MAATILAPÖLYN KERÄYSMENETELMÄT JA PÖLYN VAIKUTUKSET KEUHKOEPITEELIMALLISSA
Tarleena Tossavainen Maatilapölyn keräysmenetelmät ja pölyn vaikutukset keuhkoepiteelimallissa Pro Gradu -tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, Ympäristö- ja biotieteiden laitos Helmikuu 2019
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristö- ja biotieteiden laitos, Ympäristötieteen pääaine
Tarleena Tossavainen: Maatilapölyn keräysmenetelmät ja pölyn vaikutukset keuhkoepiteelimallissa
Pro Gradu -tutkielma 54 sivua, 1 liite (2 sivua)
Tutkielman ohjaajat: Marjut Roponen (apulaisprofessori, FaT), Maria-Viola Martikainen (FT) Helmikuu 2019
___________________________________________________________________________
avainsanat: maatilapöly, pölynkeräys, näytteenotto, allergia, astma, yhteiskasvatusmenetelmä TIIVISTELMÄ
Lapsuusiän astma ja allergiat ovat suuri terveysongelma teollistuneissa maissa ja kasvava ongelma kehittyvissä maissa. Elintason nousu ja lisääntynyt hygienia ovat osasyy allergisten sairauksien lisääntymiseen. Kehittyneet elinolosuhteet vähentävät lasten immuunipuolustuksen mikrobiologisia haasteita ja näin ihmisen immuunijärjestelmä ei koulutu entiseen tapaan.
Samaan aikaan allergioiden ja astman lisääntyessä, maatiloilla asuvilla lapsilla on havaittu vähemmän astmaa, heinänuhaa ja allergioita verrattuna lapsiin, jotka elävät kaupunkiympäristössä. Suojaaviksi tekijöiksi on havaittu muun muassa mikrobirikas navettaympäristö ja prosessoimattoman maidon juonti. Suojaavan vaikutuksen on havaittu toimivan parhaiten, kun altistuminen tapahtuu raskauden aikana tai 2-3 ensimmäisen elinvuoden aikana, jolloin kehittyvä immuunijärjestelmä on altis muutoksille. Suojaavan vaikutuksen takana olevia immunologisia mekanismeja selvitetään vielä, mutta luontaisella immuniteetillä uskotaan olevan keskeinen rooli suojaavan vaikutuksen synnyssä.
Koska maatilapöly voi olla yksi mahdollisista suojaavista tekijöistä, keskityttiin tässä Pro gradu -työssä tutkimaan erilaisia aktiivisia ja passiivisia maatilapölyn keräystapoja. Työn tavoitteena oli vertailla eri pölynkeräysmenetelmiä ja keräystavoilla kerätyn maatilapölyn soluvasteita keuhkoepiteelimallissa. Maatilapölyä kerättiin viideltä eri maatilalta aktiivisesti sähköisellä alipaineimpaktorilla (ELPI) ja gravimetrisellä impaktorilla (DGI) sekä passiivisesti keräämällä laskeutunutta tuoretta pölyä petrimaljoilla ja vanhaa laskeutunutta pölyä rapsuttelemalla.
Toksikologisissa kokeissa altistettiin yhteiskasvatettuja A549- ja THP-1 -soluja DGI:lla, petrimaljoilla ja rapsuttelemalla kerätylle maatilapölylle. Työssä arvioitiin maatilapölyn vaikutusta solujen elävyyteen, solusykliin, metaboliseen aktiivisuuteen ja reaktiivisten happiradikaalien sekä sytokiinien muodostukseen.
Tämä Pro gradu -työ osoitti, että pölynkeräystavalla on vaikutusta toksikologisiin soluvasteisiin, mikä on tärkeää ottaa huomioon tutkimusta tehdessä. Laskeutuneen tuorepölyn ja ikääntyneen rapsutuspölyn soluvasteissa ei havaittu suurta eroa, joten molemmat menetelmät sopivat pölyn keräämiseen. Passiivisten keräysmenetelmien käyttö maatiloilla havaittiin myös helpoksi ja halvaksi tavaksi toteuttaa pölynkeräys. DGI:lla kerätyn pölyn soluvasteet sen sijaan erosivat kahdesta muusta käytetystä keräysmenetelmästä, jonka vuoksi kyseisen menetelmän sopivuutta maatilapölyn tutkimiseen tulee vielä tutkia.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry, Department of Environmental and Biological Sciences, Environmental Science
Tarleena Tossavainen: Collection methods of farm dust and its effects in lung epithelium model
Master of Science thesis 54 pages, 1 annex (2 pages)
Instructors of thesis: Marjut Roponen (associate professor, PhD) and Maria-Viola Martikainen (PhD)
February 2019
_______________________________________________________________________
keywords: farm dust, dust collection, sampling methods, allergy, asthma, co-culture ABSTRACT
Childhood asthma and allergies are a major health problem in industrialized countries and a growing problem in developing countries. The rise in living standards and increased hygiene play a role in the increase of allergic diseases. Advanced living conditions reduce the microbiological challenges of the immune defense system of children and thus the human immune system can't get enough training. Even though allergies and asthma have increased, children living on farms have been observed to have less asthma, hay fever and allergies than children living in urban environments. The microbe-rich barn environment and the usage of unprocessed milk have been identified as protective factors in farm environment. The protective effect has been found to work best when exposure occurs during pregnancy or during the first 2-3 years of life, when the developing immune system is susceptible to change. The immunological mechanisms behind the protective effect are still unknown, but natural immunity is believed to play a major role in the development of the protective effect.
Because farm dust could be a potential protective factor, this Master’s thesis is focused on studying various active and passive dust collection methods. The aim of this study was to compare different dust collection methods and cellular responses in lung epithelium model caused by the said collection methods. Farm dust was actively collected from five different farms with an electrical Low-Pressure Impactor (ELPI) and a gravimetric impactor (DGI). Dust was also collected passively by petri dish and scraping of aged dust. In the toxicological analyses, co-cultured A549 and THP-1 cells were exposed with DGI, fresh petri dish dust and scraped aged dust. Cell viability, cell cycle, metabolic activity and the formation of reactive oxygen species and cytokines were evaluated in this thesis.
This Master’s thesis showed that dust collection methods can influence toxicological cellular responses, which is important to consider when conducting research. There was no significant difference in cellular response of the settled fresh dust and aged dust, so both methods are suitable for dust collection. The use of passive collection methods on farms was also found to be an easy and inexpensive way of collecting dust. On the other hand, the cellular responses of the dust collected by DGI differed from the two other passive methods used, therefore, the suitability of this method for the study of farm dust still needs to be studied more.
ESIPUHE
Tämä opinnäyte työ on tehty Itä-Suomen yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksen Inhalaatiotoksikologian laboratoriossa lokakuun 2018 ja tammikuun 2019 välisenä aikana.
Työn ohjaajina toimivat apulaisprofessori, farmasian tohtori Marjut Roponen ja filosofian tohtori Maria-Viola Martikainen.
Haluan kiittää opinnäytetyöni ohjaajia asiantuntevasta ja tukevasta ohjauksesta työn aikana sekä laboratorion muita työntekijöitä, jotka opastivat kokeiden suorituksessa. Lisäksi haluan kiittää Kirsi Wolczkiewiczia vertaistuesta ja avusta pölynkeräyksessä sekä toksikologisissa kokeissa.
Erityiskiitos perheelleni ja avopuolisolleni Valtterille, jotka ovat jaksaneet tukea ja kannustaa koko tutkielman teon ajan.
Kuopiossa 5.2.2019 Tarleena Tossavainen
LYHENNELUETTELO
A549 Ihmisen adenokarsinooma -solulinja CD14 Cluster of differentiation 14
DCF 2′,7′-dichlorofluorescein
EDC Elektrostaattinen pölynkeräin, Electrostatic dust fall collector ELPI Sähköinen alipaineimpaktori, Electrical Low-Pressure Impactor
DGI Dekati Gravimetric Impactor
DMSO Dimetyylisulfoksidi
ELISA Entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys
IFN Interferoni
IgE Immunoglobuliini E
IL Interleukiini
LPS Lipopolysakkaridi
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide NK-solut Luonnolliset tappajasolut, Natural killer cells
PBS Phosphate-buffered saline
PI Propidium jodidi
PMA Forboli-12-myristaatti-13-asetaatti PTFE Polytetrafluoroetyleeni-filtteri
Th T-auttaja, T-helper
THP-1 Ihmisen monosyyttinen leukemia -solulinja
TLR Tollin kaltainen reseptori
TNF Tuumorinekroositekijä
Treg Regulatorinen T-solu
SISÄLLYSLUETTELO
1 JOHDANTO ... 8
2 KIRJALLISUUSKATSAUS ... 10
2.1 Immuunijärjestelmä ... 10
2.2 Sytokiinit ... 11
2.3 Allergiset sairaudet ja astma ... 11
2.4 Maatilaympäristö ... 13
2.4.1 Altistuminen ... 14
2.4.2 Terveysvaikutukset ja suojaava vaikutus ... 15
2.5 Maatilapöly ... 17
2.5.1 Pölyn keräysmenetelmät ... 17
2.5.1.1 Aktiiviset keräysmenetelmät ... 17
2.5.1.2 Passiiviset keräysmenetelmät ... 20
2.5.2 Maatilapölyn tutkiminen ja vaikutusten arviointi ... 21
3 TYÖN TAVOITTEET ... 23
4 AINEISTO JA MENETELMÄT ... 24
4.1 Pölynkeräys ... 24
4.1.1 Aktiivinen keräys ... 24
4.1.2 Passiivinen keräys ... 25
4.2 Pölyn käsittely ... 26
4.3 Toksikologiset analyysit ... 28
4.3.1 Solulinjat ... 28
4.3.2 Altistus ... 28
4.3.3 Solujen metabolinen aktiivisuus ... 29
4.3.4 Reaktiivisten happiradikaalien muodostus ... 29
4.3.5 Solujen elävyys ... 30
4.3.6 Solusyklianalyysi ... 30
4.3.7 Sytokiinimääritys ... 31
4.3.8 Tulosten käsittely ja tilastollinen analyysi ... 31
5 TULOKSET ... 33
5.1 Hiukkaskeräys ... 33
5.2 Toksikologiset analyysit ... 34
5.2.1 Metabolinen aktiivisuus ... 34
5.2.2 Solujen elävyys ... 35
5.2.3 Solusykli ... 36
5.2.4 Reaktiivisten happiradikaalien tuotanto ... 39
5.2.5 Sytokiinit ... 40
6 TULOSTEN TARKASTELU ... 42
6.1 Hiukkasten ominaisuudet ... 42
6.2 Sytotoksiset vasteet ... 43
6.3 Sytokiinituotanto ... 44
6.4 Pölynkeräystapojen vertailu ... 45
7 JOHTOPÄÄTÖKSET ... 47
8 LÄHTEET... 48 LIITTEET
LIITE 1. TAUSTATIETOJEN KARTOITUS
1 JOHDANTO
Viimeisten vuosikymmenten aikana huolenaiheeksi on noussut lasten allergisten sairauksien ja astman määrän huomattava lisääntyminen kehittyneissä maissa (Haahtela ym. 2008).
Muutokset elintavoissa ja ympäristötekijöissä voivat selittää allergisten sairauksien ja astman määrän lisääntymisen. Useiden tekijöiden on osoitettu lisäävän riskiä sairastua astmaan lapsuudessa ja riskiin vaikuttaa myös, missä keuhkojen kehitysvaiheessa tekijöille altistutaan.
Ympäristön ilmansaasteet, allergeenit, kuten home, sienet ja siitepöly, sekä infektiot voivat olla riskitekijöitä astman kehittymiselle (Lowe ym. 2004).
Useissa tutkimuksissa on osoitettu maatiloilla asuvien lasten sairastavan vähemmän astmaa, heinänuhaa ja allergioita kuin lasten, jotka elävät kaupunkiympäristössä. Tätä maatilaympäristön allergisilta sairauksilta suojaavaa vaikutusta kutsutaan kirjallisuudessa
”farm effect”:ksi. Suojaavan vaikutuksen on havaittu toimivan parhaiten, kun altistuminen tapahtuu jo kohdussa tai aikaisessa lapsuudessa. On myös mahdollista, että asuminen maatilalla johtaa elinikäiseen suojaan atooppisia sairauksia vastaan (Lampi ym. 2011). Maatilojen suojaavat tekijät eivät kuitenkaan ole täysin selvillä, mutta suojaaviksi tekijöiksi on havaittu muun muassa navettaympäristö ja prosessoimattoman maidon juonti sekä suurempi ympäristön mikrobien määrä. Maatilaympäristössä lapset ovat säännöllisessä kosketuksessa karjan ja eläinten ruoan (heinä, olki ja säilörehu) kanssa, ja näiden tekijöiden uskotaan vähentävän astman kehittymistä lapsilla (Ege ym. 2006, 2011; Riedler ym. 2000; von Mutius 2011).
Viime vuosikymmenten aikana on löydetty useita allergialta suojaavia tekijöitä, joista osa liittyy vahvasti mikrobialtistukseen. Maatiloilla oleva pöly, joka on peräisin muun muassa maatilan eläimistä, rehusta, ja heinästä, voi olla mahdollinen suojaava tekijä allergioita ja astmaa vastaan. Eläinsuojien ilman on havaittu sisältävän muun muassa useita lajeja homeita, sieniä ja bakteereja. Kuitenkin mikrobilajisto, jolle lapset altistuvat maatilaympäristössä, on vielä huonosti tunnettu (Normand ym. 2011).
Maatilapölyn keräämiseen voidaan käyttää erilaisia menetelmiä. Pölynkeräys on mahdollista suorittaa aktiivisesti tai passiivisesti. Keräysmenetelmän valintaan vaikuttavat paikka, josta pölyä kerätään ja aika, joka pölynkeräykseen on käytettävissä. Aktiiviset pölynkeräysmenetelmät ovat useimmiten myös kalliimpia kuin passiiviset. In vitro -kokeita varten pölyn tulisi olla mahdollisimman prosessoimatonta, jotta pöly kuvaisi mahdollisimman hyvin alkuperäistä altistetta. Tämä on tärkeä ottaa huomioon pölyä kerätessä.
Maatilalta kerätyn pölyn haitallisia vaikutuksia soluvasteisiin ei ole tutkittu in vitro - menetelmällä juurikaan. Tämän vuoksi tämän pro gradu -työn tavoitteena oli tutkia maatilapölyä ja eri pölynkeräystapojen vaikutuksia soluvasteisiin yhteiskasvatetuissa soluissa.
Tavoitteena oli verrata erilaisia aktiivisia ja passiivisia pölyn keräysmenetelmiä, joita maatiloilla on mahdollista hyödyntää ja tutkia onko pölynkeräystavalla vaikutusta toksikologisissa kokeissa saataviin tuloksiin.
2 KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1 Immuunijärjestelmä
Immuunijärjestelmä on monitahoinen elimistön puolustusjärjestelmä, jonka tehtävä on puolustaa elimistöä vierailta aineilta, kuten mikrobeilta, erilaisilta polysakkarideilta ja proteiineilta sekä muilta elimistöä uhkaavilta tekijöiltä. Immuunijärjestelmä on välttämätön selviytymisen kannalta ja sen toiminta perustuu järjestelmän kykyyn tunnistaa omat ja vieraat rakenteet toisistaan (ns. self-nonself-diskriminaatio). Joskus immuunireaktio voi kohdistua harmittomaan vierasaineeseen, esimerkiksi allergiassa, ja johtaa näin voimakkaaseen ja elimistöä vahingoittavaan reaktioon. (Abbas ym.
2015).
Immuunijärjestelmä koostuu karkeasti kahdesta yhdessä toimivasta osasta: luontainen (synnynnäinen) immuniteetti (innate immunity) ja hankittu (opittu) immuniteetti (adaptive immunity) (Esser ym. 2016). Luontainen immuniteetti vastaa varhaisen puolustuslinjan ylläpidosta. Sen reaktiot ovat tyypillisesti nopeita, mutta mekanismit epäspesifisiä. Luonnollinen immuniteetti sisältää fysikaaliset ja kemialliset esteet, kuten suojaavat epiteelit ja limakalvot, tunnistinmolekyylit, tulehduksen välittäjäaineet, syöjäsolut (fagosyytit) ja luonnolliset tappajasolut (NK-solut). Hankittu immuniteetti toimii spesifisemmin kuin luontainen immuniteetti. Se kykenee tunnistamaan kohderakenteita eli antigeenejä ja muistamaan ne myöhemmin. Toistuva altistus samalle antigeenille voi parantaa adaptiivisen immuniteetin vasteita. Hankittu immuniteetti koostuu lymfosyyteistä ja niiden eritystuotteista, kuten vasta-aineista ja sytokiineista. Hankittu immuniteetti voidaan jakaa vielä B-solujen välittämään humoraaliseen immuniteettiin ja T-solujen välittämään sellulaariseen immuniteettiin.
Humoraalinen immuniteetti suojaa solujen ulkopuolisilta mikrobeilta, kuten bakteereilta, kun taas T-soluvälitteinen immuniteetti suojaa pääasiassa solunsisäisiltä mikrobeilta, kuten viruksilta. (Abbas ym. 2015; Hedman ym. 2011).
Immuunijärjestelmän toiminta muuttuu ihmisyksilön ikääntyessä. Suurimmat immuunijärjestelmän muutokset tapahtuvat sikiön kehityksen ja varhaislapsuuden aikana. Kehittyvä immuunijärjestelmä on siis erittäin altis ulkoisille ärsykkeille (Sly &
Holt 2011). Esimerkiksi ympäristöaltisteet, kuten ilmansaasteet, mikrobit ja kemikaalit, voivat vaikuttaa kehittyvässä vaiheessa olevaan immuunijärjestelmään
positiivisesti tai negatiivisesti, joka näkyy allergian ilmentymisen vähentymisenä tai lisääntymisenä (Hedman ym. 2011).
2.2 Sytokiinit
Sytokiinit ovat tärkeä osa immuunijärjestelmää. Ne ovat elimistön solujen tuottamia välittäjäaineita, jotka osallistuvat tulehdusreaktion ja immuunivasteen säätelyyn sekä ohjaavat solujen kasvua ja erilaistumista. Solujen pinnalla on erilaisia reseptorijärjestelmiä, jotka aktivoituvat esimerkiksi mikrobi-infektion seurauksena voivat laukaista sytokiinituotannon. Esimerkiksi infektiot lisäävät sytokiinituotantoa, mikä johtaa elimistön puolustusreaktion voimistumiseen. Keskeisimmät sytokiiniryhmät immuunijärjestelmän kannalta ovat interleukiinit (IL), interferonit (IFN), tuumorinekroositekijä alfa (TNF-α) ja solutyyppispesifiset kasvutekijät, esimerkiksi granulosyyttikasvutekijä (G-CSF) ja erytropoietiini (EPO). (Silvennoinen ym. 2003).
Sytokiinit voidaan jakaa toiminnallisesti esimerkiksi pro- ja anti-inflammatorisiin sytokiineihin. IL-1, TNF ja IL-6 ovat tärkeimpiä tulehdusta voimistavia (pro- inflammatorinen) sytokiineja. IL-4, IL-10 ja IFN-γ ovat taas tulehdusta vaimentavia (anti-inflammatorinen) sytokiineja (Haahtela ym. 2007; Hedman ym. 2011). Sytokiinit voidaan jakaa myös ryhmiin riippuen mikä T-solujen alatyyppi tuottaa niitä. Th (T- auttaja) 1- solut erittävät IFN-γ, IL-2, ja IL-15, jotka vahvistavat soluvälitteistä immuniteettia. Epänormaali Th1-soluvaste liittyy muun muassa autoimmuunitauteihin.
Th2-solut erittävät puolestaan, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 ja IL-13, jotka säätelevät vasta- ainevälitteisen immuniteetin kehittymistä. Epänormaali Th2-soluvaste on liitetty allergisiin sairauksiin ja astmaan (Hedman ym. 2011; Zidek ym. 2009). Th17-solut erittävät pro-inflammatorisia sytokiineja kuten IL-17, IL-22 ja IL-25, mutta tuottavat myös IL-6 ja TNF-α. Th17-solut osallistuvat kehon puolustukseen sieniä ja solunulkoisia bakteereja vastaan (Zidek ym. 2009).
2.3 Allergiset sairaudet ja astma
Allergisten sairauksien ja astman esiintyvyys on lisääntynyt viimeisten vuosikymmenten aikana varsinkin länsimaissa (Haahtela ym. 2008; Jousilahti ym.
2016). Lisääntymisen syynä voi olla kaupungistuminen, korkeampi elintaso ja sosiaaliluokka sekä parantunut hygienia. Hygienia-hypoteesin mukaan immuunijärjestelmä tarvitsee haasteita toimiakseen tasapainoisesti (Esser ym. 2016).
Nykyisissä länsimaisissa kaupunkiolosuhteissa lasten immuunipuolustus ei saa riittävästi muun muassa mikrobiologisia haasteita, sillä lapset eivät pääse kosketuksiin maaperän eliöstön tai kasvien ja eläinten mikrobien kanssa verrattuna maatalousympäristössä eläviin lapsiin. Luontaisen immuniteetin kehitys jää vajaaksi kaupunkimaisessa ja hygieenisessä ympäristössä, jonka vuoksi elimistö reagoi tarpeettomasti ja liian voimakkaasti allergeeneihin ja muihin ärsykkeisiin. (Haahtela ym. 2007; Haahtela ym. 2008).
Yhdistettä, joka saa aikaan elimistössä immuunivasteen, kutsutaan antigeeniksi.
Allergisen reaktion aiheuttamaa antigeeniä kutsutaan allergeeniksi. Yleisesti allergialla tarkoitetaan immunologisiin mekanismeihin perustuvaa haitallista reaktiota ympäristössä yleisesti esiintyviä allergeeneja kohtaan. Allergia voi välittyä erilaisilla immunologisilla mekanismeilla, joista yleisin on IgE-välitteinen allergia (välitön allergia). Allergia voi olla myös soluvälitteinen, jolloin puhutaan viivästyneestä allergiasta. IgE-välitteistä allergiaa kutsutaan myös atooppiseksi allergiaksi. Se perustuu IgE-vasta-aineen muodostumiseen allergeenia, kuten siitepölyä, hilsettä tai ruoka-ainetta vastaan. Kun IgE-spesifinen antigeeni (allergeeni) tarttuu syöttösolujen pintareseptoreihin kiinnittyneisiin IgE-immunoglobuliinimolekyyleihin, se aktivoi syöttösolut erittämään histamiinia ja muita tulehdukseen liittyviä välittäjäaineita. Tästä voi aiheutua kutinaa, atooppista ihottumaa, allergista nuhaa tai allergista astmaa.
Atooppiseen allergiaan taipumus on perinnöllistä, mutta ympäristötekijöiden, kuten mikrobialtistuksen, hygieniatason ja ravintotekijöiden, uskotaan vaikuttavan myös allergian kehittymiseen (Abbas ym. 2015; Haahtela ym. 2007; Hedman ym. 2011).
Allergioita esiintyy kaikenikäisillä, mutta yleisimmillään ne ovat lapsuus- ja nuoruusiässä. Yleisimpiä allergian aiheuttajia ovat erilaiset ruoka-aineet, siite- ja eläinpöly (Haahtela ym. 2007). Kansaneläkelaitoksen tutkimusosaston teettämään kyselytutkimukseen vastanneista suomalaisesta joka kolmas sairasti lääkärin diagnosoimaa (24,4 %) tai itse todettua allergiaa (8,4 %) (Jantunen 2014). Esimerkiksi atooppista IgE-välitteistä allergista nuhaa on suomalaisella aikuisväestöllä noin 30 prosentilla (Taulukko 1).
Taulukko 1. Arvio allergisten sairauksien esiintyvyydestä Suomessa 2000-luvulla (muokattu Haahtela ym. 2008).
Allergia %
Aikuisten astma 8-10
Lasten astma 5
Astman kaltaiset oireet 5-10
Allerginen nuha (kausiluonteinen ja ympärivuotinen) 30
Heinänuha (siitepölyallergia) 20
Atooppinen ihottuma 10-20
Astma on yksi yleisimmistä pitkäaikaissairauksista ja noin 8-10 %:lla suomalaisista on lääkärin diagnosoima astma (Taulukko 1) (Haahtela ym. 2008). Astma johtuu keuhkoputkien limakalvojen tulehdustilasta. Tulehduksen vuoksi keuhkot ovat herkkiä monille ärsykkeille, kuten pölylle tai savulle, jotka voivat aiheuttaa keuhkoputkien supistelua ja näin hengenahdistusta (Mäkinen ym. 2012). Astman kehittymiseen vaikuttavat perinnöllinen alttius sekä ympäristötekijät. On kahdentyyppistä astmaa:
allerginen ja ei-allerginen astma. Aikuisten sairastamasta astmasta noin 50 % on allergista astmaa, lapsilla luku on noin 80 %. Allerginen astma, atooppinen ihottuma ja allerginen nuha sekä silmäallergiat ovat yhteydessä toisiinsa, sillä elimistöllä on ominaisuus herkistyä erilaisille ympäristön allergeeneille (Haahtela ym. 2007).
2.4 Maatilaympäristö
Maatilalla tarkoitetaan yleisesti maa-aluetta tai tilaa, joka tuottaa ensisijaisesti elintarvikkeita ja muita viljelyskasveja. Ne voivat olla muun muassa peltokasvatustiloja tai maito-, sika- tai siipikarjatiloja. Maatilat voivat erota hyvinkin paljon toisistaan, niin kokonsa kuin toimintansa puolesta. Vuonna 2017 Suomessa oli noin 48 500 maatilaa (Kuva 1). Yleisin maatilojen tuotantosuunta on viljanviljely (16 240 maatilaa). Kotieläinsektorilla lypsykarjatalous on suurin tuottaja (6 700 maatilaa) (Luonnonvarakeskus).
Kuva 1. Maatilojen lukumäärä Suomessa tuotantosuunnittain vuonna 2017 (Luonnonvarakeskus, Tilastotietokanta).
2.4.1 Altistuminen
Maatilaympäristö on ympäristönä hyvin moninainen, sillä se sisältää lukuisia erilaisia altisteita sekä erilaisia altistumistapoja. Altistuminen ei tapahdu ainoastaan ulkona tai esimerkiksi navetassa, vaan altistuminen voi tapahtua myös asuintalossa, sillä asuintalo on yleensä rakennettu lähelle maatilarakennuksia. Vaatteiden ja kenkien välityksellä mikrobeja voi kulkeutua sisätiloihin, jolloin esimerkiksi lapset voivat altistua. On osoitettu, että maalaistalot ovat mikrobiologisesti monipuolisempia kuin tavalliset kodit (Wlasiuk & Vercelli 2012).
Maatilaympäristössä yksi yleisimmistä altisteista ovat ympäristön mikrobit. Mikrobeja ovat muun muassa bakteerit, hiivat, homeet ja virukset. Riippuen maatilan tyypistä mikrobialtistus voi olla peräisin eläimistä, kasveista tai molemmista (Riedler ym. 2001).
Eläintilojen ilman on havaittu sisältävän suuria pitoisuuksia muun muassa endotoksiineja ja muramiinihappoa (Braun-Fahrländer ym. 2002). Endotoksiinit, kuten LPS, muodostavat suurimman osan bakteerien solukalvon ulkokerroksesta (Abbring ym. 2019). Ne vaikuttavat makrofageihin, monosyytteihin ja endoteelisoluihin aktivoimalla nämä tuottamaan sytokiineja ja muita tulehdustekijöitä. Endotoksiinien lisäksi navettapölystä on löydetty bakteerien DNA:ta. Sen on havaittu vaikuttavan
endotoksiineihin voimistaen näiden immuunijärjestelmää muokkaavia toimintoja (Haahtela ym. 2007). Eläinperäisten mikrobien lisäksi navettojen hengitysilmassa on tutkimuksen mukaan myös kasviperäisiä oligosakkarideja, kuten arabinolaktaania, jonka on havaittu suojaavan allergiselta hengitystietulehdukselta hiirimalleissa (Peters ym. 2010). Martikainen ym. (2018) analysoivat tutkimuksessaan maatilapölyn mikrobiomia. He löysivät pölystä gram-negatiivisten bakteereiden DNA:ta, joka oli peräisin pääasiassa kasviperäisistä gram-negatiivisista Erwinia- ja Bradyrhizobiaceae- suvun bakteereista.
Maanviljelijäperheiden ruokavalio on erilainen verrattuna kaupungeissa asuviin. Maalla ihmisen suolisto altistuu monipuolisemmin erilaisille mikrobeille esimerkiksi prosessoimattoman maidon käytön vuoksi. Maatilamaito on yleensä ”raakamaitoa”, joka sisältää erilaisia bakteereja, rasvoja ja rasvahappoja sekä maitoproteiineja, joiden rakenne voi muuttua maidonkäsittelyn seurauksena (Braun-Fahrländer & von Mutius 2011; Abbring ym. 2019). Raakamaito sisältää myös enemmän gram-negatiivisia bakteereja ja niiden lipopolysakkarideja kuin pastöroitu maito (Riedler ym. 2001).
Pastöroimattoman maidon käytön on havaittu lisäävän maatiloilta saatavaa suojavaikutusta, mutta toisaalta terveysviranomaiset eivät suosittele raakamaidon käyttöä, sillä maito voi sisältää patogeenisiä bakteereja, kuten salmonellaa.
2.4.2 Terveysvaikutukset ja suojaava vaikutus
Useissa tutkimuksissa on osoitettu, että perinteisillä maatiloilla asuvat lapset sairastavat vähemmän astmaa, heinänuhaa ja allergioita kuin lapset, jotka elävät kaupunkiympäristössä (Horak ym. 2014; Riedler ym. 2001; von Ehrestein ym. 2000).
Tutkimuksissa on yritetty selvittää ympäristön ominaisuuksia, jotka voisivat selittää maatilojen suojaavaa vaikutusta allergisia sairauksia vastaan, mutta suojaavat tekijät eivät ole vielä täysin selvillä.
Suojaavan vaikutuksen on havaittu toimivan parhaiten, kun altistuminen tapahtuu raskauden aikana tai 2-3 ensimmäisen elinvuoden aikana, jolloin kehittyvä immuunijärjestelmä on altis muutoksille (Ege ym. 2006; Illi ym. 2012; Riedler ym.
2001). On myös osoitettu, että maatilalla asuminen ja siellä kasvaminen voi johtaa elinikäiseen suojaan atooppisia sairauksia vastaan (Lampi ym. 2011), mutta toisaalta aikuisiällä tai työperäisesti altistuminen maatilaympäristölle voi lisätä riskiä sairastua hengityselinsairauksiin (Greskevitch ym. 2007).
Suojaavan vaikutuksen takana olevia immunologisia mekanismeja selvitetään vielä, mutta luontaisella immuniteetillä uskotaan olevan keskeinen rooli. Tutkijat uskovat bakteerien endotoksiinien ja muiden mikrobialtisteiden, jotka liittyvät eläinkontaktiin tai pastöroimattoman maidon kulutukseen, vaikuttavan TLR:n (Tollin kaltainen reseptori) ja CD14-molekyylin ilmentymiseen (Ege ym. 2006). Lauener ym. (2002) ovat huomanneet Tollin kaltainen -reseptori TLR2:n, TLR4:n ja CD14:n määrän olevan verisoluissa korkeampi maatilalapsilla kuin ei-maatila lapsilla. Toll-reseptorit ovat solukalvoproteiineja, joiden tehtävä on tunnistaa elimistössä vieraita rakenteita, kuten mikrobeja ja käynnistää sytokiinituotanto. TLR2 tunnistaa erityisesti gram-positiivisia bakteereita, hiivoja ja monia sieniä, kun taas TLR4 tunnistaa gram-negatiivisia bakteereita ja niiden ulkokalvon lipopolysakkaridia (LPS). TLR4 tarvitsee CD14:ä sitoakseen LPS:n (Hedman ym. 2011). Nämä reaktiot voivat saada aikaan uusien geenien aktivoitumista, joka voi muovata hankitun immuniteetin vastetta (Haahtela ym.
2007).
Kosketus karjan ja olkien kanssa sekä pastöroimattoman maidon kulutus varhaisessa lapsuudessa tai raskauden aikana ovat keskeisimmät altistustavat suojaavalle maatilatekijälle. Illi ym. (2012) havaitsivat oljen olevan vahvin suojatekijä allergisia sairauksia ja astmaa vastaan. Olkia käytetään pääasiassa eläinten kuivikkeena, jolloin lapset altistuvat niiden laiton ja poiston yhteydessä. Tutkijat eivät kuitenkaan pystyneet osoittamaan varmuudella oljen olevan ainoa suojatekijä, sillä olkien kanssa samaan aikaan lapset altistuvat myös heinälle ja ruoholle, jotka sisältävät muun muassa oligosakkarideja, joiden on huomattu hiirimalleissa suojaavan allergiselta astmalta (Peters ym. 2010).
Lluis ym. (2014) havaitsivat tutkimuksessaan maatila-altistuksen ja erityisesti maatilamaidon kulutuksen lisäävän regulatoristen T-solujen (Treg) määrää 4,5- vuotiailla lapsilla. Treg-solujen määrän on havaittu olevan käänteisesti verrannollinen atooppiseen herkistymiseen ja astmaan (Lluis ym. 2014). Treg-solut estävät omiin kudoksiin kohdistuvia immuunivasteita. Ne rajoittavat elimistöä reagoimasta liian voimakkaasti normaaleja, vieraita rakenteita vastaan ja suojaavat elimistöä tarpeettomilta vaurioilta (Hedman ym. 2011). Maatila-altistuksen on myös havaittu vaikuttavan dendriittisoluihin, jotka vastaavat antigeenien esittelystä T-soluille.
Dendriittisolut ovat tärkeässä roolissa immuniteetin ja toleranssin kehittymisessä, jonka
vuoksi ne voivat vaikuttaa maatila-altistuksen suojaavaan vaikutukseen astman kehittymisessä (Martikainen ym. 2015).
2.5 Maatilapöly
2.5.1 Pölyn keräysmenetelmät
Maatilapölyn keräämiseen on mahdollista käyttää erilaisia keräysmenetelmiä. Eri keräysmenetelmillä kerätyn pölyn tulisi olla mahdollisimman käsittelemätöntä, jotta se vastaisi mahdollisimman hyvin normaalia altistustilannetta maatilaympäristössä.
Pölylle altistutaan pääasiassa hengittämällä, jonka vuoksi pölynkeräyskorkeus on tärkeä ottaa huomioon kuin myös, mistä pölyä kerätään. Keskeisin pölylle altistuminen tapahtuu navetassa, mutta esimerkiksi lapset voivat altistua navetasta kulkeutuneelle pölylle asuintiloissa. Kulkeutumisen vuoksi pölyä ja sen määrää on mahdollista monitoroida myös asuintiloista. Suurimmassa osassa tutkimuksia pölyä on kerätty ainoastaan normaaleista sisätiloista, kuten makuuhuoneista, mutta monia käytetyistä menetelmistä olisi mahdollista käyttää myös navettaympäristössä.
Keräysmenetelmän valintaan vaikuttavat monet asiat. Käytetyn menetelmän tulisi olla helppokäyttöinen ja kustannustehokas. Laitteiston koko ei voi olla kovin suuri, jotta se on helppo kuljettaa ja asettaa haluttuun keräyspisteeseen. Laitteistosta ei myöskään saa kuulua kovaa ääntä, sillä esimerkiksi naudat ovat hyvin herkkiä ympäristön muutoksille.
Aktiivisia keräysmenetelmiä käytetään yleisemmin palamisesta syntyvien pienhiukkasten mittauksessa ja keräämisessä, mutta niitä voidaan hyödyntää myös maatilapölyn keräyksessä. Aktiiviset keräysmenetelmät vaativat usein monia eri osia, kuten pumpun ja impaktorin, sekä joissain tapauksissa tietokoneen, jotka vievät tilaa ja tuottavat melua. Aktiivinen keräys on myös yleensä kalliimpi toteuttaa laitekustannusten vuoksi. Passiiviset keräystavat ovat halvempia kuin aktiiviset ja ne vievät vähemmän tilaa. Toisaalta keräysajat passiivisilla keräimillä ovat yleensä pidempiä (useita viikkoja) kuin aktiivisilla keräimillä, joten jatkoanalyysien teko vie pidempään.
2.5.1.1 Aktiiviset keräysmenetelmät
ELPI™ (Electrical Low-Pressure Impactor) on sähköinen alipaineimpaktori (Kuva 2), jota ei ole hyödynnetty maatilapölyn keräyksessä aiemmin, mutta sitä käytetty kuitenkin monissa aerosolitutkimuksissa (Lamberg ym. 2011; Tissari ym. 2008).
ELPI mittaa reaaliaikaisesti ilman hiukkaskokojakaumaa ja -pitoisuutta 7 nm-10 µm:n hiukkasvälillä. (Dekati 2010).
Kuva 2. Sähköinen alipaineimpaktori (ELPI) ja impaktoritasot (Dekati 2010).
ELPI:n toiminta voidaan jakaa kolmeen pääosaan: hiukkasten varaaminen koronavaraajalla, kokoluokittelu kaskadi-impaktrorissa ja varauksen havaitseminen virtausmittarilla (elektrometri) (Kuva 3). ELPI:ssä on kaksitoista impaktoritasoa, joihin hiukkaset asettuvat aerodynaamisen koon perusteella. Ennen impaktoria on koronavaraaja, joka varaa aerosolihiukkaset. ELPI:in yhdistetään vakuumipumppu, joka saa aikaan aerosolien virtauksen laitteen läpi. Virtauksena käytetään yleensä 10 lpm. Hiukkaset asettuvat kokonsa perusteella impaktorin eri tasoille, josta hiukkasen varaus tunnistetaan. Varaus on verrannollinen hiukkaslukumäärään tasolla. ELPI:in voidaan yhdistää myös tietokone, jolloin data tallentuu ELPIVI- ohjelmaan. (Dekati 2010).
Kuva 3. ELPI:n rakenne ja toimintaperiaate (muokattu Dekati 2010).
Toinen pääasiassa moottorien pakokaasuhiukkasten keräyksessä käytetty keräin on Dekati Gravimetric Impactor (DGI) (Kuva 4), jota käytetään myös ilmanlaatumittauksissa, kun hiukkaspitoisuudet ovat pienet ja tarvitaan riittävä määrä hiukkasmassaa. DGI on kaskadi-impaktori, joka suunniteltu mittaamaan suuria näytemääriä ja alle 2,5 µm:n gravimetrista hiukkaskokojakaumaa.
Kuva 4. DGI-keräin ja impaktoritasot (Dekati 2014).
DGI-näytekeräyssysteemiin kuuluu esierotin eli sykloni, joka poistaa suurimmat hiukkaset. Esierotuksen jälkeen näyte laimennetaan huokoisessa putkessa (PRD).
Laimenninputkesta näyte imetään impaktoriin, johon on yhdistetty pumppu, joka imee ilmaa virtauksella 70 lpm (Kuva 5) (Hukkanen ym. 2010). Impaktorissa on
viisi tasoa, joille asetetaan filtterit, esimerkiksi polytetrafluoroetyleeni-filtteri (PTFE). Hiukkasmassa kertyy eri impaktoritasoille kokonsa perusteella. (Dekati 2014). Hiukkaset irrotetaan filttereiltä esimerkiksi metanoliuutolla, kuten Jalava ym. (2012) ovat tutkimuksessaan tehneet.
Kuva 5. DGI-näytekeräyskaavio. PRD (porous tube diluter) tarkoittaa huokoista laimenninputkea ja MFC (mass flow controller) massavirtasäädintä (muokattu Hukkanen ym. 2010).
2.5.1.2 Passiiviset keräysmenetelmät
Passiivisilla pölynkeräysmenetelmillä kerätään yleensä laskeutunutta pölyä.
Laskeutuneen pölyn keräämiseen voidaan käyttää esimerkiksi elektrostaattisia pölynkeräysliinoja eli EDC-keräimiä (electrostatic dust fall collector) kuten useissa tutkimuksissa on todettu (Noss ym. 2008; Normand ym. 2009; Frankel ym. 2012).
Tutkimuksissa keräimillä on kerätty yleensä asuintalojen sisäilmassa esiintyviä partikkeleita, kuten endotoksiineja ja mikrobeja. EDC-keräin koostuu polypropyleeni-näytealustasta, jossa on neljä elektrostaattista liinaa, joiden jokaisen pinta-ala on 0,0032 m2. Ilmassa oleva pöly laskeutuu elektrostaattiselle liinalle ja tarttuu kiinni siihen. Tutkimuksissa keräin on asetettu vaakatasoon noin 1,5 metrin korkeudelle esimerkiksi kirjahyllyn päälle kahdeksi viikoksi (Noss ym. 2008).
Koska EDC-keräinnäytealusta on kooltaan 30-40 senttiä, on se mahdollista kokonsa
puolesta sijoittaa myös navettaympäristöön kuten Noss ym. (2008) tutkimuksessaan totesivat. Pölyn irrotukseen keräinliinoilta voidaan käyttää esimerkiksi pyrogeenitöntä vettä, johon on lisätty 0,05 % Tween 20-liuosta (Noss ym. 2008).
Würtz ym. (2005) keräsivät laskeutunutta pölyä koulun luokkahuoneista niin sanotulla ”pitsalaatikko”-menetelmällä, jota he tutkimuksessaan kutsuvat ”dustfall collector” -menetelmäksi. Menetelmässä pahvilaatikon (51x35,5x5 cm) pohjalle asetetaan alumiinifoliosiivu, johon pöly laskeutuu. Laatikosta pöly imuroidaan polykarbonaattifiltterille, josta pöly irrotetaan kuten EDC-keräimestä. Myöhemmin Würtz ym. menetelmää on mukailleet omiin sisäilman pölymittauksiin muun muassa Hyvärinen ym. (2006), Tirkkonen ym. (2016) ja Adams ym. (2013).
Hyvärinen ym. (2006) sekä Tirkkonen ym. (2016) keräsivät tutkimuksissaan sisätilojen laskeutunutta pölyä avoimiin pahvilaatikoihin samankaltaisesti kuin Würtz ym. (2005). Adams ym. (2013) käyttivät varioidussa ”pitsalaatikko”- menetelmässä petrimaljoja, jotka sijoitettiin sisätilassa eri huoneisiin. Maljat jätettiin neljäksi viikoksi keräämään laskeutunutta pölyä, josta tehtiin mikrobiologista-analyysiä. Tässä Pro Gradu -työssä kerättiin maatiloilta laskeutunutta pölyä vastaavalla perimalja-menetelmällä.
Peters ym. (2006) tutkivat hiirimallissa perinteisiltä maatiloilta navetoista kerättyä kasautunutta pölyä (sedimented dust). Pöly kerättiin karja- ja vuohitalleista raaputtelemalla telineiden, pöytien ja työvälineiden pintoja metallisella spaattelilla.
Kerätty pöly siivilöitiin tavallisen keittiösiivilän läpi ja yhdistettiin yhdeksi näytteeksi. Kokeita varten näyte homogenoitiin lasihelmillä ja uutettiin 0,9 % natriumkloridiliuoksella. Tässä Pro Gradu -työssä käytettiin vastaavaa rapsutusmenetelmää.
2.5.2 Maatilapölyn tutkiminen ja vaikutusten arviointi
Maatilapölyä ja sen haitallisia vaikutuksia ei ole juurikaan tutkittu in vitro -kokeissa, vaan kokeellisissa tutkimuksissa on keskitytty tutkimaan maatilapölyn positiivisia vaikutuksia tutkittaviin soluihin. Maatilapölyn haitallisia vaikutuksia voidaan tutkia erilaisilla toksisuuskokeilla, joilla voidaan mitata muun muassa sytotoksisuutta, oksidatiivista stressiä ja tulehduksen määrää.
Sytotoksisuuden indikaattoreina käytetään solujen elävyyttä ja metabolista aktiivisuutta, apoptoosia sekä solusyklin vaihetta. Solusykli koostuu neljästä vaiheesta;
G1-, S-, G2- ja M-vaihe. G1-vaiheessa solu on kasvuvaiheessa, jossa tarkastetaan ovatko olosuhteet solussa otolliset solun jakautumiselle. Mikäli olosuhteet eivät ole suotuisat, solu siirtyy G0-lepovaiheeseen, jossa solusykli on pysähtynyt. S-vaiheessa tapahtuu DNA:n replikaatio, jossa solun sisältämä DNA kahdentuu. G2-vaiheessa tarkastetaan DNA:n eheys ja solu valmistautuu jakautumiseen eli M-vaiheeseen (Mäkinen ym. 2012). Solukokeissa sub-G1-vaihe on keskeisin kiinnostuksen kohde, sillä sub-G1-vaiheessa solut ovat apoptoosissa, jota voidaan pitää indikaattorina altisteen toksisuudesta.
Oksidatiivista stressiä voidaan arvioida mittaamalla reaktiivisten happiradikaalien määrää in vitro -kokeissa. Oksidatiivinen stressi on seurausta solujen hapetus- pelkistystilan epätasapainosta, mikä johtaa reaktiivisten happiradiaalien (ROS) muodostumiseen. Useimmiten oksidatiivinen stressi johtaa solujen rakenteellisiin ja toiminnallisiin häiriöihin, joka voi puolestaan johtaa erilaisten mekanismien kautta solukuolemaan, joko nekroosin tai apoptoosin kautta (Burton ym. 2011).
Sytokiineilla on keskeinen rooli tulehdusreaktion synnyssä ja sen säätelyssä, jonka vuoksi sytokiinien määrää käytetään indikaattorina tulehduksesta (Hedman ym. 2011).
Yleisesti tulehdusta voidaan mitata in vitro -kokeissa esimerkiksi tutkimalla pro- inflammatoristen sytokiinien kuten TNF-α:n, IL-6:n, IL-8:n ja IL-1:n määrää.
Kyseisiä mittausparametreja käytetään usein arvioimaan altisteiden haitallisia ominaisuuksia. On tärkeä kartoittaa negatiivisia soluvasteita myös silloin, kun jollain altisteella uskotaan olevan positiivinen vaikutus soluntoimintaan, sillä ne voivat vaikuttaa tulosten tulkintaan.
3 TYÖN TAVOITTEET
Maatiloilla oleva pöly, joka on peräisin muun muassa maatilan eläimistä, rehusta, ja heinästä, voi olla mahdollinen suojaava tekijä allergioita ja astmaa vastaan (von Mutius &
Vercelli 2010). Maatilalta kerätyn pölyn haitallisia vaikutuksia soluvasteisiin ei ole tutkittu in vitro -menetelmällä juurikaan, jonka vuoksi tässä pro gradu -työssä keskityttiin tutkimaan maatilapölyä ja eri pölynkeräystapojen vaikutuksia soluvasteisiin yhteiskasvatetuissa soluissa.
Opinnäytetyön tavoitteena oli esitellä erilaisia pölyn keräysmenetelmiä (passiivinen ja aktiivinen), joita maatiloilla on mahdollista hyödyntää. Eri keräysmenetelmillä kerätty pöly tulisi olla mahdollisimman prosessoimatonta, jotta se vastaisi mahdollisimman hyvin normaalia altistustilannetta maatilaympäristössä. Opinnäytetyön toksikologisessa osuudessa tarkoituksena oli altistaa yhteiskasvatettuja ihmisen A549-soluja ja makrofageiksi erilaistettuja THP-1-soluja eri tavoin kerätyille pölynäytteille. Pölynäytteitä kerättiin viidellä eri tapaa aktiivisesti (3 kpl) ja passiivisesti (2 kpl), jotta oli mahdollista verrata soluvasteita eri tavoin kerättyjen pölynäytteiden välillä ja selvittää toimivin tapa kerätä pölyä toksikologisiin analyyseihin.
Työn keskeisin tarkoitus oli selvittää, onko näytteenkeräystavalla merkitystä, kun arvioidaan maatilapölyn haitallisuutta ja hyötyjä sekä samalla myös selvittää onko navettojen välillä eroja. Lisäksi työssä haluttiin selvittää, eroavatko aktiivisen DGI- keräysmenetelmän soluvasteet passiivisista keräysmenetelmistä.
4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 Pölynkeräys
Tutkimuskohteena oli viisi lypsykarjamaatilaa Pohjois- ja Etelä-Savon alueilta, joista kerättiin pölyä aktiivisilla ja passiivisilla keräysmenetelmillä (Taulukko 2). Maatilat olivat tyypiltään pihattonavettoja, joissa suurin osa naudoista pääsi liikkumaan vapaasti rakennuksen sisällä ja mahdollisesti sen ulkopuolella. Tässä työssä tutkimusnavetoista käytetään nimityksiä Farmi 1, 2, 3, 4 ja 5. Maatiloista neljä oli isoja, joissa nautoja oli yli sata (Farmi 1, 3, 4 ja 5). Farmilla 2 nautoja oli noin 60. Maatiloille tehtiin taustatietojen kartoitus, jossa tilanpitäjiltä kysyttiin muun muassa navetan ilmanvaihdosta, lypsytavasta, kuivikkeen käytöstä ja lantatyypistä. Maatilojen taustatiedot on esitetty liitteessä 1.
Taulukko 2. Yhteenveto maatiloilta kerätyistä pölynäytteistä.
Farmi 1 Farmi 2 Farmi 3 Farmi 4 Farmi 5 Nautojen
määrä (kpl) 120 60 100 120 150
Aktiivinen
ELPI x x x x
Pussisuodatin x x x
DGI x
Passiivinen
Petrimaljat
(laskeutunut) x x x x
Käytettävissä olevat maljat (kpl)
15 25 18 20
Rapsutus x x x x
4.1.1 Aktiivinen keräys
Aktiivinen pölynkeräys suoritettiin kahdella tapaa; sähköisellä alipaineimpaktorilla (ELPI®, Dekati Ltd.) ja pussisuodattimella. Laitteet asetettiin mahdollisimman lähelle nautoja tai sellaiseen paikkaan, jossa tapahtui muuta toimintaa, kuten kuivikkeen käsittelyä.
Hiukkasten lukumäärää ja massaa mitattiin ELPI:llä, johon oli yhdistetty vakuumipumppu ja tietokone. Ennen mittausta ELPI:n impaktoritasoille asetettiin alumiinialustat. Alustat oli käsitelty rasvalla, jonka tarkoituksena oli vähentää
hiukkashäviötä. ELPI:n toimintaperiaate on kerrottu aikaisemmin tässä työssä (ks. s.
18-19). Laitteistolla kerättiin hiukkasia virtauksella 10 l/min 22-24,5 tuntia riippuen maatilasta. Mittauksen jälkeen impaktori purettiin ja alumiinialustat, johon hiukkaset oli kerätty, pakastettiin SEM-analyysiä (scanning electron microscope) varten.
Tietokoneelle kerätty mittausdata käsiteltiin Excel:llä.
Pussisuodattimella kerättiin hiukkasmassaa ilmasta. Pussisuodattimeen yhdistettiin pumppu, joka imi näytettä 30 l/min. Virtaus tarkistettiin saippuakuplakalibraattorilla (Gilian Gilibrator-2, Sensidyne). Hiukkasia kerättiin 22-24,5 tuntia riippuen maatilasta.
Mittauksen pöly poistettiin pussista karistelemalla pöly lasipulloon.
Toksikologisissa analyyseissä käytettiin myös aiemmin DGI-keräimellä (Dekati® Gravimetric Impactor) kerättyä pölyä (Farmi 5). Pölyä kerättiin kahtena päivänä 24 tunnin erissä noin 150 naudan navetasta. Laitekokonaisuuteen kuului esierotin, DGI- keräin ja pumppu, joka imi näytettä 70 l/min (Kuva 5). DGI-keräin keräsi hiukkasia viidelle impaktoritasolle, joihin oli asetettu polytetrafluoroetyleeni-filtterit (PTFE).
Filtterit vaihdettiin kahden mittauksen välissä ja asetetiin petrimaljoille kuljetusta varten. Laboratoriossa hiukkasnäytteet uutettiin metanolilla suodattimista kuten Jalava ym. (2012) tutkimuksessa on tehty. Suodattimet leikattiin paloiksi metanolilla täytettyyn lasiputkeen ja asetettiin ultraäänivesihauteeseen 30 minuutiksi. Tämän jälkeen ylimääräinen metanoli haihdutettiin pyöröhaihduttimella. Lopuksi näytteet kuivatiin vielä typpivirtauksella ja varastoitiin pakastimeen -20 °C:een. Tässä tutkimuksessa käytettiin näytteitä, jotka olivat DGI-keräimen kolmelta pienimmältä tasolta, kokoluokiltaan alle 1 µm.
4.1.2 Passiivinen keräys
Passiivinen keräys suoritettiin kahdella tapaa. Petrimaljoilla kerättiin laskeutunutta tuoretta pölyä ja rapsuttelemalla pölyisiä pintoja kerättiin vanhempaa laskeutunutta pölyä. Laskeutunutta tuoretta pölyä kerättiin polystyreeni-petrimaljoille. Jokaiseen navettaa asetettiin neljä tai viisi erää petrimaljoja 4-5 maljan erissä riippuen navetasta (16-25 kpl/navetta) (Taulukko 2). Maljaerät sijoitettiin eri puolille navettaa, jotta ne kuvaisivat mahdollisimman kattavasti eri navetan altistuslähteitä, niin eläinperäisiä kuin myös kasviperäisiä. Petrimaljat asetettiin navettoihin 1-2,5 metrin korkeudelle niin, että maljoihin ei kohdistunut häiriötä ja pöly pääsi laskeutumaan niille (Kuva 6). Maljat jätettiin maatiloille noin kolmeksi viikoksi keräämään laskeutunutta pölyä. Keräyksen
jälkeen maljat suljettiin varovasti käyttäen parafilmiä ja kuljetettiin laboratorioon jatkokäsittelyä varten. Maljat, jotka eivät olleet alkuperäisellä paikallaan tai niissä oli muuta epätavallista, kuten linnun ulostetta, hylättiin.
Kuva 6. Kaksi esimerkkiä petrimaljojen keräyspaikasta. ©Kirsi Wolczkiewicz
Vanhaa laskeutunutta pölyä kerättiin rapsuttamalla spaattelilla pölyisiltä pinnoilta pölyä muovisille petrimaljoille. Näytteet pyrittiin keräämään eripuolilta navettaa, jotta ne kuvasivat kattavasti eri altistuslähteitä. Maljat suljettiin parafilmillä ja kuljetettiin laboratorioon jatkokäsittelyä varten.
4.2 Pölyn käsittely
Laboratoriossa tuorepölymaljoilta poistettiin pinseteillä isommat materiaalit, kuten kärpäset ja heinän korret. Petrimaljojen pöly jaettiin neljään eri pölynäytteeseen (Kuva 7). Ensin jokaisesta maljaerästä otettiin yksi malja (a). Maljojen kannet ja itse maljat pyyhittiin steriilissä vedessä kastetulla pumpulipuikolla, joka katkaistiin saksilla muoviseen DNA-eritysputkeen (mikrobiominäyte). Sama käsittely toistettiin seuraaville maljoille (b) ja pölypumpulipuikko katkaistiin lasiputkeen (Pölynäyte 1).
Kolmanteen putkeen yhdistettiin seuraavien maljojen pöly (c) rapsuttamalla spaattelilla maljoilta pöly ennalta punnittuun lasiputkeen (Pölynäyte 2). Sama käsittely (d) tehtiin neljättä putkea varten (Pölynäyte 3). Kolmannet ja neljännet putket punnittiin pölyn lisäämisen jälkeen, jotta saatiin selville laskeutuneen pölyn massa. Jäljelle jääneet
käsittelemättömät maljat (e) laitettiin sellaisenaan pakkaseen (Pölynäyte 4). Kaikki putket pakastettiin myöhempää käyttöä varten. Mikrobiomiputki toimitettiin Terveyden ja hyvinvoinnin laitokselle mikrobiomi-analyysiin.
Kuva 7. Esimerkki laskeutuneen tuorepölyn maljaerien jakautumisesta eri pölynäytteiksi Farmilta 3.
Kustakin navetasta kerätyt vanhat laskeutuneet rapsutuspölynäytteet käsiteltiin Pienhiukkas- ja aerosolilaboratoriossa. Eripuolilta navettaa kerätyt näytteet yhdistetiin yhdeksi näytteeksi per navetta (Kuva 8). Pölystä haluttiin erotella mahdollisimman pienikokoiset hiukkaset, jonka vuoksi käytettiin ravistelijaa. Ravistelijaan asetetiin päällekkäin kokojärjestyksessä suurimmasta pienimpään siivilätasoja. Pöly kaadettiin ylimpään siivilään ja ravistelija laitettiin päälle noin 20 minuutiksi. Ravistelun jälkeen pienin siiviläkoko, jonka läpi pölyä oli mennyt, oli alle 63 µm. Jokaisen navetan pöly kaadettiin lasiputkiin ja pakastettiin. Myös ylemmän siivilätason (63-125 µm) pöly otettiin talteen lasiputkiin ja pakastettiin.
Kuva 8. Maatiloilta kerättyjen vanhan laskeutuneen rapsutuspölynäytteiden määrät.
4.3 Toksikologiset analyysit 4.3.1 Solulinjat
Altistuskokeissa käytettiin ihmisen adenokarsinooma -solulinjaa (A549) ja ihmisen monosyyttistä leukemia -solulinjaa (THP-1) yhteiskasvatusmenetelmällä (co-culture).
Yhteiskasvatettua solumallia käytetään realististen keuhko-olosuhteiden simuloimiseksi in vitro -kokeissa. Yhteiskasvatusmenetelmä heijastaa erilaisten solutyyppien välillä tapahtuvaa vuorovaikutusta ja viestintää keuhkoissa (Wottrich ym.
2004). Molempia solulinjoja kasvatettiin DMEM-mediumissa (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 10% FBS, 2 mM L-glutamiini, 100 U/ml penisilliini/streptomysiini, Sigma-Aldrich, USA) +37 °C:ssa 5 % CO2-pitoisuudessa.
A549-solut laskettiin ja pipetoitiin 12-kuoppalevylle pitoisuudessa 120 000 solua/ml/kuoppa ja niiden annettiin kiinnittyä neljä tuntia. Neljän tunnin jälkeen A549- solujen päältä poistettiin medium. Tämän jälkeen A549-solujen päälle pipetoitiin forboli-12-myristaatti-13-asetaatilla (PMA) makrofageiksi erilaistettuja THP-1-soluja pitoisuudessa 24 000 solua/ml/kuoppa. Solut jätettiin inkuboitumaan noin 48 tunniksi +37 °C:een.
4.3.2 Altistus
Altistuskokeet toistettiin kolme kertaa. Altistuksissa käytettiin Farmin 1 ja 2 alle 63 µm rapsuttelemalla kerättyjä vanhaa laskeutunutta pölyä (matriisi 1) sekä petrimaljoille kerättyä laskeutunutta tuoretta pölyä (matriisi 2). Lisäksi käytettiin Farmilta 5 DGI- keräimellä kerättyä pölyä (matriisi 3). Ennen altistusta Farmin 2 ja 3 pölynäytteet
liuotettiin PBS:lla (Phosphate-buffered saline, Sigma-Aldrich, USA) pitoisuuteen 2 mg/ml ja laitettiin ultraäänivesihauteeseen 30 minuutiksi. DGI-näyteputkeen lisättiin 5%:sta DMSO-liuosta (dimetyylisulfoksidi, Merck, Japani), jolla lasisauvan avulla irrotettiin hiukkaset putken pohjasta. Putkeen lisättiin W1503-vettä (Sigma-Aldrich, USA), jotta pölypitoisuudeksi saatiin 2 mg/ml, jonka jälkeen putki laitettiin ultraäänivesihauteeseen 30 minuutiksi.
Tunti ennen altistusta kuoppalevylle vaihdettiin puhdas medium. Levyille pipetoitiin jokaista pölyä duplikaattina kolmena annoksena: 25 µg/ml, 50 µm/ml ja 100 µg/ml.
Hiukkaskorjausta varten tehtiin yksi levy, jonka kuopissa oli vain mediumia ja edellä mainitut pitoisuudet pölyä. Levyjä inkuboitiin +37 °C:ssa 5 % CO2:ssa 18 tuntia.
Altistuksen jälkeen medium kerättiin kuopista ja pakastettiin -80 °C:een myöhempää sytokiinianalyysiä varten. Solut, jotka olivat kiinni kuoppien pohjassa, irrotettiin Trypsin-EDTA-käsittelyllä (Sigma-Aldrich, USA). Viiden minuutin inkuboinnin jälkeen kuoppiin lisättiin FBS-liuosta (Sigma-Aldrich, USA) inaktivoimaan trypsiini.
Solut irrotettiin kuoppien pohjasta ja siirrettiin eppendorf-putkiin MTT-, DCF-, PI- ja solusyklianalyysiä varten.
4.3.3 Solujen metabolinen aktiivisuus
Solujen metabolista aktiivisuutta mitattiin mitokondrioiden aktiivisuutta mittaavalla kolorimetrisellä MTT-testillä, joka perustuu tetrazolium-suolaan (MTT, 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Testi mittaa mitokondrioiden ja endoplasmakalvon kykyä muuntaa MTT-reagenssia värilliseksi formatsaaniksi (Riss ym. 2013). 96-kuoppalevylle pipetoitiin duplikaatteina solususpensiota ja blank- kuoppiin PBS-puskuriliuosta, jossa oli 10 % FBS-liuosta. Tämän jälkeen kuoppiin lisättiin MTT-liuosta. Levy peitetiin kannella ja sitä inkuboitiin 2 tuntia inkubaattorissa +37 °C:ssa, jonka jälkeen kuoppiin lisättiin SDS-puskuria. Levyä inkuboitiin noin 20 tuntia. Värin muutos (absorbanssi) mitattiin levyltä spektrofotometrillä (570 nm, Synergy H1™, Biotek®, USA).
4.3.4 Reaktiivisten happiradikaalien muodostus
DCF (2′,7′-dichlorofluorescein) -testillä mitattiin solujen oksidatiivisen stressin määrää.
DCF-testissä käytetty H2DCF-DA on ei-fluoresoiva lipofiilinen esteri, joka läpäisee helposti plasmamembraanin. H2DCF-DA siirtyy sytosoliin, jossa se hajoaa.
Hajoamistuotteiden hapettuminen johtaa fluoresenssiin, joka voidaan mitata. Värin kirkkaus indikoi reaktiivisten happiradikaalien tuotannosta (Karlsson ym. 2010). Aluksi soluliuos sentrifugoitiin (5 min, 8000 rpm, +4 °C) ja supernatantti poistettiin. Jäljelle jäänyt solunappi suspensoitiin PBS:lla ja solususpensiosta pipetoitiin duplikaatteina 96- kuoppalevylle. Blank-kuoppiin pipetoitiin PBS:a. Kaikkiin kuoppiin lisättiin H2DCF- DA-liuosta (0.5 mM DMSO:ssa, Sigma-Aldrich, USA), jonka jälkeen luettiin fluoresenssi spektrofotometrillä (eksitaatio 485 nm, emissio 528 nm, Synergy H1™, Biotek®, USA). Levyä inkuboitiin 30 minuuttia ja 60 minuuttia valolta suojattuna inkubaattorissa, ja kummassakin aikapisteessä mitattiin fluoresenssi.
4.3.5 Solujen elävyys
Solujen elävyyttä mitattiin PI (Propidium jodidi) -testillä. PI on fluoresoiva väriaine, joka ei kykene läpäisemään elävien solujen solukalvoja. Tämän vuoksi sitä käytetään kuolleiden solujen havaitsemiseen. PI sitoutuu DNA:han interkalaarisesti emästen välille, mikä nähdään fluoresenssin muutoksena (Invitrogen 2006). Aluksi DCF-testissä käytetylle 96-kuoppalevylle pipetoitiin 0,5 mg/ml pitoisuudessa olevaa PI-liuosta jokaiseen kuoppaan. Levyä inkuboitiin kaksi minuuttia levyravistelijassa ja 20 minuuttia inkubaattorissa. Inkuboinnin jälkeen luettiin fluoresenssi spektrofotometrillä (eksitaatio 540 nm, emissio 621 nm, Synergy H1™, Biotek®, USA). Luvun jälkeen kuoppiin pipetoitiin 10 % Triton X-100-liuosta (Amresco), jonka jälkeen levyä inkuboitiin huoneenlämmössä levyravistelijassa 20 min ja luettiin lopullinen fluoresenssi.
4.3.6 Solusyklianalyysi
Solusyklianalyysissä määritetään solujen DNA-pitoisuutta. Solujen DNA voidaan värjätä eri sitoutumisväreillä, kuten PI:lla. Soluilla, jotka ovat esimerkiksi S-faasissa, on enemmän DNA:ta kuin G1-vaiheessa olevilla soluilla, joten S-faasin solut ottavat suhteellisesti enemmän väriainetta sisäänsä ja fluoresoivat kirkkaammin. Jotta väriaine pääsee DNA:han, täytyy solun ulkopintaa muuttaa (fiksata) niin, että väriaine läpäisee sen. Solujen fiksaukseen käytetään yleensä alkoholia (Abcam 2018).
DCF-testistä ylijäänyt soluliuos fiksattiin etanolilla. 15 ml:n kartioputkiin lisättiin 4 ml 70 % etanolia. Kartioputkiin pipetoitiin soluliuosta tipoittain samaan aikaan vorteksoiden. Putket säilöttiin jääkaappiin 2-3 viikoksi, jonka jälkeen suoritettiin PI-
värjäys. Kartioputket sentrifugoitiin (5 min, 1600 rpm, +4 °C), jonka jälkeen putkista dekantoitiin supernatantti pois ja resuspensoitiin solunappi 1 ml PBS:a. Putket sentrifugoitiin uudestaan ja dekantoitiin supernatantti pois sekä resuspensoitiin solunappi 250 µl PBS:a. Soluliuos siirrettiin Canto II -ajoputkiin. Putkiin lisättiin ribonukleaasi A:ta (0,15 mg/ml), jonka jälkeen putket vorteksoitiin. Putket laitettiin inkuboitumaan valolta suojattuna tunniksi +50 °C:een. Inkuboinnin jälkeen putkiin lisättiin PI:ia, vorteksoitiin ja inkuboitiin 30 minuuttia inkubaattorissa + 37 °C:ssa.
Inkuboinnin jälkeen näytteet siirrettiin jäille ja solusyklin vaiheet analysoitiin virtaussytometrillä (BD FACSCanto™ II, BD Bioscience, San Jose, USA).
4.3.7 Sytokiinimääritys
Proinflammatoristen sytokiinien interleukiini 6:n (IL-6) ja tuumorinekroositekijä α:n (TNF-α) määriä mitattiin käyttämällä entsyymivälitteistä immunosorbenttimääritystä (ELISA), joka perustuu vasta-aineiden ja indikaattorimolekyylien käyttöön. Määritys tehtiin valmistajan ohjeiden mukaan (IL-6 ja TNF- α: ThermoFisher Scientific, Wien, Itävalta). Absorbanssi luettiin spektrofotometrillä (450 nm, Synergy H1™, Biotek®, USA).
4.3.8 Tulosten käsittely ja tilastollinen analyysi
Kaikki datankäsittely suoritettiin pääasiassa Excel-ohjelmalla. Virtaussytometrillä saadut solusyklitulokset analysoitiin FlowJo®-ohjelmalla. MTT-testistä saaduille arvoille tehtiin hiukkaskorjaus vähentämällä absorbanssiarvosta hiukkasten tausta-arvo.
Metabolinen aktiivisuus saatiin vertaamalla näytteen absorbanssia kontrollisolujen absorbanssiin. Oksidatiivisen stressin määrä laskettiin fluoresenssiarvoista käyttämällä kaavaa 1 ja vertaamalla tuloksia kontrolliin.
(15 ⨯ 𝑙𝑢𝑘𝑢3)+ (30 ⨯ 𝑙𝑢𝑘𝑢2) − (45 ⨯ 𝑙𝑢𝑘𝑢1), (1) missä luku1 tarkoittaa heti DCF-liuoksen jälkeistä mittausta, luku2 ensimmäisen inkuboinnin jälkeistä mittausta ja luku3 toisen inkuboinnin jälkeistä mittausta.
Solujen elävyyttä laskettaessa tuloksille tehtiin ensin hiukkaskorjaus, jossa mitatusta fluoresenssiarvosta vähennettiin pelkkien hiukkasten antama tausta-arvo.
Elävyysprosentti laskettiin käyttäen kaavaa 2.
100 − (𝑃𝐼𝑎𝑙𝑘𝑢
𝑃𝐼𝑚𝑎𝑥) ⨯ 100, (2)
missä alku tarkoittaa heti PI-liuoksen jälkeistä mittausta ja max Triton-X-100-lisäyksen jälkeistä mittausta.
Tulosten tilastolliseen analyysiin käytettiin GraphPad Prism5 -ohjelmaa. Ohjelmalla tehtiin kaksisuuntainen varianssianalyysi (two-way ANOVA), jolla verrattiin ryhmien arvoja kontrolliin ja tosiinsa Dunnettin testillä. Ohjelma korjasi tulokset Bonferroni- korjauksella. Ohjelma antoi tilastollisesti merkittävät tulokset kolmena p-arvona: * p <
0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
5 TULOKSET
5.1 Hiukkaskeräys
Neljältä maatilalta kerättiin ELPI:llä hiukkasia noin 24 tuntia. Keräysajat, hiukkaslukumäärät ja -massat on esitetty Taulukossa 3. Lukumäärällisesti ja massallisesti hiukkasia oli eniten Farmilla 1 ja vähiten Farmilla 3.
Taulukko 3. Eri maatiloilta kerättyjen hiukkasten kokonaislukumäärät ja -massat.
Farmi 1 Farmi 2 Farmi 3 Farmi 4
Keräysaika 22 h 24 h 23 h 24,5 h
Lukumäärä (kpl/cm3)
1,6⨯109 7,7⨯108 3,2⨯108 6,8⨯108
Massa (mg/m3)
8700 5700 2700 2800
Neljän maatilan hiukkasten lukumääräkokojakauma on esitetty Kuvassa 9. Eniten maatiloilla oli alle 1 µm kokoisia hiukkasia. Farmeilla 1, 2 ja 3 eniten oli 0,12 µm kokoisia hiukkasia, kun taas Farmilla 4 eniten oli 40 nm kokoisia hiukkasia. Suurimmat hiukkasmassat mitattiin Farmeilta 1 ja 2 (Kuva 10).
0.01 0.1 1 10
0 2.0108 4.0108 6.0108
Farmi3 Farmi2
Farmi4 Farmi1
Hiukkaskoko (µm) Lukumäärä dN (dlogDp) (#/cm3 )
Kuva 9. Hiukkasten lukumääräkokojakauma ELPI:llä mitattuna.
0.01 0.1 1 10 0
500 1000 1500 2000 2500
Farmi3 Farmi2
Farmi4 Farmi1
Hiukkaskoko (µm) Massa dW (dlogDp) (mg/m3 )
Kuva 10. Hiukkasten massakokojakauma ELPI:llä mitattuna.
Pussisuodatin-keräyksen jälkeen pussisuodattimesta karistettiin pölyä lasipulloon, mutta pölyä oli kerääntynyt niin vähän ja se oli tarttunut pussiin, ettei se ollut karisteltavissa. Sama ongelma toistui muilla maatiloilla, eikä pussisuodattimella saatu kerättyä pölyä, jota olisi voitu hyödyntää analyyseissä.
5.2 Toksikologiset analyysit
Toksikologisissa analyyseissä käytettiin kolmella eri keräystavalla kolmelta eri kokoiselta maatilalta kerättyä pölyä. Farmista 1 käytetään tuloksissa lyhennettä F1, Farmista 2 lyhennettä F2 ja DGI-keräysnavetasta eli Farmista 5 lyhennettä F5.
Rapsuttelemalla kerätystä vanhasta laskeutuneesta pölystä käytetään lyhennettä M1 (matriisi 1), laskeutuneesta tuorepölystä lyhennettä M2 (matriisi 2) ja DGI:lla kerätystä pölystä lyhennettä M3 (matriisi 3).
5.2.1 Metabolinen aktiivisuus
Pölyaltistus vähensi merkittävästi (p < 0,05) solujen metabolista aktiivisuutta lähes kaikilla keräystavoilla sekä annoksilla (Kuva 11). Farmilta 1 kerätyt pölynäytteet vähensivät metabolista aktiivisuutta enemmän kuin Farmin 2 pölynäytteet. Alhaisin metabolinen aktiivisuus oli Farmin 1 (F1) rapsutuspölylle (M1) altistetuilla soluilla. Eri annoksilla ei ollut nähtävissä selvää annos-vastesuhdetta. Farmin 1 keräystavat erosivat tilastollisesti merkitsevästi toisistaan kaikilla annoksilla, mutta Farmin 2 keräystapojen
välillä ei ollut merkitsevää eroa. DGI-keräysmenetelmä (F5M3) erosi tilastollisesti merkitsevästi Farmin 1 rapsutuspölystä kaikilla annoksilla ja Farmin 2 rapsutuspöly- sekä laskeutuneen tuorepölyn keräysmenetelmästä kahdella alhaisemmalla annoksella (25 ja 50 µg/ml).
F1M1 F1M2 F2M1 F2M2 F5M3
0 50 100
150 25
50 100 Kontrolli
***
**
***
**
***
*
***
***
*** **
***
b c e
b c
e b
c e
a a a
a e
a
e a e e a
c d
a c
d a
Metabolinen aktiivisuus (% kontrollista)
Kuva 11. Solujen metabolinen aktiivisuus. Kolmen eri pölyannoksen (25, 50 ja 100 µg/ml) aiheuttamaa sytotoksisuutta mitattiin MTT-testillä 18 tunnin altistuksen jälkeen.
Tähdet kertovat statistisesta merkitsevyydestä verrattuna kontrolliin (* p < 0,05, ** p <
0,01, *** p < 0,001). Virhepalkit on laskettu keskiarvon keskivirheen (standard error of mean = SEM) perusteella. a osoittaa merkitsevää eroa verrattaessa Farmin 1 matriisi 1:seen (F1M1), b Farmin 1 matriisi 2:seen (F1M2), c Farmin 2 matriisi 1:seen (F2M1), d Farmin 2 matriisi 2:seen (F2M2) ja e Farmin 5 matriisi 3:teen (F5M3) (Dunnett-testi).
5.2.2 Solujen elävyys
Solujen elävyys ei laskenut merkitsevästi eri keräystavoilla tai annoksilla (Kuva 12).
Millään maatilalla tai keräystavalla ei nähty annos-vastesuhdetta. Ainostaan Farmin 1 rapsuttelemalla kerätty vanhan laskeutuneen pölyn (F1M1) 100 µg/ml annos aiheutti tilastollisesti merkittävän (p < 0,05) elävyyden laskun.
F1M1 F1M2 F2M1 F2M2 F5M3 0
50 100 150
25 50 100 Kontrolli
*
% eläviä soluja
Kuva 12. Solujen elävyys. Solujen elävyyttä mitattiin PI-testillä 18 tunnin altistuksen jälkeen kolmella eri pölyannoksella (25, 50 ja 100 µg/ml), jotka oli kerätty kolmelta eri maatilalta kolmella eri tavalla. Tähti kertoo statistisesta merkitsevyydestä verrattuna kontrolliin (* p < 0,05) (Dunnett-testi). Virhepalkit on laskettu keskiarvon keskivirheen (standard error of mean = SEM) perusteella.
5.2.3 Solusykli
Maatilapölyn havaittiin vaikuttavan solusykliin (Kuva 13). Jokaisessa solusylin vaiheessa havaittiin lähes kaikkien maatilojen eri pölynäytteillä annos-vastesuhde.
Keskimäärin Sub-G1/G0-vaiheessa eli apoptoosivaiheessa oli 0,7 % soluista (Kuva 13A). Kaikkien maatilojen ja eri keräystapojen tulokset olivat selvästi kontrollia suurempia. Kaikista eniten apoptoosivaiheessa olivat Farmin 5 DGI-pölylle altistetut solut (p < 0,001). Farmi 1 ja 2 eivät eronneet merkitsevästi toisistaan. Myöskään Farmin 1 ja 2 eri keräystapojen välillä ei havaittu merkitsevää eroa. DGI-keräystapa erosi tilastollisesti merkitsevästi sekä Farmin 1 (F1) että Farmin 2 (F2) molemmista keräystavoista. G1/G0-vaiheessa eli solun kasvu/lepovaiheessa oli keskimäärin 61 % soluista (Kuva 13B). Lähes kaikilla eri annoksilla ja pölynäytteillä tulokset olivat tilastollisesti merkittäviä. Kaikilla maatiloilla ja eri keräystavoilla tulokset olivat selvästi kontrollia suurempia. Farmin 1 rapsutuspölyn (F1M1) korkein annos (100 µg/ml) erosi merkitsevästi saman farmin laskeutuneesta tuorepölystä (F1M2) sekä Farmin 2 rapsutuspölystä (F2M1). Muilla annoksilla Farmin 1 ja 2 välillä ei havaittu merkitsevää eroa yleisesti eikä keräystapojen välillä. DGI-keräystapa erosi merkitsevästi Farmin 1 rapsutuspölystä (F1M1). S-G2/M-vaiheessa eli solun
replikaatiosta solun jakautumiseen siirtymässä oli noin 39 % soluista (Kuva 13C).
Tulokset olivat selvästi kontrollia alhaisempia. Kaikilla pölynäytteillä ja annoksilla tulokset olivat tilastollisesti merkittäviä. Farmin 1 ja 2 välillä ei havaittu merkitsevää eroa yleisesti eikä keräystapojen välillä. Kaikista vähiten S-G2/M-vaiheessa olivat DGI- pölylle altistetut solut. DGI-keräystapa erosi tilastollisesti merkitsevästi keskimmäisellä ja korkeimmalla annoksella (50 ja 10 µg/ml) sekä Farmin 1 (F1) laskeutuneesta tuoreen pölynkeräysmenetelmästä (F1M2) että Farmin 2 (F2) molemmista keräystavoista.
