermoihin liittyvistä oireista. Joissakin tapauksissa diagnoosien tekemistä vaikeuttaa potilaiden kykenemättömyys kommunikoida (8, 18).
FTD:a ja ALS:a esiintyy sekä satunnaisena että perinnöllisenä muotona. Noin 5% ALS tapauksista näyttää olevan perinnöllisiä, FTD:ssä luku on 30–50%:n välillä niin, että suvussa on ainakin yksi taudin sairastaja, ja 10-15%:lla potilaista on selvästi nähtävä sukurasite (19, 20). Periytymismuodoltaan autosomaalisesti dominoiva, 9p21-lokuksessa sijaitsevassa, C9orf72-geenissä esiintyvä GGGGCC-heksanukleotiditoistojaksomonistuma on yleisin ge- neettinen syy FTD:n ja ALS:n taustalla (21). Näiden kahden taudin osittainen limittäisyys taudinkuvassa näyttäisi olevan toistojaksomonistuman aiheuttamaa. Suurimmalla osalla terveistä yksilöistä on alle 12 toistojaksomonistumaa, kun taas toistojaksomonistuman kan- tajilla määrät ovat yleisesti satoja taikka tuhansia (22, 23, 24). Karkeana viitearvona patologiselle määrälle on käytetty 30, mutta mitään virallista arvoa ei ole olemassa (25, 26, 27).
Suomalaisessa populaatiossa toistojaksomonistuman merkitys näyttäisi olevan erityisen voimakas Rentonin ym. mukaan. Suomalaisista perinnöllisistä ALS-tapauksista 46,4%:lla oli patologinen määrä toistojaksomonistumaa, kun taas muussa eurooppalaisperäisessä väes- tössä sama luku oli 38,1%. Samassa tutkimuksessa todettiin, että yhteensä suomalaisista perinnöllisistä sekä spontaaneista ALS-potilaista 28,1%:lla oli patologinen määrä toisto- jakso-monistumaa, kun suomalaisessa kontrolliryhmässä sitä oli vain 0,4%:lla (28). Tästä ei oltu tehty vertailua muun eurooppalaisperäisen väestön kanssa.
C9orf72-toistojaksomonistuman mekanismit
On esitetty kolme tapaa, joilla C9orf72-toistojaksomonistuma aiheuttaa patologisia muutok- sia soluissa: C9orf72-geenin koodaamien proteiinien ilmentymisen väheneminen ja siitä johtuva niiden normaalin toiminnan menetys (haploinsuffisienssi), RNA-kertymien muo- dostuminen toistojakso-RNA:sta ja proteiinikertymien muodostuminen toistojaksojen koo- daamista dipeptidi toistojaksoproteiineista (dipeptide repeat proteins, DPR-proteiinit). Vii- me aikaisissa tutkimuksissa on pyritty selvittämään, mikä kolmesta mekanismista on
kaikista haitallisin soluille, mutta tulokset ovat olleet ristiriitaisia. Todennäköisesti yksi mekanismi ei poissulje toista missään tapauksessa, vaan tautipatogeneesin on oletettu aiheutuvan kaikkien mekanismien yhteisvaikutuksesta.
C9orf72-geeni voidaan transkriptoida kolmella eri tavalla lähetti-RNA:iksi, jotka tuottavat kahta eri proteiinimuotoa: isoformi A:ta ja B:tä (Kuva 2). Transkriptivarianteista kahdessa toistojaksot sijoittuvat geenin ensimmäisen intronin alueelle ja yhdessä promoottorin alueel- le. Transkriptiotuotteiden määrän on todettu olevan alhaisempi toistojaksomonistumaa kantavilla henkilöillä verrattuna muihin (7). Toistojaksot promoottorialueella eivät siirry esi- lähetti-RNA:han, mutta ne näyttävät silti vaikuttavan proteiinien tuotantoon. Normaalisti intronin alueella olevat toistojaksot silmukoidaan pois ennen translaatiota, mutta toistojakso- monistuma tapauksissa DPR-proteiinien muodostuminen toistojaksoa sisältävästä lähetti- RNA:sta indikoi, ettei näin pääse tapahtumaan. Näiden muodostuneiden DPR-proteiinien on osoitettu kertyvän ja sakkautuvan soluihin ja ne voivat myös olla toksisia soluille (29, 30, 31). DPR-proteiineja muodostuu viittä eri tyyppiä, kummastakin DNA:n juosteesta kolmea erilaista, lukukehyksen muutoksen mukaan; koodaavasta juosteesta Poly-GR, Poly-GP ja Poly-GA ja mallijuosteesta Poly-PR, Poly-GP ja Poly-PA, ja näistä toksisimmat ovat Poly- GR ja Poly-PR (32). Nämä kaksi taudille altistavinta DPR-proteiinia reagoivat yksinkertaisia alueita (low complexity domain, LCD) sisältävien proteiinien kanssa estäen niiden normaalin toiminnan solun rakenteiden osana (33). Tällä on haitallisia vaikutuksia muun muassa lähetti-RNA:n (mRNA) translaatioon sekä tuman ja soluliman väliseen kuljetukseen (nucleocytoplasmic transport, NCT) (34). DPR-proteiinit transloidaan toistojaksoihin liitty- vällä ATG-riippumattomalla translaatiolla (repeat-associated non-ATG translation, RAN- translation), sillä niissä ei ole aloituskodonia niiden sijainnin takia. Kaiken kaikkiaan DPR- patologia ja siihen liittyvät mekanismit näyttävät olevan sairauksien synnyn kannalta erittäin merkittäviä tekijöitä (35). TAR DNA:han liitty-vän proteiini 43:n (TAR DNA-binding protein, TDP-43) sakkautuminen on yhdistetty van-kasti FTD:n sekä ALS:n syntyyn ja sen katsotaan olevan eittämätön linkki sairauksien välillä, kuten myös sairauksien synnyn avaintekijä (36, 37). TDP-43 on normaalisti transkriptio- ja silmukointitekijä ja TDP-43:n sakkautumiseen liitetty geeni on progranuliini (GRN). C9orf72-toistojaksomonistumaan liittyvän FTD:n ja ALS:n syihin luetaan myös kummastakin DNA:n juosteesta syntyvä toistojaksomonistuman sisältävä RNA, joka kerääntyy laajasti keskushermoston solujen tumiin (RNA-foci) sitoen itseensä RNA:han sitoutuvia proteiineja (RNA-binding protein,
RBP). RNA:ta sitovien proteiinien normaali tehtävä on säädellä tuotetun RNA:n silmukointia ja luentaa ja siksi näiden proteiinien kertyminen toistojaksoa sisältävään RNA:han voi aiheuttaa häiriöitä muiden geenien silmu-koinnissa ja luennassa. Tau-proteiini on myös tunnistettu FTD:n syntyyn liittyvänä tekijänä, ei kuitenkaan ALS:n. Proteiinin normaali tehtävä liittyy mikrotubuluksien keräämiseen, mitä kautta solun sisäiseen kuljetukseen sekä solun muotoon. FTD:ssa se sakkautuu fosfory-loituna hermosoluihin, kun sen geenissä, 17q21-lokuksessa, on mutaatio. Se ei siis liity C9orf72-toistojakso- monistumaan suoraan (9).
KUVA 2. C9orf72-geenin transkriptio ja translaatio (Balendra ja Isaacs 2018).
C9orf72-geenin eri transkriptimuodot (kolme kappaletta kuvan keskellä) ja translaatio- tuotteet (kaksi kappaletta edellisistä oikealle), joita ovat pitkä (isoformi A) ja lyhyt (isoformi B) muoto.
C9orf72-proteiinien on osoitettu olevan yhteydessä Rab-proteiinien aktivaatioon, jotka puolestaan ovat olennainen osa vesikkelien kautta tapahtuvaa proteiinien kuljetusta. Erityi- sesti C9orf72-proteiini isoformi A:n on näytetty liittyvän autofagiavälitteisen proteiinien hajotusmekanismin säätelyyn (4). Autofagia on evolutiivisesti ikivanha järjestelmä, jossa solu hajottaa sille tarpeettomia tai haitallisia proteiineja tai jopa kokonaisia soluelimiä. Se on keskeinen solujen homeostaasiin liittyvä mekanismi ja sen häiriöiden on osoitettu
liittyvän voimakkaasti hermostoa rappeuttaviin sairauksiin, kuten FTD:aan. Autofagiassa solussa muodostuu kaksoiskalvorakenteinen vesikkeli, autofagosomi, jonka sisälle eristetään hajotettavia proteiineja ja soluorganelleja sekä sakkautuneita tai väärinlaskos- tuneita proteiineja. Endosomit, jotka sisältävät solun ulkopuolelta endosytoosilla eristettyjä hajotukseen tulevia materiaaleja, voivat myös yhdistyä autofagosomin kanssa muodostaen amfisomin, jonka elinkaari on yhdistymisen jälkeen samanlainen aiemmin mainitun autofogosomin kanssa (38). Autofagian seuraavassa vaiheessa lysosomi yhdistyy autofago- somiin, jonka jälkeen autofagosomia kutsutaan autolysosomiksi. Lysosomi vapauttaa sen sisään happamat hydrolaasit, jotka hajottavat materiaalin kaksoiskalvorakenteen sisä- puolelta. Autofagosomit ilmentävät kalvollaan light chain 3-proteiineja (LC3), jotka hajoavat lysosomin vaikutuksesta myöhemmässä vaiheessa. Toinen autofagiassa keskeinen proteiini, p62-proteiini, sitoutuu hajotettaviin proteiineihin ja ohjaa ne autofagosomiin hajo- tusta varten, jolloin se itse hajotetaan samalla. Näiden kahden proteiinin tasojen muutoksia seuraamalla voimme tutkia autofagian eri vaiheita ja aktiivisuutta (39).
LC3
LC3-proteiineista on ihmisellä eri muotoja; LC3A, LC3B ja LC3C, joista tutkimuk- sessamme tutkimme LC3B-proteiineja. LC3B-proteiineja on kahta tyyppiä; LC3B-I ja LC3B-II. LC3B-I on LC3B-II:n esimuoto, joka sijaitsee solun solulimassa. Kun autofagia käynnistyy, muutetaan osa LC3B-I:stä LC3B-II:ksi, joka puolestaan kiinnittyy auto- fagosomaaliseen kalvorakenteeseen. Proteiini kiinnittyy sekä ulompaan että sisempään kalvoon ja autofagosomin hajotessa tuhoutuvat kalvoon kiinnittyneet proteiinit myös. Näin LC3B-II:n määrä ja LC3B-II/ LC3B-I suhde korreloivat mittauksen hetkiseen autofago- somien määrään ja täten autofagian sen hetkiseen aktiivisuuteen. LC3B-I:n määrä pysyy lähes vakiona käsittelystä riippumatta, kun LC3B-II:n määrä kasvaa autofagian lisääntyessä (40).
P62
P62-proteiinia käytetään paljon autofagian tutkimisessa. Sillä voidaan tutkia niin autofagian lisääntymistä kuin vähenemistäkin. P62/sequestosome 1 (p62/SQSTM1) tunnistaa kasau- tuneita proteiineja, joihin ubikitiini on jo liittynyt, ohjatakseen ne autofagosomiin
hajoitettavaksi (41). Kun autofagia ei toimi tai on hidastunut, kerääntyy p62 näiden proteiini- sakkaumien joukkoon. Normaalitapauksessa, jossa autofagia toimii, tunnistaa p62 LC3B- II:n ja liittyy autofagosomiin, johon puolestaan liittyy lysosomi hajottaen autofagosomin sisällön mukaan lukien p62:n (39). Kun autofagia siis lisääntyy, on solussa havaittavissa vähemmän p62-proteiinia ja autofagian vähentyessä päinvastoin enemmän.
NSC-34 solut
Toteutimme tutkimuksen NSC-43 soluissa. Kyseessä on 1990-luvulla kehitetty solulinja, jossa on yhdistetty neuroblastoomasoluja liikehermorikastettujen primaaristen embryonisten selkäydinsolujen kanssa. Tuloksena on saatu hyvin primaaristen liikehermojen toimintaa kuvaava, jakautuva solulinja, jota nykypäivänä käytetään laajasti niin FTD:n kuin ALS:nkin tutkimuksessa. Solulinja ilmentää useita liikehermosolujen ominaisuuksia, kuten asetyyli- koliinitransferaasientsyymin ja asetyylikoliinin tuotantoa. Soluissa on myös jännitteen muutoksiin reagoivia ionikanavia ja ne voivat tuottaa hermoimpulsseja (42).
TUTKIMUSTEHTÄVÄ
Tavoitteenani oli tutkia C9orf72-geenin tuottamien proteiinien normaalitoimintaa,erityisesti autofagiassa, ja tämän toiminnan mahdollista menetystä toistojaksomonistuman seurauk- sena. Tutkimusmallina käytimme NSC-34 hiiren liikehermosolulinjaa, jota on usein käytetty samankaltaisissa tutkimuksissa.
Soluviljelmissä mallinsimme C9orf72-toistojaksomonistuman aiheuttamaa C9orf72-proteii- nien toiminnanmenetystä vähentämällä C9orf72-geenin ilmentymistä RNA-interferenssi- tekniikalla käyttämällä shRNA:ta (short hairpin RNA).
Käsittelimme soluviljelmiä erilaisilla autofagiaa muokkaavilla yhdisteillä, jolloin pystyim- me tutkia eri vaiheita autofagisessa hajotusreitissä ja tunnistaa sen mahdollisia häiriöitä.
Tutkimusmenetelmänä käytimme Western blot-menetelmää. Western blot-menetelmän avulla oli mahdollista mitata autofagiassa toimivien proteiinien tasoja ja siten tunnistaa mahdollisia eroja kontrollisolujen ja C9orf72-shRNA käsiteltyjen solujen välillä.
AINEISTO JA MENETELMÄT
Soluviljely, transfektiot ja autofagian modulaatio
NSC-34 (Neuroblastoma-spinal cord-34) soluja kasvatettiin DMEM-mediumissa (Dulbecco's Modified Eagle Medium-medium), johon oli lisätty 10% naudan alkion seerumia (fetal bovine serum, FBS), 2 mM L-glutamiinia, 100 U/ml penisilliiniä ja 100 µg/ml streptomysiiniä, +37ºC.ssa, 5 % CO2 sisältävässä soluinkubaattorissa. Soluviljelmät jaettiin kaksi kertaa viikossa, jotta solujakautuminen pääsi jatkumaan estotta.
C9orf72-proteiinien toiminnanmenetystä tutkittiin vähentämällä C9orf72-geenin ilmentymistä RNA-interferenssitekniikalla. Solujen transfektiossa käytettiin 4 µg kontrolli- tai C9orf72-shRNA:n sisältävää plasmidi-DNA:ta ja 10µl:a Lipofectamiini reagenssia (Invitrogen) tuotteen ohjeiden mukaisesti. Soluille vaihdettiin tuore medium noin 24 tuntia transfektion jälkeen. Solunäytteet kerättiin 72 tuntia transfektioiden jälkeen analyysejä varten.
Autofagian aktivaatiossa käytettiin DMEM-mediumia ilman seerumia eli seerumistar- vaatiota yön yli kestävällä käsittelyllä, tämä aktivoi autofagiaa. Osa näytteistä käsiteltiin vielä seuraavana päivänä bafilomycin A1 (BafA1) reagenssilla, joka inhiboi autofagosomin ja lysosomin yhdistymistä ja siten estää autofagian viimeisintä vaihetta. Käsittelemällä soluja vain seerumistarvaatiolla ja yhdistettynä BafA1-käsittelyyn, voitiin tunnistaa mahdollisia häiriöitä niin autofagian aktivaatiossa kuin myös autofagian myöhemmissä vaiheissa.
Proteiinien eristys ja Western blot
Proteiinit eristettiin solukuopilta raaputtamalla ne 1% natriumlauryylisulfaatti (SDS)- puskuriin (10mM Tris-HCL, 2mM EDTA), johon lisätään 1:100 proteaasi-ja fosfataasi- inhibiittoreita. Proteiinikonsentraatiot mitattiin Pierce BCA protein Assay -kitillä (Thermo Scientific) ja 10-40 µg proteiinia ajettiin natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidi (SDS- PAGE)-geeleille (NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris midi, Thermo Scientific). Proteiinit siirrostettiin PVDF-membraaneille (Bio-Rad, Trans-Blot® Turbo™ Midi PVDF) käyttämällä Trans-Blot® Turbo™ siirrostus systeemiä (Bio-Rad, 30 min ohjelma).
Siirrostuksen jälkeen epäspesifiset sitoutumiskohdat peitettiin membraanista 1 tunnin inkubaatiolla huoneenlämmössä naudan seerumin albumiinilla (BSA) tai 5% rasvattomalla maidolla 1x Tris-suolaliuoksessa, johon oli lisätty 0.1% Tween 20 (TBST-puskuri).
Spesifiset proteiinit tunnistettiin inkuboimalla membraania kyseistä proteiinia vastaan kasvatetulla primäärivasta-aineella yön yli +4°C:ssa ja lisäämällä piparjuuriperoksidaasi (HRP)-linkattu sekundäärinen vasta-aine (ECL™, anti-hiiri IgG tai anti-kani IgG, GE Healthcare) 1 tunnin ajaksi huoneenlämmössä. Tämän jälkeen proteiinit tunnistettiin lisäämällä kemiluminesoiva substraatti (ECL; Amersham bioscience, GE Healthcare) ja kuvantamalla membraani ChemiDoc™ XRS+ System -kuvantamislaitteella (Bio-Rad).
Proteiinien intensiteetit kvantitoitiin Image Lab™ -ohjelmistolla (BioRad) ja tulokset normalisoitiin β-aktiini vertailuproteiinitasoihin. Membraanit stripattiin vasta-aineista strippauspuskurilla (Thermo Scientific) 10 min huoneenlämmössä. Seuraavia primääri vasta-aineita käytettiin: anti-C9orf72 (1:500; Proteintech, 22637-1-AP); anti-SQSTM1/p62 (1:1000; cell signaling technology (CST), 5114); anti-LC3B (1:3000; Abcam, ab51520);
anti-beta-aktiini (1:1000, Abcam, ab8226) ja anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (1:5000, Abcam, ab8245).
Analyysi ja statistiikka
Tulokset analysoitiin Excelissä proteiini kerrallaan. Aluksi normalisoitiin proteiinien Western blotissa saadut intensiteettiarvot β-aktiinin vastaavilla arvoilla. Vertailuproteiinina olisi voitu käyttää myös GAPDH:ta, mutta päädyttiin käyttämään hyvänä pidettyä β-aktiinia.
Tehtiin myös LC3BII/LC3BI vertailu. Kun arvot oli normalisoitu otettiin normaalikontrol- lien keskiarvo, jolla jaettiin jokainen normalisoitu arvo ja kun se kerrottiin sadalla saatiin jokaisen kokeen prosenttiarvo suhteessa normaalikontrollien keskiarvoon. Nämä prosentti-
luvut sitten yhdistettiin jokaisesta eri kokeesta (n=3) ja saatiin prosenttilukujen keskiarvo.
Samoin prosenttiluvuista laskettiin hajonta keskiarvon keskivirheenä (SEM) jokaisen koetyypin sisällä. Prosenttien keskiarvoluvuista tehtiin tuloksissa esitetyt taulukot (Kuva 3, 4).
Edellä kuvattu analyysi tehtiin kummallekin kokeelle, jonka jälkeen tulokset yhdistettiin.
Yhdistetyistä tuloksista tehtiin vasta-aineiden koekohtaisista tuloksista taas pylväsdiagrammit (Kuva 5). Seuraavaksi keskityttiin tulosten statistiikkaan Graphpad Prism 8-ohjelmalla, jossa vertailtiin tuloksia toisiinsa ja ratkaistiin ovatko tulokset merkitseviä.
Tähän käytettiin one-way ANOVA-analyysia ja jatkotutkimuksena Newman-Keuls- metodia. Merkitsevyyden raja-arvo oli 0,05.
TULOKSET
Kasvatimme kaksi soluviljelmää, nimiltään C9_105 (Kuva 3) ja C9_107 (Kuva 4), edellä mainitussa järjestyksessä. Molemmat kokeet onnistuivat ongelmitta ja saimme vertailu- kelpoisia tuloksia. Yhdistetyissä tuloksissa (Kuva 5) näkyy kuinka C9orf72-proteiini tasot ovat laskeneet merkitsevästi infektoiduissa soluissa. Emme saaneet näkyville kuitenkaan merkitseviä eroja muissa proteiinien määrien mittauksissa kontrolli- ja koeryhmän välille.
Jokaisesta käsittelystä kasvatettiin kolme soluviljelmää kummassakin kokeessa, joista esitetyt tulokset saatiin. Yhdistetyissä tuloksissa havaintoyksiköiden määrä on siis kuusi jokaista proteiinia kohti.
KUVA 3. C9_105 kokeen tulokset.
Kohdassa A) on Western blot-alueet rajattuna; vasemmalle merkitty proteiinimarkkerin molekyylipaino kilodaltoneina, yläpuolelle käsittely ja oikealle puolelle vasta-aine. Pylväs- diagrammeissa on yhdistetyt arvot eri proteiineilta normalisoituna β-aktiinilla, pois lukien
F), jossa on LC3BII normalisoituna LC3BI:llä, eri käsittelyistä. Hajonta (SEM) on merkitty pylväiden päälle viivalla ja käsittelyt on merkitty diagrammien alle.
KUVA 4. C9_107 kokeen tulokset.
Kohdassa A) on Western blot-alueet rajattuna; vasemmalle merkitty proteiinimarkkerin molekyylipaino kilodaltoneina, yläpuolelle käsittely ja oikealle puolelle vasta-aine. Pylväs- diagrammeissa on yhdistetyt arvot eri proteiineilta normalisoituna β-aktiinilla, pois lukien F), jossa on LC3BII normalisoituna LC3BI:llä, eri käsittelyistä. Hajonta (SEM) on merkitty pylväiden päälle viivalla ja käsittelyt on merkitty diagrammien alle.
KUVA 5. C9_105 ja C9_107 kokeiden yhdistetyt tulokset.
Kokeiden tulokset esitetty yhdistettynä. Tilastollisesti merkitsevät erot on merkitty tähti- merkinnällä (p < 0.05). Kohdassa A) on Western blot-alueet rajattuna; vasemmalle merkitty proteii-nimarkkerin molekyylipaino kilodaltoneina, yläpuolelle käsittely ja oikealle puolelle vasta-aine. Pylväsdiagrammeissa on yhdistetyt arvot eri proteiineilta normalisoituna β- aktiinilla, pois lukien F), jossa on LC3BII normalisoituna LC3BI:llä, eri käsittelyistä.
Hajonta (SEM) on merkitty pylväiden päälle viivalla ja käsittelyt on merkitty diagrammien alle.
POHDINTA
Kahden kokeen yhdistetyistä tuloksista nähdään, että C9orf72-proteiinin tasot ovat laskeneet merkitsevästi C9orf72-shRNA-transfektoiduissa soluissa (Kuva 5-C). Tämä todistaa, että koejärjestelyt ovat onnistuneet ja että transfektio sekä shRNA toimi. Muita merkitseviä eroja ei ryhmien välillä näkynyt, mikä viittaa siihen, ettei haploinsuffienssilla ole vaikutusta aina- kaan testattuihin solujen autofagian elementteihin. LC3BII-ryhmässä näyttäisi olevan selviä trendejä, joissa proteiinin määrät olisivat vähentyneet shRNA:lla käsitellyissä soluissa, joita ei kuitenkaan voida raportoida tuloksina (Kuva 5-E).
Toteutimme kokeen vain kaksi kertaa, vaikka normaalisti vähintään kolme toistokertaa olisi toivottu määrä. Jos koe olisi toistettu vielä kerran enemmän, tuloksissa olisi mahdollisesti voinut näkyä useampia merkitseviä eroja. Silmällä katsottaessa on nähtävissä kuvaajissa iso- jakin eroja, jotka eivät kuitenkaan ole yltäneet merkitseviksi tilastollisissa analyyseissä.
Esimerkiksi LC3BII Ctrl shRNA normal-arvo suhteessa Ctrl shRNA ST-arvoon toden- näköisesti olisi merkitsevä lukuisemmilla kokeilla (Kuva 5-E). Tässä olisi siis paikka uudel- le, laajemmalle, tutkimukselle samasta aiheesta, mahdollisesti jopa aivan samoilla järjeste- lyillä, mutta lisätyllä kokeen toistojen määrällä.
Johtopäätöksenä voidaan siis todeta, että koe oli onnistunut toteutuksen kannalta, mutta koetta ei toistettu tarpeeksi montaa kertaa. Tämä ei ollut niinkään suunnittelun puutetta vaan aikataulullinen ongelma. Merkitseviä eroja ei ollut kontrolli- ja testiryhmän välillä autofa- giaan liittyvissä tekijöissä. Jatkotutkimuksia asian tiimoilta kaivataan, sillä useat tutkimukset viittaavat siihen, että C9orf72-geenin toistojaksomonistuman aiheuttamalla haploin- suffienssilla olisi vaikutuksia autofagiaan, vaikkei sitä tässä tutkimuksessa voitukaan todistaa.
LÄHTEET
1. Neary D, Snowden JS, Gustafson L, et al. Frontotemporal lobar degeneration: a consensus on clinical diagnostic criteria. Neurology. 1998;51:1546–1554.
2. Weishaupt JH, Hyman T, Dikic I. Common molecular pathways in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Trends Mol Med. 2016;22(9):769-783.
3. Corbier C, Sellier C. C9ORF72 is a GDP/GTP exchange factor for Rab8 and Rab39 and regulates autophagy. Small GTPases. 2017;8(3):181-186.
4. Webster CP, Smith EF, Bauer CS, et al. The C9orf72 protein interacts with Rab1a and the ULK1 complex to regulate initiation of autophagy. EMBO J. 2016;35(15):1656-1676.
5. Sellier C, Campanari ML, Julie Corbier C, et al. Loss of C9ORF72 impairs autophagy and synergizes with polyQ ataxin-2 to induce motor neuron dysfunction and cell death.
EMBO J. 2016;35(12):1276-1297.
6. Leskela S, Huber N, Rostalski H, et al. C9orf72 proteins regulate autophagy and undergo autophagosomal or proteasomal degradation in a cell type-dependent manner.
Cells. 2019;8(10):1233.
7. Balendra R, Isaacs AM. C9orf72-mediated ALS and FTD: Multiple pathways to disease.
Nat Rev Neurol. 2018;14(9):544-558.
8. Bang J, Spina S, Miller BL. Frontotemporal dementia. Lancet. 2015;386(10004):1672- 1682.
9. Neary D, Snowden J, Mann D. Frontotemporal dementia. Lancet Neurol.
2005;4(11):771-780.
10. Hogan DB, Jette N, Fiest KM, et al. The prevalence and incidence of frontotemporal dementia: A systematic review. Can J Neurol Sci. 2016;43 Suppl 1:S96-S109.
11. Gorno-Tempini ML, Hillis AE, Weintraub S, et al. Classification of primary progressive aphasia and its variants. Neurology. 2011;76(11):1006-1014.
12. Rascovsky K, Hodges JR, Knopman D, et al. Sensitivity of revised diagnostic criteria for the behavioural variant of frontotemporal dementia. Brain. 2011;134(Pt 9):2456-2477.
13. Mesulam M, Wicklund A, Johnson N, et al. Alzheimer and frontotemporal pathology in subsets of primary progressive aphasia. Ann Neurol. 2008;63(6):709-719.
14. Olney NT, Spina S, Miller BL. Frontotemporal dementia. Neurol Clin. 2017;35(2):339- 374.
15. Brown RH, Al-Chalabi A. Amyotrophic lateral sclerosis. N Engl J Med.
2017;377(16):1602.
16. Andersen PM, Abrahams S, et al. EFNS guidelines on the clinical management of amyotrophic lateral sclerosis (MALS)--revised report of an EFNS task force. Eur J Neurol.
2012;19(3):360-375.
17. Swinnen B, Robberecht W. The phenotypic variability of amyotrophic lateral sclerosis.
Nat Rev Neurol. 2014;10(11):661-670.
18. Burrell JR, Kiernan MC, Vucic S, Hodges JR. Motor neuron dysfunction in frontotemporal dementia. Brain. 2011;134(Pt 9):2582-2594.
19. Goldman JS, Farmer JM, Wood EM, et al. Comparison of family histories in FTLD subtypes and related tauopathies. Neurology. 2005;65(11):1817-1819.
20. Rohrer JD, Guerreiro R, Vandrovcova J, et al. The heritability and genetics of frontotemporal lobar degeneration. Neurology. 2009;73(18):1451-1456
21. DeJesus-Hernandez M, Mackenzie IR, Boeve BF, et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 2011;72(2):245-256.
22. Rutherford NJ, Heckman MG, Dejesus-Hernandez M, et al. Length of normal alleles of C9ORF72 GGGGCC repeat do not influence disease phenotype. Neurobiol Aging.
2012;33(12):2950.e-2950.e7.
23. Harms MB, Cady J, Zaidman C, et al. Lack of C9ORF72 coding mutations supports a gain of function for repeat expansions in amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Aging.
2013;34(9):2234.e1-2234.e19.
24. van der Zee J, Gijselinck I, Dillen L, et al. A pan-european study of the C9orf72 repeat associated with FTLD: Geographic prevalence, genomic instability, and intermediate repeats. Hum Mutat. 2013;34(2):363-373.
25. Beck J, Poulter M, Hensman D, et al. Large C9orf72 hexanucleotide repeat expansions are seen in multiple neurodegenerative syndromes and are more frequent than expected in the UK population. Am J Hum Genet. 2013;92(3):345-353.
26. Suh E, Lee EB, Neal D, et al. Semi-automated quantification of C9orf72 expansion size reveals inverse correlation between hexanucleotide repeat number and disease duration in frontotemporal degeneration. Acta Neuropathol. 2015;130(3):363-372.
27. van Blitterswijk M, DeJesus-Hernandez M, Niemantsverdriet E, et al. Association between repeat sizes and clinical and pathological characteristics in carriers of C9ORF72 repeat expansions (xpansize-72): A cross-sectional cohort study. Lancet Neurol.
2013;12(10):978-988.
28. Renton AE, Majounie E, Waite A, et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 2011;72(2):257- 268.
29. Mann DM, Rollinson S, Robinson A, et al. Dipeptide repeat proteins are present in the p62 positive inclusions in patients with frontotemporal lobar degeneration and motor neurone disease associated with expansions in C9ORF72. Acta Neuropathol Commun.
2013;1:68.
30. Gendron TF, Bieniek KF, Zhang YJ, et al. Antisense transcripts of the expanded C9ORF72 hexanucleotide repeat form nuclear RNA foci and undergo repeat-associated non-ATG translation in c9FTD/ALS. Acta Neuropathol. 2013;126(6):829-844.
31. Zu T, Liu Y, Banez-Coronel M, et al. RAN proteins and RNA foci from antisense transcripts in C9ORF72 ALS and frontotemporal dementia. Proc Natl Acad Sci U S A.
2013;110(51):4968.
32. Wen X, Tan W, Westergard T, et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 2014;84(6):1213-1225.
33. Lee KH, Zhang P, Kim HJ, et al. C9orf72 dipeptide repeats impair the assembly, dynamics, and function of membrane-less organelles. Cell. 2016;167(3):774-788.e17.
34. Zhang K, Daigle JG, Cunningham KM, et al. Stress granule assembly disrupts nucleocytoplasmic transport. Cell. 2018;173(4):958-971.e17.
35. Tran H, Almeida S, Moore J, et al. Differential toxicity of nuclear RNA foci versus dipeptide repeat proteins in a drosophila model of C9ORF72 FTD/ALS. Neuron.
2015;87(6):1207-1214.
36. Neumann M, Sampathu DM, Kwong LK, et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science.
2006;314(5796):130-133.
37. Arai T, Hasegawa M, Akiyama H, et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochem Biophys Res Commun. 2006;351(3):602-611.
38. Gordon PB, Seglen PO. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 1988;151(1):40-47.
39. Liu WJ, Ye L, Huang WF, et al. P62 links the autophagy pathway and the ubiqutin- proteasome system upon ubiquitinated protein degradation. Cell Mol Biol Lett. 2016;21:29
40. Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J.
2000;19(21):5720-5728.
41. Lamark T, Kirkin V, Dikic I, Johansen T. NBR1 and p62 as cargo receptors for selective autophagy of ubiquitinated targets. Cell Cycle. 2009;8(13):1986-1990.
42. Cashman NR, Durham HD, Blusztajn JK, et al. Neuroblastoma x spinal cord (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons. Dev Dyn. 1992;194(3):209-221.
LIITTEET
Kuva 1. Remes AM, Haanpää RM, Suhonen NM, et al. Otsalohkodementia – salakavala muistisairaus. Lääkärilehti. 2018;73:37-43.
Kuva 2. Balendra R, Isaacs AM. C9orf72-mediated ALS and FTD: Multiple pathways to disease. Nat Rev Neurol. 2018;14(9):544-558.
