ESBL-BAKTEERIKANTOJEN ESIINTYMINEN SUOMALAISILLA MATKAILIJOILLA
Opinnäytetyö
Lauri Romakkaniemi Tutkielma Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos / Kliininen mikrobiologia Elokuu 2015
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta
Lääketieteen laitos
Lääketieteen koulutusohjelma
Romakkaniemi, Lauri J.: ESBL-bakteerikantojen esiintyminen suomalaisilla matkailijoilla Opinnäytetutkielma, 38 sivua
Tutkielman ohjaaja: professori Jukka Pelkonen Elokuu 2015
Tutkimuksen tavoite oli selvittää laajakirjoisten beeta-laktamaasia (ESBL) tuottavien
enterobakteerien esiintyvyyttä suomalaisilla ulkomaanmatkailijoilla. Lisäksi tarkoituksena oli kehittää yksinkertainen menetelmä ESBL-kantojen löytämiseen ulostenäytteestä.
Tutkimusaineisto kerättiin Itä-Suomen laboratoriokeskuksen liikelaitoskuntayhtymän kliinisen mikrobiologian erikoisalalta. Ulostenäytteistä etsittiin 3. polven kefalosporiineille resistenttejä gram-negatiivisia sauvabakteereita ja varmistettiin myöhemmin kiekkodiffuusiomenetelmällä ESBL-kannat aidoiksi. 66 matkailijan ulostenäytteestä löytyi 9 ESBL-kantaa (13,6%). Kaikki ESBL-kannat olivat Escherichia coli –lajiin kuuluvia. Lisäksi tutkimuksessa ilmaantui 4 AmpC- kantaa. Aasian matkaajilta (2/5) ja Afrikan matkaajilta (1/3) löytyi suhteessa eniten ESBL- kantoja. ESBL-kannoista yksikään ei ollut resistentti karbapeneemeille. Ulkomaanmatkailun todettiin olevan riskitekijä ESBL-tartunnalle, ja matkakohde vaikuttaa riskin suuruuteen.
Avainsanat: ESBL, matkustus, antibioottiresistenssi
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences
School of Medicine Medicine
Romakkaniemi, Lauri J.: Prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae among Finnish travelers
Thesis, 38 pages
Tutor: professor Jukka Pelkonen August 2015
The objective of this study was to examine the acquisition of extended-spectrum beta-
lactamase (ESBL) producing Enterobacteriacae among the faecal flora after traveling abroad.
In addition, there was an objective to develop a practical method to discover ESBL-strains in faecal samples. The research samples were acquired from department of clinical
microbiology of Eastern Finland Laboratory Centre Join Authority Enterprise. Faecal samples were screened for gram-negative bacilli which had resistance to third-generation
cephalosporins and later verified as positive ESBL-strains by using a disk diffusion test. 9 ESBL-strains of 66 traveler’s samples (13,6%) were found. The ESBL-strains were all Escherichia coli. Furthermore 4 AmpC-strains were discovered. ESBL-strains were found relatively most among travelers visiting Asia (2/5) and Africa (1/3). None of the ESBL-strains were resistant to carbapenems. Traveling abroad was discovered to be a risk factor to acquire ESBL colonization and the geographical area visited had a great impact on acquisition.
Keywords: ESBL, travel, antibiotic resistance
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
Esipuhe
Osallistuin keväällä 2015 kliinisen mikrobiologian kurssille. Koska tämä lääketieteen osa-alue vaikutti mielenkiintoiselta, halusin tutustua siihen paremmin. Otin yhteyden professori Jukka Pelkoseen, joka oli ollut pitämässä kurssin luentoja, ja keskustelimme lääketieteen
opinnäytetyön tekemisestä. Pelkonen esitti idean bakteerien antimikrobiresistenssin
tutkimisesta. Aihe kuulosti kiinnostavalta ja tartuin siihen. Tutkimussuunnitelma käytiin läpi ja sovittiin, että tutkimus aloitetaan kesäkuun alussa.
Tein tutkimusta mikrobiologian erikoisalan työtiloissa Kuopion yliopistollisessa sairaalassa kesäkuussa. Aamupäivisin tarkastelimme Pelkosen kanssa työn etenemistä ja tuloksia sekä päätimme, kuinka tutkimusta olisi järkevintä jatkaa. Työskentelin samoissa tiloissa kuin laitoksen muut työntekijät. Minulla ei ollut omaa työtilaa, vaan käytin muiden työntekijöiden työpisteitä silloin, kun he eivät niissä olleet.
Mikrobiologian laitoksen työntekijät olivat kaikki erittäin mukavia ja ystävällisiä, eivätkä he kokeneet tutkimustyöni häiritsevän heidän omaa työtään. Haluan kiittää laborantti Laura Moilasta, joka perehdytti minut tutkimusmenetelmiin ja jonka työpisteessä suoritin suurimman osan tutkimuksesta. Haluan myös kiittää laborantti Henriikka Rautapäätä, joka vastasi
massaspektrometri-laitteesta ja avusti bakteerilajien tunnistamista.
Suurimman kiitoksen tietysti ansaitsee professori Jukka Pelkonen, joka mahdollisti tutkimuksen ja tuki minua työn eri vaiheissa.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
Sisällys
1 JOHDANTO ...5
2 TEOREETTINEN TAUSTA ...7
2.1 ESBL ...7
2.1.1 ESBL:n määritelmä ...7
2.1.2 ESBL-kannat ...8
2.1.3 ESBL:n aiheuttama infektio ...9
2.1.4 ESBL:n ennaltaehkäisy ... 11
2.1.5 ESBL-testin yleisperiaate ... 12
2.2 AmpC-tyypin beetalaktamaasit ... 13
2.2.1 AmpC:n määritelmä ... 13
2.2.2 AmpC-testin yleisperiaate ... 14
2.3 Aikaisempia havaintoja ESBL-kantojen leviämisestä ... 14
3 TUTKIMUSTEHTÄVÄ ... 16
3.1 Tutkimuksen merkitys ... 16
3.2 Tavoitteet ... 16
4 AINEISTO JA MENETELMÄT ... 18
4.1 Tutkimusaineisto ... 18
4.2 Tutkimusmenetelmät ... 18
4.2.1 ESBL-kantojen seulominen ulosteesta ... 18
4.2.2 Mahdollisten ESBL-kantojen tarkastelu ... 20
4.2.3 ESBL-kantojen varmistus ... 20
4.2.4 Tutkimusmenetelmän parantaminen ... 20
5 TULOKSET ... 22
6 POHDINTA ... 28
6.1 Johtopäätöksiä ... 28
6.2 Tutkimuksen luotettavuuden ja eettisyyden arviointi ... 30
6.3 Jatkotutkimuskohteita ... 30
KIRJALLISUUS ... 32
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
1 JOHDANTO
Antibioottiresistenssi on jokapäiväinen asia, johon törmätään terveydenhuollon alalla.
Antibioottiresistenssi leviää ja kasvaa voimakkaasti mikrobien keskuudessa varsinkin alueilla, joissa hygienian taso on huono ja mikrobilääkityksen käyttö on heikosti säädelty. Yli 1,1 miljardista vuosittaisesta ulkomaanmatkailijasta noin 300 miljoonaa matkustaa
riskiherkimmille alueille (UNWTO 2015). Kansainvälinen matkailu ja eläintalous ovat
huomattavia resistenttien bakteerikantojen leviämisen syitä. Tämä on uhka terveydenhuollolle maailmanlaajuisesti.
Laajakirjoisten beetalaktaamiantibioottien käyttöönoton johdosta on kehittynyt vastaavasti laajakirjoisia beetalaktamaasientsyymejä (ESBL) toimimaan antibiootteja vastaan. Näitä entsyymejä tuottavat bakteerikannat ovat usein resistenttejä tavallisesti käytetyille beetalaktaamiantibiooteille kuten penisilliineille ja kefalosporiineille. ESBL-entsyymejä tuottavien enterobakteerien aiheuttamien infektioiden tiedetään olevan yhteydessä pitkään sairaalahoitojaksoon sekä heikosti toteutettuun antibioottihoitoon, mutta näistä infektioista on syntynyt myös suuri ongelma sairaalahoidon ulkopuolella (Lee JC 2012). ESBL-kantojen aiheuttamien infektioiden hoitaminen on normaalia hankalampaa. Ensimmäinen ESBL-kanta ilmaantui Saksassa 1983, jonka jälkeen niitä on raportoitu tasaiseen kasvavaan tahtiin maailmanlaajuisesti (Paterson DL 2005).
ESBL-kannat ovat harvinaisia Pohjoismaissa, mutta näiden aiheuttamat infektiot ovat kasvussa vuosi vuodelta. Osa ihmisissä tavatuista ESBL-bakteereista arvioidaan olevan lähtöisin elintarvikkeista. Muun muassa Escherichia coli –bakteeri kuuluu myös eläinten suoliston mikrobiflooraan. Tuotantoliha voi saastua ESBL-bakteerikannalla teurastuksessa, ja kasvikset voivat saastua epäpuhtaan kasteluveden seurauksesta. Matkailu on toinen syy, minkä takia ESBL-kannat ovat yleistyneet Pohjoismaissa. Kosketustartuntana leviävä ESBL voi helposti levitä esimerkiksi perheenjäsenten keskuudessa.
ESBL-kantoja tavataan paljon muun muassa Aasiassa ja Pohjois-Afrikassa. Erään
tutkimuksen mukaan likimäärin puolet suomalaisista Etelä-Aasian matkailijoista kantoi ESBL- kantaa suoliston normaalifloorassa (Kantele A. 2015). Ulkomaanmatkailijoiden välityksellä Suomessa yleistyvät ESBL-infektiot ovat huolestuttava kehityssuunta. Koska hygienian edistäminen sekä mikrobilääkkeiden rationaalisen käytön parantaminen ESBL-riskialueilla on hyvin haasteellista, pitäisi mahdollisesti keskittää huomio siihen, kuinka tartunnat voitaisiin ehkäistä matkailun aikana.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää suomalaisilla ulkomaanmatkailijoilla esiintyvien ESBL-kantojen määrät sekä se, mistä tartunnat oli saatu. Suomalaisilta löytyvät ESBL-kannat
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi ovat harvinaisia, joten ulkomaanmatkailijoilta löytyneet ESBL-bakteerit oli hyvin mahdollisesti saatu matkan aikana. Tästä voitiin päätellä, kuinka matkailu altistaa ESBL-tartunnalle.
Tutkimuksen toisena tavoitteena oli keskittyä kehittämään helppo ja taloudellinen menetelmä ESBL-kantojen tunnistamiseen ulostenäytteestä. ESBL:lle on useita tunnistusmenetelmiä, mutta näiden bakteerikantojen löytäminen ulosteesta on monimutkaisempaa. Tutkimuksessa etsittiin kokeilemalla yksinkertainen ja varma tapa ESBL-kantojen löytämiseen, mikä olisi mahdollista toistaa vastaavanlaisessa tutkimuksessa.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
2 TEOREETTINEN TAUSTA
2.1 ESBL
2.1.1 ESBL:n määritelmä
ESBL tulee sanoista Extended-Spectrum Beta-Lactamase (laajakirjoinen
beetalaktamaasientsyymi). Yhteistä ja tarkkaa määritelmää ESBL:lle ei ole. Yleisesti ESBL:n määritelmä on se, että ESBL:t ovat beetalaktamaasientsyymejä, jotka antavat bakteerille vastustuskyvyn penisilliineille, ensimmäisen, toisen ja kolmannen polven kefalosporiineille sekä monobaktaameille hydrolysoiden antibiootin toimimattomaan muotoon (Rawat D.
and Nair D. 2010). ESBL-entsyymejä koodaavia geenejä on tunnistettu yli 300. Laajakirjoisia beetalaktamaasi-entsyymejä koodaavat geenit ovat erityisesti yleisiä gram-negatiivisissa Enterobacteriaceae -heimon sauvabakteereissa (E. coli, Salmonella, Klebsiella Pneumoniae, Proteus). ESBL-geeniominaisuus voi olla sekä bakteerin kromosomissa että plasmideissa, ja se voi siirtyä myös eri bakteerilajien välillä. Bakteereille kehittynyt ESBL-ominaisuus johtuu tavallisesti mutaatiosta beetalaktamaaseja koodaavissa SHV, TEM ja CTX-M geeneissä.
ESBL-entsyymien toiminta estyy useilla beetalaktamaasi-inhibiittoreilla kuten klavulaanihapolla ja tatsobaktaamilla.
Beetalaktaamit ovat joukko antibiootteja, jotka vaikuttavat bakteerien soluseinään. Näihin kuuluvat penisilliinit, kefalosporiinit, karbapeneemit ja monobaktaamit. Beetalaktaamit
sitoutuvat soluseinämää muodostaviin entsyymeihin, penisilliiniä sitoviin proteiineihin, estäen niiden toimintaa. Tällöin nämä proteiinit eivät pysty katalysoimaan ristisidoksia
peptidoglykaaniseinämään, joka ympäröi bakteeria. Bakteeriseinämän heikentyminen johtaa bakteerin hajoamiseen ja kuolemiseen.
Kolmannen sukupolven kefalosporiinit ennustivat 1980-luvun alussa läpimurtoa bakteerien beetalaktaamiresistenssiä vastaan. Nämä antibiootit olivat tehokkaita muun muassa
ampisilliinia hydrolysoivia TEM-1 ja SHV-1 –kantaisia beetalaktamaasientsyymejä vastaan.
Edellä mainitut antibiootit vähensivät antibioottien haittavaikutuksia verrattuna myös gram- negatiivisiin bakteereihin vaikuttaviin aminoglykosideihin. Kuitenkin ensimmäinen
plasmidivälitteinen laajakirjoinen beetalaktamaasientsyymi raportoitiin 1983 (Knothe H. 1983), mikä viittasi siihen, ettei taistelua beetalaktamaasientsyymiä vastaan ole voitettu.
ESBL-kannan kantajuuden kestoa on selvitetty useissa tutkimuksissa. Kantajuuden kesto on keskimäärin noin puoli vuotta, mutta vaihtelee paljon eri potilasryhmien välillä (Birgand G.
2013). Tehoamaton antimikrobilääkehoito pääsääntöisesti pidentää kantajuuden kestoa suotuisen antibioottiselektiopaineen vaikutuksesta (Apisarnthanarak A. 2008).
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi ESBL-bakteerit ovat lisääntyneet maailmanlaajuisesti 2000-luvulla eläimissä ja
elintarvikkeissa. Tärkeimpinä tekijöinä ESBL-kantojen syntymiselle pidetään antibioottien epärationaalista käyttöä ihmisten lääkinnässä ja suurta kulutusta eläintaloudessa. Matkustus lisää tehokkaasti ESBL-kantojen leviämistä globaalisti. Suomessa on aloitettu ESBL-
bakteerikantojen seulonta eläimistä 2010-luvulla järjestelmällisemmin. Toistaiseksi vain kotimaisesta siipikarjasta on etsitty ESBL-bakteerikantoja, joita löydettiin vuonna 2010.
2.1.2 ESBL-kannat
Bakteerien antibioottiresistenssiä aiheuttavat beetalaktamaasit luokitellaan tavallisimmin kahdella eri tapaa: molekulaarisesti Amblerin jaottelutavan mukaan ja funktionaalisesti Bush- Jacoby-Medierosin tavan mukaan (Ambler RP 1991) (Bush K. 1995). Amblerin tapa
ryhmittelee beetalaktamaasit neljään pääryhmään (A-D). Jaottelu perustuu proteiinien homologisuuteen eli aminohappojen samankaltaisuuteen. Bush-Jacoby-Medeirosin tapa luokittelee beetalaktamaasit toiminnallisen samankaltaisuuden mukaan neljään ryhmään ja useaan alaryhmään. Viimeisemmän jakotavan mukaan ESBL kuuluu ryhmään 2be ja niihin 2d ryhmän beetalaktamaaseihin, joilla on samankaltaiset entsyymiominaisuudet kuin 2be ryhmän entsyymeillä.
Bush-Jacoby-Medeirosin jaottelutavassa 2be ryhmän entsyymit johtuvat 2b ryhmän
beetalaktamaaseista (kuten TEM-1, TEM-2 ja SHV-1). 2be:n ”e” –kirjain viittaa siihen, että ryhmän beetalaktamaasientsyymit ovat laajakirjoisia (extended). 2b ryhmän entsyymit pystyvät hydrolysoimaan muun muassa ampisilliinä ja ensimmäisen polven kefalosporiineja, mutta eivät laajakirjoisia kefalosporiineja eivätkä monobaktaameja, joten ne eivät ole ESBL- entsyymejä (Bush K. 1995). TEM-1 beetalaktamaasi on yleisin plasmidivälitteinen ampisilliinia hydrolysoiva entsyymi gram-negatiivisissa bakteereissa (esimerkiksi Escherichia coli), kun taas SHV-1 esiintyy runsainten Klebsiella Pneumoniae –lajissa (Livermore DM 1995). TEM-2 -geeni on harvinaisempi kuin TEM-1, mutta sillä on samanlaiset biokemialliset ominaisuudet.
ESBL-entsyymit ovat peräisin näistä geeneistä ja eroavat muutamien nukleotidien muutosten johdosta. Muutos vaikuttaa entsyymien aktiivisuuteen niin, että ne pystyvät hydrolysoimaan kolmannen polven kefalosporiineja ja monobaktaameja.
ESBL:t ovat Amblerin jakotavassa ryhmässä A, mutta poikkeuksena ryhmän D OXA-tyypin entsyymit pystyvät myös hydrolysoimaan kolmannen polven kefalosporiineja ja
monobaktaameja. Funktionaalisesti OXA-beetalaktamaasit jaotellaan ryhmään 2d. OXA- tyypin beetalaktamaasit ovat saaneet nimensä siitä, että ne pystyvät lisäksi hydrolysoimaan oksasilliiniä (Bush K. 1995).
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi SHV ja TEM ovat olleet yleisimpiä ESBL-muotoja viimeisten vuosikymmenten aikana, mutta nykyään CTX-M kannat ovat lisääntyneet ympäri maailmaa ja niitä pidetään yleisimpinä ESBL-tyyppeinä Escherichia coli –lajissa (Livermore DM 2007). Valtakunnallinen tutkimus Yhdysvalloissa vuosina 2009-2010 osoitti, että 91% sairaalapotilaiden ESBL-kannoista kantoi CTX-M –geeniä (Doi Y. 2013), ja Kiinassa CTX-M:n aiheuttama gram-negatiivisen bakteerin ESBL on yleisin sairaaloissa (Yu Y. 2007) (Munday C. 2004). CTX-M-tyypin beetalaktamaasit pystyvät hydrolysoimaan monia laajakirjoisia beetalaktaamiantibiootteja, erityisesti
kefotaksiimia (Tzouvelekis LS 2000). Useat CTX-M-luokan ESBL:t ovat kuitenkin herkkiä keftatsidiimille, mutta jotkut tyypit, kuten CTX-M-15, pystyvät hydrolysoimaan myös sitä (Baraniak A. 2002). On tärkeä huomata, että sama organismi voi kantaa molempia CTX-M ja SHV-tyypin tai CTX-M ja AmpC –tyypin ESBL-entsyymejä, mikä voi vaikuttaa
antibioottiresistenssin fenotyyppiin (Yan, JJ 2000). Bakteerilla voi olla siis useampia ESBL- entsyymejä (Baraniak A. 2002).
On suuri joukko muita beetalaktamaaseja (PER, VEB, GES, BES, TLA, SFO, IBC ryhmät), jotka ovat myös plasmidivälitteisiä (Bauernfeind A. 1996) (Nordmann P. 1994) (Bonnet R.
2000) (Giakkoupi P. 2000) (Matsumoto Y. 1999) (Mavroidi A. 2001) (Poirel L. 2000) (Poirel L.
1999) (Poirel L. 2001). Ne eivät ole pistemutaatioiden aiheuttamia variaatioita tunnetuista beetalaktamaaseista, ja niitä on rekisteröity löytyneen useita tapauksia eri puolilta maailmaa.
ESBL:n aiheuttaman geenin saaminen selville tapahtuu esimerkiksi DNA sekvensoinnilla PCR-menetelmän avulla.
2.1.3 ESBL:n aiheuttama infektio
Suuren antibioottikulutuksen myötä bakteerien antibioottiresistenssiominaisuus on
vahvistunut ja yleistynyt. Bakteereista on tullut vastustuskykyisiä paljon käytettyjä antibiootteja vastaan, ja potilaiden hoitamiseen joudutaan käyttämään yhä tehokkaampia antibiootteja kuin aikaisemmin. Tämän vuoksi myös mikrobilääkehoidon haittavaikutukset kasvavat.
Laajakirjoiset ja tehokkaammat antibiootit vaikuttavat enemmän suolen mikrobiflooraan kuin kapeakirjoiset.
ESBL-bakteerikannat eivät usein aiheuta ihmiselle oireita eivätkä ongelmia. Kyky tuottaa ESBL-entsyymiä ei itsessään lisää bakteerien taudinaiheutuskykyä, mutta voi haitata selvästi näiden bakteereiden aiheuttamaa taudin hoitoa mikrobilääkkeillä. Monet gram-negatiiviset sauvat kuten E. coli ja Klebsiella kuuluvat ihmisen suoliston normaaliflooraan. Kuitenkin esimerkiksi joutuessaan virtsatielle ne voivat aiheuttaa virtsatietulehduksen. Leikkauksen tai onnettomuuden seurauksena ESBL-suolistobakteerit voivat myös siirtyä suolistosta muualle elimistöön ja aiheuttaa hankalan tulehduksen. Runsaan antibioottien käytön seurauksena ESBL-bakteerit saavat tilaa lisääntyä suolistossa, ja kyky tuottaa ESBL-entsyymiä voi siirtyä muille bakteereille.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi ESBL:n hoito ei ole aivan yksinkertaista. Antibiootin valintaan vaikuttavat useat eri asiat kuten infektion sijainti ja sen vakavuus, potilaan ikä, mahdollinen raskaus ja elinten (maksan ja munuaisen) toimintakyky (Bhattacharya S. 2006). Hoitomahdollisuudet ovat rajalliset. ESBL aiheuttaa bakteerille vastustuskyvyn monille beetalaktaameille paitsi kyfamysiineille ja karbapeneemeille. Myös plasmidivälitteinen ESBL kantaa myös vastustuskykyä muille
antimikrobilääkkeille kuten aminoglykosideille, trimetopriimille, sulfonamideille, tetrasykliineille tai kloramfenikolille (Paterson DL 2000) (Livermore DM 2006). Fluorokinolonit ovat vaihtoehto ESBL:n aiheuttamiin virtsatietulehduksiin, jos ei resistenssiä kinoloneja kohtaan havaita.
Karbapeneemit on kuitenkin huomattu olevan tehokkaampia vakaviin ESBL-infektioihin kuin kinolonit (Jacoby GA 2003).
Beetalaktaami / beetalaktamaasin inhibiittori –yhdistelmä on usein tehokas hoito
bakteerikantaan, jolla on vain yksi ESBL. Mutta kuten aikaisemmin mainittiin, bakteerikannalla voi olla useita ESBL-entsyymejä (Baraniak A. 2002), mikä saattaa vähentää
yhdistelmähoidon tehokkuutta huomattavasti. Yhdistelmähoidon käyttäminen myös lisää näille resistenttien kantojen määrää. Tutkittaessa resistenssin kehitystä in vitro 35:ltä
eurooppalaisilta teho-osastoilta saadusta ESBL-kannoista, vastustuskyky piperasilliini /
tatsobaktaami –yhdistelmää kohtaan nousi 31%:sta vuonna 1994 63%:iin vuosina 1997-1998 (Babini GS 2000). Tämä voi kuitenkin olla käytännöllinen hoito vähemmän vakaviin
infektioihin kuten virtsatietulehdukseen, koska tulehdus on paikallinen, ja antibiootti eritetään suurelta osin virtsan mukana pois elimistöstä (Bhattacharya S. 2006). Lisäksi hoitotapa on potilaalle mieluinen oraalisen annostelun vuoksi. Beetalaktamaasin tuotto voi olla kuitenkin niin suurta, että se riittää bakteerin selviämiseen yhdistelmähoidosta, joten sitä ei tule käyttää vakaviin ESBL-infektioihin. Tämän ohella eläinkokeissa beetalaktaami / beetalaktamaasin inhibiittori –yhdistelmän on huomattu olevan tehottomampi hoito ESBL-infektioihin kuin karbapeneemit (Karadenizli A. 2001).
Kefamysiiniit kuten kefoksitiini ovat neljännen polven kefalosporiineja. Niiden käytöstä ESBL:n hoidossa on julkaistu vähän raportteja (Bedenic B. 2001) (Pangon B. 1989). Eräässä
tutkimuksessa ESBL-kannasta kehittyi resistentti kefoksitiinia kohtaan, ja infektio uusiutui. On myös mahdollista, että ESBL-tuottavan bakteerin soluseinässä tapahtuu muutoksia, jotka aiheuttavat resistenssin kefamysiinejä kohtaan (Samaha-Kfoury JN 2003). Huolimatta hyvistä tuloksista in vitro –kokeissa kefamysiinejä ei suositella ensisijaiseksi hoidoksi ESBL-
infektioissa.
Karbapeneemejä pitäisi käyttää ensisijaisina antibiootteina vakaviin ESBL-infektioihin. In vitro –antibioottiherkkyystesteissä karbapeneemit ovat tehokkaita ESBL-kantoja vastaan, ja
kliinisen kokemuksen kautta karbapeneemit ovat osoittautuneet hyväksi lääkitykseksi infektioon (Burgess DS 2003) (Paterson DL 2000). Imipeneemiä ja meropeneemiä suositellaan käytettävän ESBL sairaalainfektioiden hoitoon, kun taas ertapeneemiä
suositellaan käytettävän avohoidossa (Shah PM 2003). In vitro -kokeissa yhdistelmähoidon
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi (karbapeneemi + muun ryhmän antibiootti) ei ole todettu olevan tehokkaampi ESBL-kantoja vastaan kuin karbapeneemi yksinään. Synerginen vaikutus on huomattu joissakin
tutkimuksissa muttei kaikissa tutkimuksissa (Pattharachayakul S. 2003) (Roussel-Delvallez M.
1995). Vakavissa, kuolemaa uhkaavissa ESBL-infektioissa voi olla perusteltua yhdistää esimerkiksi aminoglykosidi muutamiksi hoidon ensimmäisiksi päiviksi karbapeneemin lisäksi.
ESBL-kantoja suurempi ongelma on kuitenkin karbapenemaaseja muodostavat
enterobakteerit (CPE), jotka ovat resistenttejä karbapeneemeille. Joissakin Kreikan ja Israelin sairaaloissa CPE:t ovat hyvin yleisiä. Suomessa ja useissa Euroopan maissa ne ovat
kuitenkin vielä harvinaisia. Yksittäisiä tapauksia on tullut Suomeen potilassiirtojen mukana (Anttila VJ ja Vaara M. 2011). Mikrobilääkkeiden asianmukainen käyttö turhan
selektiopaineen vähentämiseksi on tärkeää, jotta nämä kannat eivät yleistyisi ja muodostaisi suurta uhkaa.
2.1.4 ESBL:n ennaltaehkäisy
Suomessa ja muissa Pohjoismaissa ongelmamikrobien aiheuttamat infektiot ovat toistaiseksi olleet vähäisiä verrattuna muuhun maailmaan. Yleisimmin ESBL-tartunta saadaan matkalla elintarvikkeita tai käytäessä terveydenhuollon laitoksessa (Kuenzli E. 2014). Elintarvikkeiden valmistuksessa ja kuljetuksessa ei välttämättä käytetä yhtä tarkkoja menetelmiä hygienian suhteen kuin Suomessa, joten ne voivat sisältää ESBL-bakteereita. Myös matkailijoilla, jotka ovat olleet tekemisissä terveydenhuollon kanssa matkan aikana, on ollut suurempi riski saada ESBL-tartunta (Angelin M. 2015).
Elintarvikkeet, joita ei kuumenneta ennen syömistä, saattavat sisältää ESBL-bakteereita.
Muun muassa leivonnaiset ja kuumentamattomat kasvikset ovat mahdollisia tartuntalähteitä.
Tämänlaiset ruoat lisäävät riskiä saada ESBL-tartunta.
Ulkomailla terveydenhuollon kanssa tekemisiin joutuminen on myös toinen suuri riskitekijä.
Antibioottikuurin ottamista lievään tautiin kuten matkailijan ripulitautiin tulisi välttää, koska sen on huomattu olevan riskitekijä saada ESBL-tartunta (Kantele A. 2015). Sairaaloissa sairaiden ihmisen suuren lukumäärän ja antibioottiselektiopaineen vuoksi resistenttien bakteerikantojen tarjonta on runsasta, ja ne leviävät helposti, jos hygieniasta ei huolehdita riittävän hyvin.
Huolellinen suojautuminen suojavarustein ja säännöllinen käsienpesu ovat avaintekijöitä estämään antibioottiresistenttien bakteerikantojen leviäminen. Hoitohenkilökunnan tulisi myös välttää turhien katetrien ja suonensisäisten välineiden asentamista potilaille sekä sijoittaa infektiopotilaat omiin huoneisiin. Yleiset hygieniaohjeet ovat erittäin päteviä ehkäisemään infektiotartuntoja. Ohjeiden laiminlyöminen on iso ongelma.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Suurin riskitekijä on kuitenkin matkustuskohde (Kuva 1). ESBL-tartunnalta onnistuu parhaiten välttymään karttamalla Aasiaa (erityisesti Intiaa) Lähi-Itää ja Pohjois-Afrikkaa. Näille alueille matkustavilla on todettu olleen suurin riski saada ESBL-tartunta (Östholm-Balkhed Å. 2013).
Kuva 1. Matkailijoiden riski saada ESBL-tartunta riippuen matkakohteesta (Östholm-Balkhed Å. 2013).
2.1.5 ESBL-testin yleisperiaate
ESBL-määrityksessä on kaksi vaihetta. Ensimmäisessä vaiheessa rajataan mahdolliset ESBL-kannat kaikista bakteerikannoista käyttämällä 3. polven kefalosporiinia indikaattorina.
Näin löydetään bakteerikannat, jotka ovat resistenttejä, tai joilla on vähentynyt herkkyys 3.
polven kefalosporiinia kohtaan. Toisessa vaiheessa määritetään, onko bakteerikanta aito ESBL-kanta, vai johtuuko antibioottiresistenssi jostain muusta syystä.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Bakteerikannan toteaminen aidoksi ESBL-kannaksi perustuu beetalaktamaasi-inhibiittoreihin, kuten klavulaanihappoon. Inhibiittorit estävät bakteerin beetalaktamaasin toiminnan, ja
bakteerista tulee herkkä antibiootille. Koska ESBL:n kyky inhiboida eri beetalaktaameja vaihtelee, useamman kefalosporiinin käyttäminen parantaa testin luotettavuutta. On kuitenkin riittävää käyttää 3. polven kefalosporiineista kefotaksiimia, joka on herkkä CTX-M-ryhmälle, sekä keftatsidiimia, joka on erinomainen löytämään TEM ja SHV –ryhmän ESBL-kantoja. Jos vain yhtä antibioottia käytetään, paras valinta on kefpodoksiimi (Steward CD 2001). Kuitenkin ainoastaan kefpodoksiimin käyttäminen saattaa johtaa useisiin vääriin positiivisiin muiden resistenssiä aiheuttavien mekanismien vuoksi kuin ESBL:n aiheuttamiin (Livermore DM 2006).
Tässä tutkimuksessa seurattiin EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) ESBL-kiekkodiffuusiotestin ohjetta, jossa tutkitaan antibioottien aiheuttamia bakteerikasvua rajoittavia estorenkaita. Testissä käytetään kahta 3. polven kefalosporiinia, kefotaksiimia (CTX30) ja keftatsidiimi (CAZ30) sekä näiden
klavulaanihappoyhdistelmiä kefotaksiimi-klavulaanihappo (CTX/CV) ja keftatsidiimi- klavulaanihappo (CAZ/CV). Jos toisen tai molempien klavulaanihappoyhdistettyjen
antibioottikiekkojen estorenkaat ovat ≥ 5mm kuin pelkän vastaavan kefalosporiinilla saatu estorengas, kyseessä on ESBL-kanta (Kuva 5) (EUCAST 2012).
2.2 AmpC-tyypin beetalaktamaasit
2.2.1 AmpC:n määritelmä
AmpC-tyypin beetalaktamaasientsyymejä ei lasketa ESBL-entsyymeihin, vaikka ne ovat hyvin samanlainen ryhmä kuin ESBL ja ne hajottavat beetalaktaameja yhtä laajasti kuin ESBL:t.
AmpC-ominaisuutta on esitetty kuuluvan osaksi ESBL:n erikoisryhmään (Giske C. 2009).
AmpC-geenit koodaavat laajakirjoisia AmpC-beetalaktamaasi-entsyymejä. Geenit voivat olla kromosomaalisina osa bakteerilajin normaaliperimää, jolloin sen ilmentyminen on yleensä vähäistä, eikä se juurikaan saa aikaan beetalaktamaasiresistenssiä. Kromosomaalinen
AmpC-geeni voi kuitenkin indusoitua mutaatioiden tai antibioottivaikutuksen johdosta, ja tällöin bakteerikanta muuttuu usein resistentiksi kefalosporiineille, penisilliineille ja
monobaktaameille (THL 2012) eivätkä beetalaktamaasin inhibiittorit kuten klavulaanihappo inhiboi beetalaktamaasientsyymiä. Antibiootit eroavat niiden potentiaalista indusoida AmpC- beetalaktamaasi. Bentsyylipenisilliini, ampisilliini ja kefalosporiineista kefatsoliini ja kefalotin ovat voimakkaita induktoreita ja hyviä substraatteja AmpC-beetalaktamaasille. Kefotaksiimi, piperasilliini ja aztreonaami ovat heikkoja induktoreita ja huonoja substraatteja AmpC-
beetalaktamaasille, mutta nämäkin antibiootit voivat hydrolysoitua ja inaktivoitua, jos
beetalaktamaasia muodostetaan tarpeeksi. Beetalaktamaasin inhibiittorit voivat toimia myös
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi induktoreina, erityisesti klavulaanihappo, jolla on vähäinen AmpC-beetalaktamaasia inhiboiva vaikutus ja paradoksaalisesti voi voimistaa AmpC:n aiheuttamaa antibioottiresistenssiä (Kuva 8) (Kitzis MD 1989).
AmpC-geenejä esiintyy myös plasmideissa, jolloin puhutaan plasmidivälitteisestä AmpC:stä.
Tämä voi siirtyä bakteerikantoihin, joilla ei ole kromosomaalisesti AmpC-geeniä ja näin aiheuttaa näissä kannoissa samanlaisen laajan beetalaktamaasiresistenssin (THL 2012).
Plasmidivälitteinen AmpC on sairaalahygieenisesti merkittävä löydös, ja näiden merkitys on sama kuin ESBL:n.
2.2.2 AmpC-testin yleisperiaate
AmpC-testissä käytetään myös kiekkodiffusioperiaatetta. Tutkimuksessa käytettiin MAST Group ESBL & AmpC-testiä, joka selvittää bakteerikannan AmpC ja ESBL-ominaisuudet.
Testissä antibiootteina toimivat: (A) kefpodoksiimi (CPD10), (B) kefpodoksiimi (CPD10) + ESBL-inhibiittori, (C) kefpodoksiimi (CPD10) + AmpC-inhibiittori ja (D) kefpodoksiimi (CPD10) + ESBL-inhibiittori + AmpC-inhibiittori (MAST Group).
Testissä jokaisen 4 antibiootin estorenkaan ero on ≤ 2mm, jos bakteerikanta on ESBL ja AmpC –negatiivinen. Kannalla on AmpC-ominaisuus, jos A ja B –antibioottikiekkojen sekä C ja D –kiekkojen estorenkaat ovat on < 5mm, ja lisäksi D ja B –kiekkojen sekä C ja A –
kiekkojen estorenkaat ovat ≥ 5mm. Toisin sanoen kefpodoksiimi ja ESBL-inhibiittori eivät rajoita AmpC-kannan kasvua, mutta AmpC-inhibiittorikombinoidut antibioottikiekot rajoittavat (Kuva 9). Testi kertoo myös päällekkäiset ESBL ja AmpC-ominaisuudet, mutta se ei selvitä, ovatko kyseessä kromosomaaliset vai plasmidivälitteiset tyypit.
2.3 Aikaisempia havaintoja ESBL-kantojen leviämisestä
Tammikuussa 2015 julkaistiin Clinical Infectious Diseases -lehdessä tutkimus, joka selvitti antibioottien käytön yhteyttä ESBL-bakteerikantatartuntaan suomalaisilla matkailijoilla.
(Kantele A. 2015). Tutkimuksessa 430 matkailijalta etsittiin ESBL-kantoja ulostenäytteestä ennen matkaa ja sen jälkeen. Suomalaisilta löytyi 5/430 positiivista ESBL-tapausta ennen matkaa ja matkan jälkeen 93/430. Näistä 93:sta ESBL-positiivisesta matkailijasta kolmella oli sama ESBL-kanta kuin ennen matkaa, eli matkan aikana 90/430 henkilöä (21%) sai ESBL- tartunnan. Ulkomaanmatkalla 67% henkilöistä sai matkailijan ripulitaudin. Näistä 26% sai ESBL-tartunnan, kun taas vain 11% henkilöistä, jotka eivät saaneet matkailijan ripulitautia saivat ESBL-tartunnan. Niillä, jotka ottivat ripulitautiin antimikrobilääkitystä, oli suurempi riski saada ESBL. ESBL-tartunnan sai 46% henkilöistä otettuaan antimikrobilääkitystä ripulitautiin, kun taas 17% sai ESBL-tartunnan ilman lääkitystä. Syyksi tähän ehdotettiin elimistön oman mikrobiflooran tuhoutumista antimikrobilääkityksen vaikutuksesta. Elimistön normaalifloora
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi toimii tehokkaana suojana estäen ESBL-kantojen asettumista suolistoon, mutta
antimikrobilääkitys vaurioittaa sitä ja lisää riskiä ESBL-tartunnalle. Lisäksi ESBL-tartunnan riskitekijöihin kuulivat korkea ikä ja matkakohde. Tartuntatapauksista 46% tapahtui Etelä- Aasiasta. Kaakkois-Aasian, Itä-Aasian, Pohjois-Afrikan ja Lähi-Idän matkakohteista saapui seuraavaksi eniten ESBL-tartuntoja. Euroopan, Australian ja Amerikan 57 matkailijasta yksikään ei saanut ESBL-tartuntaa matkan aikana.
Edellä mainitun tutkimuksen yhteenvedossa korostettiin matkailijan ripulitaudilta välttymisen sekä antimikrobilääkityksen ottamisen ainoastaan vakavaan ripulitautiin olevan tärkeimpiä keinoja suojautua ESBL-tartunnalta.
Samanlainen tutkimus suoritettiin myös Ruotsissa. Vuonna 2013 Journal of Antimicrobial Chemotherapy –lehdessä julkaistussa tutkimuksessa seurattiin 226 Skandinavian
ulkopuolelle matkustavaa ruotsalaista (Östholm-Balkhed Å. 2013). Heistä 2,4%:lta löytyi ulostenäytteestä ESBL-kanta ennen matkaa ja matkan jälkeen jopa 30%:lla. Suurin syy ESBL-tartunnalle todettiin olevan matkakohde. Intian niemimaa, Aasia sekä Pohjois-Afrikka olivat pahimpia riskialueita. Lisäksi tutkimuksessa selvitettiin ESBL-kantojen
resistenssitilannetta tavallisimmin käytetyille antibiooteille. Multiresistenssiä todettiin 66%:lla ESBL-tapauksissa. Usein ESBL-kannoilla oli vähentynyt herkkyys 3. polven kefalosporiinin lisäksi sulfa-trimetopriimiä sekä aminoglykosideja vastaan.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
3 TUTKIMUSTEHTÄVÄ
3.1 Tutkimuksen merkitys
ESBL on yleinen ilmiö maailmalla, varsinkin Aasiassa, Lähi-Idässä ja Pohjois-Afrikassa. Hyvin harvalla suomalaisella (1-2 %) tavataan ESBL-bakteerikantoja suoliston normaalifloorassa (Kantele A. 2015). Viime vuosien aikana ovat ESBL-entsyymiä tuottavien bakteerien aiheuttamat infektiot yleistyneet myös Suomessa. Tämä kehityssuunta näyttää olevan maailmanlaajuinen, ja yhdeksi tärkeimmäksi osatekijäksi arvioidaan matkustamista.
Tutkimuksen kannalta oli oletettavissa, että ulkomaanmatkailijoilta löytyy enemmän ESBL- kantoja kuin tavallisesta suomalaisesta väestöstä keskimäärin löytyy. Tässä tutkimuksessa selvitettiin karkealla tasolla, kuinka yleisesti suomalaisilla ulkomaanmatkailijoilla esiintyy ESBL-bakteerikantoja suolistossa.
ESBL-bakteerikantojen yleistyminen suomalaisessa väestössä tarkoittaa sitä, että potilaiden hoidossa tulee ESBL ottaa tarkempaan pohdintaan. Virtsaputken ja peräaukon anatomisen läheisyyden vuoksi ESBL-kannat voivat aiheuttaa virtsatietulehduksen sekä leikkaushaavojen infektioiden suurin lähde on suolistomikrobifloora. Näiden infektioiden hoitoon eivät
välttämättä yleisimmät ja tavallisesti käytetyt antibiootit tehoa.
Runsas ESBL-kantojen löytyminen matkailijoilta osoittaa, että matkustus on huomattava tekijä ESBL:n leviämisessä. Vaikka Suomessa bakteerien antibioottiresistenssin kehitys otetaan vakavasti ja ESBL-kantojen aiheuttamat infektiot hoidetaan tehokkaasti, kiinnitetään kuitenkin vain vähän huomiota siihen, kuinka matkustamisen aikana voisi suojautua tartunnoilta.
Taistelussa mikrobien antibioottiresistenssin kehitystä vastaan on myös tärkeää tartuntojen ennaltaehkäisy.
3.2 Tavoitteet
Tutkimuksen yhtenä tavoitteena oli selvittää karkealla tasolla, kuinka yleisesti suomalaisilta ulkomaanmatkailijoila löytyy ESBL-bakteerikantoja. ESBL-kannat ovat Pohjoismaissa
kohtalaisen harvinaisia, mutta muualla maailmassa, varsinkin Lähi-idässä ja Aasiassa, melko yleisiä. Ulkomaanmatkan aikana on mahdollista saada ravinnon tai jonkun muun välityksellä ESBL-bakteerikanta suoliston normaaliflooraan. Tyypillisesti myös sairaalassa
antibioottiselektiopaineen vaikutuksesta ESBL-kannat leviävät helposti (Angelin M. 2015).
Tutkimus ei ottanut kantaa tarkemmin siihen, mikä on kohderyhmän sukupuoli tai ikä, eikä siihen, miten pitkä oli matkan kesto. Matkailijasta ei ole myöskään diagnoosia ennen matkaa, joten ei voitu sulkea pois sitä mahdollisuutta, että matkailijalla olisi ollut ESBL-bakteerikanta
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi suolistossa jo aikaisemmin. Tarkempien potilastietojen käyttämiseen tutkimuksessa olisi
jouduttu hakemaan eettisen toimikunnan lupa, jota ei tähän tutkimukseen hankittu.
Tutkimuksen toisena tavoitteena on lisäksi selvittää helppo, nopea ja taloudellinen työmenetelmä, jolla löytää ESBL-bakteerikantoja ulostenäytteestä useiden muiden bakteerikantojen seasta.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 Tutkimusaineisto
Tutkimusaineisto kerättiin Itä-Suomen laboratoriokeskuken liikelaitoskuntayhtymän kliinisen mikrobiologian erikoisalalta. Laboratoriokeskukselle saapuu päivittäin ulostenäytteitä Savon alueelta muun muassa Salmonella-todistusta varten. Ulostenäytteet käytiin läpi
tietokannassa, ja tutkimukseen valittiin vain ne näytteet, joihin liittyy matka-anamneesi.
Tutkimusnäytteet kerättiin kesäkuun ajalta. Näytteitä oli tarkoitus kerätä noin sata, mutta sopivia näytteitä saatiin vain 66 (n=66). Näistä näytteistä jopa 18 (27%) saatiin Turkin matkailijoilta. Myös Viron matkailijoita 8 (12%) ja Kreikan matkailijoita 5 (8%) oli useampia.
Tutkimukseen osallistuneet matkailijat olivat muuten matkustaneet suhteellisen tasaisesti maailmalla.
4.2 Tutkimusmenetelmät
4.2.1 ESBL-kantojen seulominen ulosteesta
Elintarviketurvallisuusvirasto Eviralta saadun ohjeen perusteella 1,0 mg/l konsentraatio 3.
polven kefalosporiinia kefotaksiimia liuoksessa on riittävä estämään ei-ESBL bakteerien kasvun (Evira 2014). Tämän toimivuus tarkistettiin tutkimuksen alussa lisäämällä 2 ei-ESBL enterobakteerikantaa E. coli ja Enterobacter aerogenes sekä 2 eri ESBL E. coli
bakteerikantaa (kefotaksiimi c = 1,0 mg/l) rikasteputkiin. Vuorokauden inkuboinnin jälkeen ilmeni, ettei tämä ole riittävä määrä antibioottia. Bakteerikasvu oli sakeaa jokaisessa liuoksessa, eikä kefotaksiimi (c = 1,0 mg/l) riittänyt estämään ei-ESBL –bakteerikantojen kasvua. Rikasteputkien kefotaksiimin vahvuutta tulisi lisätä, jotta ei saataisi turhan monta väärää positiivista tulosta. Tämän vuoksi tehtiin laimennussarja, jossa tutkittiin ei-ESBL bakteerikantojen kasvua kefotaksiimin eri väkevyysliuoksissa (Kuva 2).
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Kuva 2. Kefotaksiimin laimennussarja
Ei-ESBL bakteerikasvua ei havaittu enää ollenkaan kefotaksiimi c = 10,0 mg/l liuoksessa, kun taas ESBL-kannan kasvu oli sakeaa saman vahvuisessa liuoksessa. Tutkimusta päätettiin jatkaa kefotaksiimi c = 10,0 mg/l liuoksella.
Ensimmäinen joukko näytteitä tehtiin tutkimussuunnitelman mukaisesti. Joukossa oli sekalainen ryhmä näytteitä: 5 suomalaista ei-matkailijan näytettä, 8 ulkomaalaistaustaista Suomeen saapunutta tulotarkastuksen kautta saatua näytettä ja 6 suomalaista
matkailijanäytettä. Joukon sekalaisuutta selittää se, että tarkoituksena oli testata
tutkimusmenetelmän toimivuutta. Ei-matkailijat sekä ulkomaalaistaustaiset jätettiin pois tutkimuksesta, koska he eivät kuuluneet tutkimusryhmään.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Ulostenäytettä laitettiin vanutikulla 5,0 millilitran rikasteliuokseen (tyrptonisoija), johon oli
lisätty kefotaksiimia (c = 10,0 mg/l), ja annettiin vuorokauden inkuboitua +35-asteisessa lämpöhuoneessa. Tämän jälkeen tutkittiin, onko putkessa näkyvää bakteerikasvua.
4.2.2 Mahdollisten ESBL-kantojen tarkastelu
Rikasteputkista, joissa havaittiin bakteerikasvua vuorokauden inkuboinnin jälkeen, viljeltiin hajotusviljelmä CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient), EMB (Eosin-Methylne Blue) ja ORI (CHROMagar™) -agarmaljoille. Putkissa saattoi kasvaa muitakin bakteereita kuin ESBL- kantaisia gram-negatiivisia sauvoja kuten enterokokkeja, joihin kefotaksiimilla ei ollut
vaikutusta, joten bakteerikasvu rikasteputkissa ei suoraan viitannut ESBL-kantaan. CLED, EMB ja ORI –maljoilla kasvavat mahdolliset gram-negatiiviset sauvabakteerikannat
varmistettiin massaspektrometri-laitteella. Laitteella pystyttiin tunnistamaan ja nimeämään bakteerikanta. Negatiiviset sauvabakteerit olivat potentiaalisia ESBL-kantoja, ja nämä kannat viljeltiin Müller-Hinton –herkkyysmaljoille, jotta saataisiin varmistus. Maljoilla kasvavista mahdollisista ESBL-bakteeripesäkkeistä tehtiin lisäksi puhdasviljelmät CLED-maljalle.
4.2.3 ESBL-kantojen varmistus
Herkkyysmaljoja tehtiin aluksi kaksi jokaiselle mahdolliselle ESBL-bakteerikannalle.
Ensimmäiselle maljalle lisätään antibiootit ampisilliini, kefalotiini, kefpodoksiimi, kefuroksiimi, trimetopriimi-sulfa, tobramysiini, siprofloksasiini ja piperasilliini-tatsobaktaami, jotka selvittivät yleisesti ESBL-kantojen vastustuskykyä tavallisesti käytetyille antibiooteille. Toiselle maljalle lisättiin antibioottikiekot, jotka hälyttävät ESBL-bakteerikannasta (kefotaksiimi ja keftatsidiimi sekä näiden klavulaanihappokombinaatiot). Näin selvitettiin, onko bakteerikanta aidosti ESBL- kanta.
4.2.4 Tutkimusmenetelmän parantaminen
Edellä mainittu tutkimussuunnitelman metodi todettiin toimivaksi. Tällä menetelmällä löytyi ESBL-bakteerikantoja. Menetelmää kuitenkin muutettiin liiallisen työmäärän ja taloudellisten syiden vuoksi.
Rikasteputkissa oli vuorokauden inkuboinnin jälkeen noin 85%:ssa bakteerikasvua. Ilmeisesti antibiootin sietokykyyn vaikutti se, että näyte oli ulosteesta eikä suoraan bakteeripesästä.
Bakteerien selviytymiskykyä saattoi lisätä myös se, että viljely tapahtui mikrobikasvulle suotuisassa rikasteputkessa. Vaikka useissa tapauksissa bakteerikasvun aiheutti jokin muu kuin gram-negatiivinen sauva kuten enterokokki, johon kefotaksiimilla ei ole vaikutusta, olisi voitu harkita antibiootin konsentraation lisäämistä.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Alkuperäistä tutkimusta muutettiin niin, että bakteerikasvuisesta rikasteputkesta viljeltiin
ainoastaan CLED-maljalle hajotusviljelmä, johon tiheän kasvun alueelle lisättiin kefpodoksiimi-kiekko (10µg). Jos gram-negatiivisia sauvabakteerin näköisiä
bakteeripesäkkeitä kasvoi antibioottikiekon läheisyydessä, kyseessä saattoi olla ESBL-kanta, ja se viljeltiin herkkyysmaljalle. EMB-malja ja ORI-malja jätettiin pois tutkimuksesta, koska ne eivät antaneet erityisesti mitään uutta tietoa. Gram-negatiiviset sauvabakteerit pystyttiin erottamaan muista bakteereista jo CLED –maljan perusteella, ja näin pystyttiin jo
ennustamaan todennäköiset ESBL-bakteerit.
Myöhemmin tutkittiin ESBL-kantojen herkkyydet lisäksi atstreonaamille ja keftriaksonille tarkempien antibioottiresistenssitietojen vuoksi.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
5 TULOKSET
Tutkimuksessa löytyi ulkomaanmatkaajilta enemmän ESBL-bakteerikantoja kuin aikaisempien tutkimusten perusteella suomalaisilta on keskimäärin löytynyt (Taulukko 1).
Taulukko 1. ESBL- sekä AmpC –löydökset suomalaisilta ulkomaanmatkailijoilta.
Matkakohde Lukumäärä n=66 ESBL AmpC
P-Amerikka 2
Bulgaria 1
Espanja 3 1
Intia 1 1
Irlanti 1
Iso-Britannia 1
Italia 3
Kanada 1
Kiina 1
Kreikka 5 2
Kroatia 2
Kypros 1 1
Latvia 2
Malesia 1
Meksiko 1
Namibia 1
Puola 2 1
Saksa 1
Tansania 2 1
Tanska 2
Thaimaa 2 1 2
Turkki 18 2
Unkari 2
Venäjä 2
Viro 8 1
Yhteensä 66 9 (13,6%) 4
Libanon* 9 3 0
Ei Matkoja* 5 0 0
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
*Tutkimusmenetelmää testattaessa tutkittuja näytteitä, jotka eivät sisälly varsinaiseen tutkimusryhmään.
Tutkittiin 66 suomalaisen ulkomaanmatkailijan ulostenäytettä. Näytteistä 13,6% (9/66) sisälsi positiivisen ESBL-löydöksen. Euroopan matkaajia oli selvästi eniten. Heistä 4/36 sai ESBL- tartunnan. Vastaavasti Aasian matkaajista 2/5, Afrikan matkaajista 1/3 ja Lähi-Idän
matkaajista 2/18 saivat ESBL-tartunnan.
Löydettyjen ESBL-bakteerikantojen nimet selvitettiin massaspektrometri-laitteella. Kaikki 9 ESBL-bakteerikantaa olivat Escherichia coli –bakteerilajiin kuuluvia. Yksikään bakteerikanta ei ollut karbapenemaaseja tuottava kanta, vaan kaikki olivat herkkiä ertapeneemille ja meropeneemille. ESBL-kantoja löytyi Espanjan, Intian, Kreikan, Puolan, Tansanian, Thaimaan ja Turkin matkailijoilta.
ESBL-bakteerikantojen löytyminen nopeutui, kun CLED-maljalle hajotusviljelmään lisättiin kefpodoksiimi-antibioottikiekko. Useissa rikasteputkissa kasvoi gram-negatiivisia sauvoja kefotaksiimiliuoksesta huolimatta, joten CLED-maljalle lisätty kefpodoksiimi vähensi väärien ESBL-positiivisten määrää (Kuva 3).
Kuva 3. Esimerkki siitä, kuinka kefpodoksiimi (10µg) estää ei-ESBL bakteerikantojen kasvun.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Kuva 4. Esimerkki mahdollisista ESBL- tai AmpC-bakteerikannasta, joka kasvaa myös kefpodoksiimi-antibioottikiekon (10µg) läheisyydessä.
Menetelmän avulla löydetyt mahdolliset ESBL-bakteerikannat (Kuva 4) viljeltiin
herkkyysmaljoille ja suoritettiin ESBL-testi (Kuva 5), jotta pystyttiin varmistamaan, onko kyseessä tosiaan ESBL-kanta. Kefpodoksiimin lisääminen CLED-maljalle vähensi väärien positiivisten määrää, mutta menetelmä ei ollut täysin varma eikä virallinen ESBL-kannan varmistustapa.
Kuva 5. ESBL-testi. Näyte 36 ESBL Escherichia coli.
Vasemmalla ylhäällä on keftatsidiimi (30µg), jonka estorengas on 6mm.
Vasemmalla alhaalla on keftatsidiimi (30µg) + klavulaanihappo, jonka estorengas on 25mm.
Oikealla ylhäällä on kefotaksiimi (30µg) + klavulaanihappo, jonka estorengas on 33mm.
Oikealla alhaalla on kefotaksiimi (30µg), jonka estorengas on 6mm.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Näyte 36 on yksi suomalaisen ulkomaanmatkailijan näyte, josta löytyi ESBL E. coli
bakteerikanta. Antibioottien estorenkaiden koot täyttävät eurooppalaisen
antimikrobiherkkyysstandardin mukaiset ESBL-määritykset. Klavulaanikombinoitujen antibioottien estorenkaat ovat ≥ 5mm kuin pelkän vastaavan antibiootin estorenkaat.
ESBL-bakteerikannoista selvitettiin lisäksi herkkyydet paljon käytetyille antibiooteille (Kuva 6 ja 7).
Kuva 6. Näyte 36 ESBL Escherichia coli.
Antibiootit myötäpäivään:
meropeneemi, kefuroksiimi, kefpodoksiimi, ampisilliini,
ertapeneemi, trimetopriimi-sulfa, siprofloksasiini ja piperasilliini- tatsobaktaami
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Kuva 7. Näyte 36 ESBL Escherichia coli.
Antibiootit myötäpäivään:
tobramysiini,keftriaksoni, keftatsidiimi, atstreonaami
Näyte 36 ESBL E. coli –bakteerin herkkyydet paljon käytetyille antibiooteille ja niiden estorenkaiden koot.
NÄYTE: 36
Löydös 175 ESCHERICHIA COLI + R=resistant, S=susceptible
kiekko
Ampisill 6mm=R Kefuroxi 6mm=R Aztreona 33mm=S Meropene 35mm=S Caz 30 6mm=R Pipe-taz 23mm=S Caz cv 25mm=S Siproflo 33mm=S Ctx 30 6mm=R Tobramys 33mm=S Ctx cv 33mm=S Trimsulf 30mm=S Ertapene 35mm=S
Kefpodox 6mm=R Keftatsi 33mm=S Keftriax 33mm=S
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Tutkimuksessa ilmaantui 4 AmpC tapausta. Tarkasteltaessa bakteerin antibioottiherkkyyksiä klavulaanihapon kanssa huomattiin, että klavulaanihappo ei lisännyt antibiootin tehoa vaan estorenkaat olivat likimäärin yhtä suuret kuin pelkän vastaavan antibiootin (kuva 8). Tulos viittasi AmpC-bakteerikantaan, ja näin suoritettiin AmpC-testi (kuva 9).
AmpC-ominaisuutta kantoivat bakteerikannat Citrobacter braakii, Bacillus pumilus ja 2 Escherichia coli.
Kuva 8. ESBL-testissä 3. polven kefalosporiini ja tämä yhdistettynä klavulaanihappoon.
Vasemmalla ylhäällä kefotaksiimi + klavulaanihapon estorengas on pienempi kuin oikealla ylhäällä pelkän
kefotaksiimin estorengas.
Sama tapaus on keftatsidiimilla alhaalla.
Vasemmalla alhaalla keftatsidiimin estorengas on suurempi kuin oikealla alhaalla olevan keftatsidiimi +
klavulaanihapon estorengas.
Kuva 9. Positiivinen AmpC-testi.
AmpC-inhibiittorikombinoidut antibioottikiekot C ja D rajoittavat bakteerikannan kasvua.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
6 POHDINTA
6.1 Johtopäätöksiä
Tutkimuksessa 66:sta ulostenäytteestä 9:stä löytyi ESBL E. coli –bakteerikanta (13,6%).
Aikaisempien tutkimusten perustella ESBL-kannat ovat harvinaisia suomalaisessa väestössä.
Tämä tutkimus antaa selkeän viitteen siitä, että ESBL-tartunnan saaminen suoliston normaaliflooraan on varsin mahdollista ulkomaanmatkailun aikana.
ESBL-tartunta on todennäköisintä saada Aasiassa, Lähi-Idässä ja Pohjois-Afrikassa ruotsalaisen tutkimuksen mukaan. Tämän tutkimuksen tulokset korreloivat jonkin verran näihin aikaisempiin tuloksiin huolimatta pienestä tutkimusryhmän koosta. Aasian matkailijoista 2/5 sai ESBL-tartunnan, ja korkeimmalla riskialuella Intiassa käynyt yksi matkailija oli toinen näistä. Myös Afrikan kolmesta matkailijasta yksi sai tartunnan. Matkustuskohde on tämänkin tutkimuksen perusteella oleellinen riskitekijä ESBL-tartunnan kannalta.
Tutkimuksessa ei selvitetty, mikä oli aiheuttanut bakteerien ESBL-ominaisuuden. Kyseessä saattoi olla kromosomaalinen tai plasmidivälitteinen ESBL. Bakteerin genomin selvittämistä ei tehty tässä tutkimuksessa.
Neljä ESBL:ltä vaikuttavaa bakteerikantaa osoittautuivat AmpC-kannoiksi. Nämä kannat löytyivät Kyproksen, Thaimaan ja Viron matkailijoilta. Mielenkiintoista on, että samalta Thaimaan-matkailijalta löytyi kaksi eri AmpC-Escherichia coli-kantaa. CLED-agarilla E. coli kannat olivat selvästi eri näköiset. Tutkimuksessa ei myöskään selvitetty, olivatko AmpC- ominaisuudet aiheuttaneet kromosomaalinen vai plasmidivälitteinen AmpC-geeni. Yhdessä AmpC-tapauksessa 3. polven kefalosporiini yhdistettynä klavulaanihappoon aiheutti
pienemmän estorenkaan kuin pelkkä vastaava kefalosporiini (Kuva 8).
ESBL- ja AmpC-kannat eivät välttämättä aiheuttaneet infektiota kantajilleen. Kuten
aikaisemmin todettiin, nämä ominaisuudet eivät lisää bakteerikannan taudinaiheuttamiskykyä.
Kuitenkin niin kauan kuin ESBL- ja AmpC-kannat säilyvät suoliston mikrobifloorassa, kantajalla on riski sairastua. Pienelle osalle niistä ihmisistä jotka saavat ESBL-tartunnan, kehittyy kliininen infektio, joka voi olla hankalasti hoidettavissa ja lisätä kuolevaisuutta (Schwaber MJ 2006). Erään tutkimuksen mukaan kuolleisuus oli kaksinkertainen sellaisten potilaiden keskuudessa, joilla sepsiksen oli aiheuttanut ESBL-enterobakteeri kuin niillä, joilla sepsiksen oli aiheuttanut tavallinen enterobakteeri (Schwaber MJ 2007). Lisäksi kantajat voivat levittää resistenttejä kantoja läheisilleen.
E. coli oli aiheuttanut suurimman osan Suomessa vuonna 2014 todetuista ESBL-löydöksistä (4190 tapausta) ja Klebsiella pneumoniae oli aiheuttanut 312 tapausta (THL 2014).
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi Antimikrobilääkkeiden rationaalinen käyttö on rajoittanut ESBL-kantojen nopeaa kasvua
Suomessa, mutta ESBL-löydöksien määrä on lisääntynyt vuosittain muun muassa juuri matkustuksen takia. ESBL-infektioiden valvontaan, hoitoon ja tutkimiseen keskitytään hyvin paljon ja niihin käytetään runsaasti varoja, mutta vain vähän kiinnitetään huomiota siihen, kuinka ESBL-tartuntoja voisi vähentää ulkomaanmatkustajilla. Antibioottiresistenssin
kehittyminen mikrobeissa koskettaa kaikkia ihmisiä. Sen merkitystä ja yleisyyttä tulisikin tuoda enemmän julkisuuteen. Lisäksi kannattaisi neuvoa ulkomaanmatkailijoita, miten vähentää mikrobitartunnan vaaraa. Esimerkiksi antimikrobilääkityksen ottaminen matkustajan ripulitautiin lisää riskiä saada ESBL-tartunta (Kantele A. 2015). Lääkityksen ottaminen on tarpeellinen vakaviin oireisiin, mutta lievä ripulitauti usein parantuu itsestään ajan kanssa ilman lääkitystä. Ulkomaanmatkailijoita voitaisiin siis neuvoa välttämään antimikrobilääkitystä, ellei siihen ole todellinen tarve.
Tutkimusmenetelmän muokkaaminen alkuperäisestä tutkimussuunnitelmasta oli perusteltua, ja se vähensi työmäärää. Kefotaksiimi (c = 1,0 mg/l) ei ollut tarpeeksi väkevä erottelemaan ESBL-kantoja rikasteliuoksessa, joten antibioottimäärän lisääminen kymmenkertaiseksi oli tarpeellista. Kuitenkin tutkimuksessa noin 85% rikastepukissa oli bakteerikasvua vuorokauden inkuboinnin jälkeen. Kefotaksiimiliuoksen väkevöiminen edelleen olisi tuskin ollut kuitenkaan järkevää. ESBL-tyyppejä on useita, ja jotkut niistä eivät ole erityisen resistenttejä
kefotaksiimille vaan jollekin muulle laajakirjoiselle kefalosporiinille, mikä olisi voinut johtaa joidenkin ESBL-kantojen kuolemiseen. Tämän lisäksi ulosteessa on paljon muitakin bakteereita kuin gram-negatiivisia sauvabakteereita, joiden kasvua kefotaksiimi ei rajoita.
Usein rikasteputken bakteerikasvun aiheutti jokin sellainen bakteeri kuten jokin enterokokki, joten kefotaksiimiliuoksen väkevöiminen olisi johtanut enemmänkin ESBL-kantojen
kuolemiseen kuin tarkempaan ESBL-kantojen valikointiin.
Tutkimuksessa väärien positiivisten ESBL-löydösten määrä väheni huomattavasti
kefpodoksiimi-antibioottikiekon lisäämisen jälkeen CLED-maljalle mahdollisen ESBL-kannan hajotusviljelmälle ja säästi agar-maljoja. Kefpodoksiimi-kiekko (10µg) oli sopiva valinta, koska sillä löytyi myös heikot ESBL-kannat ja vain harva ei-ESBL-kanta kasvoi antibiootin
läheisyydessä.
Rikasteputkesta CLED-maljalle hajotusviljelemisen jälkeen oli mahdollista erottaa
todennäköisten negatiivisten sauvabakteerien muodostamat bakteeripesät ja tunnistaa laji myöhemmin esimerkiksi massaspektrometrialla. CLED-agaria selektiivisempi kasvatusalusta MacConkey-agar olisi kuitenkin ollut käytännöllisempi valinta varsinkin, jos näytemäärä olisi ollut moninkertainen. MacConkey-agar on suunniteltu gram-negatiivisille bakteereille
erottelemaan laktoosipositiiviset ja laktoosinegatiiviset bakteerit. Tällä kasvualustalla eivät enterokokit olisi kasvaneet toisin kuin CLED-agarilla. Erityisesti työmäärää säästävä ja
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi tehokas menetelmä olisi ollut ulostenäytteen viljeleminen suoraan kefotaksiimia sisältävälle
MacConkey-agarille.
6.2 Tutkimuksen luotettavuuden ja eettisyyden arviointi
Tutkimuksessa päästiin tutkimustavoitteisiin. Opinnäytetyön teossa noudatettiin hyvää tieteellistä menetelmää. Tutkimustyötä tehdessä oltiin huolellisia ja tulokset raportoitiin vilpittömästi. Tutkimuksen teossa käytettiin hyvää lähdekritiikkiä. Tekijän kokemattomuus bakteeriviljelyjen tekemisessä vaikutti välillä hajotusviljelmiin, mutta epäselvissä tilanteissa agar-maljoille tehtiin uudet viljelyt eikä jääty arvailun varaan.
Tutkimuksen suurimman epätarkkuuden aiheutti pieni otoskoko. 66 näytettä on tämänkaltaisessa tutkimuksessa liian pieni, jotta voisi tehdä varmoja johtopäätöksiä.
Asiallinen otoskoko olisi yli 500 näytettä.
Tutkimusta varten ei haettu eettisen toimikunnan lupaa, joten potilastietoja tuli käsitellä niin, ettei ketään pystytty tunnistamaan tutkimuksen perustella. Tämä tarkoitti sitä, ettei potilaan ikää, sukupuolta, aikaisempia sairauksia, matkan kestoa yms. otettu tarkasteluun. Tämä vaikutti tutkimuksen tarkkuuteen heikentävästi. Muun muassa ulkomaanmatkan kesto olisi ollut tärkeä taustatieto, sillä yhden päivän Viron matka ei ole verrattavissa kuukauden mittaiseen Intian matkaan, ja ESBL-tartunnan saaminen ei ole matkan keston vuoksi yhtä todennäköistä.
Bakteerikantoja käsiteltiin bakteerien nimillä ja numeroitiin numerosarjalla, jotta käytännön työ helpottui. Tietokannan potilasnumeroja ei käytetty.
6.3 Jatkotutkimuskohteita
Antibioottiresistenssi yleistyy mikrobeissa. Yhä useammat ihmiset kantavat
ongelmamikrobeja. Resistenttejä bakteereja voi saada ulkomaanmatkalla, mutta myös kotikaupungissa kauppamatkalla. Tätä asiaa vastaan tulisi taistella ja jatkaa tutkimuksia.
Ulkomaanmatkailun tiedetään lisäävän riskiä saada ESBL-tartunta. Olisi mielenkiintoista selvittää riskitekijöitä. Seuraavassa tutkimuksessa tulisi kartoittaa muun muassa
matkailijoiden ikä, antimikrobilääkityksen käyttö matkan aikana, terveydenhoidon laitoksen kanssa tekemisissä oleminen ja matkan kesto, jotta selvitettäisiin näiden tekijöiden vaikutusta ESBL-tartunnalle. On myös vain vähän ja ristiriitaisia tutkimuksia ESBL-kantajuuden kestosta.
Tutkimuksessa ilmaantuneita ESBL-kantajia voitaisi seurata esimerkiksi kuukauden välein tarkkaillen kantajuuden kestoa. Lisäksi ESBL-kantajien läheisiä ihmisiä kuten samassa
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi taloudessa asuvia voitaisiin tarkkailla selvittäen ESBL-kannan mahdollisesta leviämisestä
heihin.
Potilasnäytteiden pienen määrän vuoksi tässä tutkimuksessa ei voitu tehdä tilastollista
analyysiä. Vastaavanlaiseen tutkimukseen pitäisi hankkia moninkertainen näytemäärä. Tässä tutkimuksessa ei ollut esimerkiksi Etelä-Amerikassa matkustaneita. Jatkotutkimuksissa olisi tarpeen olla kattava edustus matkakohteita eri puolilta maailmaa.
Tutkimuksessa olisi ollut mielenkiintoista kerätä diagrammi ESBL-kantojen vastustuskyvystä tutkituille antibiooteille, mutta vain harvasta kannasta kerättiin kaikki antibioottiherkkyystiedot.
Vastaavanlaisessa tutkimuksessa voitaisiin selvittää tarkemmin ESBL-kantojen multiresistenssiä. Erityisesti karbapeneemeille resistentit kannat ovat mielenkiintoisia.
Karbapeneemit ovat ensisijainen hoitokeino vakaviin ESBL-infektioihin, mutta niiden käyttö altistaa näille resistenttien kantojen lisääntymiseen.
Bakteerien ESBL-ominaisuuden aiheuttavaa tekijää olisi mielenkiintoinen tutkia. DNA-
sekvensoinnilla pystytään selvittämään ESBL-entsyymejä koodaavat geenit kromosomista ja plasmidista. Tavallisten TEM, SHV ja CTX-M –kantojen esiintyvyyttä voisi myös selvittää.
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi
KIRJALLISUUS
1. Ambler RP, A. F. Coulson, J. M. Frere, J. M. Ghuysen, B. Joris, M. Forsman, R. C.
Levesque, G. Tiraby, and S. G. Waley. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem.. J. 1991. [PubMed]
2. Angelin M., Forsell J., Granlund M., Evengård B., Palmgren H., Johansson A. Risk factors for colonization with extended-spectrum beta-lactamase producing
Enterobacteriaceae in healthcare students on clinical assignment abroad: A prospective study. Travel Med. Infect. Dis. 2015. [PubMed]
3. Anttila VJ ja Vaara M. Superbakteeri NDM-1 on todellinen uhka. Duodecim. 2011.
[Duodecim]
4. Apisarnthanarak A., Bailey T., Fraser V. Duration of Stool Colonization in Patients Infected with Extended-Spectrum ²-Lactamase–Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Clin. Infect. Dis. 2008. [PubMed]
5. Babini GS, and D. M. Livermore. Antimicrobial resistance amongst Klebsiella spp.
collected from intensive care units in Southern and Western Europe in 1997-1998. J.
Antimicrob. Chemother. 2000. [PubMed]
6. Baraniak A., E. Sadowy, W. Hryniewicz, and M. Gniadkowski. Two different extended- spectrum beta-lactamases (ESBLs) in one of the first ESBL-producing Salmonella isolates in Poland. J. Clin. Microbiol. 2002. [PubMed]
7. Baraniak A., J. Fiett, W. Hryniewicz, P. Nordmann, and M. Gniadkowski. Ceftazidime- hydrolysing CTX-M-15 extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) in Poland. J.
Antimicrob. Chemother. 2002. [PubMed]
8. Bauernfeind A., Stemplinger I, Jungwirth R, Mangold P, Amann S, Akalin E, et al.
Characterization of beta-lactamase gene blaPER-2, which encodes an extended-spectrum class A beta-lactamase. Antimicrob. Agents Chemother. 1996. [PubMed]
9. Bedenic B., N. Beader, and Z. Zagar. Effect of inoculum size on the antibacterial activity of cefpirome and cefepime againstKlebsiella pneumoniae strains producing SHV
extended-spectrum beta-lactamases. Clin. Microbiol. Infect. 2001. [PubMed]
10. Bhattacharya S. ESBL-From petri dish to the patient. Indian J. Med.
Microbiol. 2006. [PubMed]
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi 11. Birgand G., Armand-Lefevre L., Lolom I., Ruppe E., Andremont A., Lucet JC. Duration of
colonization by extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae after hospital discharge. Am. J. Infect. Control. 2013. [PubMed]
12. Bonnet R., Sampaio JL, Chanal C, Sirot D, De Champs C, Viallard JL, et al. A novel class A extended-spectrum beta-lactamase (BES-1) in Serratia marcescens isolated in
Brazil. Antimicrob. Agents Chemother. 2000. [PubMed]
13. Burgess DS, R. G. Hall, Jr., J. S. Lewis, Jr., J. H. Jorgensen, and J. E. Patterson. Clinical and microbiologic analysis of a hospital's extended-spectrum beta-lactamase-producing isolates over a 2-year period. Pharmacotherapy. 2003. [PubMed]
14. Bush K., G. A. Jacoby, and A. A. Medeiros. A functional classification scheme for beta- lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents
Chemother. 1995. [PubMed]
15. Coque TM, Baquero F, Canton R. Increasing prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae in Europe. Euro Surveill. 2008. [Eurosurveillance]
16. Doi Y, Park YS, Rivera JI, Adams-Haduch JM, Hingwe A, Sordillo EM, Lewis JS, 2nd, Howard WJ, Johnson LE, Polsky B, Jorgensen JH, Richter SS, Shutt KA, Paterson DL.
Community-associated extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli infection in the United States. Clin. Infect Dis. 2013. [PubMed]
17. EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance. 2012. [EUCAST]
18. Evira 2014, ohjeistus löytää esbl
http://www.evira.fi/files/attachments/fi/evira/tapahtumat/labra/laba2014/esbl_mrsa__suvi_n ykasenoja.pdf
19. Giakkoupi P., Tzouvelekis LS, Tsakris A, Loukova V, Sofianou D, Tzelepi E. IBC-1, a novel integron-associated class A beta-lactamase with extended-spectrum properties produced by an Enterobacter cloacae clinical strain. Antimicrob. Agents Chemother. 2000.
[PubMed]
20. Giske C., Sundsfjord A, Kahlmeter G, Woodford N, Nordmann P, Paterson D, Cantón R, Walsh T. Redefining extended-spectrum beta-lactamases: balancing science and clinical need. 2009. [PubMed]
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi 21. Jacoby GA, Chow N, Waites KB. Prevalence of plasmid-mediated quinolone
resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 2003. [PubMed]
22. Kantele A., Tinja Lääveri, Sointu Mero, Katri Vilkman, Sari H. Pakkanen, Jukka Ollgren, Jenni Antikainen, and Juha Kirveskari. Antimicrobials Increase Travelers’ Risk of
Colonization by Extended-Spectrum Betalactamase-Producing Enterobacteriaceae. Clin.
Infect. Dis. 2015. [PubMed]
23. Karadenizli A., B. Mutlu, E. Okay, F. Kolayli, and H. Vahaboglu. Piperacillin with and without tazobactam against extended-spectrum beta-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa in a rat thigh abscess model. Chemotherapy. 2001. [PubMed]
24. Kitzis MD, B. Ferre, A. Coutrot, J. F. Acar, and L. Gutmann. In vitro activity of combinations of beta-lactam antibiotics with beta-lactamase inhibitors against
cephalosporinase-producing bacteria. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. 1989. [PubMed]
25. Knothe H., P. Shah, V. Krcmery, M. Antal, and S. Mitsuhashi. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella
pneumoniae and Serratia marcescens. 1983. [PubMed]
26. Kuenzli E., Jaeger VK, Frei R., Neumayr A., DeCrom S., Haller S., Blum J., Widmer AF, Furrer H., Battegay M., Endimiani A., Hatz C. High colonization rates of extended- spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli in Swiss travellers to South Asia- a prospective observational multicentre cohort study looking at epidemiology, microbiology and risk factors. BMC Infect. Dis. 2014. [PubMed]
27. Lee JC, Lee NY, Lee HC, Huang WH, Tsui KC, et al. Clinical characteristics of urosepsis caused by extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli or Klebsiella pneumonia and their emergence in the community. J Microbiol. Immunol. Infect. 2012.
[PubMed]
28. Livermore DM, Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin. Microbiol.
Rev. 1995. [PubMed]
29. Livermore DM, Canton R, Gniadkowski M, Nordmann P, Rossolini GM, Arlet G, Ayala J, Coque TM, Kern-Zdanowicz I, Luzzaro F, Poire L, Woodford N. CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe. 2007. [PubMed]
30. Livermore DM, Paterson DL. Pocket guide to extended spectrum β-lactamases in resistance. J. Antimicrob. Chemother. 2006. [OxfordJournals]
Itä-Suomen yliopisto | Lauri Romakkaniemi 31. MAST Group ESBL & AmpC Detection Disc Sets
http://www.mastgrp.com/Identification%20products/Glossies/ESBL_6pp.pdf
32. Matsumoto Y., Inoue M. Characterization of SFO-1, a plasmid-mediated inducible class A beta-lactamase from Enterobacter cloacae. Antimicrob. Agents
Chemother. 1999. [PubMed]
33. Mavroidi A, Tzelepi E, Tsakris A, Miriagou V, Sofianou D, Tzouvelekis LS. An integron- associated beta-lactamase (IBC-2) from Pseudomonas aeruginosa is a variant of the extended-spectrum beta-lactamase IBC-1. J Antimicrob. Chemother. 2001. [PubMed]
34. Munday C, Xiong J, Li C, Shen D, Hawkey P. Dissemination of CTX-M type β-lactamases in Enterobacteriaceae isolates in the People’s Republic of China. Int. Antimicrob. Agents.
2004. [PubMed]
35. Nordmann P, Naas T. Sequence analysis of PER-1 extended-spectrum beta-lactamase from Pseudomonas aeruginosa and comparison with class A beta-lactamases. Antimicrob.
Agents Chemother. 1994. [PubMed]
36. Pangon B., C. Bizet, A. Bure, F. Pichon, A. Philippon, B. Regnier, and L. Gutmann. In vivo selection of a cephamycin-resistant, porin-deficient mutant of Klebsiella
pneumoniae producing a TEM-3 beta-lactamase. J. Infect. Dis. 1989. [PubMed]
37. Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum β-Lactamases: A clinical update. Clin.
Microbiol. Rev. 2005. [PubMed]
38. Paterson DL, Recommendation for treatment of severe infections caused by
Enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases (ESBLs). Clin. Microbiol.
Infect. 2000. [PubMed]
39. Pattharachayakul S., M. M. Neuhauser, J. P. Quinn, and S. L. Pendland. Extended- spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Klebsiella pneumoniae: activity of single versus combination agents. J. Antimicrob. Chemother. 2003. [PubMed]
40. Poirel L, Le Thomas I, Naas T, Karim A, Nordmann P. Biochemical sequence analyses of GES-1, a novel class A extended-spectrum beta-lactamase, and the class 1 integron In52 from Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 2000. [PubMed]
41. Poirel L, Naas T, Guibert M, Chaibi EB, Labia R, Nordmann P. Molecular and biochemical characterization of VEB-1, a novel class A extended-spectrum beta-lactamase encoded by an Escherichia coli integron gene. Antimicrob. Agents Chemother. 1999. [PubMed]
