In vitro digestion of malts and germinated faba beans - setting the methodology

(1)

IN VITRO DIGESTION OF MALTS AND GERMINATED FABA BEANS – SETTING THE METHODOLOGY

Rantanen Timo Master’s thesis Clinical Nutrition School of Medicine

Institute of Public Health and Clinical Nutrition

University of Eastern Finland November 2020

(2)

University of Eastern Finland, Faculty of Health Sciences Institute of Public Health and Clinical Nutrition

Nutrition

RANTANEN TIMO O: In vitro digestion of malts and germinated faba beans – setting the methodology

Master’s thesis, 85 pages.

Supervisors: Carlos Gómez-Gallego, PhD; Marjukka Kolehmainen, Prof; Annika Wilhelmson, D.Sc. (Tech)

November 2020

Keywords: protein digestibility, germination

IN VITRO DIGESTION OF MALTS AND GERMINATED FABA BEANS – SETTING THE METHODOLOGY

Interest towards plant-based proteins is increasing due to a variety of reasons. However, plant-based proteins are considered to have limitations compared to animal proteins. In many cases, plants have suboptimal amino acid profiles for human dietary needs, and they also contain compounds, such as phytic acid, that reduce the bioavailability of nutrients. Malting is known to change the physical and chemical structure of cereal grains and to increase the release of nutrients in mashing process.

Germination and malting could be an affordable and easily available solution to increase the digestibility and thus the bioavailability of plant-based proteins. The aim of this study was set the methodology for evaluating the possible benefits of malting and germination for in vitro protein digestion.

Six different samples were digested in a static in vitro gastro-intestinal model. Briefly, oral phase was simulated by adding water to a ground sample, gastric phase by adding pepsin solution and incubating for 2 h at 37℃ and intestinal phase by adding pancreatin solution and incubating in the same conditions as previously. The impact of digestion on proteins were analyzed with three different methods. SDS-PAGE method was utilized to assess the degree of fragmentation of proteins. The amount of free amino acids was determined with TNBSA assay. For in vitro protein digestibility (IVPD), proteins were isolated with TCA-precipitation method and the nitrogen content was determined with Kjeldahl method.

In the SDS-PAGE analyses, both wheat and barley products were clearly digested with fragments less than 20 kDa remaining after the gastric phase and less than 15 kDa after intestinal phase. Only one 37 kDa band was visible in barley malt. All faba bean samples showed three clear bands after intestinal phase at the 20 kDa size marker and two clear bands between 25 and 37 kDa. These bands were not detected after gastric phase. In TNBSA-assay, malted products contained more free amino acids before digestion, but differences were diminished after digestion especially with barley. With faba beans, germinated version contained higher concentration of free amino acids both before and after digestion. Malting slightly increased IVPD of barley and wheat, whereas germinated faba bean had slightly lower IVPD compared to raw.

With current methods and only few batches, distinctive differences were not found. The results from the TNBSA-assay showed that malted products contain more free amino acids, which could be beneficial for individuals with digestion problems. However, the benefits or lack thereof of malting and germination cannot be concluded, and different batches are needed to test statistical significance.

A large part of the work was to optimize the methods for cereal products and legumes and practical work revealed several aspects to consider in future experiments.

(3)

Itä-Suomen yliopisto, Terveystieteiden tiedekunta

Kansanterveystieteen ja kliinisen ravitsemustieteen yksikkö Ravitsemustiede

RANTANEN TIMO O: Maltaiden ja idätetyn härkäpavun in vitro ruoansulatus ja mallin menetelmien kehittäminen.

Pro gradu -tutkielma, 85 sivua.

Ohjaajat: Carlos Gómez-Gallego, FT; Marjukka Kolehmainen, Prof; Annika Wilhelmson, TkT.

November 2020

Avainsanat: proteiinin pilkkoutuvuus, idätys

MALTAIDEN JA IDÄTETYN HÄRKÄPAVUN IN VITRO RUOANSULATUS JA MALLIN MENETELMIEN KEHITTÄMINEN

Mielenkiinto kasvipohjaisia proteiineja kohtaan on nousussa monista syistä. Kasviproteiinien aminohappoprofiilit ovat kuitenkin usein epätäydellisiä ihmisen ravitsemuksen kannalta. Lisäksi kasvit sisältävät yhdisteitä, jotka voivat heikentää ravintoaineiden hyväksikäytettävyyttä. Tällainen yhdiste on esimerkiksi fytiinihappo. Mallastus muokkaa viljan fyysistä ja kemiallista rakennetta tavoitteenaan ravintoaineiden tehokas vapautuminen mäskäysprosessissa. Mallastus ja idätys voisivat olla kustannustehokkaita ja valmiiksi tarjolla olevia ratkaisuja kasviproteiinien hyväksikäytettävyyden parantamiseen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mallastuksen ja idätyksen hyötyä in vitro proteiinin pilkkoutuvuuteen (IVPD) sekä optimoida tämän tutkimiseen käytettäviä menetelmiä.

Kuusi näytettä pilkottiin staattisen in vitro ruoansulatusmallin avulla. Suuvaihetta simuloitiin lisäämällä vettä hienonnettuun näytteeseen. Mahavaiheessa näytteeseen lisättiin pepsiiniliuosta, jota seurasi kahden tunnin inkubointi 37℃:n lämpötilassa. Suolistovaiheessa näytteeseen lisättiin pankreatiini-sappiliuosta, jonka jälkeen seurasi inkubointi samoissa olosuhteissa kuin aikaisemmin.

Ruoansulatuksen vaikutuksia arvioitiin kolmella menetelmällä. SDS-PAGE-menetelmän avulla tarkasteltiin proteiinien fragmentoitumista. Vapaiden aminohappojen määrä määritettiin TNBSA- analyysiä hyödyntäen. IVPD:n määrittämiseksi proteiinit eristettiin TCA-sakkautusmenetelmällä ja typpi määritettiin Kjeldahl-menetelmällä.

SDS-PAGE-analyysissa havaittiin sekä vehnän että ohran pilkkoutuneen tehokkaasti, sillä mahavaiheen jälkeen havaittiin alle 20 kDa:n ja suolistovaiheen jälkeen alle 15 kDa:n kokoisia fragmentteja. Ohramaltaalla havaittiin myös yksi himmeä 37 kDa:n kokoinen nauha. Härkäpavulla havaittiin kolme selkeää nauhaa 20 kDa:n molekyylipainomarkkerin kohdalla, sekä kaksi nauhaa 25 ja 37 kDa:n kohdalla. Vapaiden aminohappojen määrä oli korkeampi mallastetuilla tai idätetyillä tuotteilla sekä ennen ruoansulatusta että sen jälkeen, mutta etenkin ohralla erot heikkenivät ruoansulatuksen jälkeen. Mallastus lisäsi ohran ja vehnän IVPD:tä, kun taas härkäpavulla idätys heikensi sitä.

Käytetyillä menetelmillä ja vähäisellä näytemäärällä ei löydetty selkeitä eroja mallastettujen tai idätettyjen sekä raakojen tuotteiden välillä. Suurempi vapaiden aminohappojen määrä maltaissa voi olla hyödyllinen ruoansulatusongelmista kärsiville. Lisää tutkimusta tarvitaan, jotta mallastuksen ja idätyksen aiheuttamista vaikutuksista voidaan tehdä johtopäätöksiä. Tämä tutkimus paljasti myös useita seikkoja, jotka tulisi ottaa huomioon menetelmien kehittämisessä edelleen.

(4)

ABBREVIATIONS

FB: Faba bean.

GFB: Germinated faba bean.

WM: Wheat malt.

BM: Barley malt.

AAS: Amino acid score.

IVPD: In vitro protein digestibility.

PDCAAS: Protein digestibility corrected amino acid score.

DIAAS: Digestible indispensable amino acid score.

IV-PDCAAS: In vitro protein digestibility corrected amino acid score.

GI-tract: Gastrointestinal tract.

TIA: Trypsin inhibitor activity.

TIU: Trypsin inhibitory unit.

NPN: Non-protein nitrogen.

TPN: True protein nitrogen.

(7)

1 FINNISH SUMMARY OF THE MASTER’S THESIS

1.1 JOHDANTO

Eläinperäisten tuotteiden kulutus on herättänyt viime aikoina keskustelua niin eettisestä, terveydelliseltä kuin ympäristönkin näkökulmista, mikä on lisännyt mielenkiintoa kasvipohjaisia vaihtoehtoja kohtaan. Viljat ovat merkittävä kasvipohjaisen proteiinin lähde (McKevith 2004), mutta esimerkiksi palkokasvien käyttö on maailmanlaajuisesti silti vähäistä (Rawal ja Navarro 2019).

Tehokkaat prosessointimenetelmät voisivat lisätä näiden ravinteikkaiden kasvien hyödyntämistä proteiinien lähteinä. Kasviproteiinien hyväksikäytettävyydestä ihmisen ruoansulatuksessa tiedetään kuitenkin yllättävän vähän. Kasviproteiinia pidetään heikkolaatuisempana eläinproteiiniin verrattuna epätäydellisen aminohappokoostumuksensa takia (EFSA NDA Panel 2012). Lisäksi kasvit sisältävät yhdisteitä, jotka voivat heikentää joidenkin ravinteiden, kuten proteiinin, hyväksikäytettävyyttä (Gilani ym. 2012).

Proteiinin laadun arviointiin on kehitetty erilaisia mittareita, joita Boye ym. (2012) ovat esitelleet katsausartikkelissaan. Tällaisia ovat esimerkiksi AAS (amino acid score), IVPD (in vitro protein digestibility), PDCAAS (Protein digestibility corrected amino acid score) ja DIAAS (digestible indispensable amino acid score). Ihmisen ruoansulatusjärjestelmän jäljittelyyn on kehitetty useita in vitro malleja (Dupont ja Mackie 2016). COST INFOGEST -verkosto on kehittänyt harmonisoidun staattisen mallin vastaamaan tutkimustulosten heikkoon vertailtavuuteen (Brodkorb ym. 2019). Tässä opinnäytetyössä käytetty malli perustuu tähän INFOGEST-malliin.

Idättäminen on muinainen menetelmä parantaa viljan ja palkokasvien ravitsemuksellista laatua käynnistämällä kasvin sisäiset kasvumekanismit. Mallastus on hallittu idätysprosessi, johon kuuluu kuivaus, juuri-itujen poisto sekä joissain tapauksissa paahtaminen (MacLeod ja Evans 2016).

Kosteuden lisääntyminen jyvässä käynnistää itämisen ja mallastusprosessissa tätä vaihetta kutsutaan liotukseksi, jolloin jyvät peitetään vedellä 2–4 kertaa. Liotusvaiheiden välissä vesi poistetaan ja jyvien annetaan levätä, jotta jyvien aineenvaihduntaan on tarjolla happea sekä siksi, että aineenvaihdunnasta syntyvä hiilidioksidi ja lämpö saadaan poistettua (Kunze ja Hendel 2019). Juuri- itujen ilmaantuessa jyvät siirretään idätyslaareihin, joissa ylläpidetään idätyksen kannalta sopivia happi-, kosteus- ja lämpötilaolosuhteita (MacLeod ja Evans 2016, Kunze ja Hendel 2019).

Idätysvaiheen jälkeen jyvät lämpökuivataan ja juuri-idut poistetaan. Mallastuksen tärkein tavoite on tuottaa hydrolyyttisia entsyymejä oluentuotannon mäskäysprosessiin (Kunze ja Hendel 2019). Idätys aiheuttaa kuitenkin myös monia muutoksia viljan ja palkokasvien ravitsemukselliseen laatuun muun

(8)

muassa lisäämällä tiettyjen vitamiinien määrää sekä parantamalla kivennäis- ja hivenaineiden hyväksikäytettävyyttä (Nkhata ym. 2018).

Tämän opinnäytetyön tavoitteena on tutkia mallastuksen tai idätyksen vaikutusta ohran (Hordeum vulgare), vehnän (Triticum aestivum) ja härkäpavun (Vicia faba L.) proteiinin pilkkoutuvuuteen, sekä optimoida käytettyjä menetelmiä viljan ja palkokasvien tutkimiseen.

1.2 KIRJALLISUUSKATSAUS

Idätyksen on havaittu nostavan vehnän proteiinipitoisuutta (Ranhotra ym. 1977, Singkhornart ym.

2013, Kavitha ja Parimalavalli 2014, Świeca ym. 2017, Zhu ym. 2017). Zhu ym. (2017) raportoivat myös vehnän IVPD:n heikkenevän hieman, kun taas Montemurro ym. (2019) havaitsivat selkeän parannuksen idätyksen seurauksena durumvehnällä (T. durum). Lisäksi idätys lisää huomattavasti vapaiden aminohappojen määrää vehnässä (Tkachuk 1979, Hung ym. 2012, Świeca ym. 2017) ja durumvehnässä (Montemurro ym. 2019). Vehnän ja durumvehnän proteiinien pilkkoutumisesta ruoansulatuksessa syntyy resistenttejä peptidejä, jotka voivat olla haitallisia osalle väestöstä (Prandi ym. 2014, Mamone ym. 2015, Smith ym. 2015, Graziano ym. 2019, Pilolli ym. 2019). Idätyksellä on huomattu olevan näitä peptidejä vähentävä vaikutus durumvehnällä tehdyissä tutkimuksissa (Boukid ym. 2017, Boukid ym. 2018). Määrän vähenemisestä huolimatta peptidit eivät häviä kokonaan, joten idätetyn durumvehnän nauttiminen ei ole turvallista keliaakikoille. Muista prosessointimenetelmistä paistamisen (baking) on havaittu heikentävän vehnän gluteenin pilkkoutuvuutta ja liukoisuutta (Smith ym. 2015), kun taas esimerkiksi hapattaminen yhdessä lisättyjen entsyymien kanssa on tehokas keino parantaa IVPD:tä (Rizzello ym. 2016, Pontonio ym. 2020).

Havainnot idätyksen vaikutuksista ohran proteiinipitoisuuteen ja IVPD:hen vaihtelevat. Chung ym.

(1989) eivät havainneet idätyksen vaikuttavan proteiinipitoisuuteen lainkaan ja Singkhornart ym.

(2013) raportoivat hieman korkeamman pitoisuuden idätetyllä ohralla. Montemurro ym. (2019) puolestaan raportoivat proteiinipitoisuuden hieman laskevan idätyksen seurauksena, mutta IVPD:n paranevan huomattavasti. Lisäksi havainnot vapaiden aminohappojen määrästä olivat samansuuntaisia kuin vehnällä. Idätetyn ohran korkeampi proteiinin pilkkoutuvuus on havaittu myös in vivo rotilla (Chung ym. 1989). Mallastus vaikuttaisi olevan yksi tehokkaimmista yksittäisistä prosessointimenetelmistä parantaa ohrapohjaisten elintarvikkeiden proteiinipitoisuutta (Arora ym.

2010). IVPD:tä voidaan parantaa entisestään yhdistämällä idätys toisen menetelmän, esimerkiksi hapattamisen kanssa (Montemurro ym. 2019).

(9)

Idätys vaikuttaa hieman nostavan härkäpavun proteiinipitoisuutta (Hsu ym. 1980, Morad ym. 1980, Alonso ym. 2000, Khalil 2001, Ferruzzi ym. 2009, Setia ym. 2019). Lisäksi proteiinin pilkkoutuvuuden on havaittu paranevan jonkin verran in vitro -kokeissa (Alonso ym. 2000, Setia ym.

2019) ja in vivo rotilla tehdyissä tutkimuksissa (Khalil 2001, Rubio 2003). Idätyksen on myös havaittu vaikuttavan useiden antinutrienttien eli ravintoaineiden hyväksikäytettävyyttä heikentävien yhdisteiden määrään (Sharma ja Sehgal 1992, Vidal-Valverde ym. 1998, Khalil 2001, Kassegn ym.

2018, Setia ym. 2019). Muista prosessointimenetelmistä etenkin hapattaminen vaikuttaisi olevan tehokas keino parantaa härkäpavun ja härkäpapua sisältävien tuotteiden ravitsemuksellista laatua (Coda ym. 2017, Rizzello ym. 2017, Rosa-Sibakov ym. 2018, Sozer ym. 2019, Verni ym. 2019, Rizzello ym. 2019).

Idätyksellä on havaittu olevan positiivinen vaikutus proteiinin pilkkoutuvuuteen myös muilla viljoilla, pseudoviljoilla ja palkokasveilla. Erityisesti näyttöä on siitä, että idättäminen parantaa IVPD:tä durralla (Sorghum bicolor) (Elmaki ym. 1999, Correia ym. 2010, Mohamed Nour ym. 2010, Afify ym. 2012, A. Singh ym. 2019), hirssillä (Pennisetum spp.) (Khetarpaul ja Chauhan 1990, Sharma ja Kapoor 1996, Mbithi-Mwikya ym. 2000, Archana ym. 2001, Hejazi ja Orsat 2016, Logosaranya ym. 2016, Gulati ym. 2018) ja kikherneellä (Cicer arietinum) (Jood ym. 1989, Chitra ym. 1996, El-Adawy 2002, Khatoon ja Prakash 2006, Ghavidel ja Prakash 2007, Khattak ym. 2008, Uppal ja Bains 2012).

1.3 KOKEELLINEN OSUUS Materiaalit ja menetelmät

Viking Malt Oy toimitti näytemateriaalit ja ne koostuivat ohrasta, ohramaltaasta, vehnästä, vehnämaltaasta, härkäpavusta ja idätetystä härkäpavusta. Viljat toimitettiin kokonaisina jyvinä ja härkäpavut jauhettuina. Ohramallas oli kaupallinen Pilsner-mallas. Härkäpapu ja vehnä oli idätetty laboratoriomittakaavassa 2 kg erissä. Prosessi piti sisällään liotuksen, idätyksen ja kuivauksen.

Härkäpavun liotus kesti kokonaisuudessaan 26 h ja vehnän 31 h pitäen sisällään kaksi upotusta ja yhden hapetusvaiheen. Härkäpavun idätysvaihe kesti 72 h ja vehnän 120 h. Kuivaus suoritettiin nostamalla lämpötilaa asteittain lopullisen lämpötilan ollessa 55°C härkäpavulla ja 83°C vehnällä.

Tutkimuksessa käytetty in vitro ruoansulatusmalli perustui INFOGEST-malliin (Brodkorb ym. 2019) sekä malliin Gómez-Gallegon ym. (2016) julkaisusta. Malli on esitetty pääpiirteittään kuvassa 1.

Suuvaiheen pureskelua simuloitiin rouhimalla jyvät tehosekoittimella mahdollisimman tasalaatuiseksi. Härkäpavuissa näytteet lisättiin sellaisenaan. Suuvaiheessa ei käytetty amylaasia.

(10)

Entsyymien aktiivisuudet olivat 2000 U/ml pepsiiniliuoksessa ja 100 U/ml pankreatiini- sappiliuoksessa. Ruokasulan pH säädettiin 3:een mahavaiheessa ja 7:ään suolistovaiheessa 1 N suolahappoa ja 1 M natriumvetykarbonaattia käyttäen.

Näytteiden proteiinipitoisuus määritettiin Kjeldahl-menetelmän avulla. Proteiinipitoisuuden laskemisessa käytettiin Jonesin (1931) muuntokertoimia, jotka olivat 5,83 ohralle ja vehnälle sekä 6,25 härkäpavulle. Proteiinitypen määrä määritettiin TCA-sakkautusmenetelmän (Awolumate 1983, Pérez-Conesa ym. 2005) ja Kjeldahl-menetelmän avulla. Muun typen määrä määritettiin vähentämällä proteiinityppi typen kokonaismäärästä. IVPD laskettiin seuraavan kaavan avulla:

IVPD (%) = NPN1−NPN0

TPN

x 100

jossa NPN1 tarkoittaa muuta typpeä ennen ja NPN0 jälkeen ruoansulatuksen, sekä TPN proteiinityppeä.

Proteiinien pilkkoutumisastetta arvioitiin natriumlauryylisulfaattipolyakryyliamidigeeli- elektroforeesin (SDS-PAGE) avulla. SDS-PAGE-analyysissä käytettiin Bio-Rad Mini-PROTEAN®

3-laitteistoa ja analyysi suoritettiin valmistajan ohjeen mukaisesti (Bio-Rad Laboratories Inc. 2020).

Lisäksi näytteistä määritettiin vapaiden aminohappojen määrä käyttäen 2,4,6- Trinitrobentseenisulfonihappo-menetelmää (TNBSA) valmistajan ohjeiden mukaisesti (Thermo Fisher Scientific Inc 2012). Standardikuvaaja muodostettiin eripitoisten glysiiniliuosten avulla.

Tilastollista analyysia ei voitu suorittaa liian vähäisen näytemäärän vuoksi.

(11)

Kuva 1. In vitro ruoansulatusprosessi.

Tulokset

SDS-PAGE-analyysin tulokset on esitetty kuvissa 2–6. Analyysista voidaan havaita, että ohran ja vehnän proteiinit ovat pilkkoutuneet pääasiassa alle 15 kDa:n fragmenteiksi digestion seurauksena sekä raaoilla, että idätetyillä tuotteilla. Härkäpavulla suolistovaiheen jälkeen jäljellä on useita selkeitä fragmentteja 15 ja 37 kDa:n välillä. Näitä fragmentteja ei kuitenkaan havaita mahavaiheen jälkeen kerätyissä näytteissä, mikä selittynee proteiinien voimakkaalla sakkautumisella mahavaiheen aikana.

IVPD:n määritys on esitetty taulukossa 1. Proteiinipitoisuus oli korkeampi kaikilla tuotteilla verrattuna raakoihin versioihin. Ohralla ja vehnällä IVPD lisääntyi hieman idätyksen seurauksena, kun taas härkäpavulla havaittiin hienoinen väheneminen. Vapaiden aminohappojen määritys on esitetty taulukossa 2. Siitä voidaan huomata, että idätetyissä tuotteissa vapaiden aminohappojen pitoisuus on korkeampi sekä ennen digestiota että digestion jälkeen.

(12)

Kuva 2. Ohran SDS-PAGE-analyysi. A: Raaka ohra ennen digestiota. B: Ohramallas ennen digestiota. 1: Raaka ohra mahavaiheen digestion jälkeen. 2: Ohramallas mahavaiheen digestion jälkeen. 3: Raaka ohra suolistovaiheen digestion jälkeen. 4: Ohramallas suolistovaiheen digestion jälkeen.

Kuva 3. Ohran SDS-PAGE-analyysin yläosa ennen digestiota. Raw: Raaka ohra. Malt: Ohramallas.

(13)

Kuva 4. Vehnän SDS-PAGE-analyysi. A: Raaka vehnä ennen digestiota. B: Vehnämallas ennen digestiota. 1: Raaka vehnä mahavaiheen digestion jälkeen. 2: Vehnämallas mahavaiheen digestion jälkeen. 3: Raaka vehnä suolistovaiheen digestion jälkeen. 4: Vehnämallas suolistovaiheen digestion jälkeen.

Kuva 5. Härkäpavun SDS-PAGE-analyysi. A: Raaka ennen digestiota. B: Idätetty ennen digestiota.

1: Raaka mahavaiheen digestion jälkeen. 2: Idätetty mahavaiheen digestion jälkeen.

(14)

Kuva 7. Härkäpavun SDS-PAGE-analyysi suolistovaiheen digestion jälkeen. 1: Raaka. 2: Idätetty.

Taulukko 1. Ohran, vehnän ja härkäpavun proteiinipitoisuus ja proteiinin in vitro pilkkoutuvuus.

Proteiini mg/g DM*

NPN ennen digestiota

mg/g

Proteiinityppi mg/g

NPN digestion

jälkeen mg/g

IVPD (%)

NPN typen kokonaismäärästä

digestion jälkeen (%)

Ohra 84,7

(0,06)

6,22 8,31 13,70 90,0 94,3

Ohramallas 92,7 (0,04)

7,21 8,69 15,22 92,2 95,7

Vehnä 120,9

(0,1)

5,85 14,88 19,80 93,8 95,5

Vehnämallas 128,5 (0,08)

9,2 12,84 21,31 94,3 96,7

Härkäpapu 266,9 15,6 27,10 39,0 86,3 91,3

Idätetty härkäpapu

307,3 (2,2)

21,4 27,77 44,4 82,8 90,3

NPN: non-protein nitrogen (muu kuin proteiinityppi); IVPD: In vitro protein digestibility (proteiinin pilkkoutuvuus); DM: Dry mass (kuiva massa).

*Keskiarvo (Keskihajonta). Härkäpavun proteiinipitoisuus yhdestä mittauksesta.

(15)

Taulukko 2. Ohra, vehnä, ja härkäpapunäytteiden vapaiden aminohappojen määrä ennen ja jälkeen in vitro digestion.

Sample Proteiinini määrä

ennen digestiota (µg/ml)

Vapaat aminohapot ennen digestiota

(µg/ml)*

Vapaat aminohapot digestion jälkeen

(µg/ml)*

Ohra 85 1,53 (1,45–1,60) 7,71 (7,40–8,71)

Ohramallas 92 4,77 (4,50–5,03) 8,28 (8,16–8,55)

Vehnä 61 0,08 (0,04–0,12) 5,06 (4,61–5,23)

Vehnämallas 64 2,60 (2,05–3,15) 6,27 (5,83–6,74)

Härkäpapu 213 7,99 (7,37–8,62) 11,20 (11,16–11,30)

Idätetty härkäpapu

214 8,44 (8,28–8,60) 12,21 (12,09–12,33)

*Mediaani (Minimi–maksimi).

1.4 POHDINTA

Tämä tutkimus pilotoi in vitro ruoansulatusmallia viljoilla ja palkokasveilla ja menetelmien optimointi oli suuri osa käytännön työtä. Työssä käytetty malli on aikaisemmin testattu maitotuotteilla, jotka ovat matriisiltaan huomattavasti yksinkertaisempia verrattuna viljaan ja palkokasveihin.

Työskentelyn aikana nousi esiin useita kohtia, joita tulisi jatkokehittää myöhempiä kokeita silmällä pitäen. Ensiksi viljojen rouhintaan tulisi käyttää myllyä tasakoosteisemman rakenteen saavuttamiseksi, minkä lisäksi partikkelikoon vaikutuksia on syytä arvioida. Toiseksi valittujen menetelmien kannalta oleellisen välineistön saatavuus pitää varmistaa, esimerkiksi ultrasentrifugi ja reagensseille soveltuvat sentrifugiputket. Kolmanneksi TCA-sakkautusmenetelmässä pH tulisi säätää kullekin näytteelle erikseen parhaan mahdollisen tuloksen saavuttamiseksi. Esimerkiksi ohran proteiinien erilaiset liukoisuudet (Arendt ja Zannini 2013) saattaa olla tämän tutkimuksen tuloksia vääristävä tekijä. Myöskään palkokasvien liukoisuus ei ole lineaarista, vaan heikoimmillaan se on pH:n ollessa 3–6 (Ghavidel ja Prakash 2006). Neljänneksi etenkin IVPD:n määrityksessä käytetyissä menetelmissä näytteiden siirtämisestä aiheutuva hävikki tulisi minimoida. Viidenneksi proteiinin määritys tulisi suorittaa ennen SDS-PAGE-analyysia sekä TNBSA-analyysia, jolloin sopivien

(16)

laimennosten määrittäminen on tarkempaa. Viimeiseksi käytetyistä entsyymeistä näytteisiin lisättävän typen määrä tulisi mitata. Näiden ja muiden haasteiden pohjalta tulevaisuudessa suositeltava suoritusjärjestys on: 1) Digestio 2) TCA-sakkautusmenetelmä 3) Typen määritys Kjeldahl-menetelmällä 4) TNBSA-analyysi 5) SDS-PAGE-analyysi.

Tästä tutkimuksesta saadut tulokset ovat varsin hyvin linjassa aikaisemman tutkimustiedon kanssa.

Proteiinipitoisuuden nousu on yleinen havainto kirjallisuudessa, vaikkakin myös laskua on raportoitu.

Idätyksen aikana tapahtuva varastoproteiinien pilkkoutumisen ja uusien proteiinien muodostumisen välinen nettovaikutus määrittää proteiinipitoisuuden muutoksia (Nkhata ym. 2018).

Proteiinipitoisuuden muutoksiin voivat vaikuttaa muiden yhdisteiden pilkkoutuminen itämisen seurauksena, jolloin proteiinin suhteellinen osuus nousee. Lisäksi mallastusprosessissa poistetaan juuri-idut (Kunze ja Hendel 2019). Kaikissa tutkimuksissa ei ole määritetty onko juuri-idut poistettu, mikä osaltaan heikentää tutkimusten vertailtavuutta.

Taulukosta 1 huomataan kaikilla näytteillä IVPD oli suhteellisen korkea ja erot idätettyjen ja raakojen tuotteiden välillä olivat pieniä. Vapaiden aminohappojen määrä taulukossa 2 ja muun kuin proteiinitypen määrä taulukossa 1 havainnollistavat, että ennen digestiota ohra- ja vehnämaltaissa proteiini vaikuttaisi olevan pilkkoutuneemmassa muodossa verrattuna raakoihin tuotteisiin. Ero heikkenee jonkin verran digestion jälkeen, mutta on silti olemassa. Havaittujen erojen tilastollisen merkitsevyyden testaamiseen tarvitaan kuitenkin enemmän näytteitä.

SDS-PAGE-analyysi vahvistaa havaintoa ohran ja vehnän korkeasta pilkkoutumisen asteesta digestion jälkeen. Mielenkiintoinen havainto ohran osalta on, että ennen digestiota suuren molekyylipainon alueella havaitaan vain heikosti erottuva ja epäselvä kaistale, vaikka tälle alueelle sijoittuvat hordeiinit ovat ohran runsaslukuisimpia proteiineja (Arendt ja Zannini 2013). Havainto selittynee sillä, että osa proteiineista on liukenemattomassa muodossa ja jäänyt kaivoihin.

Härkäpavun SDS-PAGE-analyysi vahvistaa, että osa proteiinista ei ole pilkkoutunut digestion aikana, sillä useita fragmentteja on havaittavissa 15 ja 37 kDa:n välisellä alueella. Nämä fragmentit ovat todennäköisesti legumiineja (Vogelsang-O'Dwyer ym. 2020), rakenteeltaan globuliineja olevia varastoproteiineja (González-Pérez ja Arellano 2009). Kyseisten fragmenttien puuttuminen mahavaiheen jälkeen selittynee niin ikään heikolla liukoisuudella pH:ssa 3.

Idättämisen vaikutusta ohran, vehnän ja härkäpavun proteiinien pilkkoutuvuuteen on tutkittu melko vähän. Tämän tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että idätys lisää IVPD:tä vähäisesti vehnällä ja ohralla, mutta heikentää härkäpavulla. Etenkin jälkimmäisen havainnon vahvistamiseksi tarvitaan lisää tutkimusta. Joidenkin viljojen ja palkokasvien tutkimusnäyttöä on hieman enemmän ja yleisesti

(17)

ottaen idättäminen on yksi tehokkaimmista prosessointikeinoista IVPD:n parantamiseen. Kaiken kaikkiaan niin tutkimustuloksissa kuin menetelmissäkin on paljon vaihtelua. INFOGEST-malli on kehitetty lisäämään tutkimusten vertailtavuutta käytetyn ruoansulatusmallin osalta (Brodkorb ym.

2019), mutta erilaisten menetelmien moninaisuus myös tulosten analysoinnissa on edelleen ilmeinen.

Esimerkiksi IVPD:n laskemiseen ei ole tällä hetkellä standardisoitua mallia. Nämä seikat korostavat tarvetta lisätutkimukselle ja menetelmien yhdenmukaistamiselle.

Tämän tutkimuksen tulosten ja aikaisemman tutkimustiedon perusteella idättämisellä ei ole suurta merkitystä proteiinin saannin kannalta länsimaisessa ruokavaliossa. Sillä on kuitenkin muita hyödyllisiä vaikutuksia, kuten ilmavaivoja aiheuttavien oligosakkaridien väheneminen (Vidal- Valverde ym. 1998), funktionaalisten ominaisuuksien ja aistittavan laadun paraneminen (A. k. Singh ym. 2015, A. Singh ja Sharma 2017) sekä kypsennysajan lyheneminen (Mridula ja Sharma 2015).

Idättäminen voisi siis osaltaan edesauttaa kasvipohjaisten proteiininlähteiden hyödyntämistä ja näin ollen siirtymää kohti kasvipohjaista ruokavaliota. Tutkimustiedon valossa kasvipohjainen ruokavalio edistää mm. sydän- ja verisuoniterveyttä (Satija ja Hu 2018) ja painonhallintaa (Turner-McGrievy ym. 2017).

Tämän tutkimuksen vahvuus oli, että ruoansulatuksen seurauksia arvioitiin kolmella menetelmällä, joka tarjosi laajemman kuvan proteiinin pilkkoutumisesta kuin pelkkä IVPD. Toinen vahvuus oli, että ruoansulatusmallina käytettiin INFOGEST-mallia, mikä parantaa vertailtavuutta muiden vastaavalla mallilla tehtyjen tutkimusten kanssa. Heikkoutena puolestaan oli vähäinen toistojen määrä ja näin ollen tilastollisen analyysin puute. Kaiken kaikkiaan tavoitteet saavutettiin, sillä menetelmillä saatiin loogisia tuloksia ja menetelmän kehitystyötä voidaan jatkaa tämän tutkimuksen havaintojen perusteella. Tutkimus valottaa myös useita mahdollisuuksia jatkotutkimukselle. Ensinnäkin tätä tutkimusta tulisi jatkaa tilastollisen analyysin suorittamiseksi. Lisäksi tutkimukseen voitaisiin sisällyttää lisämenetelmiä, kuten aminohappokoostumuksen määrityksen, mikä tarjoaisi laajemman kuvan idätyksen eduista proteiinin laadun kannalta. Myös erilaisia prosessointimenetelmiä, kuten kuumennuksen voisi sisällyttää tutkimukseen, sillä esimerkiksi härkäpapuja ei koskaan syödä raakana. Lisäksi INFOGEST-mallin yleistyessä systemaattinen kirjallisuuskatsaus tarjoaisi yhdenmukaisempaa tietoa idätyksen vaikutuksista.

(18)

1.5 JOHTOPÄÄTÖKSET

Tämän tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että mallastus ja idättäminen vaikuttavat positiivisesti vehnän ja ohran proteiinipitoisuuteen sekä in vitro proteiinin pilkkoutuvuuteen. Härkäpavulla idätys nosti proteiinipitoisuutta ja vapaiden aminohappojen määrää, mutta vähensi in vitro proteiinin pilkkoutuvuutta. Alhaisemmasta in vitro proteiinin pilkkoutuvuudesta huolimatta idätetty härkäpapu tarjoaa siis enemmän aminohappoja elimistön hyödynnettäväksi. Tuloksia pitää kuitenkin tarkastella varauksella, sillä lisää näytteitä tarvitaan tilastollisen merkitsevyyden osoittamiseksi.

Menetelmäkokonaisuus tarjoaa hyödyllisen kuvan proteiinien pilkkoutumisesta viljalla ja palkokasveilla, kun huomioidaan tässä työssä esille tulleet jatkokehittämistä vaativat seikat.

Lisäanalyysien avulla tätä kuvaa voidaan laajentaa entisestään. Lisäksi muiden prosessointimenetelmien, kuten kuumennuksen, vaikutuksia tulisi tutkia yhdessä idätyksen kanssa, sillä viljatuotteita ja palkokasveja harvoin nautitaan raakana.

(19)

2 INTRODUCTION & BACKGROUND

Animal-based products such as meat, dairy products and eggs are well-known sources of protein.

Meat and meat products, cereal products and dairy products cover 75% of protein intake in most European diets (EFSA NDA Panel, 2012). However, consumption of animal products has raised a debate about environmental, ethical, and health-related issues. This has increased interest towards alternatives, for example, sales of plant-based foods increased 29% from year 2017 to 2019 in the U.S. (The Good Food Institute, 2020), and the market is expected to continue growing (MarketsandMarkets, 2020; Statista, 2019). As demand towards plant-based protein sources increases, so does the interest towards different processing methods. Legumes are nutritious crops, but their average consumption in the world is only 21 g per day (Rawal & Navarro, 2019). Highest consumption is reported in South Asia and Sub-Saharan Africa. Efficient processing methods would enable higher usage of legumes and offer solutions to better nutrition worldwide.

Plants are complex food matrices and surprisingly little is known about the bioavailability of plant- based proteins especially in human gastrointestinal tract. In general, plant-based proteins are considered to have some limitations compared to animal-based proteins (EFSA NDA Panel, 2012).

Main shortcoming is the suboptimal levels of certain amino acids (Hughes, Kress, Armbrecht, &

Mattfeldt-Beman, 2012). Additionally, plants contain several antinutritional factors, which can hinder the bioavailability of nutrients, such as proteins (Gilani, Xiao, & Cockell, 2012). For example, trypsin inhibitors, tannins and phytic acid are found in cereals and legumes and they all can negatively affect protein digestibility with various mechanisms (Gilani et al., 2012; Sá, Moreno, & Carciofi, 2019). These aspects can be problematic if access to variety of foods is limited or plants are the only source of protein. However, combining different sources of plant-based proteins in diet balances the weaknesses in amino acid composition of single sources (Mariotti & Gardner, 2019).

Some components of plants can cause adverse effects to some individuals. For example, oligosaccharides can cause flatulence and gastrointestinal discomfort (Hall, Hillen, & Garden Robinson, 2017). Also, cereals containing gluten cause adverse effects to the individuals intolerant to gluten, such as people with celiac disease (Pilolli et al., 2019). On the other hand, plants have an abundance of beneficial components, such as vitamins, phenolic compounds (Freese & Voutilainen, 2015) and fiber (Mutanen & Voutilainen, 2015), and therefore increasing plant consumption should be encouraged.

(20)

2.1 Protein quality and in vitro methods

Several indices have been developed to evaluate the quality of protein, utilizing both in vivo and in vitro methods. Boye et al. (2012) have presented several of these indices in their review. Amino acid score (AAS) describes the amount of limiting amino acid compared to requirement pattern, being the simplest index to evaluate protein quality. Nonetheless, it does not take into consideration factors that might reduce the bioavailability. In vitro protein digestibility (IVPD) is a percentage of digested protein after in vitro gastrointestinal digestion. Protein digestibility corrected amino acid score (PDCAAS) combines the information of protein digestibility and AAS by multiplying the AAS with true fecal digestibility (%). Generally, the digestibility is obtained from in vivo method, but utilization of in vitro methods is possible as well (Tavano, Neves, & da Silva Júnior, Sinézio Inácio, 2016). More recent index, digestible indispensable amino acid score (DIAAS), has been recommended to replace PDCAAS by FAO (2013). The main benefits of DIAAS are that the digestibility is measured as true ileal digestibility and the index takes the indispensable amino acids into consideration.

In the human gastrointestinal tract, the digestion of protein begins in the stomach and continues in the small intestine (Mutanen & Voutilainen, 2015). Briefly, pepsinogen is secreted from the gastric chief cells and is activated in acidic conditions to pepsin. At best, 15 % of proteins are hydrolyzed to peptides and amino acids during the gastric phase. Chyme traversing to the duodenum contains undigested protein, large polypeptides, and free amino acids. The pancreas secretes trypsinogen (and other zymogens) to the duodenum where enteropeptidase activates it into trypsin, which activates other proteolytic enzymes. Final hydrolysis of oligopeptides into amino acids happens in the surface and inside enterocytes by different types of peptidases. Free amino acids traverse to liver through portal vein.

As mentioned earlier, protein digestibility is one factor used in the evaluation of protein quality.

Protein digestibility can be studied with in vivo animal studies or with in vitro models. Animal studies are often disadvantageous due to their laboriousness, cost, and ethical issues (Dupont et al., 2018).

Additionally, it is questionable, how well the results can be translated to humans (Bracken, 2009).

Several models have been developed to mimic the human GI-tract in vitro. These methods can be divided into static and dynamic models (Dupont & Mackie, 2016). Static models are usually conducted in a single compartment where enzymatic solutions are added as the simulated digestion progresses (Li, Yu, Wu, & Chen, 2020). Factors, such as, time, temperature, pH, and mixing are controlled. Slight variation in digestion parameters can, however, affect the comparability between different studies (Hur, Lim, Decker, & McClements, 2011; Li et al., 2020; Minekus et al., 2014). The COST INFOGEST network has developed a harmonized method as an answer to this problem

(21)

(Brodkorb et al., 2019). An adaptation of the INFOGEST model was used in the experimental part of this thesis and a schema of it is presented in chapter 3.1.2.

Dynamic models consist of one or multiple compartments (Li et al., 2020). As the name suggests, dynamic models aim to mimic the dynamic conditions of the GI-tract during digestion that static models fail to simulate. These conditions include, for example, flow, peristaltic movement, continuous secretion of digestive enzymes and changes in pH (Dupont et al., 2018; Guerra et al., 2012; Li et al., 2020). Consequently, the static models are a suitable tool in studies that require cheap and high throughput method, such as measuring IVPD, whereas dynamic models can offer more precise information throughout the digestion (Guerra et al., 2012). Different types of dynamic models have been reviewed by Guerra et al. (2012) and by Dupont et al. (2018). In vitro gastrointestinal models can be coupled with in vitro fermentation models to simulate the process of entire GI-tract, for example, TIM-1 and TIM-2 models (Dupont et al., 2018).

2.2 Germination and malting

Germination is an age-old method to improve nutritional quality of cereals and legumes by natural process that initiates the seed’s endogenous mechanisms to plant growth. Malting is a controlled germination process which includes kilning and removal of rootlets and in some cases roasting (MacLeod & Evans, 2016). In general, germination is a complex process with a plethora of different metabolic pathways and processes (Nonogaki, Bassel, & Bewley, 2010), but in malting, the main objective is the production of hydrolytic enzymes to be utilized during mashing in beer production process (Kunze & Hendel, 2019). The metabolism in malted grain is terminated due to low moisture.

However, germinated cereals and legumes can be consumed in fresh, metabolically active form (Benincasa, Falcinelli, Lutts, Stagnari, & Galieni, 2019). These products include, for example, shoots, microgreens, and wheatgrass.

Exposure to adequate moisture initiates the water uptake and thus the germination (Nonogaki, 2008;

MacLeod & Evans, 2016; Nonogaki et al., 2010). This phase is called steeping in the malting process, where grains are immersed in water 2–4 times and water is drained between immersions (MacLeod

& Evans, 2016). In the first phase of water uptake, cell walls and storage components are hydrated rapidly by imbibition (Nonogaki, 2008; Nonogaki et al., 2010). Rapid hydration of these matrices accelerates the seed’s metabolism and respiration begins within minutes (Nonogaki, 2008). Air rests between water immersions are crucial in the steeping process to supply the grain with oxygen and to eliminate carbon dioxide and heat produced by respiration (Kunze & Hendel, 2019). In addition, water distributes to non-respiring endosperm during air rests (MacLeod & Evans, 2016).

(22)

DNA and mitochondria are repaired, and protein synthesis is started using extant mRNA during the first phase of water uptake (Nonogaki, 2008) and energy metabolism stabilizes gradually (Nonogaki et al., 2010). These processes continue in the second phase, but water uptake stagnates (Nonogaki, 2008). In this phase, protein synthesis from new mRNA starts as well as minor mobilization of reserve compounds. During this phase, radicle protrudes through the outer layers of the embryo and senso stricto germination is completed. After that, water uptake, protein and DNA syntheses continue, reserves are mobilized in a large scale and radicle elongates.

In the malting process, steeping phase is ended when rootlets become visible and the batch is transferred to germination vessels, where moisture, air, and temperature conditions are maintained (Kunze & Hendel, 2019; MacLeod & Evans, 2016). During this phase, rootlets continue to grow, and hydrolytic enzymes are formed (MacLeod & Evans, 2016). When the rootlets reach a certain length, the process that would eventually lead to the growth of a plant is stopped by heat-drying the grains.

This phase is called kilning in the malting process and its main objective lower the moisture content to a level where the metabolism is terminated without destroying the enzymes (Kunze & Hendel, 2019). Rootlets are removed after kilning, which inevitably leads to some loss caused by the malting process.

The mobilization of reserve compounds by enzymatic activity during germination has an impact on nutritional values of cereals and legumes (Nkhata, Ayua, Kamau, & Shingiro, 2018). Due to hydrolysis of starch, germination causes an increase in sugar content and decrease in starch content (Benincasa et al., 2019; Nkhata et al., 2018). The loss of dry matter through the breakdown of storage components can result in relatively higher fiber content (Nkhata et al., 2018). Formation of new cell walls is another possible explanation for the increase of fiber content (Benincasa et al., 2019).

Germination has also been reported to increase the content of γ-aminobutyric acid, certain vitamins, and antioxidants. Also, reduction of antinutrients and improved bioavailability of minerals is widely reported (Benincasa et al., 2019; Nkhata et al., 2018). The high fiber content, increased antioxidant activity and a variety of phytochemicals indicate potential to have beneficial health effects, but more research is needed to provide evidence (Benincasa et al., 2019; Nelson, Stojanovska, Vasiljevic, &

Mathai, 2013). From the health point of view, one disadvantage of germination is the degradation of β-glucan in barley and oats (Benincasa et al., 2019). β-glucans have health claims authorized European Commission (Commission regulation (EU) no 1048/2012.; Commission regulation (EU) no 432/2012,).

Protein components are affected due to reserve mobilization during germination as well (Benincasa et al., 2019). For example, storage proteins are hydrolyzed, and new proteins are synthetized in the

(23)

growing parts of the seedling. Crude protein content depends on the balance of protein degradation and biosynthesis (Benincasa et al., 2019; Nkhata et al., 2018) and the outcome varies between different species and germination conditions (Benincasa et al., 2019; Nelson et al., 2013; Nkhata et al., 2018). Furthermore, germination is known to increase the amount of free amino acids and alter the amino acid composition, which are affected by species and germination conditions as well (Benincasa et al., 2019). In addition, increased protein digestibility has been reported (Nkhata et al., 2018).

2.3 The objective of this study

The aim of this study is to evaluate, how malting and germination affect protein digestibility of barley (Hordeum vulgare), wheat (Triticum aestivum) and faba bean (Vicia faba L.). The literature review concentrates on the effects of germination on protein content and digestibility of cereals, legumes, and pseudo-cereals with special emphasis on barley, wheat and faba bean, as they are studied in the experimental part of this thesis. Protein content, in vitro protein digestibility, SDS-PAGE analysis, and the amount of free amino acids of barley, wheat and faba bean and their malted or germinated counterparts are studied in the second, experimental part. Also, setting the methodology to study the quality of protein is discussed.

3 LITERATURE REVIEW

3.1 Search protocol

The search protocol for the literature review is presented in Figure 1. First search was conducted using PubMed-database to investigate, what is known about in vitro protein digestibility of wheat, barley and faba bean. A following search statement was used:

((in vitro protein digest*[Title/Abstract] OR simulated protein digest*[Title/Abstract] OR in vitro gastrointest*[Title/Abstract] OR simulated gastrointest*[Title/Abstract])) AND (wheat[Title/Abstract] OR Triticum aestivum[Title/Abstract] OR barley[Title/Abstract] OR hordeum vulgare[Title/Abstract] OR faba bean[Title/Abstract] OR fava bean[Title/Abstract] OR broad bean[Title/Abstract] OR vicia faba[Title/Abstract])

The second search was conducted using PubMed-database to investigate the impact of germination on protein digestibility of cereals and legumes with a following search statement:

(((cereal* OR grain* OR legume* OR pulse* OR wheat[Title/Abstract] OR triticum aestivum[Title/Abstract] OR barley[Title/Abstract] OR hordeum vulgare[Title/Abstract] OR faba bean[Title/Abstract] OR fava bean[Title/Abstract] OR broad bean[Title/Abstract] OR vicia faba[Title/Abstract])) AND (malt[Title/Abstract]

OR malte*[Title/Abstract] OR malti*[Title/Abstract] OR germin*[Title/Abstract] OR sprout*[Title/Abstract])) AND protein[Title/Abstract] AND digest*[Title/Abstract]

(24)

The second PubMed-search was complemented with similar search using Web of Science -database but the search result was limited to studies published from the year 2000 to present day:

TOPIC: (cereal* OR grain* OR legume* OR pulse* OR wheat OR triticum aestivum OR barley OR hordeum vulgare OR faba bean OR fava bean OR broad bean OR vicia faba) AND TOPIC: (in vitro protein digest*) AND TOPIC: (malt OR malte* OR malti OR germin* OR sprout*)

Additionally, several articles were handpicked from the references of relevant articles. Articles without access to full text in English were excluded.

Figure 1. Search protocol.

3.2 Protein digestibility of wheat (Triticum aestivum) and durum wheat (Triticum durum)

An overview of wheat (T. aestivum) and durum wheat (T. durum) is presented in Table 1. The protein content tends to be slightly higher in germinated wheat. Two studies indicate that germination has a minor negative effect on IVPD, whereas one study has reported a considerable increase in germinated wheat.

Montemurro et al. (2019) reported that germination significantly improved IVPD and decreased the concentration of condensed tannin and phytic acid in durum wheat. Also, a significant increase of total free amino acids was observed with nearly tenfold increase from 760 to 7033 mg/kg. However,

(25)

the highest IVPD was achieved with sourdough fermentation alone. The decrease of phytic acid is an agreement with Singkhornar et al. (2013). They also discovered significantly higher protein content in germinated wheat, which is an agreement with Zhu et al. (2017). Similar results have been reported in other studies as well (Kavitha & Parimalavalli, 2014; Lemar & Swanson, 1976; Ranhotra, Loewe,

& Lehman, 1977).

Hung et al. (2012) studied the effect of germination time on amino acid composition of waxy wheat.

They discovered a significantly higher concentration of every amino acid during the germination.

However, the duration of germination affected the concentrations. For example, the concentration of lysine was highest after 6 and 24 h, but the concentration decreased below the initial level after 48 hours. The amount of total free amino acids increased significantly from 2207 to 7881 mg/kg after 48 h germination, which is in line with the observations from durum wheat by Montemurro et al.

(2019) and wheat by Tkachuk (1979). Tkachuk (1979) also discovered that the concentration of lysine increased throughout the germination process.

Digestion of wheat and durum wheat proteins release resistant peptides that can cause adverse effects to some individuals (Graziano et al., 2019; Mamone et al., 2015; Pilolli et al., 2019; Prandi et al., 2014; Smith et al., 2015). Germination has been studied as a method to decrease the number of these peptides after digestion (Boukid, Prandi, Buhler, & Sforza, 2017; Boukid, Prandi, Vittadini, Francia,

& Sforza, 2018). Germination of durum wheat appeared to significantly reduce the amount of both immunogenic and toxic gliadin originated peptides after in vitro digestion. However, these peptides were still present and thus consuming germinated wheat is not safe for individuals with celiac disease.

The germination time affected the amount of detected peptides and the most notable degradation was observed after 6 days (Boukid et al., 2018). This finding is in line with results from Koehler et al.

(2007) who detected that gluten of common wheat substantially degraded during 7 days of germination and total gliadins started to degrade after 4 days.

Germinated wheat has been utilized to improve the nutritional quality of different types of food products. Świeca et al. (2017) discovered a significantly higher relative protein digestibility and the amount of free amino acids and peptides in sprouted wheat flour compared to raw. However, the addition of sprouted flour did not affect the relative protein digestibility in breads, and the addition in fact significantly lowered the amount of free amino acids and peptides. Addition of sprouted flour increased the protein content significantly when 10–20% wheat flour was replaced. Nevertheless, IVPD was significantly reduced in these breads.

(26)

Addition of prolyl endopeptidase or enzymes produced by lactic acid bacteria has been reported to decrease immunoreactive peptides during bread making and in vitro digestion (Brzozowski, 2018).

In fact, sourdough fermentation with the addition of proteases can be used to produce gluten-free wheat bread (Rizzello et al., 2007). This type of bread has been reported to have significantly higher IVPD than wheat containing bread and commercial gluten free breads (Rizzello, Montemurro, &

Gobbetti, 2016). The addition of bacteria originated phytase into wheat flour has been observed to effectively increase IVPD (Tripathi, A, & Kapoor, 2018). High-phytase yeast is also a potential method to reduce phytate in wheat products (Haraldsson, Veide, Andlid, Alminger, & Sandberg, 2005). Baking on the other hand, reduces wheat gluten digestibility and solubility (Smith et al., 2015).

However, heat treatment of wheat products has been reported to lower the wheat’s allergenicity when compared to raw flour (de Gregorio et al., 2009). Replacing some of the wheat with gluten-free cereal flour is also a promising way to reduce the adverse effects of wheat products (Susanna &

Prabhasankar, 2012). Additives such as hydroxypropylmethyl cellulose, xanthan gum or locust bean gum can be added to improve pasting properties, texture, and sensory quality, even though these additives tend to lower IVPD.

Whole wheat flour can be fractioned to process branny fraction separately to acquire nutritional improvement of whole wheat products (Demir & Elgün, 2014). Stabilization of branny fraction with autoclaving, microwaving, infrared and ultraviolet C irradiation were discovered to significantly increase wheat bread’s IVPD and decrease its phytic acid content. IVPD of wheat products can also be improved by the addition of other type of cereal bran or husk (El-Moniem, 1994). Fermentation with added xylanase is also an effective way to achieve higher IVPD of different types of bran (Pontonio et al., 2020). Along with higher IVPD, supplementation of wheat bread with fermented bran significantly improve several nutritional characteristics, such as protein, fiber, ash, and total phenolic contents.

Mandalari et al. (2018) reported that particle size affects the digestibility of durum wheat porridges, the smallest particle size being the most digested. Furthermore, storing conditions can affect IVPD.

Rehman & Shah (1999) reported a decrease in lysine content and IVPD of wheat in 25 and 45℃

temperatures, whereas only minor changes were observed at 10℃. Cultivar is also an important factor in wheat IVPD. Gulati et al. (2020) reported significantly higher IVPD in modern cultivars compared to historical cultivars.

(27)

Table 1. Effects of malting/germination on protein content and in vitro protein digestibility of wheat (Triticum aestivum) and durum wheat (Triticum durum).

Reference Germination

conditions

Protein content % IVPD %

R G R G

Ranhotra et al., 1977 Hard red winter wheat (NS)

3–5 d, 23℃ 13.58 15.08

Lemar & Swanson, 1976 Wheat (NS) 1–3 d, 30℃ 12.30 12.83–13.13

Rehman & Shah, 1999 Wheat (NS) 74.68

Hung et al., 2012 Waxy wheat

6–48 h, 30℃ 15.4 15.5–15.7

Susanna & Prabhasankar, 2012

Durum wheat

10.83

Singkhornart et al., 2013 Wheat (NS) 25℃ 13.26 14.13

Demir & Elgün, 2014 Wheat (NS) 13.1

15.0 Kavitha & Parimalavalli,

2014

Wheat (NS) 10.02 14.10

Laxmi, Chaturvedi, &

Richa, 2015

Wheat 48 h 12.1 12.2

Boukid et al., 2017 Durum wheat

8 d, 25℃ 12.88–19.72 12.93–20.07 Raimondi et al., 2017 Fresh

durum wheat sprouts

6 d, 25℃ 12.6

Świeca et al., 2017 Wheat 4 d, 20℃ 12.68 13.04 51.74 51.06

Zhu et al., 2017 Hard winter wheat (NS)

48 h, 25℃ 15.36 15.93 93.38 92.13

Mandalari et al., 2018 Durum wheat

35.1–62.6

Tripathi et al., 2018 Wheat 11.2 48.83

Montemurro et al., 2019 Durum wheat

3 d, 16.5°C 17.46 17.34 52.6 78.9

IVPD: In vitro protein digestibility. R: Raw; G: Germinated; NS: scientific species not specified.

Bolded numbers indicate statistically significant differences between raw and germinated wheat.

3.3 Protein digestibility of barley (Hordeum vulgare)

An overview of barley (H. vulgare) is presented in Table 2. As the table indicates, protein content varies between 11.4–14.2% and 10.4–13.61% in native and germinated barley, respectively.

Additionally, germination appears to increase protein digestibility.

Bai et al. (2018) reported that untreated hull-less barley contained 11.4 g/100 g of crude protein and that lysine was the first limiting amino acid with a concentration of 0.39 g/100 g of flour with an AAS of 0.61. The IVPD was 72.30% and the IV-PDCAAS 44.44%. Montemurro et al. (2019) discovered a statistically significant increase of IVPD with barley from 54.5 to 83.7% after germination. A slight

(28)

decrease in protein content was observed as well as a significant increase in total free amino acid content from 1475 to 8119 mg/kg. A significant reduction of phytic acid was also reported.

Singkhornart, Gu, & Ryu (2013) reported a higher protein content in barley after germination. Also, a significant decrease in phytic acid content and a significant increase in protease activity were reported as affected by germination. Chung, Nwokolo, & Sim (1989) did not discover a difference in the protein content in raw and sprouted barley, but they reported a significant increase in lysine content after sprouting. They also reported significantly higher in vivo protein digestibility with rats.

However, Beloshapka et al. (2016) reported distinctly lower lysine content in malted barley than in any other barley products.

Germinated barley has been used as an ingredient of food products and germination is often combined with other processing techniques (Arora, Jood, & Khetarpaul, 2010; Bai et al., 2018; Montemurro et al., 2019; Singkhornart et al., 2013). Gahlawat & Sehgal (1994) compared the protein digestibility of weaning mixes based on roasted or malted products. For both wheat- and barley-based weaning mixes a significantly increased IVPD was observed. Malting also improved IVPD more effectively than roasting. Arora, Jood, & Khetarpaul (2010) investigated the effects of different processing techniques on barley-based food mixtures. The germination alone resulted significantly higher protein content compared to a product that were germinated, autoclaved, and fermented. Additionally, the amount of lysine increased as an effect of germination and the highest lysine content was measured from the germinated, autoclaved, and fermented food mixture. Montemurro et al. (2019) reported the highest IVPD of barley from combination of germination and sourdough fermentation. Other techniques can be used to increase IVPD of barley, for example infrared heating and tempering (Bai et al., 2018).

(29)

Table 2. Effects of malting/germination on protein content, in vitro protein digestibility and content of some antinutritional factors of barley (Hordeum vulgare).

IVPD: In vitro protein digestibility; TIA: Trypsin inhibitor activity; TIU: Trypsin inhibitory units; R: Raw; G: Germinated; NS: scientific species not specified; DM: Dry mass.

Bolded numbers indicate statistically significant differences between raw and germinated barley. *In vivo protein digestibility.

Reference Germination

conditions

Protein content % IVPD % Lysine Condensed tannins

(mg/g of sample)

TIA (TIU/mg of sample)

Phytic acid/phytate (g/100 g of sample)

R G R G R G R G R G R G

Chung et al. 1989 Barley (NS) 6 d, 22℃ 11.85 11.85 65.28* 79.69* 0.32 (%

of protein)

0.40

Singkhornart et al., 2013

Barley (NS) 25℃ 11.89 12.43 <1.2 <1.0

Beloshapka et al., 2016

Barley 13.5 0.06

% of DM Raimondi et al.,

2017

Fresh barley sprouts

6 d, 25℃ 10.4

Bai et al., 2018 Hull-less barley (NS)

11.4 72.3 0.39 (g /

100g flour)

1.99 1.25

Montemurro et al., 2019

Barley 3 d, 16.5°C 14.02 13.61 54.5 83.7 0.26 0.24 0.82 0.78 0.73 0.36

(30)

3.4 Protein digestibility of faba bean (Vicia faba L.)

An overview of faba bean (V. faba L.) is presented in Table 3. Protein content in germinated faba bean tends to be higher than in raw. Germination seems to increase IVPD and has a clear impact on antinutritional factors.

Sulphur containing amino acids, i.e. methionine and cysteine, are the first limiting amino acids in faba bean (Alghamd, 2009; Nosworthy et al., 2018). Additionally, tryptophan has been reported to be the first limiting amino acid in some cases (Nosworthy et al., 2018; Setia et al., 2019). Setia et al.

(2019) discovered that after germination threonine was the first limiting amino acid. In the same study a significant increase in IVPD after 72 h germination was reported. However, the increase did not significantly affect IV-PDCAAS which was 56.2 % before and 56.5 % after germination. One older study reported minor decrease in the proportion of methionine, cysteine, and threonine from the total amount of amino acids after germination (Hsu, Leung, Finney, & Morad, 1980). Khalil (2001) reported a slight decrease of cysteine and an increase of tryptophan and threonine after germination.

Di Stefano et al. (2019) reported a significant increase in degree of protein hydrolysis after 5 d germination in faba bean, however, the difference was not significant after simulated gastrointestinal digestion.

Khalil (2001) observed a significant increase in true digestibility of protein in vivo with germinated faba bean. The number increased 10 %-units from 78 to 88% and was close to the casein control diet which was 92%. Protein efficiency ratio and biological value were also improved significantly after germination. Another in vivo study demonstrated a significantly improved apparent nitrogen digestibility in faba bean based diet, which increased from 53.6 to 58.3% due to germination, and net protein utilization, which increased from 61 to 75% (Rubio, Muzquiz, Burbano, Cuadrado, &

Pedrosa, 2002). Germination also improved apparent ileal digestibility of all amino acids studied.

These findings are in line with another in vivo study, where germinated faba bean product exhibited better protein efficiency ratio, true nitrogen digestibility, biological value, and net protein utilization than other two products (Bakr & Bayomy, 1997). Rubio (2003) has reported similar results with other in vivo studies.

Germination has been reported to affect the amounts of antinutritional factors in faba bean. Setia et al. (2019) observed a significant reduction in contents of condensed tannins and phytic acid, and in the activity of trypsin inhibitor. These findings are in line with other studies (Kassegn, Atsbha, &

Weldeabezgi, 2018; Khalil, 2001; A. Sharma & Sehgal, 1992). The reduction has been reported to be up to 75% for phytic acid (Khalil, 2001), 65% for TIA and from 80 to 91% for tannins (Kassegn et

(31)

al., 2018; A. Sharma & Sehgal, 1992). Vidal-Valverde et al. (1998) reported a 45% reduction of phytic acid after germination.

Fermentation is an effective method to improve the utilization of faba bean protein. Coda et al. (2017) discovered that complementing wheat bread with faba bean increased protein content. The addition of sourdough fermentation to the process improved IVPD and nutritional quality indices such as essential amino acid index (EAAI), biological value (BV), protein efficiency ratio (PER), and nutritional index (NI). The increase of IVPD and BV were statistically significant. These results are in line with discoveries by Sozer et al (2019). They obtained significantly higher IVPD, protein score, EAAI, BV and NI from bread made of sourdough pre-fermented faba bean flour compared to breads from unfermented faba bean and soybean flours. Similar results have been reported by Rizzello et al.

(2017) with pasta fortified with fermented faba bean. Verni et al. (2019) discovered that lactic acid fermentation increased IVPD and concentration of free amino acids of faba bean flour. Several bacterial strains can induce positive effects on IVPD and reduction of antinutritional factors (Rizzello et al., 2019). Rosa-Sibakov et al. (2018) reported slight, insignificant decrease of phytic acid after 24 h fermentation of faba bean. Compared to this result, phytase treatment of native faba beans proved to be a more effective method to reduce phytic acid. The phytase treatment also increased protein solubility in the lower end of the pH-scale and improved IVPD especially during the gastric phase.

Contradictory to previous results, Chandra-Hioe et al. (2016) did not discover significant differences in IVPD or TIA between native and fermented faba beans.

Another method for more effective utilization of faba bean protein is fractionation. Vogelsang- O'Dwyer et al. (2020) compared the IVPD of dry fractioned protein-rich faba bean flour, acid extracted protein isolate and dehulled flour. The isolate demonstrated significantly higher IVPD and lower TIA. However, protein solubility of the dry fractioned product was higher. A combination of air classification and fermentation has been studied by Coda et al. (2015). Fermentation significantly improved IVPD of unfractioned faba bean flour and starch rich fraction. TIA was significantly reduced in flour and protein rich fraction after germination. Amount of tannins, vicine and convicine were reduced in flour and both fractions after fermentation. Fermentation did not affect the phytic acid content, which was, however, significantly lower in starch rich fraction.

Impacts of extrusion, boiling and baking on faba bean protein quality were studied by Nosworthy et al. (2018). Baking resulted highest AAS, DIAAS and IVPDAAS values despite lower IVPD.

Sulphur-containing amino acids were limiting amino acid after all treatments, and additionally tryptophan for cooked faba bean. Cooking has been reported to significantly decrease tannin and phytic acid content of faba bean and increase IVPD (A. Osman et al., 2014). In addition to heating,

(32)

soaking in sodium carbonate has been reported to reduce tannin content and improve IVPD (Babiker

& el Tinay, 1993). Furthermore, citric acid soaking in combination with cooking and dry-heating without soaking have been observed to significantly decrease phytic acid content (Vidal-Valverde et al., 1998). Alonso et al. (2000) reported that dehulling, soaking and extrusion significantly reduced the amount of condensed tannins in faba bean. Furthermore, soaking and extrusion significantly reduced phytic acid content, whereas it was increased after dehulling. Dehulling excluded, all the treatments significantly improved IVPD, extrusion being the most effective. Dehulled faba bean in fact had higher TIA, chymotrypsin inhibitor activity, and a-amylase inhibitor activities than raw seeds whereas all other treatments lowered them.

Soaking, autoclaving, and cooking have been reported to decrease the amount of phytic acid in faba bean (Khalil, 2001). This was also demonstrated with in vivo experiment with rats, as all the treatments significantly improved PER, true digestibility (TD) and BV of the diet of rats compared to raw faba bean. A study focused on hydrothermal treatments reported that annealing significantly improved IVPD of faba bean. (Chávez-Murillo, Veyna-Torres, Cavazos-Tamez, de la Rosa-Millán,

& Serna-Saldívar, 2018). Microwave treatments have also been reported to affect IVPD (Pysz, Polaszczyk, Leszczyńska, & Piątkowska, 2012). IVPD increased and TIA decreased as the soaked faba beans were subjected to higher amounts of energy. However, increase in the energy also decreased protein solubility. Khatoon & Prakash (2004) reported 77,4 % IVPD for faba bean, which was slightly but significantly lower than pressure cooked faba beans. The study did not report the IVPD of raw product. Cultivation conditions can affect IVPD of faba beans as Babiker et al. (1995) have reported. Nitrogen fertilization and fixation caused an increase in protein content with a slight decrease in IVPD. Additionally, viral infection was reported to decrease IVPD.

In vitro digestion of malts and germinated faba beans - setting the methodology