Homeiden ja niiden toksisten aineenvaihduntatuotteiden, mykotoksiinien, esiintyminen säilörehussa voi aiheuttaa eläimelle terveydellisiä haittoja ja tuottavuuden laskua (Auerbach 2003)

SÄILÖREHUJEN HOMEET JA NIIDEN AIHEUTTAMAT RISKIT Tuija Sarlin¹ ja Eeva Saarisalo²

1VTT, PL 1000, 02044 VTT, tuija.sarlin@vtt.fi, ²MTT, Kotieläintuotannon tutkimus 31600 Jokioinen

Johdanto

Säilörehun laadulla on useita yhteyksiä eläimen hyvinvointiin sekä maidon hygieeniseen ja jalostukselle tärkeään tekniseen laatuun. Terveys- ja laaturiskejä voivat aiheuttaa ainakin säilörehun hiivat, homeet, klostridit, aerobiset itiöitä muodostavat bakteerit (Bacillus), enterobakteerit (Salmonella, EHEC) ja listeria (Wilkinson 1999, Driehuis ja Oude Elferink 2000, Sivelä 2001).

Homeiden ja niiden toksisten aineenvaihduntatuotteiden, mykotoksiinien, esiintyminen säilörehussa voi aiheuttaa eläimelle terveydellisiä haittoja ja tuottavuuden laskua (Auerbach 2003). Myös riski mykotoksiinien joutumisesta elintarvikeketjuun kasvaa. Tutkimustietoa säilörehuissa esiintyvistä homeista ja mykotoksiineista sekä niiden vaikutuksista tuotantoeläimiin on suhteellisen vähän.

Yleinen käsitys on, että rehuissa esiintyy yleisimmin Fusarium-, Alternaria-, Cladosporium-, Penicillium- ja Aspergillus-suvun homeita (Auerbach 2003). Näihin sukuihin kuuluu useita potentiaalisia mykotoksiinien tuottajia, joita on myös tavattu säilörehuissa (Taulukko 1). Homeet vaativat kasvaakseen tietynlaiset olosuhteet. Erityisen tärkeitä kasvuun vaikuttavia tekijöitä ovat lämpötila, kaasuilmakehän koostumus (etenkin happipitoisuus), ravintotekijät, kosteus ja veden aktiivisuus sekä pH ja kasvualustan muu kemiallinen koostumus (Auerbach 2003). Lisäksi muiden mikro-organismien läsnäolo saattaa vaikuttaa homeiden kasvuun. Oikeaoppisesti valmistetussa säilö- rehussa homeiden kasvua rajoittavat etenkin hapettomuus ja orgaanisten happojen avulla aikaansaatu matala pH (Scudamore ja Livesey 1998).

Penicillium roqueforti –homeen on raportoitu olevan yleisin säilörehuissa esiintyvä toksinen home (Auerbach ym. 1998, Boysen ym. 2000). P. roquefortin tiedetään sietävän alhaisia pH-, lämpötila- ja happipitoisuusarvoja sekä korkeaa hiilidioksidipitoisuutta (Auerbach ym. 1998, Auerbach 2003), mikä edesauttaa lajin selviytymistä säilörehuissa ja näin ollen parantaa lajin kilpailuvalmiuksia. P.

roqueforti –ryhmä on äskettäin jaettu ribosomaalisen DNA:n sekvenssierojen perusteella käsittämään kolme lajia (Boysen ym. 2000). Ryhmään kuuluvat P. roquefortin lisäksi P. carneum ja P. paneum. P.

roqueforti –ryhmän homeiden on todettu tuottavan mm. seuraavia toksisia yhdisteitä: PR-toksiini, patuliini, roquefortiinit, penisilliinihappo, mykofenolihappo (Auerbach 2003, Taulukko 1).

Taulukko 1. Säilörehuissa ja rehukasveissa yleisimmin esiintyvät homeet ja niiden tärkeimmät toksiinit vaikutuksineen (Scudamore ja Livesey 1998, Auerbach 2003).

Homesuku/-laji Tärkeimmät toksiinit Toksiinien vaikutus

Alternaria alternariol, tenuazonihappo, altertoksiinit solumyrkky, verenvuoto, anoreksia Aspergillus aflatoksiinit, okratoksiini A, useita muita

toksisia yhdisteitä

syöpä, maksa-, munuais- ja DNA- vauriot

Byssochlamys patuliini syöpä?, verenvuoto, keuhkovauriot

Claviceps ergotalkaloidit kuolio, heikentynyt hedelmällisyys

Fusarium trikotekeenit zearalenoni

syömättömyys, ripuli, verenvuoto estrogeeniset vaikutukset

Monascus ruber sitriini, monakoliinit munuaisvauriot

Paecilomyces varioti patuliini syöpä?, verenvuoto, keuhkovauriot

Penicillium roqueforti roquefortiini C, PR-toksiini, patuliini, penicilliinihappo, mykofenolihappo

maksa- ja munuaisvauriot, hermostolliset vaikutukset,

Erityisesti roquefortiini C –toksiinia on löydetty säilörehuista (Auerbach ym. 1998). Tällä mykotoksiinilla on havaittu olevan neurotoksisia vaikutuksia. Myös eläimen vastustuskykyä heiken- tävää mykofenolihappoa on tavattu säilörehuista (Schneweis ym. 2000). Edellämainituista mykotoksii- neista myrkyllisimpiä ovat PR-toksiini ja patuliini, mutta näiden toksiinien esiintymisestä säilörehuissa on vain vähän viitteitä (Scudamore ja Livesey 1998).

Toisen merkittävän riskiryhmän rehuissa muodostavat toksiineja tuottavat Aspergillus-lajit (Auerbach 2003). Hyvin myrkyllisiä ja karsinogeenisia aflatoksiineja tuottavat tietyt A. flavus-, A. parasiticus- ja A. nomius-lajin kannat, joita säännöllisesti tavataan elintarvikkeista ja eläinten rehuista (Scudamore ja Livesey 1998, Jaimez ym. 2003). Maidon vierasainetutkimuksissa aflatoksiini M1:tä on löydetty vain yksittäisissä tapauksissa ja lähteeksi on osoitettu homeinen rehuvilja (EELA 2001, 2002). Afla- toksiinien esiintymisestä säilörehuissa on raportoitu vain harvoin. Säilörehun happamien olosuhteiden on todettu olevan epäsuotuisia A. flavus-lajin kasvulle ja näin ollen aflatoksiinien muodostumiselle (Scudamore ja Livesey 1998). Toisaalta on tapauksia, joissa aflatoksiina on löydetty säilörehuista huomattaviakin määriä (Scudamore ja Livesey 1998). Lisäksi on raportoitu, että ennen säilöntä- prosessia muodostunut aflatoksiini hajosi hitaasti maissista valmistetun säilörehun varastoinnin aikana (Scudamore ja Livesey 1998).

Fusarium-homeiden aiheuttamat ongelmat liittyvät useimmiten viljoista ja maissista valmistettuihin rehuihin. On kuitenkin havaittu, että myös heinäkasveissa esiintyy Fusarium-homeita ja niiden toksiineja (Scudamore ja Livesey 1998, Auerbach 2003). Esimerkiksi Uudessa Seelannissa todettiin zearalenonilla saastuneen heinän laiduntamisen aiheuttaneen lampailla hedelmällisyyden laskua (Towers ja Sprosen 1993). Fusarium-homeet eivät selviydy säilörehun hapettomissa olosuhteissa.

Lisäksi on raportoitu, että Fusarium-toksiineilla zearalenonia lukuunottamatta on taipumus hajota säilönnän aikana (Scudamore ja Livesey 1998, Auerbach 2003).

Perinteisesti mikrobien osoitukseen käytetään viljelymenetelmiä, joissa tutkittavaa näytettä tai siitä valmistettua laimennosta siirrostetaan kasvatusalustalle, jolta tietyn ajan kuluttua lasketaan kasva- neiden pesäkkeiden määrä. Kaikki mikrobit eivät kasva yhtä hyvin kaikilla alustoilla, mistä johtuen alustan valinnalla on suuri vaikutus tuloksiin. Viime aikoina ovat yleistyneet perintöaineksen eli DNAn analysointiin perustuvien molekyylibiologisten menetelmien käyttö mikrobien tunnistuksessa ja analysoinnissa. PCR (Polymerase Chain Reaction) on menetelmä, jossa suunniteltujen, spesifisten nukleotidialukkeiden avulla monistetaan näytteestä tiettyä, tutkittavalle mikrobille tyypillistä DNA- aluetta. Positiivinen monistustulos osoittaa, että näyte sisältää tutkittavaa mikrobia tai mikrobiryhmää.

Menetelmää on myös mahdollista soveltaa mikrobipitoisuuksien määrittämiseen näytteistä. PCR mahdollistaa herkän ja spesifisen osoituksen huomattavasti lyhyemmässä ajassa kuin viljely. Lisäksi on mahdollista saada tietoa mikrobeista, joita on vaikea saada kasvamaan synteettisillä alustoilla tai jotka hidaskasvuisuudestaan johtuen saattavat jäädä havaitsematta. Jos nukleotidialukkeet on suunniteltu sellaiselle DNA-alueelle, joka käsittää esimerkiksi mykotoksiinisynteesistä vastaavan geenin, saadaan PCR-menetelmällä tietoa, sisältääkö näyte tämän nimenomaisen mykotoksiinin tuottajaorganismia. Tietoa voidaan hyödyntää mykotoksiiniriskin arvioinnissa.

Vuosien 2003-2005 aikana tehdyssä tutkimuksessa ”Alkutuotannon ja maidonjalostuksen laaturiskit rehuntuotantoteknologian tehostuessa” seurattiin mm. toksigeenisten homeiden esiintymistä säilörehu- näytteissä. Tavoitteena oli tutkia säilönnän aikana etenkin P. roqueforti- ja aflatoksigeenisten Aspergillus –lajien esiintymistä nurmisäilörehunäytteissä. Perinteisten viljelymenetelmien lisäksi testattiin homeiden osoittamista uudella molekyylibiologisella PCR-menetelmällä.

Menetelmät Säilörehunäytteet

Nurmisäilörehut valmistettiin vuosina 2003 ja 2004 sekä 1. että 2. sadosta. Säilörehut valmistettiin joko laakasiiloihin tai pyöröpaaleiksi alla esitetyin menetelmin (tarkemmin tässä julkaisussa Jaakkola ym. 2006).

Laakasiilorehu = niitto karholle, lievä esikuivatus, säilöntäaine (AIV2 plus 5 l/t), korjuu tarkkuus- silppurilla, säilöntä laakasiiloon

Pyöröpaalirehu = täysleveä niitto, voimakas esikuivatus, karhotus, ei säilöntäainetta, korjuu pyöröpaaleihin, käärintä 6 muovikerrosta

Kustakin säilörehutyypistä otettiin kerralla kaksi näytettä noin kuukauden välein. Toinen näytteistä pyrittiin ottamaan silminnähden hyvänlaatuisesta rehusta ja toinen mahdollisimman homeisesta rehusta. Käytännössä hyvänlaatuinen näyte otettiin siilon / paalin sisäosista ja huonolaatuinen näyte siilon / paalin pinnasta. Näytteet toimitettiin VTT:lle kylmälaukkuihin pakattuina ja ne analysoitiin seuraavana päivänä näytteenoton jälkeen.

Homeanalyysit

Nurmirehunäytteitä punnittiin 10 g Stomacher-pussiin, johon lisättiin 90 ml 0,9 % NaCl –liuosta.

Näytteitä homogenoitiin Stomacher-laitteella 10 min. Näytehomogenaateista tehtiin laimennossarjat, joita pipetoitiin 0,2 ml seuraaville alustoille:

* Potato Dextrose Agar (PDA, Difco): yleisalusta homeille ja hiivoille

* Modifioitu mallasuuteagar + 0,5 % etikkahappoa (MEA+HAc): spesifinen alusta P. roqueforti –ryhmän homeille (Engel ja Teuber 1978)

* Sabouraud dextrose -agar + 0,3 % β-W7M 1.8-cyclodextrin (Sab+Cyd): UV-valon avulla mahdollista osoittaa aflatoksiineja tuottavat Aspergillus-lajit (Fente ym. 2001, Jaimez ym. 2003)

Homemaljoja kasvatettiin 5-7 vrk 25°C:ssa.

PCR-analyysi

PCR-menetelmän soveltuvuutta säilörehunäytteiden homepitoisuuden määrittämiseen tutkittiin eristämällä DNAta kolmesta erilaisen sienipitoisuuden omaavasta säilörehunäytteestä ja analysoimalla DNA-näytteet käyttäen homeiden ja hiivojen yhteisosoitukseen suunniteltuja PCR-alukkeita. DNA eristettiin käyttäen FastDNA Spin Kit for Soil –eristyskittiä (Q-BioGene). Tutkittujen näytteiden homepitoisuudet olivat suunnilleen 10² pmy/g (paali 26 sisus), 10³ pmy/g (siilo 2 sisus) ja 10⁸ pmy/g (siilo 2 pinta). Kaikista DNA-näytteistä analysoitiin laimentamaton, 1/2, 1/5 ja 1/10 laimennettu näyte.

Positiivikontrolleiksi otettiin Penicillium-lajista eristetyn DNA-näytteen kaksi eri laimennosta.

Negatiivikontrollina käytettiin steriiliä vettä. PCR-analyysi tehtiin käyttäen yleissienialukkeita nu- SSU-0817-5’ ja nu-SSU-1536-3’ sekä kirjallisuudessa esitettyjä PCR-olosuhteita (Borneman ja Hartin 2000). Käytettyjen yleissienialukkeiden on raportoitu soveltuvan useimpien tunnettujen home- ja hiivasukujen määrittämiseen (Borneman ja Hartin 2000). PCR-ajossa monistunut DNA-alue on mahdollista visualisoida ja karkeasti kvantitoida agaroosigeeliltä. Mitä kirkkaampi juova geelissä, sitä enemmän näyte sisältää tutkittavaa DNA:ta.

Tulokset

Nurmisäilörehunäytteiden homeet

Penicillium roqueforti-ryhmän homeiden todettiin olevan yleisin säilörehunäytteissä esiintyvä homeryhmä. Muut näytteissä esiintyvät homeet olivat pääasiassa muita Penicillium-suvun tai Mucor- suvun lajeja. Muutamista näytteistä havaittiin myös jonkin verran Aspergillus-, Cladosporium-, Fusarium- ja Trichoderma-suvun homeita. Lisäksi näytteistä löytyi hiivoja. Yhdestäkään näytteestä ei havaittu aflatoksigeenisiä Aspergillus-lajeja. Auerbach ym. (1998) totesivat mykotoksiiniriskin kasvavan, jos rehunäyte sisältää P. roqueforti-ryhmän homeita yli 10⁶ pesäkettä muodostavaa yksik- köä per gramma säilörehua (pmy/g). Tällaisen rehun syöttöä eläimille tulisi välttää. Tutkimuksen mukaan silminnähden homeettomat rehunäytteet sisälsivät P. roqueforti-hometta keskimäärin 10⁴ pmy/g, kun taas selvästi homeisissa näytteissä pitoisuus oli 10⁶-10⁸ pmy/g.

Vuoden 2003 sadosta 1 siiloon valmistetun säilörehun sisäosista otetut näytteet sisälsivät P. roqueforti –hometta alle 10³ pmy/g koko seurantajakson ajan (kuva 1). Sadosta 2 siiloon valmistettu säilörehu sisälsi hometta huomattavasti enemmän. Jo ensimmäisellä näytteenottokerralla 26.11.03 sadon 2 sisusnäyte sisälsi P. roqueforti –hometta 10⁴ pmy/g ja määrä oli jo noussut yli arvon 10⁶ pmy/g toisella näytteenottokerralla 14.12.03 (kuva 1). Tulos osoitti, että sadon 2 säilöntä siiloon oli jostain syystä epäonnistunut. Todennäköisesti rehumassan tiivistyminen oli puutteellista, jolloin olosuhteet rehussa eivät olleet hapettomat. Molempien siilojen pinnalla kasvoi runsaasti hometta (10⁶-10⁸ pmy/g, kuva 1).

Vuoden 2003 paalinäytteissä esiintyi vain vähän homeita koko seurannan ajan (kuva 2). Vuonna 2004 valmistetuissa säilörehuissa ainoastaan siilojen ja paalien pintanäytteissä esiintyi runsaasti (10⁶-10⁸ pmy/g) P. roqueforti –hometta. Kaikissa siilojen ja paalien sisäosista otetuissa näytteissä P. roqueforti –pitoisuudet olivat alle 10⁴ pmy/g.

Tulokset osoittivat, että hyvin valmistetussa säilörehussa homeiden muodostamat riskit säilönnän aikana ovat pienet. Siilon pintaosissa homekasvu voi olla runsasta, minkä seurauksena rehumassan pintaosiin on voinut muodostua mykotoksiineja. Tällaisen silminnähden homeisen pintarehun kuoriminen pois ennen rehun syöttöä eläimille on suositeltavaa. Tulokset osoittivat myös, että säilönnän epäonnistumisen seurauksena hometasot, etenkin P. roqueforti-homeen osalta, nousevat rehussa nopeasti ja mykotoksiinien muodostumisriski kasvaa. Myös syötön alkaessa tulisi varmistaa, että rehumassa pysyy tiiviinä, jotta mahdollisimman hyvin estetään hapen pääsy massan sisäosiin.

Muussa tapauksessa voimakas homekasvu ja mykotoksiinien muodostuminen saattaa käynnistyä syöttökauden aikana.

PCR-analyysin tulokset

Kuvassa 3 on esitetty säilörehunäytteiden PCR-testin tulokset agaroosigeelillä. Tulokset osoittivat, että PCR-tekniikan avulla on mahdollista määrittää säilörehunäytteiden sienipitoisuuksia. Heikko positiivinen tulos saatiin näytteestä, jonka homepitoisuus oli noin 10³ pmy/g (siilo 2 sisus). Vahva positiivinen tulos saatiin näytteestä, jonka homepitoisuus oli noin 10⁸ pmy/g (siilo 2 pinta). Näytteestä, jonka homepitoisuus oli noin 10² pmy/g (paali 26 sisus), ei monistunut havaittavaa määrää tutkittua DNA:ta. Koska näytteen laimentaminen lisäsi PCR-tuotteen monistumistehokkuutta (vahvempi juova geelillä analysoitaessa laimeampaa näytettä), voidaan näytteiden olettaa sisältävän yhdisteitä, jotka inhiboivat PCR-reaktiota. Tämä laskee jonkin verran menetelmän detektioherkkyyttä. Tulosten mukaan herkkyys kuitenkin riitti sienipitoisuuden 10⁶ pmy/g määrittämiseen, jolloin riski P. roqueforti –toksiinien esiintymiselle rehussa kirjallisuuden mukaan lisääntyy, kun oletetaan P. roquefortin olevan yleisin näytteessä esiintyvä home. Tässä tutkimuksessa käytettiin yleisesti homeiden ja hiivojen osoittamiseen suunniteltua PCR-alukeparia. Kirjallisuudessa on kuvattu alukepareja sekä P. roqueforti – että aflatoksigeenisten Aspergillus-lajien spesifiseen osoittamiseen PCR-tekniikan avulla (Haugland

roquefortin ja aflatoksigeenisten Aspergillus-lajien pitoisuus rehunäytteissä, mikä mahdollistaisi toksiiniriskin paremman ennustamisen.

1.0E+01 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06 1.0E+07 1.0E+08 1.0E+09

Sato 1 Sato 2 Sato 1 Sato 2 Sato 1 Sato 2 Sato 1 Sato 2 Siilonäytteet 2003

pmy/g

P. roqueforti, sisus Homeet, sisus P. roqueforti, pinta Homeet, pinta

26.11.2003 15.12.2003 7.1.2004 26.1.2004

Kuva 1. P. roqueforti – ja kokonaishomepitoisuus vuonna 2003 valmistetuissa siilonäytteissä. Näytteet on otettu sekä siilon pinnalta että sisäosista.

1.0E+01 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06 1.0E+07 1.0E+08 1.0E+09

Sato 1 Sato 2 Sato 1 Sato 2 Sato 1 Sato 2 Sato 1 Sato 2 Paalinäytteet 2003

pmy/g

P. roqueforti, sisus Homeet, sisus P. roqueforti, pinta Homeet, pinta

26.11.2003 15.12.2003 7.1.2004 26.1.2004

Kuva 2. P. roqueforti – ja kokonaishomepitoisuus vuonna 2003 valmistetuissa paalinäytteissä.

Näytteet on otettu sekä paalin pinnalta että sisäosista.

Kuva 3. PCR-testin tulokset säilörehunäytteistä.

Kuva 3. PCR-testin tulokset säilörehunäytteistä.

Yhteenveto

Penicillium roqueforti –ryhmän homeet oli selvästi yleisin nurmisäilörehunäytteissä esiintynyt homeryhmä. Näytteissä esiintyi myös muita Penicillium-suvun ja Mucor-suvun homeita, mutta vain harvoin muita homeita. Lisäksi näytteissä esiintyi hiivoja. Aflatoksiineja muodostavia Aspergillus- lajeja ei viljelyteknisin menetelmin havaittu yhdestäkään näytteestä. Pintanäytteet ja vuoden 2003 sadon 2 siilonäytteet sisälsivät P. roqueforti –hometta siinä määrin (>10⁶ pmy/g), että riski toksiinien, etenkin roquefortiini C:n esiintymiselle oli olemassa. Myös muiden P. roqueforti –homeen muodostamien mykotoksiinien esiintyminen kyseisissä näytteissä oli mahdollista. Tällaisten rehujenn syöttöä eläimille tulisi välttää. Oikeaoppisella säilöntäprosessilla estetään tehokkaasti homeriskien muodostuminen säilörehuissa, kun rehuihin käytetään korkealaatuista raaka-ainetta. PCR-tekniikan todettiin soveltuvan homeiden määrittämiseen säilörehunäytteistä. Menetelmän herkkyys riitti P.

roqueforti –riskitason havaitsemiseen.

Kirjallisuusviitteet

Auerbach, H., 2003. Mould growth and mycotoxin contamination of silages: sources, types and solutions - a review. Proceedings of Alltech´s Ninteens Annual Syposium, Lexington May 2003, Nottingham University Press, Eds. T.P. Lyons and K. A. Jacques.

Auerbach, H., Oldenburg, E. ja Weissbach, F. 1998. Incidence of Penicillium roqueforti and Roquefortine C in Silages. J. Sci. Food Agric. 76: 565-572.

Borneman J. ja Hartin, R.J. 2000. PCR primers that amplify fungal rRNA genes from environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 66(10): 4356-4360.

Boysen, M.E., Jacobsson, K.-G. ja Schnürer, J. 2000. Molecular identification of species from the Penicillium roqueforti group associated with spoiled animal feed. Appl. Environ. Microbiol.

66:1523-1526.

Driehuis, F., Oude Elferink, S.J.W.H. 2000. The impact of the quality of silage on animal health and food safety: a review. Vet Quart. 22: 212-217.

EELA 2001. Eläimistä saatavien elintarvikkeiden vierasainetutkimukset 2000, Elintarvikevirasto (EVI), Eläinlääkintä- ja elintarviketutkimuslaitos (EELA), Maa- ja metsätalousministeriö, Helsinki:

EVI, EELA, MMM/EO, 67 s.

EELA 2002. Eläimistä saatavien elintarvikkeiden vierasainetutkimukset 2001, Elintarvikevirasto (EVI), Eläinlääkintä- ja elintarviketutkimuslaitos (EELA), Maa- ja metsätalousministeriö, Helsinki:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ^1. Molekyylikokostandardi 2. Siilo 2 sisus, ~10³ pmy/g 3. Siilo 2 sisus, laim. 1/5 4. Siilo 2 sisus, laim. 1/10 5. Paali 26 sisus, ~10²pmy/g 6. Paali 26 sisus, laim. 1/5 7. Paali 26 sisus, laim. 1/10 8. Siilo 2 pinta, ~10 ⁸ pmy/g 9. Siilo 2 pinta, laim. 1/5 10. Siilo 2 pinta, laim. 1/10 11. Penicillium kontrolli 1 12. Penicillium kontrolli 2 13. H2O kontrolli

14. Molekyylikokostandardi

Engel, G. ja Teuber, M. 1978. Simple aid for the identification of Penicillium roqueforti Thom.

European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 6:107-111.

Fente, C.A., Ordaz Jaimez, J., Vázquez, B.I., Franco, C.M. ja Cepeda, A. 2001. New additive for culture media for rapid identification of aflatoxin-producing Aspergillus strains. Appl. Environ.

Microbiol. 67:4858-4862.

Haugland, R.A., Varma, M., Wymer, L.J. ja Vesper S.J. 2004. Quantitative PCR analysis of selected Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces species. System. Appl. Microbiol. 27: 198-210.

Jaakkola, S., Saarisalo, E., Heikkilä, T., Nysand, M., Suokannas, A., Taimisto, A-M., Mäki, M. 2006.

Maitoa siilo- vai paalirehulla?In: toim. Eeva Saarisalo, Mari Topi-Hulmi. Rehuntuotantotekno- logian kehitys - riski maidon laadulle? Alkutuotannon ja maidonjalostuksen laaturiskit rehuntuo- tantoteknologian kehittyessä eli Amare-hankkeen loppuseminaari, Jokioinen 26.4.2006. Suomen Nurmiyhdistyksen julkaisu nro 23, p. 26-35.

Jaimez, J., Fente, C.A., Franco, C.M., Cepeda, A. ja Vázquez, B.I. 2003. Application of a modified culture medium for the simultaneous counting of moulds and yeasts and detection of aflatoxigenic strains of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. J. Food. Prot. 66:311-318.

Shapira, R., Paster, N., Eyal, O., Menasherov, A.M. ja Salomon, R. 1996. Detection of aflatoxigenic molds in grains by PCR, Appl. Environ. Microbiol. 62(9): 3270-3273.

Schneweis, I., Meyer, K., Hörmansdorfer, S. ja Bauer, J. 2000. Mycophenolic acid in silage. Appl.

Environ. Microbiol. 66(8): 3639-3641.

Scudamore, K.A. ja Livesey, C.T. 1998. Occurrence and significance of mycotoxins in forage crops and silage: a review. J. Sci. Food Agric. 77:1-17.

Sivelä, S. 2001. The Relationship between Silage Quality and Food Quality. Nurmi 2001 Symposium 6.6.2001. Suomen Nurmiyhdistyksen julkaisu nro 15: 31 – 37.

Towers, N.R. ja Sprosen, J.M. 1993. Zearalenone-induced infertility in sheep and cattle in New Zealand. NZ Vet. J. 41: 223-224.

Wilkinson, J.M. 1999. Silage and Health. Proceedings of the XII International Silage Conference, Silage Production in Relation to Animal Performance, Animal Health, Meat and Milk Quality, July 5-7, 1999, Uppsala, s. 67-8.