yhteistransfektioon Gpx-4-geenin kanssa ja katsottiin vaikuttaako se SOD1:n esiintyvyyteen ja aktiivisuuteen näytteissä. Gpx-4 on solun normaaliin hapetus-pelkistys-tasapainoon vaikuttava antioksidantti, jota yli-ilmentämällä solussa on pystytty vaikuttamaan SOD1:n aiheuttamaan toksisuuteen (Lu L. ym. 2009).
Kuvassa 13 on esitetty yhteistransfektion jälkeisiä paraquat-käsittelyn tuloksia verrattuna kontrolliin. SOD1-transfektoituja soluja oli ennen paraquat-käsittelyä elossa n. 20 % vähemmän kuin kontrolliryhmässä. SOD1+Gpx-4 -geenejä yli-ilmentävässä ryhmässä soluja oli elossa ennen käsittelyä n. 30 % vähemmän verrattuna kontrolliryhmään, mutta kuitenkin enemmän kuin Gpx-4-ryhmässä. Kaikissa ryhmissä paraquat-käsittelyn jälkeen kuoli noin puolet soluista. Gpx-4 yhteisilmentyminen SOD1:n kanssa ei siis näyttänyt vaikuttavan positiivisesti solujen määrään, kuten hypoteesimme oletti.
kuva 13. Transfektoitujen solujen elinkykyisyysmittaus paraquat-käsittelyn jälkeen.
0 10000 20000 30000 40000
Kontrolli SOD1 Gpx4 SOD1+Gpx4
Resazurin yksiköt
cntr PQ
Kuvan 14 kohdassa A on esitetty immunoblotit ja -aktiinin määrä näytteissä.
Näytteiden SOD1-proteiinin ilmentyminen on saatu esille SOD1-vasta-aineen avulla.
Tulokset on esitetty kuvaajassa 14 B. Kuten odotettiinkin, niin SOD1-ilmentyminen on korkein näytteissä, jotka yli-ilmentävät SOD1-geeniä (n. 2-kertainen). Hieman vähemmän proteiinia on SOD1+Gpx-4 -näytteessä. Kontrolliakin vähemmän SOD1-proteiinia on näkyvissä näytteessä, joka yli-ilmentää vain Gpx-4-geeniä. Erot Gpx-4- ja kontrollinäytteen välillä ovat kuitenkin hyvin pienet, mikä saattaa vääristää tulosta.
Kuvaajassa 14 C on esitetty 4-vasta-aineen avulla esille saadut tulokset. Eniten Gpx-4-proteiinia on näytteessä, joka yli-ilmentää Gpx-Gpx-4-proteiinia (n. 2-kertaisesti). Toiseksi eniten ja yhtä paljon Gpx-4-proteiinia on näytteissä, jotka sisältävät SOD1-geenin. Vaikka Gpx-4-proteiini ilmentyminen pystyttiin toteamaan 2-kertaiseksi, ei saman proteiinin pelastavaa vaikutusta SOD1-toksisuuteen havaittu yhteistransfektoidussanäytteessä.
Kuva 14. Western blot -analyysin tulokset. Solulysaattinäytteiden proteiinimäärät on suhteutettu -aktiinin määrään. (A) Blotit vasta-aineilla Gpx-4, SOD1 ja niiden suhteellinen -aktiinin määrä. (B) SOD1-vasta-aineella esille saadut SOD1-proteiinipitoisuudet näytteissä. (C) vasta-SOD1-vasta-aineella esille saadut Gpx-4-proteiinipitoisuudet näytteissä.
Zymografiaa varten näytteet laitettiin geelille -aktiinin määrien mukaan eli eri näytteissä oli oletettavasti samat proteiinimäärät. Tämän vuoksi proteiinimäärä ei vaikuta aktiivisuuteen vaan havaittu entsyymi-aktiivisuus on todellinen. Kuvassa 15 näkyy, että SOD1 on kaikkein aktiivisin näytteessä, joka yli-ilmentää SOD1-geeniä. Toiseksi aktiivisin se on kontrollinäytteessä. Himmeimmin geelillä näkyy näyte, jossa yli-ilmennetään Gpx-4-geeniä. Gpx-4-näytettä aktiivisemmin SOD1 näkyy näytteessä, johon tehtiin yhteistransfektio (SOD1+Gpx-4). Yhteistransfektio siis näytti hypoteesin mukaisesti vähentävän SOD1-aktiivisuutta solulysaattinäytteessä.
Kuva 15. Zymografia SOD1-aktiivisuuden tarkastamiseksi näytteissä.
6 POHDINTA
Pro Gradu -tutkielman tarkoituksena oli selvittää, onko yli-ilmennetty villityypin SOD1 toksinen liikehermosoluille ja/tai herkistääkö se käytetyt NSC-34-solut hapetusstressille.
Lisäksi pyrittiin selvittämään, voiko näihin mekanismeihin vaikuttaa ilmentämällä solujen hapetus-pelkistys-tasapainoon vaikuttaa glutationiperoksidaasi-4:a samanaikaisesti SOD1:n kanssa. Kun tutkimussuunnitelma työlle tehtiin, ei villityypin SOD1:n vaikutuksista motoneuroneille tiedetty vielä paljoa.
Transfektion optimointi suoritettiin professori Koistinahon ryhmässä aiemmin tehtyjen alustavien kokeiden perusteella. Tulokset viittasivat siihen, että liposomi-välitteinen transfektio ei mahdollisesti ollut riittävän tehokas menetelmä. Neon elektroporaation pitäisi valmistajan mukaan soveltua myös herkille ja vaikeasti transfektoitaville soluille, koska toisena elektrodina toimiva kärki on kultaa eikä sillä siten pitäisi olla toksisia vaikutuksia.
Transfektion optimoinnista saadut tulokset olivat selviä: lipofektamiini-välitteinen
transfektio oli hellempi soluille, mutta n. 7 %:n transfektiotehokkuus jäi paljon alle elektroporaation tarjoaman parhaimmillaan 45 %:n tehokkuuden. Virtaussytometrilla mitattuja näytteitä ei siivilöity, joten jotkut solut voivat esiintyä dupletteina. Tämän ei kuitenkaan pitäisi vaikuttaa muuten niin selvään tulokseen.
Tutkiaksemme eri geenien yli-ilmentämisen sekä sen jälkeen niille aiheutetun hapetusstressin vaikutuksia solujen elinkykyisyyteen, altistimme transfektoidut solut paraquat-kemikaalille. Tämän käsittelyn pitäisi lisätä soluissa superoksidin tuottoa.
Solujen elinkykyisyysmittauksissa paraquat-käsittely laski elävien solujen elinkykyisyyden puoleen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. SOD1:n yli-ilmentämisellä nähtiin toksisemmat vaikutukset soluille verrattuna SOD2:ta yli-ilmentäviin ja kontrolliryhmän soluihin. Toisinaan paraquat-käsittelyn tehokkuudessa oli eroja, mitkä voivat johtua solulaskusta tai solujen kasvunopeudesta, mikä vaihtelee sen mukaan miten konfluentiksi solut päästää kasvamaan. Tulos oli kuitenkin aina samanlainen, vain tehokkuus vaihteli.
Tämä tukee liialliseen SOD1-aktiivisuuteen liittyvää hypoteesia, minkä mukaan liiallinen SOD1-aktiivisuus nostaa vetyperoksidin määrää, joka toimii hapettimena ja näin aiheuttaa lisää hapetusstressiä. Jos tämä reaktio tapahtuu mitokondriossa, voi seurauksena olla mitokondrion vaurioita. Goldsteins G. ym. (2008) tekemässä tutkimuksessa superoksidien lisääntyminen mitokondrioiden välitilassa, nosti myös SOD1-aktiivisuutta, mikä viittaa vahvasti liialliseen SOD1-aktiivisuuteen liittyvän hypoteesin paikkansa pitävyyteen.
Villityypin SOD1-proteiinin on myös huomattu aiheuttavan samanlaista stressiä soluille, kuin mutatoituneenmuodon (Graffmo K. ym. 2012; Prudencio M. ym. 2010). Sen on myös havaittu lisäävän mutantin toimintaa. Tuloksistamme voidaan päätellä, että villityypin SOD1 on toksinen käytetyille NSC-34-soluille.
SOD1 toksisen vaikutuksen varmistamisen jälkeen tutkimme proteiinin esiintymistä sekä aktiivisuutta NSC-34-soluissa. Tulosten kvantitointi kalvolta tuotti välillä vaikeuksia signaalin epätasaisuuden vuoksi. Usein kvantitointiohjelma antoi useita vyöhykearvoja, joista piti arvioida blottia vastaava luku. -aktiiniin perustuvaa kvantitointia parempi voisi olla Coomassie-värjäys, jolloin kvantitoitavaksi alueeksi voi valita laadullisesti parhaan.
Zymografiakuvia ei kontrastin heikkouden vuoksi kvantitoitu vaan geelillä olevien näytteiden aktiivisuuden arviointi perustuu silmämääräiseen arviointiin.
SOD2-proteiinia oli odotusten mukaisesti eniten näytteessä, johon oli transfektoitu SOD2-geeni. Sama havaittiin SOD1-proteiinin kohdalla eli näytteessä, johon oli transfektoitu SOD1-geeni, oli eniten SOD1-proteiinia. SOD2:ta käytettiin kokeissa positiivisena vertailukohteena kontrollin rinnalla. SOD1-aktiivisuutta on eniten näytteessä, johon oli transfektoitu SOD2-geeni. Ero SOD1-aktiivisuudessa näytteiden SOD1 ja -2 välillä ei kuitenkaan ole huomattavan suuri. Tulos kertoo, että kyseiset proteiinit ovat esiintyessään myös aktiivisessa muodossa eli ne on pystytty onnistuneesti laskostamaan aktiiviseen muotoon.
Gpx-4-vasta-aine osoittautui hyvin huonoksi. Sillä oli hankala saada minkäänlaista immunoreaktiivisuutta esiin ja tuloksena usein olikin aivan tyhjä blotti. Tämän vuoksi kyseisellä vasta-aineella saadut tulokset eivät välttämättä ole kovinkaan luotettavia.
Toisaalta bloteista saadut tulokset näyttivät uskottavilta, epäluotettavuus liittyi enemmän kvantitointiin korkean taustan vuoksi.
Hypoteesi oli, että Gpx-4 yhteistransfektio SOD1:n kanssa pelastaisi soluja solukuolemalta eli näytteessä, johon transfektoitiin SOD1+Gpx-4, pitäisi olla enemmän soluja elossa kuin näytteessä, johon transfektoitiin pelkkä SOD1. Gpx-4-geenin ja sen tuottaman proteiinin ei pitänyt olla toksinen soluille (Lu L. ym. 2009). Toisin kuin hypoteesimme oletti, SOD1+Gpx-4 yhteistransfektoidussa näytteessä on elossa vähemmän soluja kuin pelkässä SOD1-transfektoidussa näytteessä. Gpx-4:n ilmentäminen ei siis pelastanut soluja SOD1 yli-ilmentämisen aiheuttamalta toksisuudelta, toisin kuin aiemmin Lu L. ym. (2009) tekemässä tutkimuksessa retinan soluilla, missä Gpx-4-ekspressio kumosi osan SOD1-toksisuudesta. Samassa tutkimuksessa todetaan, että antioksidattisysteemin komponenttien yli-ilmentämisellä on erilaisia vaikutuksia eri solutyypeistä ja oksidatiivisen stressin luonteesta riippuen. Näyte, johon transfektoitiin Gpx-4-geeni, näyttää sisältävän vielä vähemmän soluja kuin yhteisilmentävänäyte. Tämä tulos toistui monta kertaa, joten se voisi kertoa esimerkiksi itse transfektion aiheuttamasta toksisuudesta tai plasmidissa mahdollisesti olevasta kontaminaatiosta. Kontaminaatioriski tosin on hyvin pieni, koska kaikki käytetyt plasmidit on eristetty samalla kertaa. Western blot -analyysin tulos kuitenkin näyttää, että pelkän Gpx-4-geenin sisältävä näyte sisältää myös kyseistä proteiinia kaksinkertaisesti muihin näytteisiin verrattuna. Samassa kuvassa nähdään kuitenkin, että pelkkä SOD1-näyte ja yhteistransfektoitu (SOD1+Gpx-4) -näyte sisältävät Gpx-4-proteiinia saman verran, vaikka yhteistransfektoidunnäytteen pitäisi
sisältää Gpx-4-proteiinia pelkkää SOD1-transfektoitua näytettä enemmän. Käytetty blotti on kontrollin laidalta hyvin haalea, mikä voi vaikuttaa saatuihin tuloksiin. Zymografiakuva osoittaa, että SOD1-proteiini oli kaikkein aktiivisin näytteessä, johon transfektoitiin pelkkä SOD1-geeni. Lisäksi odotusten mukaisesti kuvassa näkyy myös, että SOD1 on aktiivisempi kontrollinäytteessä kuin yhteistransfektoidussanäytteessä. Gpx-4 voisi mahdollisesti vähentää SOD1-aktivaatiota, jos sillä on protektiivista eli suojelevaa vaikutusta SOD1-toksisuudelta. Joten vaikka emme pystyneet näyttämään yhteistransfektion pelastavaa vaikutusta solujen elinkykyisyysmittauksissa tai proteiinin määrissä, oli aktiivisuudessa viitteitä hypoteesimme suuntaan.
Vaikka SOD1-ilmentyminen oli muihin näytteisiin verrattuna vain kaksinkertainen, silti pystyttiin toksisuus näkemään hyvin selkeästi. Tähän voi olla selityksenä, että voimakkaimmin ilmentyvät solut kuolevat jo aikaisessa vaiheessa, eikä niitä näin saada mukaan otokseen. SOD1:a yli-ilmentävät solut olivatkin yleensä hyvin pienikokoisia ja pyöreänmuotoisia, mikä kertoo niiden voivan huonosti. Tätä asiaa voitaisiin selvittää keräämällä soluja aikaisemmista aikapisteistä kuin 48 tuntia transfektion jälkeen.
Valitsimme tämän aikapisteen, jotta solut ehtisivät hieman toipua transfektion aiheuttamasta stressistä ja vahingosta.
SOD1 esiintyy runsaimpana solun sytoplasmassa (Klug D. Ja Rabani J. 1972). Kokeissa käytettiin kokosolulysaattia, joten tuloksissa näkyvää SOD1-aktiivisuutta edustaa suurimmaksi osaksi sytosolinen-SOD1. Mitokondrioiden kalvojen välitilassa ei ole tehokasta vetyperoksidia poistavaa mekanismia, toisinkuin matriksissa (SOD2) (Zimmerman M.C. ym. 2007). Siksi oksidatiivinen stressi tekee suurta vahinkoa juuri kalvojen välitilassa. Vain pieni osa blotissa nähtävästä aktiivisuudesta edustaa mitokondrionaalista SOD1-aktiivisuutta, mutta tämäkin saattaa riittää aiheuttamaan nähdyn toksisuuden soluille. Mikä osuus havaitusta SOD1-aktiivisuudesta on mitokondrioissa ja mikä sytoplasmassa, olisi ollut seuraava mielenkiinnon kohde tutkimuksessa. Tämä vaatii suuria solumääriä, jotta voidaan eristää tarpeeksi mitokondrioita aktiivisuusmäärityksiin.
7 LÄHDELUETTELO
Amodio R., Esposito E., De Ruvo C., Bellavia V., Amodio E., Carruba G.,Red wine extract prevents neuronal apoptosis in vitro and reduces mortality of transgenic mice, Annals New York Academy of Sciences,1089, 88-97 (2006)
Anderson C.M., Swanson R.A.,Astrocyte glutamate transport: Review of properties, regulation, and physiological functions, Glia,32, 1-14 (2000)
Barnham K.J., Masters C.L., Bush A.I.,Neurodegenerative diseases and oxidative stress, Nature Reviews Drug Discovery,3, 205-214 (2004)
Bensimon G., Lacomblez L., Meininger V., and the ALS/Riluzole study group,A controlled trial of riluzole in amyotrophic lateral sclerosis, The New England Journal of Medicine,330 (1994)
Boillèe S., Velde C.V., Cleveland D.W.,ALS: A disease of motor neurons and their nonneuronal neighbors, Neuron,52, 39-59 (2006)
Brooks B.R., Miller R.G., Swash M., Munsat T.L.,El Escorial revisited: revised criteria for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis, ALS and other motor neuron disorders, 1, 293-299 (2000)
Bruijn L.I., Becher M.W., Lee M.K., Anderson K.L., Jenkins N.A., Copeland N.G., Sisodia S.S., Rothstein J.D., Borchelt D.R., Price D.L., Cleveland D.W.,ALS-linked mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions, Neuron,18, 327-338 (1997)
Byrne S., Elamin M., Bede P., Shatunov A., Walsh C., Corr B., Heverin M., Jordan N., Kenna K., Lynch C., McLaughlin R., Mahadeva Iyer P., O’Brien C., Phukan J., Wynne B., Bokde A.L., Bradley D.G., Pender N., Al-Chalabi A., Hardiman O.,Cognitive and clinical characteristics of patients with amyotrophic lateral sclerosis carrying a C9orf72 repeat expansion: a popular-based cohort study, The Lancet Neurology,11, 232-240 (2012)
Cashman N.R., Durham H.D., Blusztajn K., Oda K., Tabira T., Shaw I.T., Dahrouge S., Antel J.P.,Neuroblastoma x spinal cord (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons, Developmental Dynamics,194, 209-221 (1992)
Chen C-N., Pan S-M.,Assay of superoxide dismutase activity by combining
electrophoresis and densitometry, Botanical Bulletin of Academia Sinica,37, 107-111 (1996)
Culotta V.C., Klomp L.W.J., Strain J., Casareno R.L.B., Krems B., Gitlin J.D.,The copper chaperone for superoxide dismutase, The Journal of Biological Chemistry,272, 23469-23472 (1997)
Clement A.M., Nguyen M.D., Roberts E.A., Garcia M.L., Boillée M., Rule M., McMahon A.P., Doucette W., Siwek D., Ferrante R.J., Brown Jr. R.H., Julien J-P., Goldstein L.S.B., Cleveland D.W.,Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neuron in ALS mice, Science,302, 113-117 (2003)
DeJesus-Hernandez M., Mackenzie I.R., Boeve B.F., Boxer A.L., Baker M., Rutherford N.J., Nicholson A.M., Finch N.A., Flynn H., Adamson J., Kouri N., Wojtas A., Sengdy P., Hsiung G-Y.R., Karydas A., Seeley W.W., Josephs K.A., Coppola G., Geschwind D.H., Wszolek Z.K., Feldman H., Knopman D.S., Peterson R.C., Miller B.L., Dickson D.W., Boylan K.B., Graff-Radford N.R., Rademakers R.,Expanded GGGGCC
hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS, Neuron,72, 245-256 (2011)
De Jong S.W., Huisman M.H.B., Sutedja N.A., Van der Kooi A.J., De Visser M., Schelhaas H.J., Fischer K., Veldink J.H., Van der Berg L.H.,Smoking, alcohol consumption, and the risk of amyotrophic lateral sclerosis: A population-based study, American Journal of Epidemiology,176, 233-239 (2012)
Deng H-X., Chen W., Hong S-T., Boycott K.M., Gorrie G.H., Siddique N., Yang Y., Fecto F., Shi Y., Zhai H., Jiang H., Hirano M., Rampersaud E., Jansen G.H.,
Donkervoort S., Bigio E.H., Brooks B.R., Ajroud K., Sufit R.L., Haines J.L., Mugnaini E., Pericak-Vance M., Siddique T.,Mutations in UBQLN2 cause dominant X-linked juvenile and adult onset ALS and ALS/dementia, Nature,477, 211-215 (2012)
Deng H-X., Shi Y., Furukawa Y., Zhai H., Fu R., Liu E., Gorrie G.H., Khan M.S., Hung W., Bigio E.H., Lukas T., Dal Canto M.C., O’Halloran T., Siddique T.,Conversion to the amyotrophic lateral sclerosis phenotype is associated with intermolecular linked insoluble aggregates of SOD1 mitochondria, Proceedings of the National Academy of Sciences, 103, 7142-7147 (2006)
Dimos J.T., Rodolfa K.T., Niakan K.K., Weisenthal L.M., Mitsumoto H., Chung W., Croft G.F., Saphier G., Leibel R., Goland R., Wichterle H., Henderson C.E., Eggan K., Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons, Science,321, 1218-1221 (2008)
Field L.S., Furukawa Y., O’Halloran T.V., Culotta V.C.,Factors controlling the uptake of yeast Copper/Zinc superoxide dismutase into mitochonria, The Journal of Biological Chemistry,278, 28052-28059 (2003)
Flanagan S.W., Anderson R.D., Ross M.A., Oberley L.W.,Overexpression of
manganese superoxide dismutase attenuates neuronal death in human cells expressing mutant (G37R) Cu/Zn-superoxide dismutase, Journal of Neurochemistry,81, 170-177 (2002)
Goetz C.G.,Amyotrophic lateral sclerosis: Early contributions of Jean-Martin Charcot, Muscle Nerve,23, 336-343 (2000)
Goldsteins G., Keksa-Goldsteine V., Ahtoniemi T., Jaronen M., Arens E., Åkerman K., Chan P.H., Koistinaho J.,Deleterious role of superoxide dismutase in the
mitochondrial intermembrane space, Journal of biological chemistry,283, 8446-8452 (2008)
Graffmo K.S., Forsberg K., Bergh J., Birve A., Zetterström P., Andersen P.M., Marklund S.L., Brännström T., Expression of wild-type human superoxide dismutase-1 in mice causes amyotrophic lateral sclerosis, Human Molecular Genetics (2012)
Gurney M.E., Pu H., Chiu A.Y., Dal Canto M.C., Polchow C.Y., Alexander D.D.,
Caliendo J., Hentati A., Kwon Y.W., Deng H., Chen W, Zhai P., Sufit R.L., Siddique T., Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation, Science,264, 1772-1775 (1994)
Haidet-Phillips A.M., Hester M.E., Miranda C.J., Meyer K., Braun L., Frakes A., Song S., Likhite S., Murtha M.J., Foust K.D., Rao M., Eagle A., Kammesheidt A., Christensen A., Mendell J.R., Burghes A.H.M., Kaspar B.K., Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons, Nature biotechnology (2011)
Higgins C.M.J., Jung C., Ding H., Xu Z., Mutant Cu, Zn superoxide dismutase that causes motoneuron degeneration is present in mitochondria in the CNS, The Journal of Neuroscience,22 (2002)
Howland D.S., Liu J., She Y., Goad B., Maragakis N.J., Kim B., Erickson J., Kulik J., DeVito L., Psaltis G., DeGennaro L.J., Cleveland D.W., Rothstein J.D.,Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrphic lateral sclerosis (ALS), Proceedings of the National Academy of Sciences,99, 1604-1609 (2002)
Johnson J.O., Mandrioli J., Benatar M., Abramzon Y., Van Deerlin V.M., Trojanowski J.Q., Gibbs J.R., Brunetti M., Gronka S., Wuu J., Ding J., McCluskey L., Martinez-Lage M., Falcone D., Hernandez D.G., Arepalli S., Chong S., Schymick J.C., Rothstein J., Landi F., Wang M., Calvo A., Mora G., Sabatelli M., Monsurró M.R., Battistini S., Salvi F., Spataro R., Sola P., Borghero G., Italsgen, Galassi G., Scholz S.W., Taylor J.P., Restagno G., Chió A., Traynor J.T.,Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS, Neuron,68, 857-864 (2010)
Johnsson P.A., Graffmo K.S., Brännström T., Nilsson P., Andersen P.M., Marklund S.L.,Motor neuron disease in mice expressing the wild type-like D90A mutant superoxide dismutase-1, Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 65, 1126-1136 (2006) Kabashi E., Valdmanis P.N., Dion P., Spiegelman D., McConkey B.J., Vande Velde C., Bouchard J., Lacomblez L., Pochigaeva K., Salachas F., Pradat P., Camu W.,
Meininger V., Dupre N., Rouleau G.A.,TARDBP mutations in individuals with sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis, Nature Genetics,40, 572-574 (2008)
Kaspar B.K., Lladó J., Sherkat N., Rothstein J.D., Gage F.H.,Retrograde viral delivery of IGF-1 prolongs survival in a mouse ALS model, Science,301, 839-842 (2003)
Kawamata H. and Manfredi G.,Mitochodrial dysfunction and intracellular calcium dysregulation in ALS, Mechanism of Ageing and Development,131 ,517-526 (2010)
Kiernan M.C., Vucic S., Cheah B.C., Turner M.R., Eisen A., Hardiman O., Burrell J.R., Zoing M.C.,Amyotrophic lateral sclerosis, The Lancet Neurology,377, 942-955 (2011) Klug D. and Rabani J.,A direct demonstration of the catalytic action of superoxide dismutase through the use of pulse radiolysis, The Journal of Biological Chemistry,247, 4839-4842 (1972)
Kwiatkowski Jr. T.J., Bosco D.A., LeClerc A.L., Tamrazian E., Vanderburg C.R., Russ C., Davis A., Gilchrist J., Kasarskis E.J., Munsat T., Valdmanis P., Rouleau G.A., Hosler B.A., Cortelli P., de Jong P.J., Yoshinaga Y., Haines J.L., Pericak-Vance M.A., Yan J., Ticozzi N., Siddique T., McKenna-Yasek D., Sapp P.C., Horvitz H.R., Landers J.E., Brown Jr. R.H.,Mutation in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis, Science,323, 1205-1208 (2009)
Lewis M., Gordon P.H.,Lou Gehrig, Rawhide, and 1938, Neurology,68, 615-618 (2007) Liu Y., Hao W., Dawson A., Liu S., Fassbender K.,Expression of amyotrphic lateral sclerosis-linked SOD1 mutant increases the neurotoxic potential of microglia via TLR2, The Journal of Biological Chemistry,284, 3691-3699 (2009)
Logroscino G., Traynor B.J., Hardiman O., Chió A., Mitchell D., Swingler R.J., Millul A., Benn E., Beghi E.,Incidence of amyotrophic lateral sclerosis in Europe, Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry,81, 385-390 (2010)
Lu L., Oveson B.C., Jo Y., Lauer T.W., Usui S., Komeima K., Xie B., Campochiaro P.A.,Increased expression of glutathione peroxidase 4 strongly protects retina from oxidative damage, Antioxidants & Redox Signaling, 11 (2009)
Lyons T.J., Liu H., Goto J.J., Nersissian A., Roe J.A., Graden J.A., Café C., Ellerby L.M., Bredesen D.E., Butler Gralla E., Selverstone Valentine J.,Mutations in copper-zinc superoxide dismutase that cause amyotrophic lateral sclerosis alter the copper-zinc binding site and the redox behavior of the protein, Biochemistry,93, 12240-12244 (1996)
Mackenzie I.R.A., Bigio E.H., Ince P.G., Geser F., Neumann M., Cairns N.J., Kwong L.K., Forman M.S., Ravits J., Stewart H., Eisen A., McClusky L., Kretzschmar H.A., Monoranu C.M., Highley J.R., Kirby J., Siddique T., Shaw P.J., Lee V.M-Y.,
Trojanowski J.Q.,Pathological TDP-43 distinguishes sporadic amyotrophic lateral sclerosis from amyotrophic lateral sclerosis with SOD1 mutations, Annals of Neurology, 61, 427-434 (2007)
Magrané J., Hervias I., Henning M.S., Damiano M., Kawamata H., Manfredi G.,Mutant SOD1 in neuronal mitochondria causes toxicity and mitochondrial dynamics abnormalities, Human Molecular Genetics,18, 4552-4564 (2009)
Maruyama H., Morino H., Ito H., Izumi Y., Kato H., Watanabe Y., Kinoshita Y., Kamada M., Nodera H., Suzuki H., Komure O., Matsuura S., Kobatake K., Morimoto N., Abe K., Suzuki N., Aoki M., Kawata A., Hirai T., Kato T., Ogasawara K., Hirano A., Takumi T., Kusaka H., Hagiwara K., Kaji R., Kawakami H.,Mutations of optineurin in amyotrophic lateral sclerosis, Nature,465, 223-226 (2010)
Nagai M., Aoki M., Miyoshi I., Kato M., Pasinelli P., Kasai N., Brown Jr R.H., Itoyama Y.,Rats expressing human cytosolic copper/zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease, The Journal of Neuroscience,21, 9246-9254 (2001)
O’Brien J., Wilson I., Orton T., Pognan F.,Investigation of the alamar blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity, European Journal of Biochemistry,267, 5421-5426 (2000)
Oeda T., Shimohama S., Kitagawa N., Kohno R., Imura T., Shibasaki H., Ishii N., Oxidative stress causes abnormal accumulation of familial amyotrophic lateral sclerosis-related mutant SOD1 in transgenic Caenorhabditis elegans, Human Molecular Genetics, 10, 2013-2023 (2001)
Phillips J.P., Campbell S.D., Michaud D., Charbonneau M., Hilliker A.J.,Null mutation of copper/zinc superoxide dismutase in Drosophila confers hypersensitivity to paraquat and reduced longevity, Proceedings of the National Academy of Sciences,86, 2761-2765 (1989)
Prudencio M., Durazo A., Whitelegge J.P., Borchelt D.R.,An examination of wild-type SOD1 in modulating the toxicity and aggregation of ALS associated mutant SOD1, Human Molecular Genetics,19, 4774-4789 (2010)
Ralph G.S., Radcliffe P.A., Day D.M., Carthy J.M., Leroux M.A., Lee D.C.P., Wong L., Bilsland L.G., Greensmith L., Kingsman S.M., Mitrophanous K.A., Mazarakis N.D., Azzouz M.,Silencing mutant SOD1 using RNAi protects against neurogeneration and extends survival in a ALS model, Nature Medicine,11, 429-433 (2005)
Ramesh T., Lyon A.N., Pineda R.H., Wang C., Janssen P.M., Canan B.D., Burghes A.H.M., Beattie C.E.,A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish
displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease, Disease Models and Mechanisms, 3, 652-662 (2010)
Rao S.D., Weiss J.H.,Excitotoxic and oxidative cross-talk between motor neurons and glia in ALS pathogenesis, Trends in Neurosciences,27, 17-23 (2004)
Renton A.E., Majounie E., Waite A., Simón-Sánchez J., Rollison S., Gibbs J.R., Schymick J.C., Laaksovirta H., van Swieten J.C., Myllykangas L., Kalimo H., Paetau A., Abramzon Y., Remes A.M., Kaganovich A., Scholz S.W., Duckworth J., Ding J., Harmer D.W., Hernandez D.G., Johnson J.O., Mok K., Ryten M., Trabzuni D.,
Guerreiro R.J., Orrell R.W., Neal J., Murray A., Pearson J., Jansen I.E., Sondervan D., Seelaar H., Blake D., Young K., Halliwell N., Bennion Callister J., Toulson G.,
Richardson A., Gerhard A., Snowden J., Mann D., Neary D., Nalls M.A., Peuralinna T., Jansson L., Isoviita V-M., Kaivorinne A-L., Hölttä-Vuori M., Ikonen E., Sulkava R., Benatar M., Wuu J., Chió A., Restagno G., Borghero G., Sabatelli M., The ITALSGEN Consortium, Heckerman D., Rogaeva E., Zinman L., Rothstein J.D., Sendtner M., Drepper C., Eichler E.E., Alkan C., Abdullaev Z., Pack S.D., Dutra A., Pak E., Hardy J., Singleton A., Williams N.M., Heutink P., Pickering-Brown S., Morris H.R., Tienari P.J., Traynor B.J.,A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of
chromosome 9p21-linked ALS-FTD, Neuron,72, 257-268 (2011)
Rosen D.R., Siddique T., Patterson D., Figlewicz D.A., Sapp P., Hentati A.,
Donaldson D., Goto J., O’Regan J.P., Deng H., Rahmani Z., Krizus A., McKenna-Yasek D., Cayabyab A., Gaston S.M., Berger R., Tanzi R.E., Halperin J.J., Herzfeldt B., Van den Bergh R., Hung W., Soo K.Y., Atkin J.D., Farg M., Walker A.K., Horne M.K., Nagley P., Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis, Nature,362, 59-62 (1993)
Sasaki S., Nagai M., Aoki M., Komori T., Itoyama Y., Iwata M.,Motor neuron disease in transgenic mice with an H46R mutant SOD1 gene, The Journal of Neuropathology &
Experimental Neurology,66, 517-524 (2007)
Shaw P.J., Forrest V., Ince P.G., Richardson J.P., Wastell H.J.,CSF and plasma amino acid levels in motor neuron disease: elevation of CSF glutamate in a subset of patients, Neurogeneration,4, 209-216 (1995)
Shetner J.M. and Gooch C.L.,Motor unit number estimation, Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America,14, 243-260 (2003)
Son M., Puttaparthi K., Kawamata H., Rajendran B., Boyer P.J., Manfredi G., Elliott J.L.,Overexpression of CCS in G93A-SOD1 mice leads to accelerated neurological deficits with severe mitochondrial pathology, PNAS, 104, 6072-6077 (2007)
Soo K.Y., Atkin J.D., Farg M., Walker A.K., Horne M.K., Nagley P.,Bim links ER stress and apoptosis in cells expressing mutant SOD1 associated with amyotrophic lateral sclerosis, PLoS One,7 (2012)
Sturtz L.A., Diekert K., Jensen L.T., Lill R., Culotta V.C.,A fraction of yeast Cu,Zn-superoxide dismutase and its metallochaperone, CCS, localize to the intermembrane space of mitochondria, The Journal of Biological Chemistry,276, 38084-38089 (2001) Trotti D., Rolfs A., Danbolt N.C., Brown Jr. R.H., Hediger M.A.,SOD1 mutants linked to amyotrophic lateral sclerosis selectively inactivate a glial glutamate transporter, Nature Neuroscience,2, 427-433 (1999)
Turner M.R., Hardiman O., Benatar M., Brooks B.R., Chio A., de Carvalho M., Ince P.G., Lin C., Miller R.G., Mitsumoto H., Nicholson G., Ravits J., Shaw P.J., Talbot K., Traynor B.J., Van den Berg L., Veldink J.H., Vucic S., Kiernan M.C.,Controversies and priorities in amyotrophic lateral sclerosis, The Lancet Neurology,12, 310-322 (2013)
Wang J., Slunt H., Gonzales V., Fromholt D., Coonfield M., Copeland N.G., Jenkins N.A., Borchelt D.R.,Copper-binding –site-null SOD1 causes ALS in transgenic mice:
aggregates of non-native SOD1 delineate a common feature, Human Molecular Genetics, 12, 2753-2764 (2003)
Wang J., Xu G., Li H., Gonzales V., Fromholt D., Karch C., Copeland N.G., Jenkins N.A., Borchelt D.R.,Somatodendritic accumulation of misfolded SOD1-L126Z in motor neurons mediates degeneration: B-crystallin modulates aggregation, Human Molecular Genetics,14, 2335-2347 (2005)
Wong P.C., Pardo C.A., Borchelt D.R., Lee M.K., Copeland N.G., Jenkins N.A., Sisodia S.S., Cleveland D.W., Price D.L.,An adverse property of a familial ALS-linked
Wong P.C., Pardo C.A., Borchelt D.R., Lee M.K., Copeland N.G., Jenkins N.A., Sisodia S.S., Cleveland D.W., Price D.L.,An adverse property of a familial ALS-linked