HIILEN KIERTO AQUAPONICS-JÄRJESTELMÄSSÄ
Sanni Semberg Hiilen kierto aquaponics-järjestelmässä Pro Gradu -tutkielma
Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, Ympäristö- ja biotieteiden laitos Marraskuu 2021
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristötiede
Sanni Semberg: Hiilen kierto aquaponics-järjestelmässä Pro Gradu -tutkielma 67 sivua, 3 liitettä (4 sivua)
Tutkielman ohjaajat: tutkija Harri Kokko (FM) ja yliopistotutkija Hannu Nykänen (FT, dos.) Marraskuu 2021
________________________________________________________________________
avainsanat: aquaponics, hiili, hiilen vakaat isotoopit, Urtica dioica, Coregonus maraena TIIVISTELMÄ
Aquaponics-viljely yhdistää kalojen ja kasvien kasvatuksen suljetussa kiertovesijärjestelmässä, joka kierrättää vettä ja ravinteita. Aquaponics-viljelyllä voidaan tuottaa jopa enemmän satoa pienemmin ympäristövaikutuksin verrattuna perinteiseen kalojen ja kasvien kasvatukseen.
Tämän tutkielman tavoitteena oli selvittää kalojen tuottaman hiilen kulkeutumista kasveille aquaponics-järjestelmässä hiilen isotooppien avulla ja samalla selvittää, voivatko jotkin kasvit hyödyntää veteen liuennutta epäorgaanista hiiltä juurillaan suoraan vedestä.
Kolmessa aquaponics-järjestelmässä kasvatettiin vaellussiikaa (Coregonus maraena) ja nokkosta (Urtica dioica), joista kahteen syötettiin levän avulla 13C-leimattua kalanrehua.
Järjestelmien vedenlaatua seurattiin Aquatroll-500 mittalaitteiden avulla ja vesiparametreja säädettiin tarvittaessa. Hiilen kiertoa järjestelmissä seurattiin 13C-isotoopin avulla ottamalla kasvi-, kala-, kiintoaines-, kaasu- ja liuenneen epäorgaanisen hiilen näytteitä isotooppi analyysiin. Tuloksista laskettiin järjestelmiin syötetyn ja sieltä poistuneen tai sinne sitoutuneen hiilen määrä. Lisäksi laskettiin arvio kasvien juurilla ottaman hiilen määrästä.
Aquaponics-järjestelmien toiminta ja nokkosten sekä siikojen kasvu oli verrannollista aiempiin tutkimuksiin, kiintoaineksen määrää lukuun ottamatta. Kiintoainesta ei saatu mekaanisten suodattimien avulla kokonaan talteen, vaan sitä kertyi myös muualle systeemiin, esimerkiksi kasvipetien pohjalle. Tutkimuksessa havaittiin aquaponics-järjestelmään kalanrehun mukana syötetystä hiilestä kaloihin sitoutuvan 19 %, biofilttereiden poistoilman mukana poistuvan 21
%, vedessä liuenneena epäorgaanisena hiilenä olevan 0,1 %, liuenneena orgaanisena hiilenä ja hiukkasmaisena orgaanisena hiilenä 1 %, kasvien ottavan juurillaan käyttöönsä 0,1 % ja kiintoainekseen päätyvän 40 %. Lopulle 20 % ei pystytty selvittämään tarkkaa lopullista sijaintia.
Tässä tutkimuksessa havaittiin kasvien pystyvän ottamaan pieniä määriä epäorgaanista hiiltä juurillaan suoraan vedestä, vaikka kasvit ottivatkin yli 99 % tarvitsemastaan hiilestä lehdillään ilmasta. Aquaponics-järjestelmässä kiertävä hiili voi kuitenkin hyödyttää kasveja myös muilla tavoin, esimerkiksi tehostamalla kasvien kykyä ottaa nitraattia. Kasvit voivat myös hyödyntää aquaponics-järjestelmän tuottaman CO2:n lehdillään ilmasta tai kuljettaa veteen liuenneen hiilen juurista versoon, vapauttaa sen lehdistä ilmaan ja välittömästi hyödyntää uudelleen lehtien fotosynteesiin.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry Environmental Science
Sanni Semberg: Carbon cycle in aquaponic-system
Master of Science thesis 67 pages, 3 appendixes (4 pages)
Instructors of thesis: researcher Harri Kokko (MS) and university researcher Hannu Nykänen (PhD, doc.)
November 2021
________________________________________________________________________
keywords: aquaponics, carbon, stable isotopes of carbon, Urtica dioica, Coregonus maraena ABSTRACT
Aquaponic farming combines aquaculture and hydroponics in closed recirculating systems that recycle water and nutrients. Aquaponics can produce even more yield with smaller environmental impacts compared to traditional fish and plant cultivation. The aim of this thesis was to study the path of carbon from fish to plants in aquaponic systems by using stable isotopes of carbon, and also to find out if some plants can utilize dissolved inorganic carbon from water with their roots.
Whitefish (Coregonus maraena) and stinging nettle (Urtica dioica) were grown in three aquaponic systems, from which two were fed with fish feed labelled via algae. The water quality of systems was monitored with Aquatroll-500 measuring equipment and water parameters were adjusted when necessary. The carbon cycle in aquaponics was followed via 13C-isotope by taking plant, fish, gas, solids and dissolved inorganic carbon samples for isotope analysis. The amount of carbon fed to the systems and the amount of carbon accumulated or removed from the systems were calculated from the isotope results. Additionally, an estimation of carbon uptake by plant roots was calculated.
The function of aquaponic systems as well as the growth of fish and plants were comparative to previous studies, except for the amount of solids. The mechanical filters were not able to capture all of the solids formed in systems and it is likely that solids were accumulated in other parts of the systems as well, for example in plant beds. This study shows that from the carbon fed to the systems, 19 % is bind to fish, 21 % exits the systems from biofilters, 0,1 % is in water as dissolved inorganic carbon, 1 % is in water as dissolved organic carbon and particulate organic carbon, 0,1 % is taken up by the plant roots and 40 % ends up in solid waste. This study could not point the faith of the remaining 20 %.
It was observed, that plants can uptake small amounts of dissolved inorganic carbon from the water by their roots. Even though over 99 % of the carbon needed was fixed from the air by the plant leaves. However, the carbon circulating in aquaponic systems can benefit the plants in other ways, for example by enhancing nitrate uptake. Additionally, the plants in aquaponic systems can exploit the CO2 formed in the system from the air with their leaves or transport the dissolved inorganic carbon from roots to shoot, release it in the air and immediately utilize again in photosynthesis in the leaves.
ESIPUHE
Tämän Pro Gradu-tutkielman tarkoituksena oli selvittää kalojen tuottaman hiilen kulkeutumista kasveille aquaponics-järjestelmässä hiilen isotooppien avulla ja samalla selvittää, voivatko jotkin kasvit hyödyntää veteen liuennutta epäorgaanista hiiltä juurillaan suoraan vedestä. Työn kokeellista osuutta rahoitti SUREAQUA-projekti. Työn esikokeita suoritettiin talvella 2020–
2021 ja kokeellinen osuus suoritettiin kesä-elokuussa 2021 Kuopio Water Clusterin aquaponics-laboratoriossa Itä-Suomen yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksella. Työ kirjoitettiin huhti-lokakuussa 2021.
Ensimmäisenä haluan kiittää ohjaajiani Harri Kokkoa ja Hannu Nykästä mielenkiintoisesta tutkimusaiheesta, lukuisista neuvoista ja opastuksesta, mutta myös inspiroimisesta tutkielman teon aikana. Kiitos Savonian tutkimusinsinööri Jussi Nivamo ja testausinsinööri Timo Lassila avusta mittalaitteiden liveseurannan pystyttämisessä, Terhon Tammi Oy kalojen toimittamisesta sekä Luonnonvarakeskuksen erityisasiantuntija Antti Nousiainen avusta kalojen merkkauksessa ja siihen tarvittavien välineiden toimittamisesta. Lisäksi kiitos yliteknikko Timo Oksaselle teknisestä avusta aquaponics-järjestelmien rakentamisessa, Japo Jussilalle kaloihin ja aquaponics-järjestelmään liittyvistä neuvoista ja avusta, sekä Jari Syvärannalle neuvoista työn kirjallisuusosioon ja isotooppeihin liittyen. Kiitos myös työn tukemisesta SUREAQUA-projektin Mikko Kolehmaiselle ja Raine Kortetille. Rainelle kiitos myös työn toisena tarkastajana toimimisesta. Viimeisenä kiitokset läheisilleni, jotka ovat kannustaneet ja tukeneet minua koko opintojeni ajan.
Kuopiossa 29.10.2021 Sanni Semberg
LYHENTEET JA MÄÄRITELMÄT
12C: hiili-12 isotooppi
13C: hiili-13 isotooppi
14C: hiili-14 isotooppi
δ-arvo: aineen isotooppikoostumuksen ilmaisemiseen käytetty arvo, yksikkö ‰ R: raskaan ja kevyen isotoopin suhde
Δ, fraktionaatio: aineen isotooppikoostumuksen muuttuminen biogeokemiallisissa prosesseissa
at%: atomiprosentti, raskaamman isotoopin prosenttiosuus aineessa
IRMS: isotooppisuhteita mittaava massaspektrometri (isotope-ratio mass spectometry) CO2: hiilidioksidi
HCO3-: bikarbonaatti NO3-: nitraatti
NH3: ammoniakki NH4+: ammonium-ioni
TAN: kokonaisammoniakin määrä, NH3 ja NH4+ (total ammonia nitrogen) C3-kasvi: fotosynteesissä Calvinin sykliä käyttävä kasvi
KOH: kaliumhydroksidi
DIC: liuennut epäorgaaninen hiili (dissolved inorganic carbon) DOC: liuennut orgaaninen hiili (dissolved organic carbon)
POC: hiukkasmainen orgaaninen hiili (particulate organic carbon)
SISÄLLYS
1 JOHDANTO ... 9
2 KIRJALLISUUSKATSAUS ... 11
2.1 AQUAPONICS-JÄRJESTELMÄ ... 11
2.1.1 Rakenne ja toimintaperiaate ... 11
2.1.2 Ravinteiden kierto ... 13
2.2 VAKAAT ISOTOOPIT ... 14
2.2.1 Vakaiden isotooppien käyttäminen tutkimuksessa ... 14
2.2.2 Isotooppisuhteiden mittaaminen ... 16
2.3 HIILEN KIERTO KASVEISSA ... 17
2.3.1 Kasvien hiilimetabolia ... 17
2.3.2 Hiilen isotoopit ... 18
2.3.3 Kasvien hiilen ottaminen juurilla ... 20
3 TYÖN TAVOITTEET ... 24
4 AINEISTO JA MENETELMÄT ... 25
4.1 AINEISTO ... 25
4.1.1 Kasvit ... 25
4.1.2 Kalat ... 25
4.1.3 Biofiltterin bakteerikanta ... 25
4.1.4 Levä ... 26
4.1.5 Kalanrehu ... 26
4.2 AQUAPONICS-JÄRJESTELMÄT ... 27
4.2.1 Järjestelmien kuvaus ... 27
4.2.2 Koeasetelma ... 28
4.3 JÄRJESTELMIEN TOIMINNAN SEURAAMINEN ... 29
4.3.1 Vedenlaadun seuraaminen ... 29
4.3.2 Toimenpiteet järjestelmien ylläpitämiseksi ... 29
4.3.3 Kalojen ja kasvien kasvun seuraaminen ... 30
4.4 NÄYTTEENOTTO ISOTOOPPIANALYYSIA VARTEN ... 31
4.4.1 Kalanäytteet ... 31
4.4.2 Kasvinäytteet ... 31
4.4.3 Kiintoainesnäytteet ... 31
4.4.4 Kaasunäytteet ... 32
4.4.5 Näytteet liuenneen epäorgaanisen hiilen määrittämiseksi ... 32
4.5 ISOTOOPPINÄYTTEIDEN KÄSITTELY JA ANALYSOINTI ... 32
4.5.1 Kasvi-, kala- ja kiintoainesnäytteiden käsittely ... 32
4.5.2 Kasvi-, kala- ja kiintoainesnäytteiden analysointi ... 32
4.5.3 Kaasunäytteiden ja liuenneen epäorgaanisen hiilen analysointi ... 33
4.5.4 Rehu- ja kalkkinäytteet ... 33
4.6 HIILEN MÄÄRÄN LASKEMINEN ... 33
4.7 TILASTOLLINEN TESTAAMINEN ... 34
5
TULOKSET
... 355.1 JÄRJESTELMIEN TOIMINTA... 35
5.1.1 Vedenlaatu ... 35
5.1.2 Kiintoaines ... 38
5.1.3 Kasvien ja kalojen kasvu ... 38
5.2 ISOTOOPPIANALYYSIT ... 40
5.2.1 Rehu- ja kalkkinäytteet ... 40
5.2.2 Kalanäytteet ... 40
5.2.3 Kasvinäytteet ... 41
5.2.4 Kiintoainesnäytteet ... 43
5.2.5 Kaasunäytteet ... 44
5.2.6 Liuennut epäorgaaninen hiili ... 45
5.3 HIILEN KIERTO JÄRJESTELMISSÄ ... 46
6
TULOSTEN TARKASTELU
... 486.1 JÄRJESTELMIEN TOIMINTA... 48
6.1.1 Vedenlaatu ... 48
6.1.2 Kalojen ja kasvien kasvu ... 49
6.1.3 Kiintoaines ... 50
6.2 HIILI AQUAPONICS-JÄRJESTELMÄSSÄ ... 51
6.2.1 Kaasujen δ13C ja hiilen määrä ... 51
6.2.2 Liuenneen epäorgaanisen hiilen δ13C ja määrä ... 52
6.2.3 Kiintoaineksen δ13C ja hiilen määrä ... 52
6.2.4 Kalojen δ13C ja hiilen määrä ... 53
6.2.5 Kasvien δ13C ja hiilen määrä ... 54
6.2.6 Hiilen kierto aquaponics-järjestelmässä ... 54
6.3 KASVIEN HIILEN OTTAMINEN JUURILLA ... 56
7 JOHTOPÄÄTÖKSET ... 58
8 LÄHDELUETTELO ... 60
LIITTEET
LIITE 1. Järjestelmiin pH:n nostamiseksi tehdyt kaliumhydroksidi (KOH) lisäykset (g) kokeen ajalta.
LIITE 2. Järjestelmiin lisätyn deionisoidun veden määrä (l) kokeen ajalta.
LIITE 3. Laskuesimerkki kasvien juurilla otetun hiilen määrästä, Scenedesmus- järjestelmä.
1 JOHDANTO
Tällä hetkellä arvioidaan, että vajaa 9 % väestöstä eläisi nälässä, ja määrän ennustetaan vain kasvavan kiihtyvän väestönkasvun myötä (FAO 2020). Ruoantuotannon täytyy siis tulevina vuosikymmeninä kasvaa huomattavasti, mutta sen lisäksi se tulee kohtaamaan myös muita haasteita, kuten ilmastonmuutos, saasteet, luonnon monimuotoisuuden väheneminen, pölyttäjien väheneminen ja viljelymaiden pilaantuminen (Goddek ym. 2019). Vaikka ruoankulutus kasvaa maailmanlaajuisesti, käytettävissä olevat resurssit kuten maapinta-ala, vesi ja mineraalit pysyvät rajallisina (Goddek ym. 2019). Vuoteen 2050 mennessä ruokaa tulisi arvioiden mukaan tuottaa jopa 50 % enemmän, jotta pystyttäisiin kattamaan kasvava tarve (FAO 2020). Tämä tarkoittaisi myös ruoantuotannon ympäristövaikutusten lisääntymistä, jos nykyiset ruokailutottumukset ja ruoan tuotantotavat säilyvät ennallaan (FAO 2020).
Kalankasvatus on muuhun eläinproteiinin tuotantoon verrattuna ympäristön kannalta parempi vaihtoehto, koska kalat pystyvät käyttämään rehua tehokkaasti, jolloin tarvittavan rehun tuotantoon kuluu vähemmän vettä ja maapinta-alaa (Pantanella 2018). Kalojen kiertovesiviljely myös kuluttaa vähemmän vettä verrattuna muuhun eläinproteiinin tuotantoon (Joyce ym. 2019) ja lisäksi kaloissa on paljon proteiinia ja ihmisille terveellisiä rasvoja (Ruxton 2011).
Perinteisen kalanviljelyn ongelmia ovat kuitenkin suuri vedenkulutus, helposti leviävät taudit, fossiilisten polttoaineiden käyttö viljelylaitoksissa ja jätevedet, jotka usein lasketaan luontoon.
Perinteinen kasvienviljely taas kuluttaa paljon maapinta-alaa ja vettä sekä aiheuttaa rehevöitymistä lähialueilla ravinnehuuhtoumien takia. Lisäksi lisääntynyt myrkkyjen ja antibioottien käyttö aiheuttaa muun muassa maaperän saastumista, pölyttäjien määrän vähenemistä, resistenttien mikrobikantojen kehittymistä ja riskejä ihmisten terveydelle. (Joyce ym. 2019).
Aquaponics-viljelyllä tarkoitetaan yhdistettyä kalojen ja kasvien kasvatusta suljetussa kiertovesijärjestelmässä (Lennard ja Goddek 2019). Aquaponics-järjestelmä kierrättää vettä ja ravinteita, mikä tekee siitä kestävän ja tehokkaan ruoantuotantomuodon myös kuivilla ja ravinneköyhillä alueilla (Goddek ym. 2019). Aquaponics-järjestelmä pystyy tuottamaan saman verran, tai jopa enemmän satoa, kuin kasvien ja kalojen viljely erillään, mutta huomattavasti pienemmillä ympäristövaikutuksilla (Palm ym. 2019).
Vakaiden isotooppien avulla pystytään seuraamaan aineiden kiertoja niiden toimiessa ikään kuin luonnollisina merkkiaineina (Fry 2006). Hiilen isotooppeja tutkimalla voidaan selvittää
sen kulkeutumista ekosysteemeissä, esimerkiksi hiilidioksidin lähteitä ja käyttäjiä sekä sitä, mihin reaktioihin hiili osallistuu. Aquaponics-järjestelmässä kalojen tuottama hiilidioksidi liukenee veteen, josta se joko haihtuu ilmaan tai kulkeutuu veden mukana kasvien juurille.
Kasvit voivat ottaa hiilidioksidialehdillään ilmasta, mutta mahdollisesti myös pieniä määriä juurilla vedestä.
Tämän tutkielman tavoitteena oli rakentaa toimivia aquaponics-järjestelmiä, kasvattaa niissä vaellussiikaa ja nokkosta sekä selvittää kalojen tuottaman hiilen kulkeutumista kasveille hiilen isotooppien avulla. Samalla haluttiin selvittää, voivatko jotkin kasvit ottaa epäorgaanista hiiltä juurillaan vedestä ja kuinka paljon.
2 KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1 AQUAPONICS-JÄRJESTELMÄ 2.1.1 Rakenne ja toimintaperiaate
Aquaponics-järjestelmä yhdistää kalanviljelyn ja kasvien vesiviljelyn (hydroponinen viljely) samalla vähentäen niiden ympäristöhaittoja. Järjestelmässä syömättömän kalanrehun ja kalojen jätteiden ravinteet muutetaan mikrobien avulla kasveille käytettävissä olevaan muotoon (Joyce ym. 2019). Aquaponics viljelykeinona voi ravinteiden ja jätteiden kierrätyksen kautta auttaa saavuttamaan kestävän kehityksen tavoitteita, etenkin kuivilla ja viljelyskelvottomilla alueilla (Goddek ym. 2019). Kaupunkialueilla ruoantuotanto voitaisiin tuoda lähemmäksi kuluttajia aquaponics-viljelyn avulla (Goddek ym. 2019). Aquaponics-viljelyllä voidaan myös lisätä systeemin tuottoa verrattuna pelkkien kalojen kiertovesiviljelyyn, jossa ongelmana ovat usein myös korkeammat kulut systeemin pyörittämisessä (Timmons ja Ebeling 2007).
Perinteinen aquaponics-järjestelmä koostuu kalatankista, mekaanisesta suodattimesta, biologisesta suodattimesta ja kasvien vesialtaasta (Palm ym. 2019). Rakocy ym. (2006) kuvaavat veden kulun aquaponics-järjestelmässä seuraavasti: vesi kulkee kalatankista ensin mekaanisen suodattimen läpi, jolloin se puhdistuu kiinteästä jätteestä. Sen jälkeen vesi kulkee biofiltterin läpi, jossa sen sisältämä ammoniakki muuttuu nitraatiksi bakteerien toimesta.
Seuraavaksi vesi kulkee kasveille, jossa kasvit ottavat siitä tarvitsemiaan ravinteita ja kasvialtaassa olevat bakteerit poistavat siihen jäänyttä ammoniakkia ja nitriittiä. Lopulta puhdistunut vesi palaa kalatankkiin ja kierros alkaa alusta.
Mekaaninen kiintoaineksen suodatus voidaan toteuttaa monella tavalla, joista käytetyimpiä ovat painovoimaan perustuva suodatus, erilaisten suodattimien käyttö, hapetus ja vaahtoerotus (Thorarinsdottir 2015). Biosuodattimena puolestaan toimii jokin kasvualusta, jossa kasvaa nitrifikaatioon tarvittavia bakteereita (Thorarinsdottir 2015). Järjestelmä tarvitsee myös liuenneen hapen pitoisuuden ylläpitoa, joka tehdään ilmastuksen tai suoran hapen lisäyksen kautta (Lennard ja Goddek 2019). Puhdasta happea käytettäessä tulee kuitenkin huomioida, että silloin tarvitaan myös CO2:n sidontaa, jotta voidaan estää CO2:n kertyminen veteen (Timmons ja Ebeling 2007).
Kasvien vesiviljelyyn on olemassa useampia menetelmiä, joista käytetyimpiä ovat kasvipedit, syvävesiviljely ja ravinnekalvotekniikka (Thorarinsdottir 2015). Kasvipedeissä altaat on täytetty kiinteällä aineella, esimerkiksi lecasoralla, ja niihin kulkee vettä kalatankista
(Thorarinsdottir 2015). Syvävesiviljelyssä kasvit kasvavat kelluvan tai roikkuvan tuen varassa, kuten paneelin tai laudan, paljon vettä sisältävässä altaassa (Maucieri ym. 2019).
Ravinnekalvotekniikassa kasvit kasvavat pienissä putkissa, joissa vesi kiertää jatkuvasti (Maucieri ym. 2019).
Yksi tärkeimmistä prosesseista aquaponics-järjestelmässä on toimiva nitrifikaatio, jossa mikrobit muuttavat kalojen tuottaman haitallisen ammoniakin (NH3) nitriitiksi (NO2-) ja edelleen nitraatiksi (NO3-) (Eck ym. 2019). Ensimmäisen vaiheen tekevät ammoniakkia hapettavat bakteerit, kuten Nitrosomonas, ja toisen vaiheen nitriittiä hapettavat bakteerit, kuten Nitrobacter (Thorarinsdottir 2015). Kalat erittävät typpeä kiduksistaan ammoniakkina ja virtsassa sekä ulosteessa orgaanisena typpenä (Eck ym. 2019). Ammoniakki voi olla lajista riippuen kaloille haitallista jopa alle 1 mg/l pitoisuutena (Eck ym. 2019), mutta useimmilla makean veden lajeilla akuutti haitallinen pitoisuus on noin 3 mg/l (Randall ja Tsui 2002).
Ammoniakin haitallisuus johtuu luultavasti siitä, että ammoniumioni (NH4+)korvaa elimistössä kaliumionin (K+) ja depolarisoi neuroneita, jonka seurauksena soluihin pääsee ylimäärin kalsiumioneja (Ca2+), mikä taas voi johtaa solukuolemiin keskushermostossa (Randall ja Tsui 2002). Nitriitti puolestaan vaikuttaa veren hemoglobiinin hapenkuljetuskykyyn ja sen pitoisuudet suositellaan pitämään alle 1 mg/l (Timmons ja Ebeling 2007). Nitrifikaation toimintaan vaikuttavat ammoniakin määrä, pH, lämpötila ja liuenneen hapen määrä (Timmons ja Ebeling 2007). Kasvit voivat käyttää typen kaikkia muotoja (NH3, NH4+, NO2-, NO3-), mutta nopeimmin kasvit pystyvät hyödyntämään nitraattia (Thorarinsdottir 2015).
Veden laadun ja sen parametrien tarkkailu on aquaponics-järjestelmän toimivuuden kannalta erittäin tärkeää (Lennard ja Goddek 2019). Veden pH-arvo on yksi tärkeimmistä veden parametreista, koska se vaikuttaa kalojen kasvuun, kasvien ravinteiden ottoon ja bakteerien nitrifikaatio toimintaan (Lennar ja Goddek 2019). Kalojen, kasvien ja bakteerien optimi pH- arvot eroavat kuitenkin toisistaan, joten pH tulee asettaa kaikille näille mahdollisimman suotuisaksi, mikä on yleensä 6,8–7,0 (Thorarinsdottir 2015). pH muuttuu aquaponics- järjestelmässä päivittäin respiraation ja nitrifikaation seurauksena, joten sitä joudutaan tarkkailemaan ja ylläpitämään säännöllisesti (Thorarinsdottir 2015). Muitakin veden parametreja tulee tarkkailla ja tarvittaessa säätää aquaponics-järjestelmän onnistuneen toiminnan saavuttamiseksi. Liuenneen hapen pitoisuuden tulisi olla yli 5 mg/l, veden CO2- pitoisuuden alle 20 mg/l ja liuenneen kiinteän aineksen määrän alle 30 mg/l (Lennard ja Goddek
2019). Eri kasvi- ja kalalajien suosimat lämpötilat tulisi myös ottaa huomioon parhaan kasvun saavuttamiseksi (Thorarinsdottir 2015).
Aquaponics-viljelyssä pystytään kasvattamaan monia eri kala- ja kasvilajeja, mutta lajien valintaan vaikuttaa muun muassa systeemin kapasiteetti ja käytettävä kalanrehu (Thorarinsdottir 2015). Siika on Suomessa tärkein valkolihainen kala, mutta kalastetun siian vaihteleva laatu ja saatavuus ovat markkinoiden kannalta ongelma (Setälä 2008). Siikaa on ainakin kerran aiemmin kasvatettu onnistuneesti aquaponics-järjestelmässä (Saramäki 2021).
Nokkonen (Urtica dioica) nähdään usein rikkakasvina, mutta sillä on monia hyviä ominaisuuksia, joita voitaisiin hyödyntää muun muassa ruoka-, lääke- ja kosmetiikkasektoreilla (Virgilio ym. 2015). Nokkonen pystyy kasvamaan myös ylilannoitetussa kasvualustassa (Virgilio ym. 2015), mikä on hyvä ominaisuus aquaponics-järjestelmän kannalta, koska nitraatin pitoisuudet usein nousevat järjestelmän pyöriessä pidemmän aikaa (Rakocy ym.
2006).
2.1.2 Ravinteiden kierto
Merkittävin ravinteiden lähde aquaponics-järjestelmässä on kalanrehu, joka perinteisesti sisältää 6–8 % orgaanista typpeä, noin 1 % orgaanista fosforia ja 40–45 % orgaanista hiiltä (Timmons ja Ebeling 2007). Pieni osa rehusta jää lähes aina käyttämättä, jolloin se hajoaa vedessä kuluttaen happea ja vapauttaen CO2:a ja ammoniakkia (Eck ym. 2019). Kalat käyttävät rehusta saamastaan hiilestä arviolta 22–25 % kasvuun ja aineenvaihduntaan (Eck ym. 2019 ja Yogev ym. 2016). Jäljelle jäänyt hiili eritetään kaloista joko liuenneena tai kiinteänä jätteenä tai respiraation mukana veteen liuenneena CO2:na (Eck ym. 2019). Biofiltterin bakteerikanta käyttää hiiltä nitrifikaatioon, mutta tällä ei katsota olevan vaikutusta kokonaishiilen määrään aquaponics-järjestelmässä, koska käytännössä kaikki orgaaniseksi muutettu hiili hapetetaan bakteerien toimesta (Yogev ym. 2016). Hiiltä on myös aquaponics-järjestelmän vedessä pieniä määriä liuenneena epäorgaanisena hiilenä (DIC), liuenneena orgaanisena hiilenä (DOC) ja hiukkasmaisena orgaanisena hiilenä (POC). Näiden lisäksi suuren osan rehun mukana syötetystä hiilestä (jopa 40 %) arvioidaan päätyvän kiintoainekseen (Yogev ym. 2016).
Kasvit saavat tarvitsemansa hiilen ilman sekä kalojen hengittämästä CO2:sta, josta ne sitovat hiilen biomassaansa ja vapauttavat happea (Eck ym. 2019). Korkeamman ilman CO2- pitoisuuden tiedetään parantavan kasvien tuottoa, mutta CO2:n lisääminen ilmaan on kallista ja kuluttaa paljon energiaa (Timmons ja Ebeling 2007). Aquaponics-viljelyssä CO2:a tuotetaan
systeemissä itsessään, joka voi nopeuttaa kasvien kasvua verrattuna hydroponiseen viljelyyn (Timmons ja Ebeling 2007).
Suurin osa kasvien tarvitsemista ravinteista tulee aquaponics-järjestelmään kalanrehun kautta, mutta eivät kuitenkaan kaikki (Eck ym. 2019). Rakocy ym. (2006) kertovat kasvien tarvitsevan kasvuunsa joitain ravinteita suurempina määrinä (makroravinteet: typpi, kalium, kalsium, magnesium, fosfori, rikki) ja toisia pienempinä pitoisuuksina (mikroravinteet: kloori, rauta, mangaani, boori, sinkki, kupari, molybdeeni). Heidän mukaansa aquaponics-järjestelmässä yleiskuvan veden ravinteista saa mittaamalla johtokykyä, minkä tulisi olla 300–600 µs/cm. He huomauttavat hydroponisessa viljelyssä suositellun arvon olevan 1500–3500 µs/cm, mutta aquaponics-viljelyssä ravinteita tuotetaan jatkuvasti, jolloin pienemmät pitoisuudet riittävät saavuttamaan hyviä tuloksia.
Rakocy ym. (2006) mukaan kaliumin ja kalsiumin pitoisuudet ovat usein riittämättömät aquaponics-järjestelmässä ja kaliumia voidaankin lisätä kaliumhydroksidina (KOH) ja kalsiumia kalsiumhydroksidina (Ca(OH)2), jolloin saadaan samalla nostettua myös veden pH- arvoa. Monesti myös magnesiumin ja raudan lisääminen järjestelmään on tarpeellista kasvien kasvun kannalta. Heidän mukaansa tulee myös huomioida, että natriumpitoisuus ei saisi olla yli 50 mg/l, koska korkea natriumpitoisuus voi vaikuttaa muiden ravinteiden ottamiseen kasveissa ja on yhdessä kloorin kanssa myrkyllistä kasveille. Muita tarvittavia makro- ja mikroravinteita on Rakocy ym. (2006) mukaan tutkimusten perusteella riittävästi, eikä niitä tarvitse lisätä järjestelmän ulkopuolelta.
2.2 VAKAAT ISOTOOPIT
2.2.1 Vakaiden isotooppien käyttäminen tutkimuksessa
Isotoopit ovat saman alkuaineen eri muotoja, jotka eroavat ytimen neutronien lukumäärältään.
Neutronien määrän erotessa suuresti protonien määrästä isotooppi muuttuu epävakaaksi, ja siten hajoaa luonnossa. Fry (2006) mukaan vakaat isotoopit ovat luonnossa pysyviä muotoja ja niitä voidaan käyttää ikään kuin luonnollisina väriaineina tai merkkiaineina aineiden kiertojen tutkimiseen. Fry (2006) kuvaa saman alkuaineen isotooppien reagoivan hieman eri tavoin erilaisissa reaktioissa. Eteenpäin kulkevissa reaktioissa, joissa kemiallisia sidoksia muodostetaan tai rikotaan, pienet erot isotooppien massassa aiheuttavat sen, että kevyempi isotooppi reagoi raskaampaa nopeammin. Tasapainoreaktioissa, jotka voivat kulkea sekä eteen-
että taaksepäin kunnes ne saavuttavat tasapainotilan, raskaampi isotooppi kerääntyy vahvimmat sidokset omaavaan molekyyliin. Näissä reaktioissa isotoopit yhdistyvät ja fraktioituvat eli erottuvat toisistaan. Fry (2006) kuvaa fraktionaation olevan ikään kuin sekoittumisen vastakohta, jossa yhdisteen lähtöaineet erottuvat yhdisteestä takaisin omiksi aineikseen.
Fraktionaation (Δ) ilmaisemiseen ja laskemiseen on käytössä monia eri tapoja, joiden käyttöön vaikuttaa tutkittava kohde (Hayes 2002).
Aineen isotooppikoostumus ilmoitetaan raskaan ja kevyen isotoopin suhteena:
𝑅 = 𝐻𝑋
𝐿𝑋 , (1)
missä X= alkuaine, H= raskas isotooppi ja L= kevyt isotooppi(Hayes 2002).
Käytännön syistä tätä suhdetta merkitään yleensä δ-arvona, joka kuvaa mittauksen isotooppisuhteen eroa standardiin:
δ = [( 𝑅𝑛ä𝑦𝑡𝑒
𝑅𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑𝑖− 1)] ∗ 1000, (2) (Fry 2006).
Hiilen standardina käytetään maailmanlaajuisesti VPDB:tä (alkuperäinen PeeDee Belemnite, nykyisin vastaava Vienna PeeDee Belemnite), jonka 13C/12C on 0,011180 (Fry 2006, Haeyes 2002). δ-arvon yksikkönä käytetään tuhannesosaa (‰) helpottamaan muuten todella pienien lukujen käsittelyä, mistä johtuen δ-arvo saa pienet muutokset isotooppikoostumuksessa vaikuttamaan suuremmilta kuin mitä ne oikeasti ovat (Fry 2006). Korkean δ-arvon saaneet näytteet ovat rikastuneita raskaalla isotoopilla, kun taas matalan δ-arvon omaavat näytteet ovat rikastuneita kevyellä isotoopilla (O’Leary 1988).
Isotooppien suhde kertoo raskaamman isotoopin prosenttiosuuden aineessa, jota voidaan kuvata myös atomiprosentteina (at%):
𝑎𝑡% 𝑋𝐻 = [ 𝐻𝑋
( 𝑋𝐿 + 𝑋𝐻 )] ∗ 100, (3),
missä X= alkuaine, H= raskas isotooppi ja L= kevyt isotooppi (Hayes 2004).
δ-arvojen käyttö tuottaa hyvin pieniä virheitä laskettaessa fraktionaatiota ja sekoittumista (etenkin rikastuneissa näytteissä), jolloin atomiprosentti on parempi laskentatapa, koska se antaa absoluuttisia tuloksia (Fry 2006, Hayes 2004).
Varauksettoman massan (neutronien) lisääminen ei vaikuta aineen kemialliseen reaktiivisuuteen, joten saman alkuaineen eri isotoopit käyttäytyvät suurimmilta osin samalla tavalla kemiallisissa reaktioissa (Peterson ja Fry 1987). Reaktionopeus ja aineiden kulkeutumisnopeus kuitenkin riippuvat nuklidin massasta, mikä saa aikaan eroja aineiden isotooppikoostumuksissa (Hayes 2004). Vakaat isotoopit pystyvät kertomaan sekä aineen alkuperästä, että sen osallistumisesta reaktioihin (Peterson ja Fry 1987). Luonnossa isotoopit kiertävät niille tyypillisiä reittejä, jotka ovat seurausta suurista varastoista, muutamasta yleisestä resurssien ottoon liittyvästä entsyymistä ja yleisestä stoikiometriasta, joka linkittää orgaanisten aineiden kiertoja toisiinsa (Fry 2006).
Dawson ym. (2002) mukaan käytettäessä vakaiden isotooppien luonnollisia esiintymiä edellytyksenä on, että eri isotooppien lähteillä on erilaiset ja toistettavat δ-arvot, jotka eroavat myös tutkittavan kohteen arvoista ja ettei merkittävää fraktionaatiota tai sekoittumista tapahdu aineen kulkeutuessa sen lähteestä tutkittavaan kohteeseen. Nämä edellytykset eivät kuitenkaan usein täyty, mistä johtuen tutkimuksissa käytetäänkin monesti isotoopeilla leimattuja aineita, jolloin voidaan seurata aineen kulkua eri prosesseissa vaikuttamatta sen luonnolliseen kulkeutumiseen (Dawson ym. 2002). Vakaiden isotooppien käyttäminen tutkimuksissa toimii samankaltaisesti kuin radioisotooppien, mutta vakaat isotoopit eivät ole haitallisia ja niitä voidaankin käyttää eläville organismeille ilman toksisia vaikutuksia (Stürup ym. 2008).
Vakaiden isotooppien käyttäminen vaatii kuitenkin tarkkoja menetelmiä isotooppien mittaamiseen ja suuremman määrän isotoopilla rikastettua ainetta verrattuna radioisotoopin käyttämiseen (Stürup ym. 2008). Isotooppileima, usein isotoopilla rikastettu suola, voidaan viedä tutkittavaan kohteeseen joko biosynteesin kautta tai se voidaan lisätä suoraan ulkopuolelta (Stürup ym. 2008).
2.2.2 Isotooppisuhteiden mittaaminen
Isotooppisuhteiden selvittämiseen käytetään massaspektrometrisiä menetelmiä, jotka perustuvat varautuneiden atomien ja molekyylien erotteluun niiden massojen perusteella (Hoefs 2018). Perusidea on, että näytteet muutetaan kaasuiksi ja näytekaasun molekyylit ionisoidaan, jonka jälkeen ionit erotellaan massa-analysaattorilla atomimassan perusteella (Fry 2006).
Massaspektrometri voidaan yhdistää alkuaineanalysaattoriin, jolloin näytteiden esikäsittely on automatisoitua (Kuva 1) (Hoefs 2018).
Kuva 1. Alkuaineanalysaattori yhdistettynä IRMS-laitteeseen hiilen ja typen isotooppien määrittämiseksi. Lähde: Hoefs (2018).
Hiilen ja typen isotooppeja mitattaessa alkuaineanalysaattori muuttaa polttamalla kiinteän näytteen typen ja hiilen N2- ja CO2-kaasuiksi reaktioputkessa, josta ne siirretään kantokaasun (heliumin) avulla kaasukromatografille eroteltavaksi (Révész ym. 2012). Tämän jälkeen kaasut kulkevat isotooppien suhteita mittaavaan massaspektrometriin (IRMS-laite), joka koostuu näytteensyöttö systeemistä, ionilähteestä, massa-analysaattorista ja ionidetektorista (Hoefs 2018). Ionilähteessä kaasun molekyylit ionisoidaan, massa-analysaattorissa ne erotellaan magneettikentän avulla (Révész ym. 2012) ja sen jälkeen erotellut ionit kerätään detektoreille (Hoefs 2018).
2.3 HIILEN KIERTO KASVEISSA 2.3.1 Kasvien hiilimetabolia
Kasvillisuuden hiilivirtoihin vaikuttavat pääasiassa kolme metabolista prosessia: fotosynteesi, fotorespiraatio ja respiraatio. Fotosynteesissä kasvit tuottavat CO2:sta ja vedestä happea ja hiilihydraatteja valon avulla (Duca 2015). Fotosynteesiin liittyvät fysikaaliset ja kemialliset prosessit suosivat hiilen isotooppeja eri tavoin, minkä takia kasveja voidaan luokitella eri
fotosynteettisiin ryhmiin niiden isotooppikoostumuksen perusteella: Calvinin sykliä käyttävät kasvit (C3), Hatch-Slack-sykliä käyttävät kasvit (C4) ja CAM-kasvit (O’Leary 1988). C3- kasvit ovat C4- ja CAM-kasveja yleisempiä luonnossa (O’Leary 1988).
Fotosynteesin ensimmäistä vaihetta kutsutaan valoreaktioiksi ja toista vaihetta CO2:n assimilaatioksi (pimeäreaktiot) (Lal 2018a). C3-kasvien valoreaktioissa kasvi ottaa CO2:a ilmasta ja muuttaa valoenergiaa kemialliseksi energiaksi tuottaen nikotiiniamidiadeniini- dinukleotidifosfaattia (NADPH) ja adenosiinitrifosfaattia (ATP) (Duca 2015). CO2:n assimilaatio tapahtuu Lal (2018a) mukaan Calvinin syklissä, joka voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen. Ensimmäisessä vaiheessa (karboksylaatio) CO2:sta ja ribuloosi 1,5-bisfosfaatista (RuBP) muodostetaan Rubisco-entsyymin avulla 3-fosfoglyseraattia, josta tehdään toisessa vaiheessa (pelkistys) glyseraldehydi 3-fosfaattia, käyttämällä valoreaktioissa tuotettua NADPH:ta ja ATP:ta. Kolmannessa vaiheessa (regeneraatio) 1/6 glyseraldehydi 3-fosfaatista käytetään viherhiukkasissa tärkkelyksen biosynteesiin tai kuljetetaan ulos viherhiukkasista käytettäväksi sakkaroosin biosynteesiin ja loput 5/6 muutetaan takaisin RuBP:iksi käytettäväksi uudestaan Calvinin syklissä.
Respiraatiolla glukoosi hajotetaan solulimassa puryvaatiksi (glykolyysi), joka hapetetaan asetyylikoentsyymi-A:ksi ja käytetään mitokondrioissa ATP:n tuotantoon sitruunahappokierron ja elektroninsiirtoketjun avulla (Lal 2018b). Respiraatio kuluttaa happea ja tuottaa CO2:a. Duca (2015) mukaan respiraatio on kasveille ATP:n tuoton lisäksi tärkeää kaasujen vaihdon ja reaktioissa muodostuvien välituotteiden takia. Normaalin respiraation lisäksi kasvit vapauttavat CO2:a fotorespiraatiossa, jossa Rubisco-entsyymi hapettaa RuBP:ia valon ja hapen läsnä ollessa, muodostaen 2-fosfoglykolaattia ja 3-fosfoglyseraattia (Duca 2015). Fotorespiraatiolla ei tuoteta ATP:ta, vaan sillä on Lal (2018a) mukaan merkitystä kasvin hiilitalouden kannalta, koska saadaan kierrätettyä Calvinin syklissä muuten menetetyt hiilet sekä Rubiscon tuottama glykolaatti. Fotorespiraatio myös suojaa kasvia fotoinhibitiolta ja on osa välttämättömien aminohappojen (glysiini ja seriini) synteesiä.
2.3.2 Hiilen isotoopit
Hiilellä on kaksi vakaata isotooppia: ¹²C (kevyt) ja ¹³C (raskas). Molempia isotooppeja on kaikissa luonnollisissa materiaaleissa, mutta ¹²C osuus on 98,89 %, kun taas ¹³C osuus on vain 1,11 % (Fry 2006). Hiiliatomin osallistuessa kemiallisten sidosten muodostamiseen ja katkeamiseen, sen isotooppien suhde muuttuu (Farquhar ym. 1989). Hiilen kierto luonnossa sisältää aktiivista CO2:n vaihtoa ilmakehän ja maaekosysteemien sekä merenpinnan välillä,
kuten kuvasta 2 huomataan (Peterson ja Fry 1987). Ilmakehän CO2:n δ¹³C-arvo (tällä hetkellä -8 ‰) on pienentymässä fossiilisten polttoaineiden käytön, biomassan polton ja orgaanisen aineksen hajoamisen myötä (Fry 2006). Myös eläimet ovat tärkeä osa aineiden kiertoa ekosysteemissä ja niiden isotooppikoostumus hiilen osalta on usein samanlainen kuin niiden syömässä ravinnossa (Peterson ja Fry 1987).
Kuva 2. δ¹³C jakauma ekosysteemeissä. Yksittäiset nuolet kuvaavat CO2:n kulkua ja kaksinkertainen nuoli kuvaa tasapainoa isotooppifraktionaatiossa. Kuvassa näkyvät numerot ovat varastojen δ¹³C-arvoja (‰) ja nuolien arvot kuvaavat siirtymien aikana tapahtuvaa fraktionaatiota (‰). Lähde: Peterson ja Fry (1987).
C3-kasveilla CO2:n sisäänotto alkaa sen kulkeutumisella ilmarakojen läpi lehden sisäiseen kaasutilaan, jossa CO2 liukenee ja kulkeutuu viherhiukkasille (O’Leary 1988). Näissä vaiheissa tapahtuu pientä isotooppien fraktionaatiota, noin 4,4 ‰ (Δδ), mikä johtuu 13C:a sisältävien CO2-molekyylien hitaammasta liikkeestä (Marshall ym. 2007). Suurin fraktionaatio, noin 29
‰ (Δδ), tapahtuu vasta karboksylaatiossa, jossa Rubisco-entsyymi suosii 12C:a (O’Leary 1988).
Kasvin lopullinen δ¹³C-arvo määräytyy riippuen CO2:n diffuusiosta ja sen entsymaattisesta tarpeesta kasvissa (Marshall ym. 2007). C3-kasveilla lehtien δ¹³C-arvo on yleensä -28 ‰ luokkaa. Lehden δ¹³C-arvot kuvaavat O’Leary (1988) mukaan melko hyvin fraktionaatiota, joka tapahtuu CO2:n sitomisessa, mutta kasvin respiraatio voi vaikuttaa näihin arvoihin. Jos ulos hengitettävässä hiilessä on vähemmän 13C-isotooppia lehteen verrattuna, lehti rikastuu 13C- isotoopilla respiraation myötä.
2.3.3 Kasvien hiilen ottaminen juurilla
Veden liuennut epäorgaaninen hiili (DIC) koostuu liuenneesta CO2, hiilihaposta (H2CO3), bikarbonaatista (HCO3-) ja karbonaatista (CO32-) (Karberg ym. 2005). Liuenneen epäorgaanisen hiilen määrä vedessä määrittyy sekä kaasu-neste tasapainon, että veden pH:n mukaan. Veden pH:n ollessa alle 6,4, suurin osa (>99 %) DIC:stä on muodossa CO2 ja vähän muodossa H2CO3, kun taas pH:n noustessa (6,4–10,4) HCO3- on vallitseva muoto ja pH:n ollessa yli 10,4 CO32-
muuttuu vallitsevaksi (Wojtowicz 2001). CO2 on veteen erittäin liukenevaa, mutta sen konsentraatio puhtaassa vedessä on matala johtuen sen matalasta konsentraatiosta ilmassa (Timmons ja Ebeling 2007).
Vesikasvien tiedetään ottavan merkittäviä määriä hiiltä juurillaan sedimentistä käytettäväksi fotosynteesiin (Raven ym. 1988), mutta maakasvit ottavat suurimman osan (yli 95 %) tarvitsemastaan CO2:sta lehtien kautta ilmasta (Enoch ja Olesen 1992). Tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että maakasvitkin pystyvät ottamaan epäorgaanista hiiltä myös juurillaan (Vuorinen ym. 1989, Stemmet ym. 1962, Leibar-Porcel 2020, Ford ym. 2006, Vuorinen ja Kaiser 1997). Yhden maakasvin (Stylites andicola) on myös todettu ottavan melkein kaiken sen tarvitseman hiilen juurilla maaperästä, koska sen lehdissä ei ole ilmarakoja (Keeley ym. 1984).
Juurilla otetun hiilen merkityksestä maakasveille ei olla vielä täysin varmoja, koska tutkimuksissa on raportoitu niin positiivisia kuin negatiivisia tuloksia lisättäessä kasvien kasvualustan DIC-pitoisuutta (Enoch ja Olesen 1992). Tarkkaa mekanismia hiilen ottamiseen juurilla ja sen kohtaloa kasveissa ei myöskään tiedetä kunnolla. Teoriassa juurilla otetulle CO2:lle tapahtuu jokin seuraavista kasvissa: CO2 yhteytetään fosfoenolipuryvaatti (PEP) karboksylaasin toimesta oksaloasetaatiksi ja malaatiksi ja lopulta muutetaan aminohapoiksi, CO2 kuljetetaan ksyleemissä juurista versoon ja käytetään varren tai lehtien viherhiukkasissa fotosynteesiin tai CO2 vapautetaan verson osista ilmaan (Shimono ym. 2018).
Enoch ja Olesen (1992) kokoavat artikkelissaan CO2:lla rikastetun veden käytön vaikutuksia kasvien kasvuun ja satoon. Heidän analysoimissaan tutkimuksissa CO2:lla rikastetulla vedellä kasvatettujen kasvien sato kasvoi keskimääräisesti noin 3 %:lla verrattuna kontrolleihin.
Tutkijoiden mukaan yksi kasvua selittävä tekijä voisi olla CO2:n ottaminen juurilla, vaikkakin kasvit yleisesti ottavat 95–99 % tarvitsemastaan CO2:stailmasta. He arvioivat kuitenkin, että suurin satoa lisäävä tekijä olisi tahaton ilman CO2-pitoisuuden nostaminen käyttämällä CO2:lla rikastettua vettä. Useammissa tutkimuksissa kasvien on kuitenkin havaittu pystyvän ottamaan liuennutta epäorgaanista hiiltä vedestä juurillaan ja kuljettamaan sen muihin kasvin osiin,
vaikka CO2:nvapautuminen vedestä ilmaan on estetty (Vuorinen ym. 1989, Stemmet ym. 1962, Leibar-Porcel 2020, Ford ym. 2006, Vuorinen ja Kaiser 1997).
Amiro ja Ewing (1992) käyttivät 14C apuna tutkiessaan papujen epäorgaanisen hiilen ottoa juurilla ja havaitsivat sen olevan lähinnä passiivinen tapahtuma, joka etenee haihdutuksen kanssa samaa tahtia. Heidän tutkimuksessaan ilman CO2-pitoisuudella ei ollut vaikutusta juurien epäorgaanisen hiilen ottoon, vaikka se vaikuttikin kasvin fotosynteesin tehokkuuteen.
Tutkijoiden mukaan tämä viittaisi siihen, että kasvi ei voi kompensoida hiilen saantiaan matalassa ilman CO2-pitoisuudessa ottamalla juurillaan enemmän CO2:a.
Vuorinen ym. (1989) käyttivät 14C:a tutkiessaan pajun kykyä ottaa liuennutta epäorgaanista hiiltä vesiliuoksesta juurilla ja havaitsivat pajun kuljettavan 14C:a juurista versoon ja lehtiin sekä pimeässä, että valoisassa. Heidän käyttämänsä kontrollikasvit osoittavat, että vesiliuoksesta ei päässyt haihtumaan merkittäviä määriä hiiltä ilmaan, jolloin Enoch ja Olesen (1992) kuvailema tahaton ilman rikastaminen CO2:lla ei ole ollut kyseessä. Vuorinen ym.
(1989) myös vertasivat lasketun passiivinen kuljetuksen (transpiraatio) osuutta havaittuun kasvien kuljettaman 14C:n määrään ja totesivat, että passiivinen kuljetus voi vastata vain osittain hiilen otosta, jolloin kasvien on myös aktiivisesti otettava hiiltä juurillaan.
Stemmet ym. (1962) käyttivät 14C:a apuna tutkiakseen tomaattien kykyä ottaa CO2:a juurilla vesiliuoksesta kolmessa eri valaistuksessa (luonnonvalo, luonnonvalo ja hehkulamppu sekä täysi pimeys). Kasvit, jotka olivat saaneet tarpeeksi CO2:a maaperästä ennen koetta, ottivat vähemmän CO2:a vesiliuoksesta verrattuna kasveihin, jotka eivät olleet saaneet juurillaan CO2:a 12 tuntiin. Tutkijat huomasivat juurilla otetun CO2:n määrän olevan suunnilleen sama pimeässä ja valoisassa, mutta havaitsivat luonnonvalossa ja pimeässä kasvavien kasvien vapauttavan 14CO2 lehdistään respiraation myötä. Tehostetussa valaistuksessa 14CO2:ta imettiin juurilla enemmän verrattuna luonnonvaloon, mutta sitä ei vapautettu lehdistä ollenkaan. 14C- pitoisuus versossa oli kuitenkin lähes sama kuin juurissa. Tämä viittaisi siihen, että yhdistettä, jossa 14C kulkeutui versoon, ei ole hyödynnetty respiraatio tuotteena tai se on vapautettu ja hyödynnetty välittömästi uudelleen lehdissä tapahtuvassa fotosynteesissä. Pimeässä olleiden kasvien 14C-pitoisuudet olivat paljon suuremmat juurissa kuin versossa, mutta sitä vapautettiin lehdistä enemmän kuin valoisassa. Tutkijoiden mukaan tämä tarkoittaisi sitä, että suurin osa juurilla otetusta 14C:sta on kuljetettu versoon ja vapautettu CO2:na. Matalammalla valon voimakkuudella 14C-pitoisuudet olivat juurissa sekä versossa samaa luokkaa, mutta 14CO2:a vapautettiin vähemmän kuin pimeässä.
Leibar-Porcel ym. (2020) lisäsivät 13C-leimattua HCO3- hydroponisesti kasvatetun salaatin ja paprikan kasvatusliuoksiin ja havaitsivat niiden biomassojen kasvavan 10 %:lla. He myös raportoivat molempien kasvien lehtien δ13C-arvojen nousevan, mikä varmistaa DIC:in ottamisen juurilla ja kuljetuksen versoon. Tutkimuksessa havaittiin kasvatusliuoksen pH:n vaikuttavan kasvien verson δ13C-arvoihin, minkä arvioidaan merkitsevän sitä, että pH vaikuttaa kasvien aineiden kuljetukseen juurista versoon. pH:lla ei kuitenkaan havaittu olevan vaikutusta kasvin hiilen ottamiseen juurilla, mikä tarkoittaisi sitä, ettei DIC:in muoto (CO2/HCO3) vaikuta kasvin kykyyn ottaa sitä juurilla.
Ford ym. (2006) tutkivat mäntyjen (Pinus taeda) kykyä ottaa maaperän veteen liuennutta hiiltä juurillaan 13C:n avulla ja NH4+:n vaikutusta hiilen sitomiseen. He havaitsivat hiilen kulkeutuvan männyn taimissa juurista versoon ja varren sisältävän kasvin maanpäällisistä osista eniten juurista tuotua 13C:a. Maan alla olevista osista eniten 13C:a löytyi ei-sienijuurista. Korkeampi NH4+-pitoisuus vaikutti maasta otetun hiilen jakautumiseen kasvissa ja lisäsi sienijuurilla otetun hiilen määrää 130 % verrattuna kontrolleihin. Heidän tuloksensa osoittivat, että mäntyjen taimet pystyvät ottamaan hiiltä juurillaan ja yhteyttämään sen kasvissa, mutta tutkijat arvioivat juurilla otetun hiilen vastaavan noin 1 % koko kasvin tarvitsemasta hiilestä. Heidän mukaansa juurilla otetulla hiilellä voi kuitenkin olla tärkeä merkitys tietyissä kasvin osissa, kuten uusissa varsissa ja hienojuurissa, sekä sienijuurissa.
Vuorinen ja Kaiser (1997) tutkivat CO2:n vaikutusta pajun ja ohran juurien fotosynteesin pimeäreaktioihin. He kasvattivat kasveja HCO3-- ja CO2-liuoksissa sekä käyttivät NaH14CO3:a apuna tutkiessaan pimeäreaktioita. Tutkimuksessa havaittiin HCO3-- sekä CO2-liuoksien yhdessä NO3-:n kanssa lisäävän pimeäreaktioiden nopeutta pajun ja ohran juurissa. NH4+
yhdessä HCO3- tai CO2:n kanssa ei lisännyt pimeäreaktioiden nopeutta yhtä paljon. Tutkijoiden mukaan heidän tuloksensa osoittavat, että epäorgaanisen hiilen aikaansaamalla pimeäreaktioiden nopeutumisella olisi merkitystä juurien nitraatti metaboliaan. He arvioivat, että epäorgaanisen hiilen lisääminen mahdollistaa jatkuvat sitruunahappokierron, jolloin NADPH:ta tuotetaan enemmän, josta seuraa tehokkaampi NO3-:n ottaminen.
Suurin osa aquaponics-järjestelmän CO2:staon kalojen tuottamaa tai muodostuu orgaanisen aineksen hajotessa, koska diffuusio ilmasta on hyvin pientä (Timmons ja Ebeling 2007). CO2
liukenee järjestelmässä veteen ja voi sitä kautta kulkeutua kasvien juurille, josta kasvit voisivat sitä mahdollisesti hyödyntää. Osa CO2:sta haihtuu vedestä ilmaan eri järjestelmän osissa, josta kasvit voivat sitä myös hyödyntää lehtiensä avulla. Vaikka tutkimustulokset juurilla otetun
CO2:n merkityksestä kasveissa eroavat jokseenkin toisistaan, on tutkimuksissa havaittu kasvien pystyvän ottamaan ja hyödyntämään juurilla otettua hiiltä. Aquaponics-järjestelmässä kalojen tuottama CO2 voisi siis mahdollisesti lisätä kasvien kasvua ja näin tuotettua biomassaa.
3 TYÖN TAVOITTEET
Tämän työn tarkoituksena oli rakentaa toimivia aquaponics-järjestelmiä ja kasvattaa niissä vaellussiikaa sekä nokkosta. Lisäksi tarkoituksena oli leimata kalanrehua 13C-isotoopilla levän avulla ja selvittää kalojen tuottaman hiilen kulkeutumista kasveille käyttäen hiilen isotooppeja.
Työn tavoitteena oli selvittää hiilen kiertokulku aquaponics-järjestelmässä hiilen isotooppien avulla. Samalla haluttiin selvittää, voivatko jotkin kasvit ottaa epäorgaanista hiiltä juurillaan vedestä ja kuinka paljon.
4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 AINEISTO 4.1.1 Kasvit
Syyskuussa 2020 kerättiin luonnosta (62° 52,288 P, 027° 39,009 I) nokkosen (Urtica dioica) pistokkaita, joita kasvatettiin lecasorassa lannoitevedessä talvella 2020–2021. Näistä nokkosista otettiin pistokkaita, joita esikasvatettiin ravinneliuoksessa yhdeksän viikon ajan.
Nokkoset siirretiin aquaponics-järjestelmiin, jossa niitä kasvatettiin yhdeksän viikon ajan ennen kokeen alkua. Neljä viikkoa ennen kokeen alkua järjestelmissä olevista nokkosista otettiin pistokkaita niin, että kasvialtaissa oli puolet (19 kpl) vanhoja kasveja ja puolet (19 kpl) uusia pistokkaita. Uudet pistokkaat juurrutettiin suoraan järjestelmissä.
4.1.2 Kalat
Kaikissa järjestelmissä kasvatettiin vaellussiikaa (Coregonus maraena), jotka saatiin Terhon Tammi Oy:lta neljä viikkoa ennen kokeen alkua. Kalat merkattiin kaksi viikkoa ennen kokeen alkua Biomarkin GPT12 PIT-merkeillä (merkkausalusta Biomark pre-loaded tray clamp, merkkauspistooli Biomark MK25 impant gun) yksilöllisen kasvun seuraamiseksi.
Merkkauksen ajaksi kalat nukutettiin Pharmaq Tricainella (pitoisuus 0,1 g/ l vettä) laittamalla nukutus astiaan 10 l vettä, 1 g Tricainea ja 1 g ruokasoodaa. PIT-merkit ja kalojen paino sekä pituus tallennettiin RUFCO-GM2 tiedonkeruujärjestelmällä merkkauksen yhteydessä.
Merkkauksen jälkeen kalojen annettiin herätä erillisessä astiassa, josta ne siirrettiin takaisin järjestelmiin. Kalojen merkkaus tehtiin yhteistyössä Luonnonvarakeskuksen kanssa.
Siikoja oli kokeen alkaessa altaissa seuraavasti: Scenedesmus-järjestelmässä (järjestelmien nimeäminen ks. kappale 4.2.2) oli 16 kpl, yhteispaino 942 g, Acutodesmus-järjestelmässä oli 14 kpl, yhteispaino 855 g ja kontrollijärjestelmässä oli 18 kpl, yhteispaino 935 g. Yhden kalan paino oli keskimääräisesti Scenedesmus-järjestelmässä 59 g, Acutodesmus-järjestelmässä 61 g ja kontrollijärjestelmässä 52 g.
4.1.3 Biofiltterin bakteerikanta
Bakteerikantaa biofilttereitä varten kasvatettiin erillään järjestelmistä neljän kuukauden ajan.
Bakteerikanta saatiin aiemmin käytetyistä suodatinmateriaaleista, sekä lisäämällä Kallaveden vettä bakteerikasvatukseen. Kasvatukseen lisättiin myös säännöllisesti ammoniakkia bakteereille käytettäväksi. Kasvatuksen aikana nitrifikaation tehokkuutta seurattiin mittaamalla ammoniumin ja nitraatin määriä Aquatroll-500 mittalaitteilla (Insitu, Yhdysvallat). Neljä
kuukautta ennen kokeen alkua kunkin järjestelmän biofiltteriin lisättiin kasvatuksesta aktivoituja bakteereja sisältävää suodatinmateriaalia 28 l, joiden lisäksi laitettiin uutta suodatinmateriaalia 45 l. Suodatinmateriaali mahdollisti bakteereille suuremman pinta-alan kasvuun. Ennen kalojen lisäämistä järjestelmiin, biofilttereihin lisättiin säännöllisesti ammoniakkia bakteerikannan ylläpitämiseksi.
4.1.4 Levä
Yliopiston aikaisemmasta leväkasvatuksesta saatiin kaksi valmista leväkasvustoa:
Acutodesmus ja Scenedesmus. Näitä kasvatettiin viikon ajan MWC-kasvatusliuoksessa (Guillard ja Lorenzen 1972), jonka aikana Acutodesmus-kasvustoon lisättiin yhteensä 0,9 g ja Scenedesmus-kasvustoon 1,5 g 13C-leimattua natriumvetykarbonaattia. Leimaa lisättiin kasvustoihin kolmena eri päivänä viikon ajan. Kasvatuksen lopussa levät eroteltiin kasvatusliuoksesta sentrifugoimalla (sentrifuugi 5810 R, 4000 rpm, 10 min, 9 °C) ja levämassa säilytettiin kylmiössä kalanrehun tekoon asti.
4.1.5 Kalanrehu
Alkuperäinen kalanrehu (lähes vastaava kuin Raisioaqua Oy:n Silver Opti 1,7 S) saatiin Terhon Tammi Oy:lta, josta valmistettiin kolme erilaista rehua koetta varten: Acutodesmus-levän avulla leimattu rehu, Scenedesmus-levän avulla leimattu rehu ja leimaamaton rehu. Leimattu kalanrehu valmistettiin sekoittamalla ensin levämassa 1 l vettä monitoimikoneella, jonka jälkeen siihen sekoitettiin 2 kg kalanrehua. Valmis seos jauhettiin lihamyllyn läpi, jotta saatiin kaloille sopivan kokoisia pellettejä. Pelletit kuivattiin lämpökaapissa 50 °C vuorokauden ajan.
Leimaamaton rehu käsiteltiin muuten samalla tavalla, mutta ei lisätty levää.
4.2 AQUAPONICS-JÄRJESTELMÄT 4.2.1 Järjestelmien kuvaus
Tämän tutkielman kokeellinen osuus suoritettiin Itä-Suomen yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksen Snellmania-rakennuksessa Kuopio Water Clusterin Aquaponics- laboratoriossa. Aquaponics-järjestelmiä oli kolme, jotka koostuivat kasvialtaasta, kala-altaasta, pumpun altaasta, mekaanisista suodattimista ja biologisesta suodattimesta (Kuva 3).
Kuva 3. a) Aquaponics-järjestelmän komponentit laboratoriossa b) Kaaviokuva aquaponics- järjestelmästä. Aquaponics-järjestelmät koostuivat kala-altaasta (1), mekaanisista suodattimista (2a ja 2b), kasvipedistä (3), pumppualtaasta (4), biologisesta suodattimesta (5), kasvivalosta (6), ruokinta- automaatista (7) sekä Aquatroll-500 mittalaitteesta (8).
Mekaanisena suodattimena käytettiin lieriön mallista pyörreselkeytintä, jonka vesitilavuus oli 30 l ja alaosa sisältä suppilomainen. Pyörreselkeyttimeen oli kiinnitetty erillinen pienempi selkeytin (tilavuus 4 l, vettä 3,7 l), jossa oli suodatin. Sen tarkoituksena oli kerätä kala-altaasta tulevaa syömätöntä rehua ja kiintoainesta. Biologisena suodattimena käytettiin reilun kahden metrin korkuista putkea, jossa oli suodatinmateriaalia. Biofilttereissä oli vettä 64 l ja suodatinmateriaalia 73 l. Järjestelmät ilmastettiin johtamalla ilmaa pumpulla (Hiblow HP120,
a) b)
ilmavirta 25 ml/min jaettuna kolmeen järjestelmään) ilmastinkivien läpi biofilttereiden pohjalle. Biofilttereiden tulovesi ohjattiin putkien avulla niiden pohjalle, mutta vesi poistui biofiltteristä sen yläreunassa olevan putken kautta. Vesipumput (Eheim compactON 2100) olivat erillisessä altaassa, jonka tilavuus oli 43 l. Pumppualtaat olivat järjestelmien ainoa osa, jossa veden määrä vaihteli. Vettä pumppualtaissa oli kokeen aikana 13 – 22 l. Kala-altaan tilavuus oli 87 l ja siinä oli vettä noin 80 l. Kasvialtaana käytettiin muovista allasta, jossa oli vettä 52 l. Kasvialtaan keskeltä kulki putki pumppujen altaisiin, minkä avulla kasvialtaan veden korkeus säädettiin sopivalle tasolle. Kasveja kasvatettiin syvävesiviljely tekniikalla, eli kasvialtaan päällä oli vanerilevy, jossa oli reiät kasvien ruukuille. Kasvit istutettiin reiällisiin ruukkuihin lecasoraan ja asetettiin vanerilevyn reikiin. Jokaisessa altaassa oli paikka 38 kasville. Kaikkien kasvipetien yllä oli LED-valaisimet (Koray RX-G700), joita ohjattiin puhelinsovelluksen (Koray Horti Guru) avulla. Valaisimet olivat päällä klo 06.00-18.00 ja valon intensiteetti (PAR) oli 500 – 700 µmol/m2/s kasvipedin vanerilevyn pinnalla, ennen kasvien varjostamista.
Järjestelmissä vesi kulki kala-altaasta ensin pienempään mekaaniseen selkeyttimeen, sitten pyörreselkeyttimeen, josta vesi kulkeutui kasvialtaaseen ja edelleen pumppualtaaseen.
Pumppualtaasta vesi pumpattiin akvaariopumpuilla biofiltteriin, josta se lopulta palasi takaisin kala-altaaseen. Veden nostokorkeus oli noin 2 metriä. Yhteensä yhden järjestelmän vesimäärä oli kokeen aikana 317–326 l, riippuen pumppualtaan veden määrästä. Kaikki läpinäkyvät osat päällystettiin foliolla ja altaiden päälle tehtiin kannet levien kasvun ja kaasujen vapautumisen estämiseksi. Biofilttereiden päältä vapautuvat kaasut johdettiin putkien avulla ilmanpoistokanavaan.
4.2.2 Koeasetelma
Koe suoritettiin 32 päivän aikana 10.7.–10.8.2021. Hiilen kiertoa järjestelmissä seurattiin 13C- isotoopin avulla, joka lisättiin järjestelmiin kalanrehun kautta. Järjestelmän 1 kaloille syötettiin Scenedesmus-rehua (jatkossa Scenedesmus-järjestelmä), järjestelmän 2 kaloille syötettiin Acutodesmus-rehua (jatkossa Acutodesmus-järjestelmä) ja järjestelmän 3 kaloille leimaamatonta rehua (jatkossa kontrollijärjestelmä). Kalat ruokittiin ruokinta-automaattien avulla neljä kertaa päivässä; klo 6, 9, 12 ja 15. Jokaiseen järjestelmään syötettiin yhteensä 430 g rehua kokeen aikana seuraavasti: koepäivinä 1–24 yhteensä 15 g/päivä ja päivinä 25–32 yhteensä 10 g/päivä. Kokeen aikana järjestelmien toimintaa seurattiin ja ylläpidettiin.
Isotooppianalyysia varten kokeen aikana kerättiin kasvi-, kala-, kiintoaines-, kaasu- ja DIC- näytteitä.
4.3 JÄRJESTELMIEN TOIMINNAN SEURAAMINEN 4.3.1 Vedenlaadun seuraaminen
Järjestelmien vedenlaatua seurattiin Aquatroll-500 mittalaitteilla (In-Situ, Yhdysvallat), joihin oli kytkettynä pH (toimintaväli 0-14, tarkkuus ±0,1, resoluutio 0,01), lämpötila (toimintaväli - 5–50 °C, tarkkuus ±0,1 °C, resoluutio 0,01 °C) ja johtokyky (toimintaväli 0–350 000 µS/cm, tarkkuus ±0,5 µS/cm, resoluutio 0,1 µS/cm), ammonium (toimintaväli 0–10 000 mg/l-N, tarkkuus ±2,0 mg/l-N, resoluutio 0,01 mg/l) sekä nitraatti (toimintaväli 0–40 000 mg/l-N, tarkkuus ±2,0 mg/l-N, resoluutio 0,01 mg/l) sensorit. Aquatroll-500 laitteet oli asetettu pyörreselkeyttimien päälle ja kytketty Rasberry PI 4-laitteistoon, josta mittausdataa tallennettiin Python-sovelluksella SQLite-tietokantaan sekä varmuuskopioitiin Google Drive- palveluun. Datan liveseurantaan käytettiin Grafana-sivustoa, johon mittausdata haettiin SQLite-tietokannasta. Aquatroll-500 mittalaitteiden lukeminen sekä luetun tiedon tallentaminen ja visualisointi toteutettiin yhteistyönä Savonia-ammattikorkeakoulun kanssa.
Lisäksi hapen pitoisuuksia seurattiin satunnaisesti kokeen aikana Fibox 4 trace happimittarilla.
4.3.2 Toimenpiteet järjestelmien ylläpitämiseksi
Neljä kuukautta ennen kokeen alkua kaikkien järjestelmien kasvialtaisiin lisättiin kalkkikivirouhetta 500 g sekä Ferticare 4-17-24 lannoitetta 50 g. Kokeen aikana järjestelmiin lisättiin kalium hydroksidia (KOH) pumppualtaiden kautta pH:n nostamiseksi. Kaikki järjestelmiin tehdyt KOH-lisäykset on esitetty Liitteessä 1.
Kokeen alussa järjestelmiin lisättiin 300 l deionisoitua vettä. Kokeen aikana vettä poistui järjestelmistä kiintoaineksen poiston, haihtumisen ja kasvien transpiraation yhteydessä, joten deioinisoitua vettä lisättiin järjestelmiin pumppualtaiden kautta tarvittaessa. Järjestelmiin tehdyt veden lisäykset on esitetty Liitteessä 2.
Kala-altaista tulevaa kiintoainesta poistettiin pyörreselkeyttimien alaosan kautta kerran viikossa. Nokkosia harvennettiin ja kukintoja leikattiin pois kokeen aikana tarvittaessa. Kokeen loppupuolella vedenkierto heikentyi järjestelmissä, koska kasvien juuret tukkivat kasvipedin poistoputkea ja järjestelmissä kiertävä kiintoaines heikensi pumppujen tehoa. Tällöin kala- altaiden pohjiin, etenkin Acutodesmus-järjestelmässä, kerääntyi syömätöntä kalanrehua ja kalojen eritteitä. Kala-altaiden pohjista poistettiin kiintoainesta koepäivinä 25 ja 26.
Koepäivänä 27 kasvien juuria siirrettiin kasvipetien poistoputkien päältä ja pumput puhdistettiin, jolloin vedenkierto saatiin palautettua normaaliksi kaikissa järjestelmissä.
4.3.3 Kalojen ja kasvien kasvun seuraaminen
Kalat punnittiin laboratoriovaa’alla (tarkkuus 0,01 g) ja mitattiin viivoittimella yksilöllisesti ennen kokeen alkua ja sinä päivänä, kun ne poistettiin järjestelmistä. Kalojen kokonaiskappalemäärää ja yhteismassaa jokaisessa järjestelmässä seurattiin myös kokeen aikana. Kaikille kaloille laskettiin hetkellinen kasvu (%/vrk) Kaavalla 4.
𝐻𝑒𝑡𝑘𝑒𝑙𝑙𝑖𝑛𝑒𝑛 𝑘𝑎𝑠𝑣𝑢 = (
𝑊𝑙−𝑊𝑎 𝑡
𝑊𝑙 ) × 100, (4)
missä Wl=kalojen loppupaino (g), Wa=kalojen alkupaino (g) ja t=kokeen kesto päivinä.
Nokkosista leikattiin kokeen aikana kukintoja pois useamman kerran. Lisäksi nokkosbiomassaa poistettiin kaksi kertaa kokeen aikana, päivinä 4 ja 21, kasvun kontrolloimiseksi. Poistettu nokkosbiomassa kuivattiin lämpökaapissa 60 °C kolmen päivän ajan ja punnittiin laboratoriovaa’alla (tarkkuus 0,01 g). Kokeen loputtua nokkosista leikattiin kaikki kasvipedin päällinen biomassa talteen. Kaikkien nokkosten juuret huuhdeltiin kiintoaineksen poistamiseksi ensin hanavedellä ja sitten deionisoidulla vedellä. Juuret leikattiin irti ruukuista ja kuivattiin muun biomassan kanssa lämpökaapissa 60 °C viiden päivän ajan. Kuivattu biomassa punnittiin laboratoriovaa’alla (tarkkuus 0,01 g).
4.4 NÄYTTEENOTTO ISOTOOPPIANALYYSIA VARTEN 4.4.1 Kalanäytteet
Kalanäytteitä otetiin koepäivinä 0, 10, 20 ja 32. Päivinä 0, 10 ja 20 kaloja otettiin kolme kappaletta näytteeksi jokaisesta järjestelmästä ja kokeen lopussa otettiin kaikki jäljelle jääneet kalat. Kalat punnittiin, niiden pituus mitattiin ja niistä otettiin maksa- sekä lihasnäytteet.
Näytteet pakastettiin myöhempää analysointia varten. Viimeisistä (koepäivä 32) kalanäytteistä otettiin maksa- ja lihasnäytteen lisäksi myös ulostenäyte.
4.4.2 Kasvinäytteet
Nokkosista otettiin näytteitä koepäivinä 0, 10, 20 ja 32. Yhdeksi näytteeksi otettiin kolmesta eri kasvista 4–6 lehteä sisältävä silmu niin, että kasvit sijaitsivat pituussuunnassa samalla kohdalla, mutta leveyssuunnassa eri kohdalla kasviallasta. Pienemmistä nokkosista otettiin aina kolme kokoelmanäytettä ja isommista kolme, jolloin nokkosnäytteitä otettiin yhteensä kuusi kappaletta jokaisesta järjestelmästä. Lisäksi pienempien nokkosten juurista otettiin samalla tavalla kokoelmanäytteitä kolme kappaletta jokaisesta järjestelmästä. Juuria huuhdeltiin deioinisoidulla vedellä ennen kuivausta pinnalla olevan kiintoaineksen poistamiseksi.
Isommista nokkosista ei otettu kokeen aikana juurinäytteitä juurien suuren koon ja näin ollen vaikean näytteenoton takia.
4.4.3 Kiintoainesnäytteet
Pyörreselkeyttimistä otettiin kerran viikossa jätevettä 5 l, josta otettiin 50 ml osanäyte.
Osanäytteen homogeenisuus varmistettiin sekoittamalla jätevettä magneettisekoittajalla näytteenoton yhteydessä. Kiintoaines erotettiin vedestä ensin sentrifugoimalla 50 ml:n putkissa (sentrifuugi 5810 R, 4000 rpm, 10 min, 9 °C), jonka jälkeen supernatantti dekantoitiin pois ja pohjalle painunut kiintoaines siirrettiin deionisoidun veden avulla eppendorf-putkiin.
Lopullinen näyte saatiin sentrifugoimalla eppendorf-putket (sentrifuugi 5414D, 10 rcf, 5 min), dekantoimalla supernatantti pois ja kuivaamalla jäljelle jäänyt sakka lämpökaapissa yön yli.
Kuivunut kiintoaines punnittiin laboratoriovaa’alla (tarkkuus 0,1 mg) ja sen perusteella laskettiin arvio kiintoaineksen määrästä järjestelmissä.
Kokeen loputtua kasvipetien vedestä otettiin 50 ml:n näytteet kiintoaineksen määrän arvioimiseksi. Kasvipetien vettä sekoitettiin akvaariopumpun avulla, jotta saataisiin homogeeninen otos. Jokaisesta kasvipedistä otettiin kaksi rinnakkaista näytettä. Näytteet käsiteltiin samoin kuin pyörreselkeyttimistä otetut kiintoainesnäytteet.
4.4.4 Kaasunäytteet
Biofilttereiden poistoilmasta otettiin kaasunäytteitä ennen kokeen alkua, koepäivinä 7, 14, 21, 28, sekä kokeen lopussa. Muiden päivien näytteet otettiin aamupäivällä, mutta koepäivän 28 näytteet otettiin iltapäivällä. Näytteitä otettiin kaksi rinnakkaista jokaisesta järjestelmästä sekä kaksi näytettä huoneilmasta (ambientti). Kaasunäytettä otettiin 25 ml 12 ml:n vakumoituihin näyteputkiin ja ne säilytettiin huoneenlämmössä myöhempää analysointia varten. Ennen näytteiden analysointia niistä poistettiin ylipaine vesilukon avulla.
4.4.5 Näytteet liuenneen epäorgaanisen hiilen määrittämiseksi
Järjestelmien vedestä otettiin näytteitä liuenneen epäorgaanisen hiilen (DIC) määrittämiseksi ennen kokeen alkua, koepäivinä 7, 10, 14, 21, 28, sekä kokeen lopussa. Näytteitä otettiin kolme rinnakkaista jokaisen järjestelmän pyörreselkeyttimestä sekä pumppualtaasta. Jokaisesta järjestelmästä otettiin yhteensä kuusi näytettä jokaisella kerralla. Näytettä otettiin samalta syvyydeltä 2 ml hapotettuihin (0,2 ml 85 % H3PO4) ja typellä (N2) huuhdottuihin näyteputkiin.
Ennen näytteenottoa näyteputkista poistettiin ylipaine vesilukon avulla. Näytteet säilytettiin pystyasennossa huoneenlämmössä myöhempää analysointia varten.
4.5 ISOTOOPPINÄYTTEIDEN KÄSITTELY JA ANALYSOINTI 4.5.1 Kasvi-, kala- ja kiintoainesnäytteiden käsittely
Nokkosnäytteitä kuivattiin lämpökaapissa 60 °C kolmen päivän ajan. Kuivatut kasvinäytteet jauhettiin spaattelilla ja niihin lisättiin 3-5 pisaraa suolahappoa (1M HCl) epäorgaanisen hiilen poistamiseksi. Hapotetut näytteet kuivattiin uudestaan lämpökaapissa 60 °C yhden vuorokauden ajan. Hapotetut ja kuivatut näytteet säilytettiin eksikaattoreissa.
Kalojen maksa-, lihas- ja ulostenäytteet kylmäkuivattiin LyoLab 3000 (Heto) laitteella, joka oli yhdistetty RC 10–10 sentrifuugihaihduttajaan (Jouan). Kuivatut näytteet jauhettiin spaattelilla.
Kaikki kasvi-, kala- ja kiintoainesnäytteet punnittiin tinakuppeihin MX5 milligramma vaa’alla (Mettler Toledo) isotooppianalyysia varten. Kasvinäytteitä punnittiin 2 mg, kalanäytteitä 1 mg ja kiintoainesnäytteitä 1 mg.
4.5.2 Kasvi-, kala- ja kiintoainesnäytteiden analysointi
Näytteet analysoitiin Finnigan Delta plus XP Advantage IRMS:llä (Thermo Scientific, Saksa), joka oli yhdistetty Flash EA 1112 (Italia) alkuaineanalysaattoriin. Isotooppi standardina
