PROTEOSTASIAN ROOLI DIABETEKSEN AIHEUTTAMASSA RETINOPATIASSA
Elisa Kainulainen Tutkielma Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos/
silmätaudit Joulukuu 2021
Lääketieteen koulutusohjelma
KAINULAINEN, ELISA: Proteostasian rooli diabeteksen aiheuttamassa retinopatiassa Opinnäytetutkielma, 26 sivua
Tutkielman ohjaajat: Johanna Ruuth, Professori Kai Kaarniranta Joulukuu 2021
Diabetes on yksi nopeimmin yleistyvä sairaus maailmassa. Yli puoli miljoonaa suomalaisista sairastaa diabetesta. Joka kolmannella diabeetikolla on diabeteksen aiheuttaman retinopatian muutoksia verkkokalvolla. Diabeettinen retinopatia onkin yksi tärkeimmistä näkövammaisuuden aiheuttajista työikäisillä maailmalla. Jos diabetes ei ole hoitotasapainossa, se voi johtaa krooniseen hyperglykemiaan, joka lisää tulehdusta ja hapetusstressiä verkkokalvon verisuonissa. Nämä aiheuttavat verisuonten endoteeliin vaurioita ja toimintahäiriöitä. Endoteelin vaurioiden lisäksi hiussuoniin voi muodostua tukoksia, jotka yhdessä aiheuttavat hapen ja ravinteiden puutetta. Hapetusstressin,
tulehduksen ja hapenpuutteen seurauksena autofagian ja proteasomien toiminta heikkenee.
Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää vaikuttavatko Alzheimerin taudin riskigeenien mutaatiot, APP/PSEN1dE9 x CX3CR1GFP/GFP, yhdessä ruokavaliolla aiheutetun diabeteksen kanssa diabeettisen retinopatian kehittymiseen. Retinopatian kehittymistä kuvaavien aggregaatiomarkkereiden, LC3:n ja p62:n, ilmentymistä verrattiin
transgeenisten ja villityypin hiirien välillä. Aggregaatiomarkkereiden ilmentyminen kertoi autofagian ja ubikitiini-proteasomi-järjestelmän aktiivisuudesta.
Alzheimerin taudin vaikutusta diabeettisen retinopatian kehittymiseen tutkittiin, koska Alzheimer-potilailla on havaittu lisääntynyttä näön heikkenemistä normaaliväestöön verrattuna. Lisäksi Alzheimerin taudissa ja diabeteksessa on yhteisiä riskitekijöitä sekä samankaltaisia muutoksia, kuten hapetusstressi ja proteiiniaggregaatit verkkokalvolla.
Tulosten perusteella diabetes heikentää autofagiaa. Lisäksi mutaatioilla on yhteys diabeettisen retinopatian nopeammalle kehittymiselle, sillä transgeenisillä rasvarehua syöneillä hiirillä autofagia oli heikompaa kuin rasvarehua syöneillä villityypin hiirillä.
Medicine
KAINULAINEN, ELISA: The role of proteostasis in diabetic retinopathy Thesis, 26 pages
Tutors: Johanna Ruuth and Professor Kai Kaarniranta December 2021
Diabetes is one of the most fastest growing diseases in the world. There are over half a million people with diabetes in Finland. One in three diabetics has retinopathy-induced changes in their retina. Diabetic retinopathy is one of the leading causes of visual
impairment in people of working age. If diabetes is not managed appropriately, it may lead to chronic hyperglycemia, which in turn increases inflammation and oxidative stress in the blood vessels of the retina. Inflammation and oxidative stress damage the endothelium and lead to endothelial dysfunction. In addition to the endothelial damage, blockages can form in the capillaries, which together cause ischemia. As a result of oxidative stress,
inflammation, and ischemia, autophagy and the function of proteasomes decreases.
The aim of the study was to determine whether mutations in the risk genes of Alzheimer’s disease, APP / PSEN1dE9 x CX3CR1GFP/GFP, together with diet-induced diabetes, affect the development of diabetic retinopathy. The expression of aggregation markers describing the development of retinopathy, LC3 and p62, was compared between transgenic and wild- type mice. Aggregation markers indicated activity of the autophagy and the ubiquitin- proteasome system.
The effect of Alzheimer’s disease on the development of diabetic retinopathy was studied because increased visual impairment has been observed in Alzheimer’s patients when compared to people without the disease. In addition, Alzheimer’s disease and diabetes share common risk factors and cause similar changes such as oxidative stress and protein aggregates in the retina.
Results show that diabetes reduces autophagy. Furthermore, it was found that mutations in the risk genes are associated with a faster development of diabetic retinopathy, as
transgenic fat-fed mice had more impaired autophagy than wild-type fat-fed mice.
Aβ Beta-amyloidi
AGE Glykaation lopputuote APP Amyloidiprekursoriproteiini IDE Insuliinia hajottava entsyymi PSEN 1 Preseniliini 1
PSEN1dE9 Preseniliini-1-geenin eksoni 9:n deleetio UPS Ubikitiini-proteasomi-järjestelmä
VEGF Verisuonten endoteelin kasvutekijä
1 TAUSTAKAPPALE ... 6
1.1 Yleistä diabeettisesta retinopatiasta ... 6
1.2 Diabeettisen retinopatian kehittyminen ... 6
1.3 Diabeettisen retinopatian luokittelu ... 7
1.4 Alzheimerin tauti ja sen yhteys diabeettiseen retinopatiaan ... 10
2 HÄIRIINTYNEET SOLUN HAJOTUSJÄRJESTELMÄT ... 13
2.1 Yleistä autofagiasta ja ubikitiini-proteasomi-järjestelmästä ... 13
2.2 LC3, p62 ja ubikitiini ... 14
2.3 Hajotusjärjestelmien heikentynyt toiminta ... 15
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ... 17
3.1 Tutkimuskysymykset ... 17
4 MENETELMÄT ... 19
5 TULOKSET ... 21
6 POHDINTA ... 25
7 YHTEENVETO ... 28
8 LÄHDELUETTELO ... 29
1 TAUSTAKAPPALE
1.1 Yleistä diabeettisesta retinopatiasta
Diabeettinen retinopatia on silmän verkkokalvosairaus, joka on yksi yleisimmistä diabeteksen liitännäissairauksista. Diabetesta sairastaa yli puoli miljoonaa suomalaista ja se on yksi nopeimmin yleistyvistä sairauksista niin Suomessa kuin maailmallakin. Tähän ovat vaikuttaneet elintavat kuten vähäinen liikunta ja rasvainen ruokavalio (Tyypin 2 diabetes:
Käypä hoito -suositus, 2018).
Diabeettinen retinopatia on yksi tärkeimmistä näkövammaisuuden aiheuttajista työikäisillä maailmalla. Joka kolmannella diabeetikolla on retinopatian muutoksia verkkokalvolla (Cheung ym. 2010). Tyypin 1 diabetesta sairastaa Suomessa noin 50 000 ja joka toisella on diabeettisen retinopatian muutoksia. 20 vuotta sairastettuaan tyypin 1 diabetesta 80-100
%:lle kehittyy retinopatia. Tyypin 2 diabeetikoita on diagnosoitu Suomessa 200 000 ja lisäksi 200 000:lla tauti on toteamatta. Heistä joka kolmannella on diabeettisen retinopatian muutoksia. Tyypin 2 diabeetikoilla pisimmälle kehittyneimmän muodon eli proliferatiivisen retinopatian riski on pienempi kuin tyypin 1 diabeetikoilla. Tyypin 1 diabeetikoiden verkkokalvomuutokset ovat siis useammin vakavampia. Alle 10-vuotiailla silmänpohjanmuutokset ovat harvinaisia. Retinopatian esiintyvyys lisääntyy diabeteksen keston pidentyessä. Tupakointi, ylipaino ja kohonnut verenpaine lisäävät riskiä verkkokalvosairaudelle diabeetikolla (Seppänen, 2018).
Muutokset silmänpohjassa kehittyvät vähitellen, ilman näköoireiden ilmenemistä.
Tyypillisiä oireita ovat viivojen vääristyminen ja näön sumeneminen. Hoitamattomana diabeettinen retinopatia voi johtaa näkökyvyn menetykseen. Tämän takia diabetesta sairastavien silmänpohjia tutkitaan säännöllisesti ja hoito pyritään aloittamaan ajoissa.
Näkövamman syntymistä pyritään estämään joko laserhoidolla, kirurgisilla toimenpiteillä tai lääkehoidoilla riippuen retinopatian vaikeusasteesta (Diabeettinen retinopatia: Käypä hoito -suositus, 2014).
1.2 Diabeettisen retinopatian kehittyminen
Tyypin 2 diabeteksessa insuliinin vaikutus on heikentynyt eli henkilölle on kehittynyt insuliiniresistenssi. Lisäksi sairauteen liittyy insuliininpuute. Nämä aiheuttavat kohonneen veren glukoosipitoisuuden eli hyperglykemian. Tyypin 2 diabeetikoilla on usein muitakin
sairauksia, kuten kohonnut verenpaine eli hypertensio sekä metabolinen oireyhtymä (Tyypin 2 diabetes: Käypä hoito -suositus, 2018). Pitkään jatkunut hyperglykemia sekä hypertensio lisäävät riskiä sydän- ja verisuonisairauksiin, kuten retinopatiaan sekä sepelvaltimotautiin (Mayeda ym. 2015).
Hyperglykemia aiheuttaa muun muassa tulehdusta ja hapetusstressiä verisuonistoon. Ne yhdessä hypertension kanssa vahingoittavat verkkokalvolla verisuonten sisäpintaa eli endoteelia, joka aiheuttaa endoteelin toimintahäiröitä. Lisäksi hiussuoniin voi syntyä tukkeumia. Näistä seuraa hapen ja ravinteiden puutetta. Verkkokalvo pyrkii mukautumaan tilanteeseen esimerkiksi verisuonien uudismuodostuksen eli angiogeneesin avulla (Cheung ym. 2010).
Diabeteksessa antioksidanttientsyymien aktiivisuus vähenee verkkokalvolla, jolloin reaktiivisten happiyhdisteiden määrä lisääntyy. Tällöin muodostuu hapetusstressiä eli oksidatiivista stressiä, joka lisää väärinlaskostuneiden proteiinien ja vaurioituneiden soluelimien määrää. Oksidatiivinen stressi, krooninen tulehdus ja autofagia ovat osallisia diabeettisen retinopatian synnyssä (Dehdashtian ym. 2018). Autofagian heikentynyt toiminta johtaa väärinlaskostuneista proteiineista muodostuvien proteiiniaggregaattien kertymiseen. Taudin edetessä pidemmälle stressi soluissa pahenee ja proteiiniaggregaatteja kertyy. Nämä heikentävät solun toimintaa, mikä lopulta johtaa solukuolemaan (Shruthi ym.
2017).
Kroonisen tulehduksen tunnusmerkkejä ovat verisuonten lisääntynyt läpäisevyys eli permeabiliteetti, turvotus, tulehdussolujen tunkeutuminen kudoksiin sekä lisääntynyt tulehdussytokiinien määrä. Näitä ilmenee diabeettisessa retinopatiassa hyperglykemian seurauksena (Antonetti ym. 2006).
Hyperglykemia lisää proteiinien ei-entsymaattista sokeroitumista eli glykaatiota. Glykaation lopputuotteita ovat AGE-yhdisteet (Advanced Glycation End products). AGE-yhdisteet lisäävät oksidatiivista stressiä, joka kasvattaa riskiä solukuolemaan. Verisuonien tukisolut eli perisyytit ilmentävät AGE-reseptoreita ja ovat siten herkkiä AGE:n aiheuttamille vaurioille ja solukuolemalle (Witmer ym. 2003).
1.3 Diabeettisen retinopatian luokittelu
Diabeettinen retinopatia luokitellaan diabeettiseen makulopatiaan, taustaretinopatiaan ja proliferatiiviseen retinopatiaan (kuva 1). Taustaretinopatia eli ei-proliferatiivinen retinopatia
on retinopatian varhainen muoto. Verkkokalvolla havaitaan mikroaneurysmia eli verisuonissa esiintyviä pieniä pullistumia sekä vähäisiä verenvuotoja. Muutosten lisääntyessä, ilman uudissuonten muodostusta, puhutaan preproliferatiivisesta retinopatiasta.
Tyypillisiä löydöksiä preproliferatiivisessa retinopatiassa ovat verenvuodot, perisyyttikato, lipidikertymät sekä hiussuoniston poikkeavuudet verkkokalvolla eli intraretinaaliset mikrovaskulaariset muutokset (Wong ym. 2016). Hyperglykemia lisää AGE:n, oksidatiivisen stressin ja tulehduksen määrää, mikä aiheuttaa hiussuonten endoteelissa toimintahäiriöitä (Cheung ym. 2010). Verkkokalvon verenkierto heikkenee tulehduksen, verisuonien tukkeumien ja verisuonivaurioiden takia. Tästä seuraa hapenpuute, joka lisää verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) tuotantoa endoteelisoluista. Tämä edistää hiussuoniston muutoksia, pyrkien hapenkuljetuksen parantumiseen (Arya ym. 2019).
Kuva 1. Retinopatian edetessä verkkokalvolla tapahtuu muutoksia. Ei-proliferatiivisessa retinopatiassa havaitaan lipidikertymiä, mikroaneurysmia ja pientä verenvuotoa. Pre- proliferatiivisessa retinopatiassa nämä muutokset lisääntyvät ja perisyyttien määrä vähenee.
Lisäksi verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ja tulehdussytokiinien eritys lisääntyy.
Tilanteen edetessä proliferatiiviseksi retinopatiaksi, verkkokalvolla näkyy lisäksi uudissuonien muodostumista (Wong ym. 2016).
Pahimmillaan sairaus etenee proliferatiiviseksi retinopatiaksi, jolloin verkkokalvolle on muodostunut uusia verisuonia ja vuodot ovat laajempia (kuva 2). Hapenpuute ja sen seurauksena erittyvät VEGF ja erytropoietiini ovat tärkeitä tekijöitä uudissuonten muodostuksessa (Cheung ym. 2010). Uudessa verisuonikudoksessa on myös sidekudosta.
Ajan kanssa se voi alkaa supistumaan ja aiheuttaa vetoa, jolloin verkkokalvon irtautuminen on mahdollista. Irtauma voi rikkoa hauraita uudissuonia ja johtaa verenvuotoon. Näön menetyksen mahdollisuus on suurin verkkokalvon irrotessa makulan eli tarkan näkemisen alueelta (Neely ym. 1998).
Kuva 2. Silmänpohjakuva proliferatiivisesta retinopatiasta oikeasta silmästä.
Verkkokalvolla näkyy uudissuonia (keltainen nuoli), mustia pistemäisiä mikroaneurysmia (sininen nuoli), mustina laikkuina verenvuotoja (punainen nuoli) sekä vaaleita lipidikertymiä (vihreä nuoli) (Diabeettinen retinopatia: Käypä hoito -suositus, 2014 (viitattu 26.6.2020). www.käypähoito.fi, muokattu).
VEGF ja endoteelin toimintahäiriöt lisäävät suonten permeabiliteettiä, jolloin plasmaa pääsee tihkumaan suonten ulkopuolelle. Tämä aiheuttaa turvotusta, joka kuuluu makulopatian oireisiin. Mikroaneurysmista tihkuva veri aiheuttaa myös turvotusta.
Makulopatia voi olla paikallista tai laaja-alaista, riippuen turvotuksen laajuudesta (Cheung
ym. 2010). Se voi kehittyä retinopatian missä vaiheessa tahansa. Makulopatia on vaikea- asteisempi, jos tarkan näkemisen alueen keskipisteessä on turvotusta (Wong ym. 2016).
1.4 Alzheimerin tauti ja sen yhteys diabeettiseen retinopatiaan
Alzheimerin tauti on yleisin dementiaa aiheuttava hermorappeumasairaus. Taudin puhkeamiseen vaikuttavat monet samat tekijät kuin diabetekseen: kohonnut verenpaine, korkea kolesteroli ja liikunnan puute. Myös diabetes itsessään lisää riskiä Alzheimerin tautiin. Tautiin ei ole parantavaa hoitoa. Saatavilla on vain lääkityksiä, jotka lieventävät oireita (Scheltens ym. 2016).
Alkionkehityksen aikana keskushermostosta väliaivojen kohdalta pullistuu silmärakkula, josta verkkokalvo kehittyy. Neuroretinan solut erilaistuvat erilaisiksi hermosoluiksi, kuten gangliosoluiksi. Verkkokalvoilta lähtevät gangliosolujen aksonit muodostavat näköhermot, jotka risteävät näköhermoristissä. Tämän jälkeen aksonit jatkavat näköjuostetta pitkin lateraaliseen polvitumakkeeseen, jonka kautta viesti välittyy näköaivokuorelle.
Gangliosolujen ja lateraalisen polvitumakkeen välissä ei siis ole välineuroneita, kuten yleensä viestin välittyessä tumakkeisiin (Zagozewski ym. 2014). Koska verkkokalvo on muodostunut keskushermoston jatkeena, silmästä ja aivoista löytyy samoja ominaisuuksia ja rakenteita, kuten gliasolut, yhteinen verenkierto sekä samoja neurotransmittereitä.
Aivoissa on veriaivoeste ja silmässä veriretinaeste. Tällaista rakennetta ei ole muualla elimistössä. Alzheimerin taudissa ja retinopatiassa on monia yhteisiä oireita, kuten verisuoniston poikkeavuudet, proteiiniaggregaatit, neurodegeneraatio ja oksidatiivisen stressin sekä tulehduksen lisääntyminen. Alzheimerin taudissa näitä muutoksia ilmenee myös verkkokalvolla taudin edetessä. Tämä aiheuttaa näkökyvyn heikkenemistä (Doustar ym. 2017).
Alzheimerin taudin patofysiologiassa olennaista on solun ulkoiseen tilaan kertyvät Aβ-plakit (beta-amyloidi) sekä solun sisälle kasaantuvat Aβ-aggregaatit. Lisäksi patofysiologiaan kuuluu hermosolun sisäisten, tau-proteiinista koostuvien, hermosäievyyhtien kasaantuminen (Tanila ym. 2018). Tau-proteiini on normaalisti osa hermosolun tukirankaa ja se on sitoutuneena mikrotubuluksiin. Alzheimerin taudissa tau-proteiinin päästessä hyperfosforyloitumaan, aiheuttaa se tau-proteiinin irtautumisen mikrotubuluksista, joka johtaa proteiinin aggregoitumiseen (Naseri ym. 2019).
Aβ muodostuu amyloidiprekursoriproteiinista (APP) endosomeissa, lysosomeissa ja solukalvolla. APP pilkotaan α- ja γ-sekretaasin tai β- ja γ-sekretaasin avulla. β- ja γ-
sekretaasireitillä vapautuu solukalvon ulkopuolelle Aβ40 tai Aβ42. α- ja γ-sekretaasin pilkkomana APP:sta ei muodostu Aβ (O’Brien, Wong. 2011).
Tutkimuksessa käytetyillä hiirillä on preseniliini-1-geenin eksoni 9:n deleetio (PSEN1dE9) ja APP-geenin mutaatio. Mutaatiot aiheuttavat alle 65-vuotiaana ilmaantuvan periytyvän Alzheimerin taudin. PSEN 1 toimii γ-sekretaasin katalyyttisenä yksikkönä (Lanoiselée ym.
2017). Mutaatiot PSEN1 ja APP-geeneissä vaikuttavat sekretaasientsyymien toimintaan lisäten Aβ:n kokonaistuotantoa ja johtavat Aβ42-proteiinien lisääntyneeseen syntyyn.
Seurauksena Aβ42/Aβ40 suhde nousee. Aβ42 sakkautuu ja muodostaa solunulkoisia plakkeja toisin kuin lyhyemmät Aβ-proteiinit (Szaruga ym. 2017). Aβ42 ja hyperglykemia lisäävät tulehdussytokiinien IL-1β, IL-6 ja TNF-α eritystä gliasoluista, kuten astrosyyteistä.
Tulehdussytokiinit edistävät Aβ42 muodostumista, joka Alzheimerin taudissa kasaantuu aivoihin (González-Reyes ym. 2017).
Insuliini ja Aβ hajoavat saman entsyymin, IDE (insuliinia hajottava entsyymi), avulla. IDE:ä on lähes kaikissa solutyypeissä. Se toimii Aβ:n pääasiallisena poistajana esimerkiksi hippokampuksessa ja aivoselkäydinnesteessä. IDE:n aktiivisuus heikkenee ikääntyessä, mikä lisää riskiä Alzheimerin tautiin. Sen aktiivisuus on heikentynyt myös varhaisen vaiheen Alzheimerin taudissa (Kurochkin ym. 2018). Insuliini ja Aβ kilpailevat entsyymiin sitoutumisesta aivoissa. Insuliinin toimintahäiriö vaikuttaa näin myös Aβ:n määrään (Mayeda ym. 2015). Diabeetikoilla insuliiniresistenssin ja insuliinin kohonneen määrän seurauksena Aβ:n määrä lisääntyy aivoissa (Hiltunen ym. 2012).
Keskushermostossa sekä verkkokalvolla on synnynnäiseen immuunijärjestelmään kuuluvia mikrogliasoluja. Ne fagosytoivat apoptoottisia soluja sekä solujätettä. Mikrogliat ovat tärkeitä hermoston kehityksen kannalta. Ne fagosytoivat turhia synapseja ja ovat mukana hermosolujen muodostumisessa. Pitkäaikainen mikroglia-aktivaatio voi kuitenkin johtaa liialliseen hermosolujen tuhoutumiseen ja synapsikatoon. Aivoissa ja verkkokalvolla mikroglian aktivaatiota aiheuttavat kudosvauriot ja toimintahäiriöt, kuten AGE-yhdisteiden kertyminen. Hyperglykemia, hypoksia eli hapen puute ja oksidatiivinen stressi aktivoivat mikrogliasoluja diabeettisessa retinopatiassa. Aktivoituessaan ne jakautuvat sekä leviävät mikroaneurysmien, verenvuotojen ja iskeemisten alueiden ympärille. Lisäksi ne tuottavat sytokiineja ja kasvutekijöitä kuten VEGF (Altmann, Schmidt. 2018).
Mikrogliat ja makrofagit ilmentävät fraktalkiinireseptoria (CX3CR1). Fraktalkiinia tuotetaan keskushermostossa hermosoluissa ja verkkokalvolla gangliosoluissa. Fraktalkiinin
määrä on lisääntynyt diabeetikoiden verkkokalvolla. Jos fraktalkiinireseptori puuttuu mikroglian pinnalta, retinopatia kehittyy nopeammin, sillä apoptoosi ja tulehdus lisääntyvät (Beli ym. 2016). Tämän perusteella fraktalkiinireseptoreilla on suojaavaa vaikutusta diabeettisen retinopatian synnyssä.
2
HÄIRIINTYNEET SOLUN HAJOTUSJÄRJESTELMÄT
2.1 Yleistä autofagiasta ja ubikitiini-proteasomi-järjestelmästä
Solun normaalin toiminnan kannalta sen täytyy ylläpitää proteiinien homeostasiaa eli proteostasiaa. Kaikki muodostuvat proteiinit eivät laskostu heti oikein, jolloin kaperoniproteiinit laskostavat uudelleen väärinlaskostuneita proteiineja. Proteostasian kannalta erityisesti lämpösokkiproteiini 70 (Hsp70) on tärkeä. Se auttaa proteiinien laskostumisessa ja estää niiden aggregoitumista (Fernández-Fernández, Valpuesta 2018).
Jos väärinlaskostuneita proteiineja muodostuu paljon, solu hidastaa proteiinien tuotantoa ylläpitääkseen proteostasiaa. Solu pyrkii välttämään väärinlaskostuneiden proteiinien kerääntymistä, sillä ne voivat aggregoitua solun sisä- tai ulkopuolelle. Nämä proteiiniaggregaatit ovat solulle haitallisia, joten ne pyritään hajottamaan. Oksidatiivinen stressi ja hypoksia aiheuttavat ongelmia proteiinien muodostumiseen ja laskostumiseen, mikä johtaa proteiiniaggregaattien kerääntymiseen (Zhang ym. 2011). Ubikitiini- proteasomi-järjestelmä eli UPS huolehtii lyhytikäisten ja väärinlaskostuneiden proteiinien pilkkomisesta. Autofagia on keskittynyt hajottamaan suurempia materiaaleja, kuten proteiiniaggregaatteja ja soluorganelleja (Liu ym. 2016).
Autofagiaa on kolmea päätyyppiä: makroautofagiaa, mikroautofagiaa ja kaperonivälitteistä autofagiaa. Makroautofagia eli autofagia hajottaa vaurioituneita ja vanhentuneita soluorganelleja sekä proteiiniaggregaatteja. Autofagiassa autofagireseptori, p62-proteiini, tunnistaa hajotettavan kohteen ja liittyy siihen. p62-proteiinin avulla hajotettava materiaali ohjataan autofagosomiin pilkottavaksi (Dehdashtian ym. 2018).
Autofagosomi yhdistyy happaman lysosomin kanssa solulimassa, jonka jälkeen materiaali alkaa hajoamaan. Lysosomi on alhaisen pH:n omaava pyöreä soluelin, jonka tehtävä on hajottaa niin soluliman proteiineja kuin endosytoitua materiaalia, kuten bakteereja, happamilla hydrolaasi-entsyymeillä. Kaksikalvoisen autofagosomin sulautuessa yksikalvoiseen lysosomiin, sen uloin kalvo fuusioituu lysosomin kalvon kanssa. Tällöin lysosomaaliset entsyymit jäävät autofagosomin kalvojen väliin, kunnes ne hajottavat autofagosomin sisemmän kalvon. Syntyy autolysosomi, jossa hajotettava materiaali pilkotaan (Yu ym. 2018).
Ubikitiini-proteasomi-järjestelmän tehtävä on hajottaa suurin osa sytoplasman hajotettavista proteiineista. Proteiinien pilkkominen tapahtuu sytoplasmassa sijaitsevissa proteasomeissa (26S). Proteasomi tunnistaa ubikitiinilla merkatun hajotettavan proteiinin, jonka jälkeen proteiini ohjautuu proteasomin sisään. Proteasomi on kookas proteiinikompleksi, joka muodostuu proteolyyttisestä ydinosasta (20S) ja säätelyosasta (19S). Säätelyosaan kuuluu kansi ja pohja. Sen tehtävä on ubikitiinin poistaminen sekä proteiinilaskosten avaaminen hajotettavasta proteiinista. Ydinosa koostuu kahdestaα- ja β-renkaasta, jotka muodostuvat seitsemästä alayksiköstä. Ydinosa pilkkoo aminohappoketjun peptidisidoksia proteaasientsyymeillä lyhyiksi peptidiketjuiksi (Nandi ym. 2006).
2.2 LC3, p62 ja ubikitiini
Proteolyysiä edeltää proteiinin ubikinaatio eli hajotettavan proteiinin merkitseminen ubikitiiniproteiinilla. Ubikitiineja voi sitoutua monta yksitellen tai ketjuna hajotettavaan proteiiniin, jolloin p62-proteiini tehokkaasti tunnistaa sen. p62 kiinnittyy ubikitiiniin ja tunnistaa kehittyvän autofagosomin pinnalla LC3-proteiinin (light chain 3-proteiini). p62- proteiinin avulla ubikinoitu hajotettava proteiini ohjautuu autofagosomin sisään (Lamark ym. 2009). p62 voi kuljettaa ubikinoituja proteiineja myös proteasomiin hajotettavaksi.
Erityisesti jos hajotettava proteiini on tumassa, p62 rooli proteasomaalisessa hajotuksessa on tärkeä (Liu ym. 2016).
Autofagia aktivoi LC3-proteiinin tuottoa ja muuntumista. Proteiinin esiastemuoto LC3-I on solulimassa. Autofagian aktivoimana se muuttuu LC3-II muotoon, joka sitoutuu autofagosomin kalvoihin. Autolysosomin proteaasit hajottavat muun materian mukana sisempään kalvoon sitoutuneen LC3-II-proteiinin. LC3 määrän kasvaminen kertoo autofagian aktiivisuuden lisääntymisestä. LC3-proteiinin määrän vähentyessä voidaan olettaa autofagosomeja muodostuneen vähemmän eli autofagian heikentyneen (Tanida ym.
2004). Autofagian aktiivisuutta diabeteksessa on tutkittu LC3B-II määriä seuraamalla.
LC3B-II pitoisuus on alussa ollut koholla, mutta diabeteksen edetessä sen määrä on vähentynyt, eli autofagia on heikentynyt (Shruthi ym. 2017). Autofagian aktiivisuus vaikuttaa myös p62-proteiinin ja ubikitiinin määrään. Autofagian toiminnan heiketessä soluun kertyy ubikinoituja proteiiniaggregaatteja, joihin p62 on liittynyt. Tällöin p62:n ja ubikitiinin pitoisuus kasvaa. Autofagian tehostuessa p62 määrä vähenee niiden hajotessa proteiinin mukana autolysosomissa (Liu ym. 2016). LC3:a, p62:a ja ubikitiinia käytetään paljon solun hajotusjärjestelmien tutkimiseen, sillä niiden määrät kertovat
proteiiniaggregaattien määrästä ja siten autofagian ja ubikitiini-proteasomi-järjestelmän aktiivisuudesta.
2.3 Hajotusjärjestelmien heikentynyt toiminta
Proteiinien väärinlaskostumista pyritään korjaamaan ja laskostamaan niitä uudelleen. Tämän epäonnistuessa, proteiineihin liitetään ubikitiini, joka pyrkii siirtämään proteiinit proteasomeihin. Jos ubikitiini-proteasomi-järjestelmän toiminta on heikentynyt, proteasomit eivät pysty poistamaan haitallisia proteiineja. Tällöin proteiinit alkavat aggregoitumaan.
Diabeettisessa retinopatiassa ja joissain neurodegeneratiivisissa sairauksissa, kuten Alzheimerin taudissa, ubikitiini-proteasomi-järjestelmän aktiivisuus on heikentynyt.
Autofagian tehtävä on hajottaa proteiiniaggregaatteja ja estää niiden kasaantumista soluun.
Heikentynyt autofagian aktiivisuus johtaa lopulta liialliseen proteiiniaggregaattien kertymiseen, jolloin solu joutuu apoptoosiin eli ohjelmoituun solukuolemaan. Diabeetikoilla hajotusjärjestelmien toiminta on heikentynyt verkkokalvolla (kaavio 1) (Shruthi ym. 2017).
Apoptoosin määrää diabetesta sairastavilla hiirillä on tutkittu: apoptoosi on lisääntynyt hiirten verkkokalvoilla (Lopes de Faria ym. 2016, Shruthi ym. 2017).
Kaavio 1. Diabeteksessa verkkokalvolla oksidatiivinen stressi ja hypoksia eli hapen puute lisääntyvät. Nämä lisäävät proteiinien väärinlaskostumista ja soluorganellien vaurioita.
Väärinlaskostuneet proteiinit merkitään ubikitiinilla, jonka jälkeen ne ohjautuvat proteasomeihin hajotettavaksi. Proteasomaalinen hajotus ja autofagia ovat heikentyneet diabeteksessä, jolloin soluun kertyy proteiiniaggregaatteja ja vaurioituneita soluelimiä.
Nämä muutokset ovat osa retinopatian kehittymistä.
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET
Alzheimerin taudin vaikutuksia verkkokalvoon on tutkittu paljon, sillä taudin edetessä pidemmälle potilaille tulee muutoksia näkökyvyssä. On tutkimuksia, joissa Alzheimerin taudin havaitaan aiheuttavan verkkokalvolla neuraaliretinan ohenemista, verisuoniston poikkeavuuksia sekä proteiiniaggregaatteja. Nämä muutokset selittävät näkökyvyn heikkenemistä (Hart ym. 2016, Javaid ym. 2016, Doustar ym. 2017). Tutkimuksia transgeenisillä APP/PSEN1dE9 hiirimalleilla on tehty, mutta verkkokalvoissa ei ole havaittu eroja villityypin hiiriin verrattuna (Chidlow ym. 2017). Myös diabeteksen aiheuttamia muutoksia silmässä on tutkittu. Diabeetikoiden verkkokalvoja on verrattu terveiden verkkokalvoihin. Diabeetikoiden verkkokalvoilla on muutoksia, vaikkei diabeettista retinopatiaa ole todettu. Verkkokalvon neuraaliretinan paksuus on ohentunut ja verisuonistossa on muutoksia (Dumitrescu ym. 2017, Zeng ym. 2019). Alzheimerin tauti ja diabetes aiheuttavat siis itsenäisesti muutoksia verkkokalvoilla. Tämän tutkimuksen tavoitteena on selvittää vaikuttavatko Alzheimerin taudin riskigeenien mutaatiot, APP/PSEN1dE9, yhdessä ruokavaliolla indusoidun diabeteksen kanssa diabeettisen retinopatian kehittymiseen. Tutkimuksessa on kyseisten mutaatioiden suhteen transgeenisiä ja villityypin hiiriä. Sekä transgeenisten että villityypin hiirten joukossa on rasvarehua syöneitä ja vakiorehua syöneitä. Eli molemmissa ryhmissä on oletetusti diabetesta sairastavia sekä sairastamattomia hiiriä. Näitä hiiriä vertaillaan keskenään. Tarkoituksena on tutkia eroja aggregaatiomarkkereiden, LC3:n, p62:n ja ubikitiinin, ilmentymisessä transgeenisten ja villityypin hiirten välillä. Markkereiden ilmentyminen kertoo autofagian ja ubikitiini-proteasomi-järjestelmän aktiivisuudesta.
Diabeettisessa retinopatiassa hyperglykemia lisää oksidatiivista stressiä, joka lisää proteiinien väärinlaskostumista. Nämä pyritään merkitsemään ubikitiinilla ja kuljettamaan proteasomiin. Autofagian ja proteasomien toiminta ovat heikentyneet diabeettisessa retinopatiassa. Tällöin proteiiniaggregaatteja kertyy soluun. Näin ollen p62 ja ubikitiinin pitoisuus ovat lisääntyneet ja LC3 määrä pienentynyt diabeettisessa retinopatiassa. Mitä suurempi muutos on, sitä pidemmälle tauti on edennyt.
3.1 Tutkimuskysymykset
1. Altistavatko transgeenisten hiirien mutaatiot, APP/PSEN1dE9 x CX3CR1GFP/GFP, diabeettisen retinopatian kehittymiselle?
2. Kuinka aktiivisia autofagia ja proteasomit ovat diabetesta sairastavien transgeenisten hiirien verkkokalvolla?
3. Onko transgeenisten hiirien verkkokalvolla autofagian ja proteasomien toiminta heikompaa kuin villityypin hiirillä?
4 MENETELMÄT
Hiiristä puolet ovat olleet rasvarehulla (Typical Western Diet, TWD) 4 kk ̶ 13 kk, toinen puolisko on ollut vakiorehulla (STD). Hiirille, jotka ovat olleet rasvarehulla, kehittyy glukoosi-intoleranssi, insuliiniresistenssi ja rasvamaksa. Diabetes on todettu glukoosipitoisuuksia seuraamalla. Hiiret ovat transgeenisiä tai villityyppejä APP/PSEN1dE9 x CX3CR1GFP/GFP mutaatioiden suhteen. APP/PSEN1dE9 aiheuttaa Alzheimerin taudin kaltaisia muutoksia, jotka vaikuttavat hiirten aivotoimintaan ja käyttäytymiseen. CX3CR1-GFP värjää fraktalkiinireseptorit (CX3CR1) vihreän fluoresoivan proteiinin avulla (GFP) mikrogliasolujen sekä makrofagien pinnalta.
Hiirten silmät on valettu parafiiniblokkeihin, joista leikataan 5μm paksuisia leikkeitä.
Leikkeistä värjätään immunohistokemiassa autofagiamarkkerit: p62, LC3 ja UPS-markkeri:
ubikitiini.
Immunovärjäys suoritettiin silmätautien laboratorion immunovärjäysmenetelmien mukaan.
Näytteistä poistettiin parafiini ksyleenillä. Tämän jälkeen laskevan alkoholisarjan avulla poistettiin ksyleeni ja nesteytettiin näytteet (rehydration). Permeabilisointi tehtiin 0,1%
Triton X-100 avulla. Seuraavaksi näytteet ympyröitiin tussilla (Mini PAP Pen) ja jokaisen näytteen päälle laitettiin pisara 20% vuohen seerumia (20% goat serum, TBS). Näytteiden annettiin inkuboitua 30 minuuttia, jonka jälkeen seerumitipat kaadettiin pois laseilta.
Jokaisen lasin kontrollinäytteeseen laitettiin pisara 1% vuohen seerumia (1% goat serum, TBS) ja kaikkiin muihin näytteisiin primaarivasta-ainetta vuohen seerumissa. Tämän jälkeen näytteet jätettiin yhdeksi yöksi tasosekoittimelle 5℃ lämpötilaan.
primaarivasta-aine primaarivasta-aineen laimennossuhde
esikäsittely
p62 ab76340 1/100 sitraatti (1:100), 90℃, 5min
LC3 Z0458 1/100 metanoli, 10min
ubikitiini P4D1 1/100 sitraatti (1:100), 90℃, 5min
Taulukko 1. p62:lle, LC3:lle ja ubikitiinille käytetyt primaarivasta-aineet, laimennossuhde sekä käytetty esikäsittely.
Kullekin markkerille, p62, LC3 ja ubikitiini, on oma primaarivasta-aine, joka tarttui kyseiseen proteiiniin. Primaarivasta-aine ei sisällä merkkiainetta. Sekundaarivasta-aine toimii primaarivasta-aineen vasta-aineena, eli se tarttuu primaarivasta-aineeseen.
Sekundaarivasta-aineena käytettiin AF 594 G anti-mouse. Siinä on mukana merkkiaine, joka saa aikaan mikroskoopilla punaisena nähtävän fluoresenssin aallonpituudella 630-700nm.
Yön yli inkubaation jälkeen näytelasien annettiin lämmetä huoneenlämmössä puoli tuntia ja tehtiin TBS-pesu. Kaikkien leikkeiden päälle laitettiin pisara sekundaarivasta-ainetta.
Tämän jälkeen näytteiden annettiin inkuboitua kolme tuntia pimeässä. Näytteille laitettiin pisara DAPI:a (1:10000, TBS), jonka jälkeen inkuboitiin pimeässä 30 minuuttia. DAPI kiinnittyy DNA:han ja saa näin tumat erottumaan taustastaan sinisenä mikroskoopilla UV- valossa katsottuna. Lopuksi peitinlasit kiinnitettiin näytelasien päälle liimalla (Mowiol mounting media).
Värjätyt näytteet kuvattiin konfokaalimikroskoopilla, 63X suurennoksella. Tuloksista analysoitiin positiivisen signaalin intensiteettiä sekä alaa ImageJ-ohjelman avulla. Lopuksi tulokset käsiteltiin SPSS-ohjelmalla tilastoinnin saamiseksi. Data ei ollut normaalijakautunut, joten päädyttiin käyttämään Mann-Whitneyn testiä.
5 TULOKSET
LC3 ilmentymistä vertailtaessa, transgeenisillä rasvarehua syöneillä hiirillä sen intensiteetti on suurempi ja ala pienempi kuin rasvarehua syöneillä villityypin hiirillä (Kuva 3).
Rasvarehua syöneiden villityypin hiirien LC3 signaalin ala on suurempi ja intensiteetti pienempi kuin vakiorehua syöneiden villityypin hiirien. LC3 signaalin ala on suurempi rasvarehua syöneillä villityypin hiirillä kuin transgeenisillä rasvarehua syöneillä hiirillä (Kuva 5). Myös villityypin vakiorehua syöneiden hiirien LC3 signaalin ala on suurempi kuin transgeenisten rasvarehua syöneiden. Transgeenisillä hiirillä LC3 signaalin ala ja intensiteetti ovat pienempiä rasvarehua syöneillä verrattuna vakiorehua syöneisiin. Erot ovat kuitenkin pieniä.
Tarkasteltaessa p62 ilmentymistä, tuloksissa havaittiin ero rasvarehua syöneiden villityypin ja transgeenisten hiirien välillä (Kuva 4). Transgeenisillä hiirillä p62 signaalin ala ja intensiteetti ovat suurempia kuin villityypin hiirillä. Verrattaessa p62 ilmentymistä rasvarehua ja vakiorehua syöneiden välillä, transgeenisillä hiirillä p62 signaalin ala ja intensiteetti ovat suurempia rasvarehua syöneillä, kun taas villityypin hiirillä vakiorehua syöneillä p62 signaalin ala ja intensiteetti ovat suurempia.
Kuva 3. A) LC3 signaalin alan keskiarvo. Villityypin rasvarehua syöneiden hiirien LC3 signaalin ala on tilastollisesti merkitsevästi suurempi kuin transgeenisten rasvarehua syöneiden (**p=0,0012) (Kuva 5). Villityypin rasvarehua syöneiden LC3 signaalin ala on myös tilastollisesti merkitsevästi suurempi kuin transgeenisten vakiorehua syöneiden (*p=0,0140). Villityypin vakiorehua syöneiden hiirien LC3 signaalin ala on tilastollisesti
B
1805 1940
1361 1321
3,698
3,470
4,147 4,099
merkitsevästi suurempi kuin transgeenisten rasvarehua syöneiden (*p=0,0167). B) LC3 signaalin intensiteetin keskiarvo. Villityypin rasvarehua syöneiden hiirien LC3 signaalin intensiteetti on pienempi kuin transgeenisten rasvarehua syöneiden. Villityypin vakiorehua syöneiden hiirien LC3 signaalin intensiteetti on pienempi kuin transgeenisten vakiorehua syöneiden. Villityypin rasvarehua syöneiden hiirien LC3 signaalin intensiteetti on
pienempi kuin transgeenisten rasvarehua syöneiden. Kaikki LC3 signaalin intensiteetin erot ovat hyvin pieniä, eikä niissä ole tilastollisesti merkitseviä eroja.
Kuva 4. A) p62 signaalin alan keskiarvo. Villityypin rasvarehua syöneiden hiirien p62 signaalin ala on pienempi kuin transgeenisten rasvarehua syöneiden. Villityypin ja
transgeenisten vakiorehua syöneiden hiirien p62 signaalin aloissa ei ole juuri eroja. Näissä ei ole tilastollisesti merkitseviä eroja. B) p62 signaalin intensiteetin keskiarvo. Villityypin rasvarehua syöneiden hiirien p62 signaalin intensiteetti on pienempi kuin transgeenisten rasvarehua syöneiden. Villityypin vakiorehua syöneiden hiirien p62 signaalin intensiteetti on suurempi kuin transgeenisten vakiorehua syöneiden. Näissä ei ole tilastollisesti
merkitseviä eroja.
A B
3597
3246 3476 3496
33,58
8,921
14,78 16,45
Kuva 5. Fluoresenssimikroskoopilla otetut kuvat APP/PSEN1dE9 mutaation suhteen transgeenisen (TG) ja villityypin (WT) hiiren verkkokalvoleikkeistä, joissa punaisella ilmentyy LC3-proteiini. APP/PSEN1dE9 mutaatio aiheuttaa Alzheimerin taudin kaltaisia muutoksia hiirten aivoihin. Vertailussa ovat rasvarehua (Typical Western Diet, TWD) syöneet hiiret. Rasvarehu on aiheuttanut hiirille diabeteksen. Kuvissa sinisenä näkyy DAPI, joka on kiinnittyneenä DNA:han. Punaisena (AF594) kuvissa näkyy merkkiaine, joka osoittaa LC3-proteiinin (light chain 3-proteiini) ilmenemistä. LC3 määrä kasvaa autofagian lisääntyessä. A) Verkkokalvoleike, jossa suorakulmioilla merkitty alueet, joista analysoidut mikroskooppikuvat otettu. B) 20x suurennoksella otettu kuva rasvarehua syöneen villityypin hiiren verkkokalvoleikkeestä. C) 20x suurennoksella otettu kuva rasvarehua syöneen transgeenisen hiiren verkkokalvoleikkeestä. D) 63x suurennoksella
otettu kuva rasvarehua syöneen villityypin hiiren verkkokalvoleikkeestä. Kuvassa LC3 signaalin ala on suurempi kuin transgeenisen hiiren verkkokalvoleikkeessä (E). E) 63x suurennoksella otettu kuva rasvarehua syöneen transgeenisen hiiren verkkokalvoleikkeestä.
Kuvassa LC3 signaalin ala on pienempi kuin villityypin hiiren verkkokalvoleikkeessä (D).
Tämä tarkoittaa LC3-proteiinin ilmentyvän pienemmällä alueella transgeenisillä hiirillä, eli niiden verkkokalvolla autofagia on vähäisempää kuin villityypin hiirien.
6 POHDINTA
LC3 on autofagosomin markkeri. Se on sitoutuneena autofagosomin kalvoihin. LC3 määrän väheneminen kertoo heikentyneestä autofagosomien muodostumisesta, jonka perusteella voidaan olettaa autofagian heikentyneen. LC3 signaalin alaa tarkasteltaessa, se on tilastollisesti merkitsevästi pienempi transgeenisillä rasvarehua syöneillä kuin villityypin rasvarehua syöneillä hiirillä (p=0,0012) (Kuva 5). Transgeenisten rasvarehua syöneiden LC3 signaalin ala on myös tilastollisesti merkitsevästi pienempi kuin vakiorehua syöneiden villityypin hiirien (p=0,0167). Transgeenisillä vakiorehua syöneillä hiirillä LC3 signaalin ala on tilastollisesti merkitsevästi pienempi kuin villityypin rasvarehua syöneillä (p=0,0140).
LC3 signaalin alojen erojen perusteella nähdään transgeenisillä hiirillä LC3 määrien olevan vähäisempiä kuin villityypin hiirillä. Pienempi LC3 määrä kertoo autofagosomien muodostumisen olevan vähäisempää, jonka perusteella autofagian voidaan olettaa olevan heikentynyt transgeenisillä hiirillä. Näin ollen mahdollinen retinopatia on edennyt pidemmälle hiirillä, joilla on Alzheimerin taudin riskigeenien mutaatiot, APP/PSEN1dE9.
Lisäksi Alzheimerin taudin riskigeenien mutaatiot itsenäisesti heikentävät autofagiaa enemmän kuin ruokavaliolla aiheutettu diabetes.
Tuloksia tarkasteltaessa täytyy ottaa huomioon, että Alzheimerin taudin riskigeenien mutaatiot itsenäisesti aiheuttavat proteiiniaggregaatteja verkkokalvolle. Nämä aiheuttavat muutoksia p62 ja LC3 signaaliin, jonka takia transgeenisten hiirien muutoksia tarkasteltaessa ne voivat johtua diabeteksesta tai mutaatioista. Elisa
LC3 signaalin intensiteetin erot ovat hyvin pieniä, eivätkä tilastollisesti merkitseviä.
Transgeenisillä rasvarehua syöneillä LC3 signaalin intensiteetti on suurempi kuin rasvarehua syöneillä villityypin hiirillä. Rasvarehua syöneillä villityypin hiirillä LC3 signaalin intensiteetti on pienempi kuin transgeenisillä vakiorehua syöneillä. p62 rooli autofagiassa on tunnistaa ubikitiini, joka on liittynyt hajotettavaan proteiiniin. Tämän jälkeen p62 ohjaa ubikinoidun proteiinin autofagosomiin tunnistamalla autofagosomin pinnalla LC3-proteiinin. p62 voi ohjata hajotettavan proteiinin myös proteasomiin (Lamark ym. 2009). p62 proteiinin kertyminen kertoo autofagian heikentymisestä, jolloin autofagosomeja on aikaisempaa vähemmän. p62 signaalin ala sekä intensiteetti ovat suurempia rasvarehua syöneillä transgeenisillä hiirillä kuin rasvarehua syöneillä villityypin hiirillä. p62 määrä lisääntyy autofagian heikentyessä. Tämän perusteella autofagia on
heikompaa transgeenisillä hiirillä. Transgeenisillä hiirillä ruokavalio ei juurikaan vaikuta p62 signaalin intensiteettiin eikä alaan, joten mutaatiot vaikuttavat enemmän autofagian toimintaan kuin ruokavalio. Transgeenisillä vakiorehua syöneillä hiirillä p62 signaalin ala sekä intensiteetti ovat suuremmat kuin rasvarehua syöneillä villityypin hiirillä. Tämän perusteella mutaatiot itsenäisesti heikentävät autofagian toimintaa enemmän kuin ruokavalio. Nämä erot p62 signaalin intensiteetissä sekä alassa ovat kuitenkin hyvin pieniä, eivät tilastollisesti merkitseviä.
Proteasomien toimintaa ei voida vertailla, koska ubikitiinia ei analysoitu. Osaan ubikitiinin negatiivinäytteistä meni mahdollisesti hieman primaarivasta-ainetta, jonka takia värjäykset eivät onnistuneet kunnolla.
Käytetty LC3-vasta-aine on ollut aikaisemminkin heikko antamaan signaalia immunohistokemiassa, joten havaitut LC3 signaalin intensiteettien ja alojen erot voivat todellisuudessa olla suurempia. On siis positiivista, että edes pieniä eroja havaittiin.
LC3 pitoisuudet ovat lisääntyneet diabeteksen alussa ja vasta pidempään jatkuneessa diabeteksessa alentuneet. Tämän vaikutusta voisi tutkia pidemmällä tutkimuksella, jossa hiirille aloitettaisiin syöttämään rasvarehua nuorempana ja niiden annettaisiin sairastaa diabetesta kauemmin. Tässä tutkimuksessa LC3 signaalin ala oli pienempi transgeenisillä hiirillä verrattuna villityypin hiiriin, niin rasvarehua kuin vakiorehuakin syöneillä hiirillä.
Rasvarehua syöneillä hiirillä ero voisi olla mahdollisesti suurempi, jos hiiret sairastaisivat ruokavaliolla aiheutettua diabetesta kauemmin.
Heikkoutena tutkimuksessa oli pitkä aika värjäysten ja näytteiden kuvaamisen välillä rikki olleen mikroskoopin takia. Lähes viiden kuukauden väli on voinut vaikuttaa näytteiden laatuun. Lisäksi transgeenisten vakiorehua syöneiden hiirien määrä on vähäinen, mikä lisää virheellisten tulosten mahdollisuutta.
Tutkimuksen perusteella voidaan sanoa mutaatioiden, APP/PSEN1dE9 x CX3CR1GFP/GFP, mahdollisesti heikentävän diabeetikoilla autofagiaa verkkokalvolla ja näin nopeuttavan retinopatian kehittymistä. LC3 signaalin ala on pienempi transgeenisillä hiirillä verrattaessa villityypin hiiriin. Lisäksi p62 signaalin ala ja intensiteetti olivat hieman suurempia transgeenisillä hiirillä. Nämä viittaavat autofagian olevan heikompaa transgeenisillä hiirillä.
Lisäksi LC3 signaalin intensiteetti on voimakkaampi transgeenisillä hiirillä. Tämä löydös yhdessä pienemmän LC3 signaalin alan kanssa tukee autofagosomien vähäistä määrää.
Vähäisestä autofagosomien määrästä voidaan olettaa autofagian heikentyneen.
Mutaatiot yksin heikentävät autofagian toimintaa, sillä transgeenisten vakiorehua syöneiden autofagia oli heikompaa kuin rasvarehua syöneiden villityypin hiirien kaikissa tuloksissa.
Tämä kertoo Alzheimerin taudin aiheuttavan myös verkkokalvolla esimerkiksi proteiiniaggregaatteja. Ruokavalio on vaikuttanut villityypin hiirillä autofagiaan. Autofagia on heikompaa rasvarehua syöneillä kaikissa muissa tuloksissa paitsi LC3 signaalin alaa tarkasteltaessa. Transgeenisillä hiirillä ruokavalion vaikutusta ei juurikaan ole havaittavissa.
7 YHTEENVETO
Tutkimuksessa selvitettiin Alzheimerin taudin riskigeenien mutaatioiden, APP/PSEN1dE9 x CX3CR1GFP/GFP, vaikutusta diabeettisen retinopatian kehittymiseen hiirillä, joille oli rasvarehulla aiheutettu diabetes. Tulosten perusteella diabetes heikentää autofagiaa. Lisäksi mutaatioilla on yhteys diabeettisen retinopatian nopeammalle kehittymiselle, sillä ne heikentävät autofagiaa. Lisätutkimus aiheesta on tarpeellista sekä diabeteksen että Alzheimerin taudin yleisyyden vuoksi.
8 LÄHDELUETTELO
Altmann C, Schmidt MHH. The role of microglia in diabetic retinopathy: inflammation, microvasculature defects and neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences 2018;19(1)
Antonetti DA, Barber AJ, Bronson SK. Diabetic retinopathy: seeing beyond glucose- induced microvascular disease. Diabetes 2006;55:2401-2411Arya M, Sorour O, Chaudhri J ym. Distinguishing intraretinal microvascular abnormalities from retinal
neovascularization using optical coherence tomography angiography. Retina-the journal of retinal and vitreous diseases 2019;0:1-10
Beli E, Dominguez JM, Hu P ym. CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. Journal of Molecular Medicine 2016;94:1255-65
Cheung N, Mitchell P, Wong TY. Diabetic retinopathy. The Lancet 2010;376(9735):124- 36
Chidlow G, Wood JPM, Manavis J, Finnie J, Casson RJ. Investigations into retinal pathology in the early stages of a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease 2017;56(2):655-675
Dehdashtian E, Mehrzadi S, Yousefi B ym. Diabetic retinopathy pathogenesis and the ameliorating effects of melatonin; involvement of autophagy, inflammation and oxidative stress. Life Sciences 2018;193:20-33
Diabeettinen retinopatia. Käypä hoito -suositus. Suomalaisen Lääkäriseuran Duodecimin, Suomen Silmälääkäriyhdistyksen ja Diabetesliiton lääkärineuvoston asettama työryhmä.
Helsinki: Suomalainen Lääkäriseura Duodecim 2014 (luettu 26.4.2020).
www.kaypahoito.fi
Doustar J, Torbati T, Black KL, Koronyo Y, Koronyo-Hamaoui M. Optical coherence tomography in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Neurology 2017;8(701):1-13
Dumitrescu AG, Istrate SL, Iancu RC, Guta OM, Ciuluvica R, Voinea L. Retinal changes in diabetic patients without diabetic retinopathy. Rom J Ophthalmol 2017;61(4):249-255
Fernández-Fernández MR, Valpuesta JM. Hsp70 chaperone: a master player in protein homeostasis. F1000 Research 2018;7(1497)
González-Reyes RE, Nava-Mesa MO, Vargas-Sánchez K, Ariza-Salamanca D, Mora- Muñoz L. Involvement of astrocytes in Alzheimer’s disease from a neuroinflammatory and oxidative stress perspective. Frontiers in Molecular Neuroscience 2017;10(427)
Hart NJ, Koronyo Y, Black KL, Koronyo-Hamaoui M. Ocular indicators of Alzheimer’s:
exploring disease in the retina. Acta Neuropathologica 2016;132:767-787
Hiltunen M, Khandelwal VKM, Yaluri N ym. Contribution of genetic and dietary insulin resistance to Alzheimer phenotype in APP/PS1 transgenic mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine 2012;16(6):1206-22.
Javaid FZ, Brenton J, Guo L, Cordeiro MF. Visual and ocular manifestations of
Alzheimer’s disease and their use as biomarkers for diagnosis and progression. Frontiers in Neurology 2016;7(55)
Kurochkin IV, Guarnera E, Berezovsky IN. Insulin-degrading enzyme in the fight against Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences 2018;39(1):49-58
Lamark T, Kirkin V, Dikic I, Johansen T. NBR1 and p62 as cargo receptors for selective autophagy of ubiquitinated targets. Cell Cycle 2009;8(13):1986-90
Lanoiselée HM, Nicolas G, Wallon D ym. APP, PSEN1, and PSEN2 mutations in early- onset Alzheimer disease: A genetic screening study of familial and sporadic cases. PLOS Medicine 2017;14(3)
Liu WJ, Ye L, Huang WF ym. P62 links the autophagy pathway and the ubiqutin-
proteasome system upon ubiquitinated protein degradation. Cellular & Molecular Biology Letters 2016;21(29)
Lopes de Faria JM, Duarte DA, Montemurro C, Papadimitriou A, Consonni SR, Lopes de Faria JB. Defective autophagy in diabetic retinopathy. Retinal Cell Biology
2016;57(10):4356-4366
Mayeda ER, Whitmer R, Yaffe K. Diabetes and cognition. Clinics in Geriatric Medicine 2015;31:101-15
Nandi D, Tahiliani P, Kumar A, Chandu D. The ubiquitin-proteasome system. Journal of Biosciences 2006;31:137-55
Naseri NN, Wang H, Guo J, Sharma M, Luo W. The complexity of tau in Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters 2019;705:183-194
Neely KA, Quillen DA, Schachat AP, Gardner TW, Blankenship GW. Diabetic retinopathy. Medical Clinics of North America 1998;82(4):847-76
O’Brien RJ, Wong PC. Amyloid precursor protein processing and Alzheimer's disease.
Annual Review of Neuroscience 2011;34:185-204
Scheltens P, Blennow K, Breteler MMB ym. Alzheimer's disease. The Lancet 2016;388(10043):505-17
Seppänen M. Diabeteksen silmäsairaus (diabeettinen retinopatia). Lääkärikirja Duodecim 2018 (päivitetty 22.2.2018)
Shruthi K, Reddy SS, Reddy GB. Ubiquitin-proteasome system and ER stress in the retina of diabetic rats. Archives of Biochemistry and Biophysics 2017;627:10-20
Szaruga M, Munteanu B, Lismont S ym. Alzheimer’s-causing mutations shift Ab length by destabilizing γ -secretase-Abn interactions. Cell 2017;170(3):443-56
Tanida I, Ueno T, Kominami E. LC3 conjugation system in mammalian autophagy. Cell Biology 2004;36(12):2503-2518
Tanila H, Hiltunen M, Myllykangas L. Alzheimerin taudin patofysiologia – mitä uutta?.
Lääketieteellinen aikakausikirja Duodecim 2018;134(24):2511-8
Tyypin 2 diabetes. Käypä hoito -suositus. Suomalaisen Lääkäriseuran Duodecimin, Suomen Sisätautilääkärien yhdistyksen ja Diabetesliiton Lääkärineuvoston asettama työryhmä. Helsinki: Suomalainen Lääkäriseura Duodecim 2018 (luettu 26.4.2020).
www.kaypahoito.fi
Witmer AN, Vrensen GF, Van Noorden CJ ym. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Progress in Retinal Eye Research 2003;22:1-29
Wong TY, Cheung CMG, Larsen M, Sharma S, Simo R. Diabetic retinopathy. Nature Reviews Disease Primers 2016;2(16012)
Yu L, Chen Y, Tooze SA. Autophagy pathway: Cellular and molecular mechanisms.
Autophagy 2018;14(2):207-15
Zagozewski JL, Zhang Q, Eisenstat DD. Genetic regulation of vertebrate eye development.
Clinical Genetics 2014;86(5):453-460
Zeng Y, Cao D, Yu H. Early retinal neurovascular impairment in patients with diabetes without clinically detectable retinopathy. Br J Ophthalmol 2019;103(12):1747-1752 Zhang SX, Sanders E, Wang JJ. Endoplasmic reticulum stress and inflammation:
mechanisms and implications in diabetic retinopathy. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics 2011;4:51-61
