Pikasytokeratiinivärjäyksen menetelmävalidointi ja laadunvarmistus jääleikkeille
Hanna-Kaisa Vinkanharju Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto
Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos /
Kliininen Patologia 01.06.2021
Itä-Suomen yliopisto, Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos
Lääketieteen koulutusohjelma
Vinkanharju, Hanna-Kaisa: Pikasytokeratiinivärjäyksen menetelmävalidointi ja laadunvarmistus jääleikkeille
Opinnäytetutkielma, 50 sivua, 3 liitettä (6 sivua)
Tutkielman ohjaajat: Dos. Tuomas Rauramaa, FT Sanna Suikkanen, FT Satu Remes Kesäkuu 2021
Asiasanat: rinnan kasvaimet, jääleikkeet, immunohistokemia, keratiinit
Rintasyöpä on naisten yleisin syöpä. Tapausmäärät ovat lisääntyneet viime vuosikymmenien ai- kana ja ennusteiden mukaan rintasyövät tulevat yleistymään entisestään. Rintasyövän ennustee- seen vaikuttaa moni eri tekijä, ja yksi merkittävä ennusteeseen ja hoitolinjoihin vaikuttava tekijä on mahdolliset kainalon imusolmukkeiden metastaasit. Vartijaimusolmuketutkimus on pikatutki- mus, jossa jääleikkeistä tarkastellaan, löytyykö imusolmukenäytteestä syöpäsoluja. Syöpäsolujen visualisoimiseksi jääleikenäyte värjätään pikasytokeratiinivärjäyksellä, jossa vasta-aine sitoutuu epiteliaalista alkuperää olevien syöpäsolujen keratiineihin ja näin syöpäsolut erottuvat imusol- mukekudoksesta.
Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tehdä menetelmävalidointia pikasytokeratiinivärjäykselle uudella primaarivasta-aineella sekä arvioida aikaisemman pikasytokeratiinivärjäysmenetelmän teknistä laatua ja toimivuutta. Tarkoituksena oli myös vertailla uuden menetelmän värjäystulok- sia aiemmin käytössä olleisiin menetelmiin ja valita käyttöön signaali-tausta -suhteeltaan paras menetelmä. Tutkimuksen tavoitteena oli olla osa pikasytokeratiinivärjäyksen menetelmävalidoin- tia jääleikenäytteille. Tutkimus tehtiin KYS-Kuvantamiskeskuksen kliinisen patologian osastolla.
Tutkimuksessa värjättiin yhteensä 19 näytelasia 11:llä eri tavalla. Näytteenä oli jääleikenäyte mu- nuaisesta, paksusuolesta tai imusolmukkeesta. Tutkimuksen muuttujia olivat näytteen fiksaatio- aika, fiksaatioliuos, endogeenisen entsyymiaktiivisuuden estäjä, kromogeenin määrä sekä tuma- värin värjäysaika. Paras värjäystulos saatiin fiksoimalla näyte asetonilla yhden minuutin ajan, es- tämällä endogeenista entsyymiaktiivisuutta 3-prosenttisella vetyperoksidin ja Dakon Antibody Diluent with Background Reducing Components (BRC) -liuoksen yhdistelmällä sekä käyttämällä 20 µl kromogeenia DAB-liuoksessa ja tumavärin vaikutusaikana 30 sekuntia.
Laadunvarmistuksessa mikroskopoitiin arkistosta kerättyjä potilasnäytteitä. Kahdeksan potilaan vartijaimusolmukenäytteiden jää- ja parafiinileikkeet mikroskopoitiin. Näytteitä oli yhteensä 50 kappaletta. Jääleikenäytteistä yhdeksän 25:stä oli värjäystulokseltaan ja tekniseltä laadultaan sel-
laisia, että arvioin tekeminen niistä oli helppoa. Lopuissa 15:ssä jääleikenäytteessä laatua hei- kensi mikroskopointia häiritsevä taustavärjäytyminen, näytteen repeytyminen tai näytteen poi- muttuminen useampana kerroksena objektilasilla.
University of Eastern Finland, Faculty of Health Sciences School of Medicine
Institute of Medicine
Vinkanharju, Hanna-Kaisa: Validation and quality assurance of cytokeratine staining method for frozen sections
Thesis, 50 pages, 3 appendix (6 pages)
Supervisors: Docent Tuomas Rauramaa, PhD Sanna Suikkanen, PhD Satu Remes June 2021
Keywords: Breast Neoplasms, Frozen Sections, Immunohistochemistry, Keratins
Breast cancer is the most common cancer in women. The number of breast cancer cases has in- creased in the last decades and is expected to continue to increase in the future. Many factors affect the prognosis of breast cancer. One important factor that affects prognoses and treat- ment methods is metastases of the axillary lymph nodes. Sentinel lymph node biopsy is an in- traoperative diagnostic method to analyse whether there are cancer cells or not in frozen sec- tions of the lymph node. Frozen sections are stained using immunohistochemistry to detect cy- tokeratines in cancer cells. Anti-cytokeratine antibodies bind to cells of epithelial nature and hence cancer cells are visualised from lymph node tissue.
The aim of this study was to validate cytokeratine staining method with a new primary antibody and assess the quality and functionality of the previously used cytokeratine staining method. The aim was also to compare the new protocol’s staining results to previously used protocols’ results and select the protocol with best signal-to-background ratio. The objective of this study was to be a part of cytoceratine staining method validation for frozen sections. The study was per- formed in KYS-Diagnostic Imaging Center’s department of clinical pathology.
In this study 19 specimens were stained with 11 different protocol settings. Tissues used were from kidney, colon or lymph node. Variables in the study were fixation time, fixation solution, en- dogenous enzyme activity blocking solution, amount of chromogen and staining time with coun- terstain. The best staining result was using a protocol in which fixation time was one minute in acetone, blocking solution was a solution of 3-percentual hydrogen peroxide and Dako’s Anti- body Diluent with Background Reducing Components (BRC), amount of chromogen was 20 µl in DAB solution and staining time with counterstain was 30 seconds.
In quality assurance specimens from archives were analysed. Eight patients’ frozen sections and paraffin embedded specimens from sentinel lymph nodes were analysed. There were 50 speci- mens. Nine specimens of the 25 frozen sections were easy to evaluate based on their staining results and technical quality. The remaining 15 frozen sections’ quality was reduced by back- ground staining, tissue tears, and tissue folding in to two layers on microscope slide.
Sisältö
1 Johdanto ... 7
2 Rintasyöpä ... 9
2.1 Esiintyvyys ... 9
2.2 Etiologia ja riskitekijät ... 9
2.3 Diagnostiikka ... 11
2.4 Hoito ja ennuste ... 12
3 Jääleiketekniikka ... 15
3.1 Käyttöindikaatio ... 15
3.2 Kudosnäytteen käsittely ja leikkaus ... 16
3.3 Laadullisia näkökulmia ... 17
3.4 Jääleiketekniikka rintasyöpäleikkauksessa ... 18
4 Pikasytokeratiinivärjäys ... 20
4.1 Immunohistokemiallisen menetelmän periaate ... 20
4.2 Keratiinit ... 23
4.3 Pikasytokeratiinivärjäys AE1/AE3 vasta-aineella ... 24
4.4 Värjäyksen laatuun vaikuttavia tekijöitä... 25
5 Tutkimuksen tarkoitus ja tavoite ... 28
6 Aineisto ja menetelmät ... 29
6.1 Materiaalit ... 29
6.2 Vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen estäminen ... 29
6.3 Endogeenisen entsyymiaktiivisuuden estäminen ... 30
6.4 Värjäyksen intensiteetin säätö ... 31
6.5 Värjättyjen näytteiden mikroskopointi ja laadunvarmistus arkistonäytteistä ... 31
7 Tulokset ... 33
7.1 Vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen estäminen ... 33
7.2 Endogeenisen entsyymiaktiivisuuden estäminen ... 33
7.3 Värjäyksen intensiteetti ... 35
7.4 Laadunvarmistus arkistonäytteistä ... 36
8 Pohdinta ... 38
1 Johdanto
Rintasyöpä on naisten yleisin syöpä. Tapausmäärät ovat lisääntyneet viime vuosikymmenien ai- kana ja ennusteiden mukaan rintasyövät tulevat yleistymään entisestään. Vuonna 2018 Suo- messa todettiin naisten rintasyöpätapauksia 4 934 kappaletta ja miesten rintasyöpiä 33 kappa- letta. Rintasyövässä ennuste on hyvä, viiden vuoden kuluttua diagnoosista 91 % potilaista on elossa ja kymmenen vuoden päästä 85 %. Ennusteeseen vaikuttaa moni eri tekijä ja eri rinta- syöpätyypit käyttäytyvät eri tavoin (Joensuu ja Huovinen 2013d, Pitkäniemi ym. 2020).
Yksi merkittävä ennusteeseen ja hoitolinjoihin vaikuttava tekijä on mahdolliset kainalon imusol- mukkeiden metastaasit. Rintasyövän primaarikasvaimen kirurgisen poiston yhteydessä tehdään vartijaimusolmuketutkimus, jossa vartijaimusolmuke paikannetaan ja poistetaan näytteeksi. Pa- tologi tutkii alustavasti, löytyykö näytteestä tehdyistä jääleikkeistä kasvainsolukkoa. Patologin ar- vio näytteestä saadaan noin puolessa tunnissa. Tulos vaikuttaa leikkauksen kulkuun. Jos kasvain- solukkoa ei löydy näytteestä, kainalon imusolmukkeita ei poisteta. Jos kasvainsolukkoa löytyy tai vartijaimusolmuketta ei löydetä, leikkaus etenee kainalon imusolmukkeiden poistoon eli kaina- loevakuaatioon (Leidenius ja Joensuu 2013a, Huovinen 2017, Leidenius ja Meretoja 2018b).
Syöpäsolujen visualisoimiseksi jääleikenäyte värjätään pikasytokeratiinivärjäyksellä, jossa pri- maarivasta-aine sitoutuu epiteliaalista alkuperää olevien syöpäsolujen keratiineihin. Sitoutumi- nen saadaan visualisoitua entsyymireaktiolla, joka tuottaa värillisen lopputuotteen vasta-aineen sitoutumisalueelle. Pikasytokeratiinivärjäyksessä imusolmukenäytteessä olevat syöpäsolut vär- jäytyvät ja patologi arvioi niiden lukumäärän (Mäkinen ja Stenbäck 2012, Leidenius ja Meretoja 2018b, Pernick 2021).
Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tehdä menetelmävalidointia pikasytokeratiinivärjäykselle uudella primaarivasta-aineella sekä arvioida aikaisemman pikasytokeratiinivärjäysmenetelmän teknistä laatua ja toimivuutta. Tarkoituksena on myös vertailla uuden menetelmän värjäystulok- sia aiemmin käytössä olleisiin menetelmiin ja valita käyttöön signaali-tausta -suhteeltaan paras menetelmä. Tutkimuksen tavoitteena on olla osa pikasytokeratiinivärjäyksen menetelmävali-
dointia jääleikenäytteille. Tutkimus tehdään KYS-Kuvantamiskeskuksen kliinisen patologian osas- tolla ja tutkimuksen ohjaajina toimivat dos. Tuomas Rauramaa, FT Sanna Suikkanen ja FT Satu Remes.
2 Rintasyöpä
2.1 Esiintyvyys
Rintasyöpä on naisten yleisin syöpä. Maailmanlaajuisesti vuonna 2018 diagnosoitiin yhteensä 2 088 849 uutta rintasyöpätapausta, joka edustaa 11,6 % kaikista uusista syöpätapauksista. Kysei- senä vuonna 626 679 potilasta maailmanlaajuisesti kuoli rintasyöpään, joka on 6,6 % kaikista syöpään liittyvistä kuolemista. Rintasyöpä on naisilla toiseksi yleisin syöpäkuolemien aiheuttaja keuhkosyövän jälkeen (Joensuu ja Huovinen 2013d, Riis 2020).
Suomessa vuonna 2018 naisten uusia rintasyöpätapauksia todettiin 4 934 kappaletta ja miesten 33 kappaletta. Samana vuonna naisten rintasyöpäkuolemia oli 873 kappaletta ja miesten 5 kap- paletta. Viime vuosikymmenten aikana naisten rintasyövät ovat yleistyneet Suomessa ja ennus- teiden mukaan ne yleistyvät tulevaisuudessakin (Joensuu ja Huovinen 2013d, Pitkäniemi ym.
2020).
2.2 Etiologia ja riskitekijät
Tarkkaa rintasyövän alkamismekanismia tai varmaa syytä sairastumiseen ei tiedetä. Tästä huoli- matta naisilla rintasyövän riskiä suurentavia ja riskiä pienentäviä tekijöitä on tunnistettu useita.
Riskitekijät voidaan jakaa hormonaalisiin tekijöihin ja muihin tekijöihin (Joensuu ja Huovinen 2013c, Huovinen 2017, Barzaman ym. 2020).
Hormonaalisilla tekijöillä on suuri merkitys rintasyövässä. Naiset, jotka eivät ole olleet raskaana tai naiset, jotka ovat saaneet ensimmäisen lapsensa 30 ikävuoden jälkeen ovat hieman suurem- massa riskissä sairastua. Puolestaan useat täysiaikaiset raskaudet ja/tai ensisynnytys nuorena pienentävät rintasyöpäriskiä. Varhaisella iällä alkaneet kuukautiset tai korkealla iällä alkaneet vaihdevuodet lisäävät riskiä. Tämä selittyy sillä, että kuukautiskiertojen kokonaismäärä lisääntyy ja sitä myötä lisääntyy myös eliniän aikainen altistus estrogeenille ja progesteronille, joka puoles- taan lisää rintasyöpäriskiä. Vaihdevuosien hormonikorvaushoito, toteutettuna progesteronin ja
estrogeenin yhdistelmähoitona, lisää rintasyöpäriskiä jo kahden vuoden käytön jälkeen. Hormo- nikorvaushoidon lopetuksen jälkeen rintasyöpäriski palautuu alkuperäiselle tasolle viiden vuo- den sisällä lopetuksesta (Huovinen 2017, Polo 2017, Feng ym. 2020).
Muita tekijöitä, jotka nostavat rintasyövän riskiä, ovat alkoholi, lihavuus ja ionisoiva säteily. Alko- holin käyttö lisää sairastumisriskiä ja on suoraan verrannollinen annosmäärään. Esimerkiksi päi- vittäin 2–3 annosta kuluttavien naisten riski on 20 % korkeampi verrattuna naisiin, jotka eivät käytä lainkaan alkoholia. Naisilla, jotka kuluttavat vain yhden alkoholiannoksen päivässä, riski on hieman lisääntynyt (Huovinen 2017, Feng ym. 2020).
Vaihdevuosien jälkeen munasarjat lopettavat estrogeenin tuotannon, jolloin naisella suurimman osan estrogeenista tuotetaan rasvakudoksessa. Tämän takia suuri rasvakudoksen määrä nostaa estrogeenisatasoja vaihdevuosien jälkeen, jolloin rintasyöpäriski nousee. Lisäksi ylipainolla on taipumus johtaa kohonneisiin insuliinitasoihin, jotka on liitetty tiettyihin syöpätyyppeihin, mu- kaan lukien rintasyöpään. Painon ja rintasyöpäriskin välinen yhteys on monimutkainen eikä sitä täysin vielä ymmärretä (Huovinen 2017, Feng ym. 2020).
Rintakehälle kohdistunut ionisoiva säteily, esimerkiksi sädehoito, lisää rintasyövän riskiä. Riski nousee erityisesti silloin, mikäli sädehoito on annettu naiselle hänen ollessa teini-ikäinen tai nuori aikuinen, jolloin rinnat vielä kehittyvät. Sädehoito 40 ikävuoden jälkeen ei näytä lisäävän sairastumisriskiä (Huovinen 2017, Feng ym. 2020).
Kaikista rintasyöpätapauksista 5–10 % liittyy perittyyn geenimutaatioon. Yleisimmät näistä ovat mutaatiot BRCA1- tai BRCA2 -geenissä. Mutaation löytyminen nostaa keskimäärin naisen toden- näköisyyden sairastua rintasyöpään 80 vuoden ikään mennessä 70 %:iin (Huovinen 2017, Feng ym. 2020).
Miehillä ei voida osoittaa yhtä selvää riskitekijää rintasyöpädiagnoosin yhteydessä. On kuitenkin todisteita, että etiologisena tekijänä vaikuttaa tietyn tyyppiset hormonitasojen epätasapainotilan- teet, joissa joko estrogeenia on liikaa tai androgeenia liian vähän. Estrogeenin ylimäärään liittyviä
tiloja, jotka voivat lisätä miehen rintasyöpäriskiä, ovat muun muassa krooninen maksasairaus, ylipaino ja farmakologinen estrogeenihoito. Rintasyöpään liitettyjä, alhaisia androgeenitasoja si- sältäviä, tiloja ovat muun muassa Klinefelterin syndrooma (XXY), kivestulehdus ja kivesten poisto.
Miehillä vahvin riskitekijä on BRCA2-geenimutaation löytyminen suvusta. BRCA2-geenimutaation löytyminen nostaa miehen elinaikaista riskiä sairastua rintasyöpään 7 %:iin, joka on 80–100 ker- tainen verrattuna muuhun populaatioon (Joensuu ym. 2013a, Massarweh ja Choi 2016).
2.3 Diagnostiikka
Kultaisena standardina rintasyöpädiagnostiikassa pidetään kolmoisdiagnostiikkaa, joka sisältää rintojen kliinisen tutkimuksen, kuvantamistutkimukset (mammografia ja kaikututkimus) sekä paksuneulanäytteen. Mikäli yksikin näistä tekijöistä herättää syöpäepäilyn, tulee rintamuutos poistaa aina (Leidenius ja Joensuu 2013b).
Kliinisessä tutkimuksessa tarkastellaan (inspektio) ja tunnustellaan (palpointi) rinnat ja kainalot.
Rintojen kliininen tutkimus tulee tehdä potilaan sekä maatessa että istuessa siten, että potilaan käsivarsi on ensin vartalon myötäisesti ja sitten kohotettuna pään taakse. Inspektiossa tarkastel- laan rintojen symmetrisyyttä, mahdollista kokoeroa, haavaumia, ihottumaa sekä ihon rakennetta mahdollisen appelsiininkuori-ihon varalta. Lisäksi tarkastellaan myös nännin mahdollista sisään- vetäytymistä tai nännieritettä. Rintaa palpoidessa tulee käyttää koko kämmentä ja edetä järjes- telmällisesti, kiinnittäen huomiota rintarauhasen kudosrakenteeseen ja mahdollisiin kyhmyihin.
Kainalon imusolmukkeita palpoidessa tulee potilaan olkavarsi tukea lievään abduktioon ja tun- nustella kainaloa rintakehää vasten (Leidenius ja Joensuu 2013b, Sane 2019).
Kuvantamistutkimuksista mammografia on perusmenetelmä, jonka sensitiivisyys vaihtelee 35–
95 % välillä. Sensitiivisyyden laajaan vaihteluun vaikuttaa kuvien laatu, rintarauhasen rakenne ja kuvien tulkitsijan kokemus. Sensitiivisyys on paras iäkkäillä naisilla, joiden rauhaskudos on kor- vautunut rasvakudoksella. Huonoin sensitiivisyys on nuorilla naisilla, joiden rintarauhaskudos on
tiivistä. Sensitiivisyyden laajan vaihtelun takia potilaalla voi olla rintasyöpä, vaikka mammografi- assa kasvainta ei voida todeta. Rintasyövässä tyypillinen mammografialöydös on tähtimäinen tuumori tai epätarkkarajainen, mutta pyöreä tiivistymä (Heikkilä 2012b, Leidenius ja Joensuu 2013c).
Mammografiaa täydentävä tutkimus oireisella potilaalla on kaikukuvaus. Sitä käytetään myös pe- rustutkimuksena alle 30-vuotiaille potilaille mammografian sijaan. Nuorilla naisilla kaikututki- muksen sensitiivisyys on samaa luokkaa mammografian kanssa. Kaikukuvauksen luotettavuus riippuu tutkimuksen tekijän ammattitaidosta ja laitteiston laadusta. Kaikututkimuksen etuna on hyvä saatavuus ja sen avulla voidaan todeta kainalon imusolmukemetastasointi ennen leik- kausta. Kuten mammografiassa, kaikututkimuksellakaan ei voida todeta kaikkia rintasyöpiä (Lei- denius ja Joensuu 2013c).
Epäilyn herättävistä kuvantamislöydöksistä tulee ottaa paksuneulanäyte kaikututkimus- tai mammografiaohjauksessa. Paksuneulanäytteen tulkitsee patologi, joka tekee näytteestä patolo- gisanatomisen diagnoosin näytteen histologian perusteella. Kudosnäytteestä voidaan määrittää hoitovastetta ennustavia tekijöitä, esimerkiksi HER2-onkogeenin monistuma ja kasvaimen hor- monireseptorit. Muutosalue tai kyhmy poistetaan histologista tutkimusta varten silloin, kun pak- suneulanäytteellä ei päästä diagnoosiin tai löydökset kliinisessä tutkimuksessa tai kuvantamis- tutkimuksissa viittaavat pahanlaatuiseen muutokseen (Leidenius ja Joensuu 2013d, Huovinen 2017, Meretoja ym. 2018).
2.4 Hoito ja ennuste
Rintasyövän hoito suunnitellaan moniammatillisessa hoitoryhmässä potilaskohtaisesti. Hoitolin- jat ovat yhtenäiset sukupuolien välillä. Ensisijaisena hoitona on kasvaimen kirurginen poisto, joka voidaan tehdä joko rintaa säästävällä menetelmällä tai poistamalla koko rinta eli suorittamalla mastektomia. Mikäli potilas toivoo rinnan säästävää leikkausta ja kasvain on suuri, voidaan kas- vainta yrittää pienentää aloittamalla solunsalpaajahoito ennen leikkausta. Tällaista hoitoa kutsu-
taan neoadjuvanttihoidoksi. Tavoitteena leikkauksessa on poistaa kasvain ja mahdolliset kaina- lon imusolmukemetastaasit sekä saada hyvä toiminnallinen ja kosmeettinen tulos. Leikkauksen yhteydessä selviää tärkeät ennustetekijät, jotka ovat kasvaimen koko ja metastaattisten imusol- mukkeiden määrä (Heikkilä 2012a, Joensuu ym. 2013c, McDonald 2016, Leidenius ja Meretoja 2018a).
Leikkauksen jälkeen annetaan sädehoitoa, jonka tarkoituksena on tuhota alueellisiin imusolmuk- keisiin ja leikkausalueelle mahdollisesti jääneet syöpäsolut. Sädehoito annetaan aina rintaa sääs- tävän leikkauksen jälkeen ja mastektomian jälkeen potilaille, joilla syövän paikallisen uusiutumi- sen vaara on suuri. Sädehoidon aloitus ajoittuu muutaman viikon päähän leikkauksen jälkeen, jolloin leikkausarpi on jo parantunut. Hoidon aikana vältetään keuhkon ja sydämen sädetystä ja hoito annetaan viistokenttien avulla (Joensuu ja Huovinen 2013b, McDonald 2016).
Useimmille potilaista annetaan leikkauksen jälkeen liitännäislääkehoito eli adjuvanttihoito, jonka tarkoituksena on tuhota subkliiniset metastaasit. Subkliinisillä metastaaseilla tarkoitetaan tilan- netta, jossa syöpä on levinnyt rinnan ja alueellisten imusolmukkeiden ulkopuolelle, mutta sitä ei ole voitu levinneisyystutkimuksilla osoittaa. Adjuvanttihoitona voidaan käyttää hormonaalisia hoitoja, sytostaatteja ja täsmälääkkeitä, kuten vasta-aineita. Adjuvanttihoidon valintaan vaikutta- vat potilaan yleiskunto ja ikä, kasvaimen uusiutumisvaara sekä kasvainsolukon HER-2-geenimo- nistuman esiintyminen ja hormonireseptoristatus. Mikäli potilaalle annetaan sekä solusalpaaja- hoitoa että hormonaalista hoitoa, potilaalle annetaan ensin solunsalpaajia. Solunsalpaajahoitoa ja hormonaalista hoitoa ei tule antaa yhtä aikaa, koska solunsalpaajahoidon teho saattaa heiketä hormonaalisen hoidon vaikutuksesta (Joensuu ja Huovinen 2013a).
Rintasyövissä on seuranta 5–10 vuoden ajan. Seurannan tarkoituksena on todeta mahdolliset paikalliset uusiutumat varhaisessa vaiheessa ja uuden rintasyövän toteaminen terveessä rin- nassa. Mammografia on tärkeä osa seurantoja ja on osoitettu, että mammografialla, 1–2 vuoden välein toteutettuna, on ennustetta parantava vaikutus. Puolestaan tiheillä vastaanotoilla ja muilla kuvantamistutkimuksilla ei ole samanlaista vaikutusta. Rintasyöpähoitajien ja lääkärien vastaan- otot ajoitetaan mammografioiden yhteyteen. Harvakseltaan tapahtuvan seurannan aikana on
tärkeää, että potilaalla on mahdollisuus saada yhteys terveydenhuollon ammattilaiseen helposti ja viivettä, kun hänellä on huolestuttavia oireita tai kysymyksiä. Säännöllisen seurannan päätty- essä on lisäksi tärkeää, että potilas tietää, miten, missä ja milloin hänen syöpätautiaan seurataan sekä kuinka hän voi elämäntavoillaan vaikuttaa syövän uusiutumisriskiin (Joensuu ym. 2013b, Mattson ym. 2016).
Ennuste rintasyövässä on hyvä. Viiden vuoden kuluttua diagnoosista 91 % on elossa ja kymme- nen vuoden kuluttua 85 %. Ennuste riippuu lukuisista eri tekijöistä ja rintasyövät käyttäytyvät hy- vin eri tavoin. Sukupuolten välillä ennuste on samanlainen. Viime vuosikymmenten aikana en- nuste on parantunut jatkuvasti ja merkittävimpänä tekijänä pidetään adjuvanttihoitojen tehostu- mista. Lisäksi syövän varhentuneella toteamisella on tärkeä osuus ennusteen paranemisessa (Heikkilä 2012a, Joensuu ym. 2013b, Mattson ym. 2016).
3 Jääleiketekniikka
Kudosnäytteen histopatologinen tutkiminen valomikroskoopilla vaatii ensin kudosnäytteen käsit- telyn patologian laboratoriossa. Prosessin vaiheita ovat kudoksen kiinnittäminen eli fiksointi, dis- sekointi, kudoskuljetus, valaminen, leikkaus mikrotomilla sekä värjäys ja päällystäminen. Proses- sin tarkoituksena on saada kudosrakenne pysymään suhteellisen muuttumattomana ja saada kudosnäyte käsiteltyä sellaiseksi, että siitä voidaan leikata 2-5 µm:n paksuisia leikkeitä mikroto- milla mikroskopoitavaksi. Kudosrakenteiden visualisoimiseksi näytteet värjätään histologisilla ja immunohistokemiallisilla värjäysmenetelmillä ennen mikroskopointia (Iles ja Docherty 2012, Mä- kinen 2012b).
Jääleikenäyte poikkeaa tavallisista formaliinifiksoiduista ja parafiiniin valetuista näytteistä siten, että tuore kudosnäyte jäädytetään ja valaminen tapahtuu näytteen upottamisella kaupalliseen tukiaineeseen. Näin kudosnäytteen käsittelyaikaa laboratoriossa saadaan lyhennettyä päivistä alle puoleen tuntiin (kuvio 1) (Iles ja Docherty 2012, Mäkinen 2012a, UBA Research 2020).
Kuvio 1. Jääleikenäytteen prosessi laboratoriossa (mukaillen Mäkinen 2012a ja Mäkinen 2012b).
3.1 Käyttöindikaatio
Jääleikediagnostiikkaa voidaan hyödyntää silloin, kun tarvitaan nopeasti karkea patologin arvio näytteestä. Kysymyksen asetteluna voi olla esimerkiksi se, mitä kudosta näyte on tai onko poiste- tun kasvaimen ympärillä riittävät tervekudosmarginaalit. Lisäksi voidaan arvioida kasvaimen neoplastista luonnetta eli onko kasvain benigni vai maligni (Iles ja Docherty 2012, Mäkinen 2012a).
Preoperatiivisten kartoitus- ja diagnosointimenetelmien kehittymisen myötä tarve jääleikediag- nostiikalle on vähentynyt. Nykyään jääleikediagnostiikkaa käytetään onkologisissa leikkauksissa,
joissa kasvaimen alustava diagnoosi ratkaisee operaation kulun. Jääleiketutkimuksia tehdään esi- merkiksi pään ja kaulan kasvainten leikkauksien yhteydessä sekä aivokasvain- ja munasarjaleik- kauksissa. Lisäksi jääleikediagnostiikkaa hyödynnetään vartijaimusolmukestatuksen määrittämi- sessä malignin melanooman ja rintasyövän yhteydessä. Jääleikkeistä annetaan alustava vastaus puhelimitse ja lopullinen kirjallinen lausunto myöhemmin (Mäkinen 2012a, Taxy ym. 2014).
3.2 Kudosnäytteen käsittely ja leikkaus
Kudosnäyte jäädytetään tukiaineessa -40 °C:een. Tukiaineen tarkoituksena on helpottaa näyt- teen leikkaamista. Kudosnäyte leikataan kryostaatilla mikroskopoitaviksi leikenäytteiksi.
Kryostaatti on mikrotomi, jonka lämpötila on -20 °C ja se on tarkoitettu kylmäkiinnitettyjen näyt- teiden leikkaamiseen. Kudosnäytteen nopealla jäädyttämisellä pysäytetään solun toiminnot ja vähennetään jääkiteiden aiheuttamaa vääristymää kudosrakenteisiin (Iles ja Docherty 2012, Taxy ym. 2014, Solunetti 2020).
Jääleikkeiden paksuus on yleensä 5–8 µm. Eri kudoksilla on erilaiset ominaisuudet leikkautua, jol- loin leikepaksuutta voidaan joutua muuttamaan, jotta leikkeiden leikkaus onnistuisi. Esimerkiksi näytteen sisältäessä runsaasti rasvakudosta joudutaan leikepaksuutta yleensä suurentamaan.
Jääleikkeet siirretään kryostaatilta suoraan näytelasille. Tutkimuksessa käytetään positiiviseksi varautuneita objektilaseja, jotta kudosnäyte kiinnittyisi paremmin objektilasille (Iles ja Docherty 2012, Taxy ym. 2014).
Leikkaamisen ja lasille siirtämisen jälkeen leikkeet kiinnitetään lasille ilmakuivaamalla. Ilma- kuivaaminen lisää näytteen adheesiota eli kiinnittymistä lasiin ja on hyödyllinen immunohistoke- miallisissa värjäyksissä. Liika kuivuminen vähentää sytoplasmisia ja tuman yksityiskohtia, joten ilmakuivaamista tulee tehdä harkitusti. Ennen näytelasin värjäystä, leikkeet fiksoidaan lyhyesti, yleensä alkoholi-formaliinia hyödyntäen. Kudosnäytteen jäädyttäminen ei tuhoa infektiivisiä pa- togeenejä, joten näytteen käsittelijä on infektiovaarassa, kunnes kudosnäyte on fiksoitu 95 % al- koholilla tai alkoholi-formaliinilla (Iles ja Docherty 2012, Taxy ym. 2014).
3.3 Laadullisia näkökulmia
Luotettavan diagnostiikan edellytyksenä on laadukkaat ja edustavat jääleikkeet. Jääleikkeiden laatuun vaikuttaa moni eri tekijä, jotka on huomioitava näytteitä käsitellessä. Leikkauksen aikana tehtäville jääleikkeille on asetettu aikaraja, jonka aikana näyte tulisi olla käsitelty ja mikrosko- poitu. Suurimmalla osalla leikkauksen aikaisista jääleikenäytteistä tämä aikaraja on alle 30 mi- nuuttia, joka luo haastetta laboratoriolle (Taxy ym. 2014, Liu ym. 2019).
Jääkiteiden muodostuminen aiheuttaa artefaktaa jääleikkeissä, koska ne tuhoavat histologisia yksityiskohtia kudoksessa, sytoplasmassa ja tumissa vaikeuttaen diagnostiikkaa. Suuren vesipi- toisuuden omaavia näytteitä, esimerkiksi ödeemiset leesiot tai limaiset tuumorinäytteet, voidaan kuivata kevyesti paperipyyhkeellä ennen jäädyttämistä. Jääkiteiden muodostumista voidaan vält- tää myös jäädyttämällä näyte nopeasti, käyttämällä alhaisempaa jäädytyslämpötilaa sekä käsitte- lemällä ohuempia kudospaloja. Lisäksi voidaan käyttää erityisiä suoja-aineita, jotka suojaavat näytettä jäädyttämisen aiheuttamilta vaurioilta ja vähentävät jääkiteiden muodostumista näyt- teeseen (Taxy ym. 2014, Zhou 2017).
Jääleikkeiden laatuun vaikuttaa niiden leikkaamisen onnistuminen. Runsaasti rasvakudosta sisäl- tävät näytteet ovat haastavia leikata, jolloin leikepaksuutta joudutaan lisäämään. Leikkauslämpö- tilalla on merkitystä. Esimerkiksi ideaalilämpötila rasvakudoksen leikkaamiselle on -30– -25 °C, kun puolestaan aivokudokselle optimaalisin lämpötila on -15– -10 °C. Näytteitä käsitellessä tulee näytteet ja näytelasit merkata tarkasti, ettei tunnistusvirheitä tapahdu. Lisäksi on hyvä, että vain yhden potilaan näytteitä käsitellään kerrallaan yhdessä kryostaatissa. Näin saadaan pienennet- tyä inhimillisen virheen vaaraa näytteiden sekoittumisesta (Taxy ym. 2014).
Jääleikenäyteblokit käsitellään jääleikediagnoosin jälkeen parafiiniblokiksi, jolloin voidaan vielä tarkastella parafiinileikkeiden ja jääleikkeiden välisiä eroavaisuuksia. Tämä vertaaminen on tär- keä osa jääleikkeiden laadunvarmistusta. Jääleike ei ole histologisesti laadultaan yhtä hyvä kuin parafiinileike, jonka vuoksi jääleikediagnoosi ei ole yhtä luotettava verrattuna parafiinileikediag- noosiin. Diagnoosin luotettavuuteen vaikuttaa myös se, että jääleike otetaan vain yhdestä kohtaa
lähetettyä kudosmateriaalia. Tämän takia lopulliset diagnoosit annetaan aina parafiinileikkeestä (Ristimäki ym. 2013, Taxy ym. 2014).
3.4 Jääleiketekniikka rintasyöpäleikkauksessa
Jääleiketekniikkaa käytetään rintasyöpäleikkauksien yhteydessä vartijaimusolmuketutkimuk- sessa. Tutkimuksessa patologi tutkii alustavasti, löytyykö vartijaimusolmukenäytteestä kasvain- solukkoa (kuva 1). Jos imusolmukenäytteestä löytyy kasvainsolukkoa tai vartijaimusolmuketta ei löydetä, leikkaus etenee kainalon imusolmukkeiden poistoon eli kainaloevakuaatioon. Positiivi- sen löydöksen suuruus vaikuttaa kainaloevakuaatiopäätökseen. Kainaloa ei tyhjennetä, jos ky- seessä on mikrometastaasi, näytteessä on vain yksittäisiä kasvainsoluja, tai tulos on negatiivinen (Leidenius ja Joensuu 2013a, Huovinen 2017, Leidenius ja Meretoja 2018b).
Kuva 1. Syöpäsoluja vartijaimusolmukenäytteessä kolmella eri objektiivilla mikroskoopissa (Ku- vat: Tuomas Rauramaa, UEF)
4 Pikasytokeratiinivärjäys
4.1 Immunohistokemiallisen menetelmän periaate
Immunohistokemia on värjäysmenetelmä, joka perustuu vasta-aineen spesifiseen sitoutumiseen antigeeniinsa. Antigeeni on vasta-aineen kohderakenne, joka on molekyylin osa tai molekyyli- kompleksi. Spesifinen sitoutuminen tapahtuu tarkan kolmiulotteisen rakenteen perusteella, jossa antigeeni ja vasta-aine kiinnittyvät toisiinsa sitoutumisalueelle muodostuvien vetysidosten, van deer Waalsin voimien ja sähköisten varausten avulla. Antigeenin ja vasta-aineen kolmiulot- teisten rakenteiden yhteensopivuutta voidaan kuvata avain-lukko-periaatteella, jossa vasta-aine (avain) voi sitoutua vain tiettyyn antigeeniin (lukko). Immunohistokemiassa vasta-aine on lei- mattu entsyymillä, joka reagoi näytteeseen lisätyn kromogeenin kanssa tuottaen värillisen liuke- nemattoman lopputuotteen vasta-aineen sitoutumisalueelle. Immunohistokemiaa käytetään kasvaindiagnostiikassa ja sen avulla voidaan arvioida kasvainten alkuperää ja rajata metas- taasien mahdollisia lähtöpaikkoja (Iles ja Docherty 2012, Jackson ja Blythe 2013, Kalyuzhny 2016).
Vasta-aineet ovat B-lymfosyyttien tuottamia ja ne toimivat osana elimistön hankittua immuuni- puolustusta. Vasta-aineiden perusrakenne on Y-kirjaimen muotoinen ja ne koostuvat proteii- nirungosta sekä siihen liittyneestä pienestä hiilihydraattiosasta. Proteiinirungossa on kaksi ident- tistä raskas- eli H-polypeptidiketjua (H, heavy) ja kaksi identtistä kevyt- eli L-polypeptidiketjua (L, light) (kuva 2). L-ketju kiinnittyy H-ketjuun ei-kovalenttisilla sidoksilla ja yhdellä rikkisillalla muo- dostaen HL-ketjuparin. Yhdessä vasta-ainemolekyylissä on kaksi sitoutumiskohtaa. Sitoutumis- kohdissa H- ja L-ketjut koostuvat varioivasta osasta, joiden aminohapposekvenssissä on paljon vaihtelua. Suuri vaihtelu aminohapposekvenssissä muodostaa suuren määrän erilaisia vasta-ai- neita, joiden sitoutumiskohdat ovat rakenteeltaan erilaisia. Muu osa vasta-aineen rakenteesta on varsin vakio. Vasta-aineen spesifistä sitoutumiskohtaa antigeenissä kutsutaan epitoopiksi (Joki- ranta ja Seppälä 2011, Mäkinen ja Stenbäck 2012).
Kuva 2. Vasta-aineen rakenne (mukaillen Jackson ja Blythe 2013).
Vasta-aineet voidaan jakaa mono- tai polyklonaalisiin vasta-aineisiin. Monoklonaaliset vasta-ai- neet tuotetaan kuolemattoman eli immortalisoidun hybridisoluviljelmän avulla. Tuotetut mo- noklonaaliset vasta-aineet sitovat vain yhtä tiettyä epitooppia antigeenissa. Polyklonaalisten vasta-aineiden tuotanto tapahtuu immunisoimalla kohde-eläin hyvin puhdistetulla antigeenilla, joka on liitetty kantajamolekyyliin. Tuotetut vasta-aineet kerätään eläimen seerumista ja puhdis- tetaan affiniteettikromatografian avulla. Polyklonaaliset vasta-aineet tunnistavat eri epitooppeja, mutta ne sitoutuvat samaan antigeeniin (Iles ja Docherty 2012, Jackson ja Blythe 2013, Mäkinen ja Stenbäck 2012).
Vasta-aineen sitoutuminen antigeeniin täytyy saada näkyviin valomikroskoopissa. Immunohisto- kemiassa vasta-aineeseen liitetään entsyymileima, jonka katalysoimassa reaktiossa syntyy nä- kyvä värillinen liukenematon lopputuote. Värillinen lopputuote muodostuu vasta-aineen sitoutu- misalueelle. Entsyymi voidaan liittää suoraan antigeenia sitovaan vasta-aineeseen eli primaari- vasta-aineeseen, jolloin kyseessä on suora menetelmä. Epäsuorassa menetelmässä entsyymi lii- tetään sekundaariseen vasta-aineeseen, joka sitoutuu primaarivasta-aineeseen (kuva 3). Nyky- ään suositaan epäsuoria menetelmiä niiden paremman herkkyyden takia (Iles ja Docherty 2012, Mäkinen ja Stenbäck 2012, Kalyuzhny 2016).
Kuva 3. Epäsuora menetelmä (mukaillen Mäkinen ja Stenbäck 2012).
Histopatologiassa eniten käytetty entsyymileima on piparjuuriperoksidaasi (eng. horseradish pe- roxidase, HRP). Piparjuuriperoksidaasin etuja ovat pieni koko, joka mahdollistaa tunkeutumisen solun sisälle, ja hyvä kyky muuttaa kromogeeninen substraatti nopeasti värilliseksi tuotteeksi.
HRP on helppo konjugoida vasta-aineeseen ja muihin molekyyleihin kiinni. HRP katalysoi vety- peroksidin (H2O2) läsnäollessa reaktiota, joka hapettaa kromogeenin, diaminobentsidiinin (DAB), tummanruskeaksi lopputuotteeksi. Reaktiossa DAB muodostaa polymeerin, joka ei liukene vesi- tai alkoholipesuissa (kuva 4) (Seligman ym. 1968, Iles ja Docherty 2012, Kalyuzhny 2016, Ribatti 2017).
Kuva 4. DABin oksidatiivinen polymerisaatio värilliseksi lopputuotteeksi (mukaillen Seligman ym.
1968).
Immunohistokemia vaatii vasta-aineiden ja entsyymireaktion lisäksi muitakin reagensseja. Tarvit- tavia lisäreagensseja ovat muun muassa puskuriliuokset, joiden tehtävänä on estää näytteen pH:n muuttumista emäksiseen tai happamaan suuntaan. Näytteen pH:n pysyminen neutraalina on tärkeää, jotta vasta-aineen sitoutuminen antigeeniin olisi optimaalista. Puskuriliuoksiin lisä- tään detergenttiä, jotta reagenssit leviävät tasaisemmin. Sitoutumattoman vasta-aineen ja yli- määräisen kromogeenin huuhteluihin käytetään pesupuskuria (Kalyuzhny 2016).
Immunohistokemiallisen värjäyksen jälkeen näyte värjätään tumavärillä, jonka tarkoituksena on saada näytteen histologinen rakenne esiin. Tällöin voidaan tarkastella immunohistokemiallisen positiivisen signaalin sijaintia solussa. Tumavärin valintaan vaikuttaa immunohistokemiallisen värjäyksen positiivisen signaalin väri. Esimerkiksi DABin ruskean värisignaalin kanssa tumavärinä toimii hyvin hematoksyliini, joka värjää solujen tumat sinisiksi (Kalyuzhny 2016, Kim ym. 2016).
4.2 Keratiinit
Keratiinit, joita aiemmin on kutsuttu sytokeratiineiksi, ovat epiteelisolujen välikokoisia filament- teja, jotka ovat rakenteeltaan proteiineja. Niiden tehtävä on antaa mekaanista tukea soluille sekä ylläpitää solun muotoa. Tutkimusten perusteella keratiineilla näyttäisi olevan myös muita tehtä- viä, esimerkiksi solujen välisessä viestinnässä, solujen jakaantumisessa sekä maligneissa muu- toksissa (Schweizer ym. 2006, Moll ym. 2008).
Keratiinit jaetaan kahteen luokkaan; tyypin I keratiinit ovat pienempiä ja happamia, ja tyypin II keratiinit ovat isompia ja pH:ltaan neutraaleja tai emäksisiä. Tyypin I keratiineja ovat K9-K10, K12- K28 ja K31-K40. Tyypin II keratiineja ovat K1-K8 ja K71-K86. Tyypin I 28:sta keratiinista 17 ovat epiteliaalisia keratiineja ja 11 hiuskeratiineja. Tyypin II 26:sta keratiinista 20 on epiteliaalisia ja kuusi hiuskeratiineja (Moll ym. 2008, Jacob ym. 2018).
Keratiineja aletaan ilmentää aikaisin sikiönkehityksen aikana ja tietyssä vaiheessa kehitystä kera- tiinien ilmenemismuoto muuttuu sikiönaikaisesta ilmentämisestä täysiaikaiselle tyypilliseksi paikkaspesifiseksi ilmentämiseksi. Keratiinien ilmentämistä säädellään kudosspesifisesti ja solun
erilaistumisesta riippuen. Esimerkiksi kerrostunut levyepiteeli ilmentää keratiineja K5 ja K14, kun yksinkertainen epiteelisolukko ilmentää keratiineja K8 ja K18. Kerrostuneessa epiteelissä solujen keratiinikoostumus muuttuu solun kypsymisen myötä. Aluksi tyvikerroksessa ilmennetään kera- tiineja K5 ja K14. Kun tyvisolu erilaistuu ja kypsyy, keratiinien K5 ja K14 ilmeneminen vähenee as- teittain ja uusi keratiinipari ottaa vallan keratiinikoostumuksessa kudostyypistä riippuen (Dmello ym. 2019).
Kasvaimissa ja metastaaseissa solut säilyttävät sen keratiiniproteiinikoostumuksen, joka esiintyy niiden lähtökudoksessa. Tätä ominaisuutta hyödynnetään diagnostiikassa. Esimerkiksi suurentu- neen imusolmukkeen huonosti erilaistuneet solut voidaan tunnistaa karsinoomaksi keratiineja tunnistavien vasta-aineiden avulla immunohistokemiallisella värjäyksellä. Karsinooman erittely immunohistokemiallisesti erilleen lymfoomasta, sarkoomasta, melanoomasta ja itusolutuumo- rista on mahdollista, sillä näistä kasvaintyypeistä vain karsinoomat ilmentävät keratiineja. Tar- kempaa tietoa epiteelien välisistä eroista keratiinikoostumuksissa voidaan hyödyntää, kun halu- taan rajata etäpesäkkeen mahdollisia vaihtoehtoja primaarikasvaimen sijainnista. Esimerkiksi adenokarsinoomista kaikki syöpäsolut ilmentävät keratiineja K8, K18 ja K19, mutta vaihtelua il- menee keratiinien K7 ja K20 määrissä ja niiden välisessä vallitsevuudessa. Paksusuolen adeno- karsinoomassa solut ilmentävät lähes aina keratiinia K20, mutta eivät keratiinia K7 tai selvästi matalampaa K7-tasoa verrattuna keratiiniin K20. Munasarjan, endometriumin ja keuhkon adeno- karsinoomissa keratiiniprofiilissa K7 on vallitseva ja keratiinia K20 ei ilmennetä lainkaan (Moll ym. 2008, Soini 2013, Dmello ym. 2019).
4.3 Pikasytokeratiinivärjäys AE1/AE3 vasta-aineella
AE1/AE3 on sekoitus kahta eri monoklonaalista vasta-ainetta, jotka tunnistavat suurimman osan ihmisen keratiineista. Näistä AE1 tunnistaa keratiineja 10, 13, 14, 15, 16 ja 19. AE3 tunnistaa kera- tiineja 1–8. AE1/AE3 vasta-aineseoksen avulla voidaan tunnistaa yksinkertaisen ja kerrostuneen epiteelin solut näytteestä. Tätä ominaisuutta käytetään muun muassa värjäämään metastaatti- sen karsinooman soluja imusolmukkeissa, varmistamaan onko näytteessä epiteliaalisia soluja ja määrittämään kasvaimen invaasiosyvyys näytteessä (Dako 2021, Pernick 2021).
4.4 Värjäyksen laatuun vaikuttavia tekijöitä
Immunohistokemiallisen menetelmän värjäystulos on laadultaan hyvä, kun saadaan selkeä posi- tiivinen värisignaali ja vähän tai ei lainkaan epäspesifistä taustavärjäytymistä. Epäspesifistä taus- tavärjäytymistä tulee välttää, koska se vaikeuttaa mikroskopointia ja heikentää positiivisen sig- naalin erottumista ympäröivästä kudoksesta. Värjäystuloksen laatuun vaikuttaa moni eri tekijä (Kalyuzhny 2016, Zhou 2017).
Spesifisen värjäystuloksen saamiseksi on tärkeää, että primaarivasta-aine sitoutuu oikeaan anti- geeniin. Primaarivasta-aineen oikea valinta, riittävä konsentraatio, optimaalinen inkubaatioaika sekä inkubaatiolämpötila vaikuttavat värjäyksen lopputulokseen. Vasta-aineen konsentraatio vai- kuttaa saatavan värjäystuloksen intensiteettiin, mutta liian suuri konsentraatio aiheuttaa epä- spesifistä taustavärjäytymistä. Sopivan konsentraation valintaan vaikuttaa myös se, onko vasta- aine mono- vai polyklonaalinen. Pääsääntöisesti polyklonaalista vasta-ainetta käytettäessä tarvit- tava konsentraatio on pienempi verrattuna monoklonaalista vasta-ainetta käytettäessä (Ka- lyuzhny 2016, Kim ym. 2016).
Inkubaatiolämpötilan ollessa +37 °C, vasta-aineen ja antigeenin välinen reaktio saavuttaa kemial- lisen tasapainon nopeammin verrattuna huonelämpötilassa tapahtuvaan reaktioon. Tämän takia lämpölevyn käyttö primaarivasta-aineen inkubaation aikana on perusteltua. Optimaalinen inku- baatioaika on tarpeeksi pitkä, jotta vasta-aine ehtii sitoutua antigeeniin, mutta tarpeeksi lyhyt ettei värjäysprosessiin kuluva aika ole käyttötarkoitukseen nähden liian pitkä (Sarrazy ja Des- moulière 2010, Kalyuzhny 2016, Zhou 2017).
Näytteen ominaisuudet vaikuttavat saatavaan värjäystulokseen. Värjäystuloksen intensiteetti voi vaihdella saman näytteen eri osissa kohdeantigeenin määrästä riippuen. Kohdeantigeenin määrä voi vaihdella, koska soluissa tuotetaan eri määriä proteiineja metabolisen aktiivisuuden mukaan. Leikepaksuus näytteessä vaikuttaa suoraan värjäystulokseen siten, että paksumpi leike antaa vahvemman intensiteetin verrattuna ohuempaan leikkeeseen. Toisaalta paksumpi leike voi vaatia pidemmän inkubaatioajan primaarivasta-aineen kanssa verrattuna ohuempaan leik-
keeseen. Värjäystuloksen kannalta sopiva leikepaksuus on 4–5 µm. Mikrotomin säännöllinen ka- librointi ja leikkaajan hyvät tekniset taidot takaavat, että leikepaksuus pysyy vakiona. Epäspesi- fistä taustavärjäytymistä esiintyy herkemmin näytteen reuna-alueilla, nekroottisilla alueilla tai kohdissa, joissa näyte on poimuttuneena lasilla. Näytteen asettelu mahdollisimman suorana ja sileänä näytelasille sekä näytteen kuivumisen estäminen värjäysprosessin aikana mahdollistavat hyvän värjäystuloksen ja vähentävät taustavärjäytymistä (Jacobsen ym. 2013, Kalyuzhny 2016, Zhou 2017).
Näytteen sisäsyntyinen eli endogeeninen entsyymiaktiivisuus aiheuttaa taustavärjäytymistä. Esi- merkiksi endogeeninen peroksidaasi hapettaa DABin, jolloin saadaan väärä positiivinen värisig- naali tai epäspesifistä taustavärjäytymistä riippumatta primaarivasta-aineen sitoutumisesta. En- dogeenista peroksidaasiaktivisuutta on muun muassa punasoluissa, granulosyyteissä, eosinofii- leissä, monosyyteissä, maksan hepatosyyteissä, lihaskudoksessa sekä munaiskudoksessa. Jää- leikkeissä fiksaatio ja kudosprosessointi eivät ole heikentämässä endogeenistä peroksidaasiaktii- visuutta. Endogeenistä peroksidaasiaktiivisuutta voidaan estää lisäämällä näytteeseen 0,3 pro- senttista vetyperoksidin ja tislatun veden tai puskuriliuoksen seosta, käsittelemällä näyte meta- nolin ja vetyperoksidin seoksella tai natriumatsidin ja vetyperoksidin seoksella. Mikäli vetyperok- sidi hajottaa värjäyksen kohteena olevan antigeenin, se tulee lisätä primaarivasta-aineen jälkeen (Sarrazy ja Desmoulière 2010, Zhou 2017).
Positiivisen signaalin tulee olla tarpeeksi vahva, jotta se on helposti havaittavissa valomikro- skoopissa. Värjäystuloksen vahvistamisessa voidaan sekundaarivasta-aineeseen liittää poly- meeri, jossa on suuri määrä entsyymimolekyylejä kiinni. Suuren entsyymitiheyden avulla substraattia muutetaan suurempi määrä tiiviiksi kasaumaksi värillistä lopputuotetta, joka näh- dään voimakkaampana värin intensiteettinä valomikroskoopissa. Polymeerikompleksi voi lisätä detektiomenetelmän sensitiivisyyttä. Kromogeenin antamaa värireaktiota voidaan vahvistaa käyttämällä yhdistettä, joka jatkaa DABin hapettumisreaktiota. DABia vahvistavana yhdisteenä käytetään yleensä raskasmetalleja, joista yleisimmin käytetty on kuparisulfaatti (Sarrazy ja Des- moulière 2010, Mäkinen ja Stenbäck 2012, Kalyuzhny 2016).
Värjäyksen laatua, primaarivasta-aineen spesifisyyttä ja käytettävien reagenssien käyttökelpoi- suutta voidaan tarkastella positiivisten kontrollinäytteiden avulla. Positiivisena kontrollinäytteenä voidaan käyttää kudosnäytettä, jossa tiedetään esiintyvän tutkittavaa antigeeniä. Jos positiivi- sessa kontrollinäytteessä saadaan vahva positiivinen signaali aikaiseksi, voidaan todeta menetel- män ja reagenssien toimivan. Mikäli positiivinen kontrollinäyte ei värjäydy positiiviseksi, kyseessä on väärä negatiivinen tulos, jonka syy pitää selvittää. Väärä negatiivinen tulos voi johtua esimer- kiksi siitä, että primaarivasta-aine ei pääse sitoutumaan antigeeniin tai menetelmän herkkyys on liian heikko, jolloin alhaisia antigeenimääriä ei saada visualisoitua mikroskopoitavalle tasolle (Sarrazy ja Desmoulière 2010, Kalyuzhny 2016, Zhou 2017).
5 Tutkimuksen tarkoitus ja tavoite
Tutkimuksen tavoitteena on olla osa pikasytokeratiinivärjäyksen menetelmävalidointia jääleike- näytteille. Saatujen tietojen perusteella KYS-kuvantamiskeskuksen kliinisen patologian osasto pystyy jatkamaan menetelmän kehitystyötä, jotta laboratorio saa menetelmäohjeesta toimivan ja luotettavan päivittäiseen käyttöön diagnostiikassa.
Tutkimuksen tarkoituksena on
1. arvioida aikaisemman pikasytokeratiinimenetelmän teknistä laatua ja toimivuutta 2. tehdä menetelmävalidointia uudella primaarivasta-aineella.
3. vertailla uuden menetelmän värjäystuloksia aiemmin käytössä olleisiin menetelmiin ja valita käyttöön signaali-tausta -suhteeltaan paras menetelmä.
6 Aineisto ja menetelmät
6.1 Materiaalit
Laboratorio-osuus aloitettiin laittamalla kaikki tarvittavat liuokset ja välineet paikoilleen. Pesu- puskurina käytettiin Dakon Wash buffer -liuosta (Agilent, Tanska), näytteen fiksoinnissa käytettiin asetonia (C3H6O) ja kokeiltiin myös metanolia (CH3OH), vasta-aineena Novodiaxin Pan-CK
AE1/AE3 (Novodiax, Inc, California, USA), endogeenisen peroksidaasin estäjänä Peroxidase- Blocking Solution Dako REAL -liuosta (Agilent, Tanska) sekä kokeiltiin vetyperoksidia (H2O2), epä- spesifisen sitoutumisen estäjänä Dakon Antibody Diluent with Background Reducing Com-
ponents (S3022) (Agilent, Tanska) ja nousevaan alkoholisarjaan käytettiin 50-prosenttista, 96-pro- senttista sekä 100-prosenttista etanolia (C2H5OH). Tumien värjäykseen käytettiin Mayerin hema- toksyliiniä ja kudoksen kirkastamiseen Sakura Tissue-Tek Tissue clearia. DAB-liuos valmistettiin siten, että DAB chromogen Dako -liuosta (Agilent, Tanska) pipetoitiin 10µl Eppendorf-putkeen ja siihen lisättiin 500 µl DAB Buffer Dako -liuosta (Agilent, Tanska). Näytteiden petausaineena käy- tettiin J.T. Baker Ultra Kitt -valmistetta (Avantor, Gliwice, Puola). Lisäksi värjäyksiin käytettiin puh- dasta aquaa, sekuntikelloja, lämpölevyä sekä peitinlaseja.
Värjäyksiä tehtiin yhteensä 19 näytelasille (liite 2), joissa näytteenä oli jääleikenäyte munuaisesta, paksusuolesta tai imusolmukkeesta. Imusolmukenäytteet olivat rintasyöpäleikkauksen yhtey- dessä otettuja potilasnäytteitä, joissa oli näkyvissä vain näytenumerot. Munuais- ja paksusuoli- näytteet toimivat kontrollimateriaalina. Leikkeiden paksuus oli 5µm. Värjäykset suoritettiin aina yksi näytelasi kerrallaan eikä värjäyksiä tehty limittäin. Kaikki värjäykset suoritettiin Novodiaxin Pan-CK AE1/AE3 vasta-ainetta (Novodiax, Inc, California, USA) käyttäen.
6.2 Vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen estäminen
Näytelasi 1 värjättiin laboratoriossa käytössä olevan protokollan, ohjeen 1, mukaan (liite 1). Pesut vasta-aineen jälkeen olivat pidempiä, kuin ohjeen 30 sekuntia. Seuraavaksi muutettiin asetoni-
fiksaation kesto yhdestä minuutista 30 sekuntiin ja hematoksyliinivärjäys pidennettiin 30 sekun- tiin, ohje 2 (liite 1). Näissä värjäyksissä huuhtelut vasta-aineen jälkeen olivat kaikki tarkasti 35 se- kuntia. Tällä ohjeella värjättiin näytelasit 2 ja 3, sillä näistä näytelasin 2 värjäystulos ei ollut onnis- tunut.
Epäspesifistä sitoutumista yritettiin vähentää vaihtamalla käytettävä estäjä (Peroxidase-Blocking Solution, Dako REAL) Dakon Antibody Diluent with Background Reducing Components (BRC) -liu- okseen. Lisäksi pesut vasta-aineen jälkeen pidennettiin yhteen minuuttiin ja asetonifiksaatio pi- dettiin minuutin mittaisena, ohje 3 (liite 1). Näytelasi 4 värjättiin tällä ohjeella.
6.3 Endogeenisen entsyymiaktiivisuuden estäminen
Näytelasille 5 värjäys tehtiin ohjeella 4 (liite 1), jossa BRC-liuokseen lisättiin vetyperoksidia estä- mään endogeenista peroksidaasia. Eppendorf-putkeen pipetoitiin 1350 µl BRC-liuosta ja 150 µl 30-prosenttista vetyperoksidia. Näin saatiin 3-prosenttinen vetyperoksidia sisältävä liuos. Oh- jeella 4 (liite 1) värjättiin myös näytelasit 6–10 sekä näytelasit 13 ja 14, jotka olivat positiivisiksi tiedettyjä imusolmukenäytteitä.
Seuraavaksi endogeenistä peroksidaasia estettiin vahvemmalla vetyperoksidi-konsentraatiolla.
Ohjetta 4 (liite 1) muokattiin siten, että BRC-liuokseen lisättiin vetyperoksidia siten, että Eppen- dorff-putkeen pipetoitiin 1200 µl BRC-liuosta ja 300 µl 30-prosenttista vetyperoksidia. Näin saa- tiin 6-prosenttinen vetyperoksidi-BRC -liuos. Värjäys tehtiin näytelasille 11. Värjäystulos ei ollut 3- prosenttiseen vetyperoksidi-BRC -liuokseen verrattuna parempi, joten värjäyksiä jatkettiin 3-pro- senttisella liuoksella.
Epäspesifistä taustavärjäytymistä lähdettiin tarkastelemaan seuraavaksi siten, että värjäys suori- tettiin ohjeella 4 (liite 1) näytelasille 12. Tässä värjäyksessä vasta-aine korvattiin pesupuskurilla.
Koska ilman vasta-ainetta näytteeseen 12 tuli positiivisuutta, värjättiin näytelasi 15 ohjeella 4 (liite 1). Nyt fiksoinnissa asetoni korvattiin huoneenlämpöisellä metanolilla ja vasta-aine jätettiin pois, kuten näytelasin 12 kohdalla, ja korvattiin pesupuskurilla.
Näytelasi 16 värjäyksessä metanolin tehoa yritettiin lisätä pitkittämällä fiksointiaikaa minuutista viiteen minuuttiin ja vasta-aine jätettiin pois. Muuten noudatettiin ohjetta 4 (liite 1). Erona näyte- lasin 15 värjäykseen, metanolia oli säilytetty fiksointiastiassa, jonka kansi oli tiivistetty parafilmillä kiinni ja säilytyslämpötila yön yli oli -20 °C. Metanolia käytettiin kylmänä värjäyksessä.
Epäspesifistä värjäytymistä tarkasteltiin vielä yhdellä värjäyksellä, jossa endogeenisen entsyy- miaktiivisuuden estäjäksi vaihdettiin EnVisionin HPR blocking solution ja vasta-aine korvattiin pe- supuskurilla. Näytelasi 17 värjättiin muuten noudattaen ohjetta 4 (liite 1).
6.4 Värjäyksen intensiteetin säätö
Värjäyksissä näytelasit 1–5 värjättiin käyttämällä DAB-liuosta, jossa oli 10 µl DAB kromogeeniä ja 500 µl DAB-puskuria. Näytelasi 6 värjättiin ohjeella 4 (liite 1). Siinä DAB-liuos valmistettiin siten, että kromogeeniä pipetoitiin Eppendorf-putkeen 20 µl ja DAB puskuria 500 µl. Suurempi kro- mogeenimäärä antoi vahvemman positiivisen signaalin, joten näytelasit 7–17 värjättiin vahvem- paa DAB kromogeenikonsentraatiota käyttäen.
Kontrastia värien välillä testattiin näytelaseilla 18 ja 19. Värjäyksessä noudatettiin ohjetta 5 (liite 1), jossa fiksoinnissa käytettiin huoneenlämpöistä metanolia ja endogeenisen entsyymiaktiivisuu- den estäjänä 3-prosenttista vetyperoksidi-BRC -liuosta. DAB-liuos sisälsi DAB kromogeeniä 10 µl ja DAB puskuria 500 µl.
6.5 Värjättyjen näytteiden mikroskopointi ja laadunvarmistus arkistonäytteistä
Mikroskopointiosuudessa vertailtiin eri ohjeilla värjättyjä näytteitä keskenään ja arvioitiin värjäys- tulosta taustan, epäspesifisen värjäytymisen sekä mahdollisen positiivisen signaalin vahvuutta.
Mikroskopointia tehtiin värjäyksien välillä, jotta osattiin havainnoida muutoksia värjäystulok- sessa, muuttaa värjäysohjelmaa haluttuun suuntaan ja tarkkailla värjäyksen onnistumista. Mikro- skopointi tehtiin vielä systemaattisesti, kun kaikki värjäykset oli saatu päätökseen.
Laadunvarmistuksessa mikroskopoitiin arkistosta kerättyjen potilasnäytteiden jääleikkeitä ja pa- rafiinileikkeitä, jotka oli värjätty sytokeratiinivärjäyksellä. Jääleikkeistä tarkasteltiin dendriittisolu- jen ja epäspesifisesti värjäytyneiden solujen määriä semikvantitatiivisesti asteikolla +/++/+++.
Syöpäsolujen löytyminen merkittiin plussalla. Taustavärjäytyvyyttä arvioitiin sanallisesti ja mainit- tiin, mikäli teknisesti leike oli huonolaatuinen. Jääleikkeissä käytetty lasimerkki kirjattiin. Parafiini- näytteistä tarkasteltiin vain dendriittisolujen ja syöpäsolujen esiintyvyys ja merkittiin plussalla, mikäli niitä oli havaittavissa.
7 Tulokset
7.1 Vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen estäminen
Näytelasi 1:n värjäystulos oli selkeä ja positiivisen signaalin intensiteetti oli vahva. Näytteessä ei ollut häiritsevää taustavärjäytymistä, mutta joitakin epäspesifisesti värjäytyneitä soluja oli näky- vissä. Kyseiset solut olivat pieniä ja osin granulaisia. Näytelaseissa 2 ja 3 värjäystulos oli kauttaal- taan läiskikäs ja epätasainen.
7.2 Endogeenisen entsyymiaktiivisuuden estäminen
Näytelasilla 4 suolen värjäystulos oli epätasainen, mutta munuaisen selkeä. Molemmissa kudok- sissa oli näkyvissä taustavärjäytymistä sekä epäspesifisesti värjäytyneitä soluja. Verrattuna näy- telaseihin 2 ja 3, näytelasin 4 värjäystulos oli hieman selkeämpi ja siinä oli vähemmän epäspesi- fistä taustavärjäytymistä.
Näytelasin 5 värjäyksessä paksusuoli- ja munuaiskudosnäytteiden värjäystuloksissa taustavärjäy- tymistä ei esiintynyt lainkaan, mutta edelleen yksittäisiä epäspesifisesti värjäytyviä soluja oli nä- kyvissä. Näytelasien 6–10 värjäystulokset olivat samansuuntaisia kuin näytelasi 5:n eli häiritsevää taustavärjäytymistä ei ollut, mutta epäspesifisesti värjäytyneitä soluja oli näkyvissä. Näytelasi 6:n kudosnäytteenä oli munuaista ja paksusuolta, näytelasien 7–9 sekä 13–14 näytemateriaali oli imusolmuketta ja näytelasi 10:n näytteenä oli munuaiskudosta. Näytelasien 7, 13 ja 14 imusol- mukenäytteissä oli syöpäsoluja (kuva 5), jotka värjäytyivät vahvasti positiivisiksi.
Kuva 5. Syöpäsoluja imusolmukkeessa näytelasilla 13, 10x objektiivilla (vas.) ja 40x objektiivilla (oik.) (Kuvat: Hanna-Kaisa Vinkanharju 2020).
Näytelasin 11 värjäystulos oli vaaleampi ja kontrasti oli heikompi. Epäspesifisesti värjäytyviä so- luja näkyi edelleen. Näytelasin 12 värjäyksessä, jossa jätettiin vasta-aine pois, saatiin värjäystu- loksena sama määrä epäspesifisesti värjäytyneitä soluja kuin näytelaseissa 5–10 (kuva 6). Muu- ten näytteessä ei ollut positiivisuutta.
Kuva 6. Epäspesifisesti värjäytyneitä soluja näytelasilla 12, 40x objektiivilla (Kuva: Hanna-Kaisa Vinkanharju 2020).
Näytelasin 15 värjäystulos oli samanlainen kuin näytelasin 12 kohdalla eli epäspesifisesti värjäy- tyneitä soluja oli näkyvissä. Metanolin vaikutuksesta hematoksyliinieosiinivärjäyksen tumaväri oli selkeästi sinisempi (kuva 7).
Kuva 7. Epäspesifisesti värjäytyneitä soluja ja sinisempi tumaväri näytelasilla 15, 40x objektiivilla (Kuva: Hanna-Kaisa Vinkanharju 2020).
Näytelasin 16 värjäystuloksena epäspesifisesti värjäytyneitä soluja ilmeni muuten negatiivisena pysyneessä näytteessä. Tumien sininen väri ei ollut yhtä tumma verrattuna näytelasiin 15. Näyte- lasin 17 värjäystuloksena saatiin näkyviin sama määrä epäspesifisesti värjäytyneitä soluja, kuin näytelasien 12,15 ja 16 värjäyksissä. EnVisionin HPR blocking solution -liuos ei estänyt tehok- kaammin endogeenista entsyymiaktiivisuutta verrattuna 3-prosenttiseen vetyperoksidi-BRC -liu- okseen.
7.3 Värjäyksen intensiteetti
Näytelasien 1-5 värjäyksissä kromogeenin antama ruskea värisignaali oli selkeä, mutta kaksinker- taista kromogeenimäärää (20 µl) käyttäessä näytelasien 6–17 kohdalla signaali oli voimakkaampi ja terävämpi (kuva 8).
Kuva 8. Mikroskooppinäkymä kromogeenimäärällä 10 µl näytelasi 5 (vas.) ja kromogeenimää- rällä 20 µl näytelasi 6 (oik.), 20x objektiivilla (Kuvat: Hanna-Kaisa Vinkanharju 2020).
Näytelaseissa 18 ja 19 värjäystuloksena saatiin vaaleampi positiivinen ruskea signaali ja molem- missa näytteissä esiintyi epäspesifisesti värjäytyneitä soluja. Tumaväri oli sinisempi metanolin vaikutuksesta ja häiritsevää taustavärjäytymistä ei ollut. Verrattuna näytelasien 6–17 värjäystu- loksiin, värin intensiteetti positiivisessa signaalissa oli vaaleampi eikä niin terävä.
7.4 Laadunvarmistus arkistonäytteistä
Laadunvarmistuksessa yhteensä kahdeksan potilaan näytteitä mikroskopoitiin (liite 3). Imusol- mukenäytteiden lukumäärä vaihteli eri potilaiden kohdalla. Yhteensä jääleikenäytteitä oli 25 kap- paletta ja vastaava määrä parafiinileikkeitä.
Jääleikkeistä kahdeksassa oli näkyvissä dendriittisoluja, joiden määrä vaihteli välillä + ja ++. Para- fiinileikkeissä 13 näytteessä oli näkyvissä dendriittisoluja. Epäspesifisesti värjäytyneitä soluja nä- kyi 14 jääleikkeessä ja niiden määrä vaihteli + ja +++ välillä. 13 jääleikkeessä ei ollut mikrosko- pointia häiritsevää taustavärjäytymistä, mutta kahdeksassa jääleikkeessä taustavärjäytyminen oli mikroskopointia häiritsevää. Neljässä tapauksessa jääleikenäytteen prosessointi oli teknisesti epäonnistunut siten, ettei arvioita näytteestä pystytty tekemään. Näissä tapauksissa näyte oli re- peytynyt, poimuttuneena kaksin kerroin objektilasilla tai huuhtoutunut pois objektilasilta.
Kahdessatoista jääleikenäytteessä näytteet olivat osittain repeytyneitä tai kaksin kerroin objekti- lasilla, joka vaikeutti arviointia huomattavasti. Ainoastaan yhdeksän jääleikenäytettä olivat sellai- sia, että arvion tekeminen näytteestä oli helppoa. Näissä näytteissä näytemateriaali oli objektila- silla yhdessä kerroksessa, ilman häiritseviä repeämiä ja värjäystulos oli tasainen ja selkeä. Eri objektilasien merkkien välillä ei ollut eroja värjäystuloksen onnistumisessa.
Jääleikkeistä syöpäsoluja ei näkynyt yhdessäkään näytteessä, mutta parafiinifiksoiduista näyt- teistä kolmessa löytyi syöpäsoluja. Näytelaseja silmämääräisesti tarkasteltaessa kaikissa tapauk- sissa parafiininäytteen leike oli eri leiketasosta otettu.
8 Pohdinta
Tutkimuksen tarkoituksena oli tehdä pikasytokeratiinivärjäyksen menetelmävalidointia uudella primaarivasta-aineella sekä arvioida aikaisemman pikasytokeratiinimenetelmän teknistä laatua ja toimivuutta. Tarkoituksena oli vertailla uuden menetelmän värjäystuloksia aiemmin käytössä olleisiin menetelmiin ja valita käyttöön signaali-tausta -suhteeltaan paras menetelmä.
Kaikista ohjeista signaaliltaan terävimmän positiivisen värjäystuloksen ilman epäspesifistä taus- tavärjäytymistä antoi ohje 4 (liite 1). Vetyperoksidi lisättynä BRC-liuokseen esti tehokkaimmin mikroskopointia häiritsevän taustavärjäytymisen. Vetyperoksidi esti näytteessä endogeenisen peroksidaasin toimintaa ja reagoimista DABin kanssa. BRC-liuos esti primaarivasta-aineen epä- spesifisen sitoutumisen näytteessä. Nämä liuokset yhdistämällä värjäyksen aikana tarvitaan yksi annostelu näytteelle, joten värjäysprosessin kesto ei pitene. Vetyperoksidin suurempi konsent- raatio heikensi positiivisen signaalin kontrastia, joten 3-prosenttinen vetyperoksidi-BRC -liuos oli riittävän tehokas estämään taustavärjäytymisen. Vaaleampi positiivinen signaali saattaa selittyä sillä, että suurempi vetyperoksidin määrä vaikuttaa näytteen keratiineihin siten, että primaari- vasta-aine ei sitoudu niihin yhtä tehokkaasti. Tällöin entsyymileimaa on vähemmän ja DABin vä- rillistä lopputuotetta muodostuu vähemmän. Taustavärjäytymisen estämiseen vaikutti lisäksi se, että vasta-aineen jälkeiset pesut tehtiin huolellisesti ja noudattamalla ohjeaikoja, jolloin sitoutu- maton vasta-aine huuhtoutui pois.
Värjäyksen intensiteettiä säätäessä suurempi kromogeenikonsentraatio antoi terävämmän ja vahvemman positiivisen signaalin. Tämä selittyy sillä, että suurempi määrä DAB-molekyylejä on reagoimassa entsyymileiman kanssa ja reaktion värillistä lopputuotetta muodostuu samassa ajassa enemmän verrattuna pienempää kromogeenimäärään.
Yllättävin löydös tutkimuksessa oli epäspesifisesti värjäytyneet solut, joiden värjäytymistä ei on- nistuttu estämään. Ilman vasta-ainetta tehtyjen värjäyksien perusteella voidaan todeta, että ne eivät värjäydy vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen takia. Näillä soluilla on endogeenista ent- syymiaktiivisuutta, jonka avulla ne hapettavat DABin värilliseksi lopputuotteeksi. Tätä entsyy- miaktiivisuutta ei onnistuttu estämään vetyperoksidia, metanolia eikä EnVisionin HPR blocking
solution -liuosta käyttämällä. Solun kokoa, morfologiaa ja sijaintia muuhun kudosrakenteeseen tarkasteltaessa, voidaan epäillä näiden solujen olevan makrofageja. Teoriaa tukee se, että mak- rofageilla tiedetään olevan endogeenista peroksidaasiaktiivisuutta ja näytteissä ne sijaitsevat sat- tumanvaraisissa paikoissa, eivätkä esimerkiksi verisuonirakenteiden sisällä. Epäspesifisesti vär- jäytyneistä soluista ei lähtenyt hiusmaisia ulokkeita, joten ne eivät ole dendriittisoluja.
Laadunvarmistuksen potilasnäytteitä mikroskopoitaessa havainnollistui, kuinka paljon näyttei- den välinen laatu vaihteli värjäyksien lopputuloksessa. Jääleikkeen leikkaaminen on haastavaa ja paineen alla työskentely vaatii tekijältä ammattitaitoa. Aikapaineesta riippumatta tulee saada lei- kattua sopivan paksuisia leikkeitä ja aseteltua ne objektilasille mahdollisimman sileänä ilman näytteen repeytymistä. Värjäyksen eri vaiheet tulee tehdä huolellisesti loppuun saakka ja esimer- kiksi välipesut pesupuskurissa on tehtävä riittävän tehokkaasti lasia liikuttelemalla, muttei liian rajusti, jotta näyte säilyy lasilla. Lisäksi käytettävien liuoksien riittävän tiheästä vaihtamisesta uu- siin tulee huolehtia, jotta hyvä värjäystulos voidaan saavuttaa. Kolmessa parafiininäytteessä oli syöpäsoluja, mutta vastaavissa jääleikkeissä syöpäsoluja ei ollut. Tämä selittyi sillä, että näytteet olivat eri leiketasoista otettuja.
Tämän tutkimuksen vahvuutena oli se, että toiminallisessa osuudessa kirjasin kaikki työvaiheet ja poikkeamat sekä työskentelin järjestelmällisesti. Värjäyksiä tehdessä käsittelin vain yhtä näytela- sia kerrallaan ja käytin sekuntikelloa seuratakseni ohjeaikoja täsmällisesti. Värjäyksiä aloittaessa vaihdoin aina asetonin ja pesupuskuriliuokset päivän alussa uusiin. Käsittelemäni potilasnäytteet olivat koodattu näytenumeroin, joten henkilötietoja en käsitellyt missään työn vaiheessa. Työn teoriaosuutta kirjoittaessa pyrin käyttämään lähteitä, jotka olivat enintään kymmenen vuotta vanhoja painottuen alle viisi vuotta vanhoihin lähteisiin. Kirjoittaessa käytin vain luotettavaksi ar- vioimiani lähteitä ja useampaa lähdettä rinnakkain tarkistaen näin tiedon oikeellisuuden.
Tutkimuksessa parannettavaa olisi ollut se, että samaa värjäysohjetta olisi toistettu useamman kerran ja värjäysohjetta olisi muutettu vain yksi muuttuja kerrallaan. Näin toimien tulosten luo- tettavuus olisi lisääntynyt. Koska näytemäärät ja värjäyksien toistokerrat ovat pienet, eri vär-
jäysohjeiden tulokset ovat suuntaa antavia. Arviot värjäyksien onnistumisesta ja mikroskopoin- nin helppoudesta pohjautuivat subjektiiviseen kokemukseeni. Mikroskopoitaessa luotettavuutta olisi lisännyt se, että arviot olisi tehnyt useampi henkilö ja henkilöt, jotka analysoivat näytteitä kliinisessä työssä päivittäin. Laadunvarmistuksessa vaaditaan suurempi näytemäärä, jotta voitai- siin sanoa, onko värjäyksien laatu riittävällä tasolla. Näin ollen myös laadunvarmistuksessa saa- dut tulokset ovat vain suuntaa antavia.
Tutkimuksen tuloksien pohjalta laboratorio jatkaa pikasytokeratiinivärjäyksen menetelmävali- dointia ja laadunvarmistusta laajemmalla potilasmateriaalilla. Erityisenä jatkotutkimuksen koh- teena on löytää estäjä, joka estäisi epäspesifisesti värjäytyvien solujen endogeenisen entsyy- miaktiivisuuden. Patologien mielipidettä metanolin antamasta sinisemmän tumavärin hyödystä kontrastivärinä tulee kartoittaa. Laboratoriolle jää selvitettäväksi lisäksi se, että olisiko DABin kromogeenimäärä 15 µl riittävä muodostamaan tarpeeksi vahvan värisignaalin, jolloin näin sääs- tettäisiin kromogeenin kulutuksessa. Lopulta vasta rutiinikäytössä nähdään, onko tämän tutki- muksen paras menetelmäohje riittävän yksinkertainen ja luotettava päivittäiseen käyttöön diag- nostiikassa.
Lähteet
Barzaman K, Karami J, Zarei Z, ym. Breast cancer: Biology, biomarkers, and treatments. Internati- onal Immunopharmacology 2020;84: 106535.
Dako. Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, Clones AE1/AE3. Luettu 19.1.2021.
https://www.agilent.com/cs/library/packageinsert/public/303322EN_06.pdf
Dmello C, Srivastava S.S, Tiwari R, Chaudhari P.R, Sawant S, Vaidya M.M. Multifaceted role of ke- ratins in epithelial cell differentiation and transformation. Journal of Biosciences 2019; 44(2).
https://www.ias.ac.in/article/fulltext/jbsc/044/02/0033
Feng Y, Spezia M, Huang S, ym. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes & Diseases 2018;
5: 77–106.
Heikkilä P. Miehen rinta. Kirjassa: Mäkinen M, Carpén O, Kosma V, Paavonen T, Stenbäck F, toim.
Patologia. Helsinki: Duodecim 2012a.
Heikkilä P. Rintasyöpä. Kirjassa: Mäkinen M, Carpén O, Kosma V, Paavonen T, Stenbäck F, toim.
Patologia. Helsinki: Duodecim 2012b.
Huovinen R. Rintasyöpä. Lääketieteellinen Aikakauskirja Duodecim 2017; 133(7):689–72.
Iles R, Docherty S. Biomedical sciences essential laboratory medicine. Chichester, West Sussex:
John Wiley & Sons Ltd 2012.
Jackson P, Blythe D. Immunohistochemical techniques. Kirjassa: Suvarna K, Layton C, Bancroft J.
Bancroft’s theory and practice of histological techniques. Saint Louis, Missouri: Churchill Livings- tone 2013.
Jacob J.T, Coulombe P.A, Kwan R, Omary M.B. Types I and II Keratin Intermediate Filaments. Cold Spring Harbor perspectives in biology 2018; 10(4) 10.1101/cshperspect.a018275
Jacobsen L, Nielsen M, Månsson S, Rudbeck L. Stainin Protocol Optimization. Kirjassa: Taylor C.R, Rudbeck L. Immunohistochemical Staining Methods. Dako Denmark A/S, An Agilent Technologies Company 2013.
Joensuu H, Huovinen R. Rintasyövän liitännäislääkehoito. Kirjassa: Joensuu H, Roberts P.J, Kello- kumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit. Helsinki: Duodecim 2013a.
Joensuu H, Huovinen R. Rintasyövän postoperatiivinen sädehoito. Kirjassa: Joensuu H, Roberts P.J, Kellokumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit. Helsinki: Duodecim 2013b.
Joensuu H, Huovinen R. Rintasyövän vaaratekijät ja ehkäisy. Kirjassa: Joensuu H, Roberts P.J, Kel- lokumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit. Helsinki: Duodecim 2013c.
Joensuu H, Huovinen R. Rintasyövän yleisyys. Kirjassa: Joensuu H, Roberts P.J, Kellokumpu-Lehti- nen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit. Helsinki: Duodecim 2013d.
Joensuu H, Leidenius M, Huovinen R. Miehen rintasyöpä. Kirjassa: Joensuu H, Roberts P.J, Kello- kumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit. Helsinki: Duodecim 2013a.
Joensuu H, Leidenius M, Huovinen R. Rintasyöpäpotilaiden ennuste, seuranta ja kuntoutus. Kir- jassa: Joensuu H, Roberts P.J, Kellokumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpä- taudit. Helsinki: Duodecim 2013b.
Joensuu H, Leidenius M, Huovinen R. Rintasyövän hoidon periaatteet. Kirjassa: Joensuu H, Ro- berts P.J, Kellokumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit. Helsinki: Duo- decim 2013c.
Jokiranta S, Seppälä I.J.T. Vasta-ainevälitteinen immuniteetti. Kirjassa: Hedman K, Heikkinen T, Huovinen P, Järvinen A, Meri S, Vaara M, toim. Immunologia. Helsinki: Duodecim 2011.
Kalyuzhny A. E. Immunohistochemistry: essential elements and beyond. Springer International Publishing AG Switzerland 2016.
Kim S-W, Roh J, Park C-S. Immunohistochemistry for pathologists: protocols, pitfalls, and tips.
Journal of pathology and translational medicine 2016; 50(6): 411–418.
https://dx.doi.org/10.4132%2Fjptm.2016.08.08
Leidenius M, Joensuu H. Kainaloevakuaatio ja vartijaimusolmuketutkimus rintasyövässä. Kirjassa:
Joensuu H, Roberts P.J, Kellokumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit.
Helsinki: Duodecim 2013a.
Leidenius M, Joensuu H. Rintasyövän diagnostiikka: kliininen tutkimus. Kirjassa: Joensuu H, Ro- berts P.J, Kellokumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit. Helsinki: Duo- decim 2013b.
Leidenius M, Joensuu H. Rintasyövän diagnostiikka: kuvantaminen. Kirjassa: Joensuu H, Roberts P.J, Kellokumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit. Helsinki: Duodecim 2013c.
Leidenius M, Joensuu H. Rintasyövän diagnostiikka: morfologiset tutkimukset. Kirjassa: Joensuu H, Roberts P.J, Kellokumpu-Lehtinen P-L, Jyrkkiö S, Kouri M, Teppo L, toim. Syöpätaudit. Helsinki:
Duodecim 2013d.
Leidenius M, Meretoja T. Rintasyöpäleikkauksen suunnittelu. Kirjassa: Leppäniemi A, Kuokkanen H, Salminen P, toim. Kirurgia. Helsinki: Duodecim 2018a.
