NGS- menetelmän avulla sekvensointi on aiempaa tehokkaampaa: tuotettavan datan määrä on kasvanut, kustannukset laskeneet ja työhön käytettävän ajan määrä vähentynyt. Näyttei-den yhdistäminen eli multipleksaus mahdollistaa useiNäyttei-den näytteiNäyttei-den samanaikaisen valmis-telun ja sekvensoinnin, mikä tehostaa työskentelyä (Luthra ym. 2014). Vaikkakin sekven-soinnin kustannukset ovat laskeneet, on koko genomin sekvensointi edelleen suhteellisen kallista. Siksipä joissain tapauksissa on järkevämpää sekvensoida vain koodaavat alueet tai valikoida spesifisten alukkeiden avulla vain tutkimuksen kannalta keskeisiä geenejä sek-vensoitavaksi. (Chilamakuri ym. 2014). Tässä tutkimuksessa käytettiin Rochen neuro-paneelia, jonka avulla sekvensoitiin hermostollisin sairauksiin ja häiriöihin liittyviä geene-jä. Tällöin voitiin tarkastella AT:n genetiikan kannalta keskeisiä geenegeene-jä.
Vaikkakin tietämys AT:n monimutkaisesta genetiikasta on lisääntynyt viime vuosina, liit-tyy sairauteen vielä mahdollisesti tuntemattomia geneettisiä komponentteja. NGS:n mah-dollistamat koko genomin laajuiset assosiaatiotutkimukset ovat paljastaneet lukuisia uusia riskigeenejä. Nämä geenit ovat yleisiä ja niiden riskivaikutus on pieni. Harvinaisempien muutosten havaitseminen kuitenkin vaatii tarkempaa sekvensointia (Bettens ym. 2013).
Kohdennetun sekvensoinnin avulla voidaan havaita sellaisia mutaatioita, joiden esiintymis-taajuus väestössä on liian pieni havaittavaksi aikaisemmilla laitteilla ja menetelmillä. Sek-vensoinnin resoluutio eli tarkkuus onkin säädettävissä sen mukaan, miten tarkkaan geno-min eri alueita halutaan tarkastella. Kohdennetussa sekvensoinnissa kohdealueelta tuote-taan enemmän luentoja eli sekvensoinnin syvyys on suurempi ja tulosten luotettavuus pa-rempi. (Illumina 2013a).
NGS- laitteiden tehokkuus tuo mukanaan omat haasteensa. Tuotettavan datan määrä on suuri, jolloin tarvitaan tehokkaita ohjelmia datan käsittelemiseksi ja analysoimiseksi. Tu-losten purkaminen on jossain määrin vaivalloista, sillä käytössä ei ole varsinaista avustetta sitä varten. Toisaalta dataa voidaan lajitella eri muuttujien avulla, mikä helpottaa datan käsittelyä ja analysointia. Datan analysointityökalujen kehittymisen myötä saadaan mah-dollisesti vielä enemmän hyötyä NGS- laitteiden kapasiteetista. Vaikka itse sekvensointi on tehokasta ja suurelta osin automatisoitua, on geenikirjaston rakentaminen käyttämämme
asetelman osalta edelleen suhteellisen työlästä ja aikaa vievää. Lisäksi jotkin vaiheet kuten sonikointi vaativat suurta tarkkuutta ja huolellisuutta DNA fragmentoinnissa.
MiSeq- sekvensaattorin kyky havaita variantteja on hyvä. Tämän ansoista sillä voidaan mahdollisesti löytää uusia mutaatioita jo aiemmin tautiin yhdistetyiltä alueilta. Meidän kolme potilasnäytettä sisälsi PSEN1 mutaation ja tämä mutaatio saatiin varmennettua tällä tekniikalla. Tosin APP- duplikaatioita ei voitu havaita, sillä käyttämällämme protokollalla voidaan tarkastella vain laadullisia eli kvalitatiivisia ominaisuuksia, jolloin kvantitatiivisia ominaisuuksia kuten koko geenin duplikaatioita ei voitu havaita. Yhteensä havaittiin noin 2000 eri varianttia yleisistä polymorfioista mutaatioihin eksoneissa ja geenien säätelyalu-eilla. NGS:n ominaisuudet: pienemmät kustannukset, näytteiden multipleksaus ja suuri kapasiteetti mahdollistavat useiden kiinnostuksen kohteena olevien geenien yhtäaikaisen ja tarkennetun sekvensoinnin. (Luthra ym. 2014). Esimerkiksi voidaan tarkastella lukuisia neurodegeneratiivisiin sairauksiin liittyviä geenejä, jolloin on mahdollista kehitellä yksiöl-lisiä hoitomenetelmiä, eteenkin kun taudin molekulaarisiin mekanismeihin perustuvat hoi-tomuodot tulevat mahdollisiksi. Lisäksi NGS- teknologiasta uskotaan olevan hyötyä poti-laiden biomateriaalien lajittelussa ja geneettisessä diagnosoinnissa (Bettens ym. 2013).
MiSeq:n sekvensointi tulosten toistettavuus on hyvä. Koska MiSeq vaatii suhteellisen vä-hän työaikaa ja on tarkka varianttien havaitsemisessa, on sillä potentiaalia toimia myös kliinisessä käytössä (Luthra ym. 2014).
Tässä tutkimuksessa MiSeq- sekvensaattorilla saatujen keksimääräisten luentojen määrässä näytettä kohden ei ole suurta vaihtelua. Kaikissa näytteissä vähintään 15 kertaa luettujen emästen osuus on noin 99 prosenttia, eli luennan tarkkuus on erittäin hyvä, ja sekvensointi-tuloksia voidaan pitää luotettavina. Havaittujen varianttien määrä eri näytteissä oli suhteel-lisen tasainen samoin kuin keskimääräiset luennat näytettä kohden.
Chilamakuri ym. (2014) vertailivat tutkimuksessaan neljää eri koko eksomin kaappaus teknologiaa. Vertailussa olivat Illuminan TruSeq Exome Enrichment-, Rochen NibleGen SeqCap EZ Exome Library-, Agilentin SureSelect Human All Exon- ja Illuminan Nextera Exome Enrichment- asetelmat. Vaikka kyseessä olivat koko eksomin sekvensointiin tarkoi-tetut asetelmat, voidaan tutkimuksen tuloksia käyttää suuntaa antavina tarkasteltaessa oman sekvensoinnin tuloksia. Tutkimuksessa kaikki eksomin kaappaus teknologiat osoit-tautuivat hyvin toimiviksi, mutta niiden välillä on myös eroja. Agilent kattoi suurimman osuuden kohde alueistaan (99,8 %) ja Nextera puolestaan pienimmän osuuden (96,5 %).
Tämän uskotaan osittain selittyvän Agilentin pienemmillä kohde alueilla. Myös filtterin läpäisseiden luentojen määrä oli suurin Agilentilla (71,7 %) ja pienin Nexteralla (40,1 %).
NibleGenilla vastaava osuus oli 66,0 %. NibleGen puolestaan kaappasi suurimman osuu-den yhosuu-den nukleotidin varianteista (SNV= Single Nucleotide Variant), kun havaittujen varianttien määrä suhteutetaan teknologian kohdealueen kokoon. Kaikkien teknologioiden toistettavuus oli hyvä, eikä siinä havaittu suurta eroa. Tutkimustuloksia Rochen neuro-paneelin käytöstä ei toistaiseksi ole saatavilla kirjallisuudessa. Valittaessa sopivaa teknolo-giaa kohdennettua sekvensointia varten on otettava huomioon kohdealueen DNA pitoisuus, lähtömateriaaliksi vaadittavan DNA:n määrä, kirjaston rakentamiseen vaadittu työmäärä ja reagenssien kustannukset halutun sekvensointi syvyyden saavuttamiseksi.
VIITTEET
Agilent Technologies (2013).Agilent 2100 Bioanalyzer System- Secure experimental suc-cess Luettu 11.8.2014.www.chem.agilent.com/library/Brochures/5991-3323EN.pdf Albertoni G, Arnoni C, Araujo P ym. Magnetic bead technology for viral RNA extraction from serum in blood bank screening. Braz J Infect Dis 2011; 15(6): 548- 52.
Alzforum (2011): AlzGene- Top Results. (Päivitetty 18.4.2011).
www.alzgene.org/TopResults.asp
Alzheimer`s Association (2014). What Is Alzheimer's? Luettu 21.10.2014.
www.alz.org/alzheimers_disease_what_is_alzheimers.asp
Alzheimer Disease and Frontotemporal Dementia Mutation Database (2014). Luettu 5.8.2014. www.molgen.ua.ac.be/ADMutations.
Bertram L, Lill CM, Tanzi RE. The genetics of Alzheimer disease: back to the future. Neu-ron 2010; 68: 270– 81
Bettens K, Sleegers K, Van Broeckhoven C. Genetic insights in Alzheimer’s disease. Lan-cet neurology 2013; 12:92–104
Blennow K, Hampel H, Weiner M, Zetterberg H. Cerebrospinal fluid and plasma bi-omarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol 2010 6:131–44
Braak, H, Braak, E. Neuropathological staging of Alzheimer-related changes. Acta Neuro-pathol 1991; 82: 239–259
Campion D, Dumanchin C, Hannequin D ym. Early-onset autosomal dominant Alzheimer disease: prevalence, genetic heterogeneity, and mutation spectrum. American Journal of Human Genetics1999; 65: 664–70.
Carlson MC, Helms MJ, Steffens DC, Burke JR, Potter GG, Plassman BL. Midlife activity predicts risk of dementia in older male twin pairs. Alzheimer’s Dement 2008; 4(5):324–31.
Carver T, Bohme U, Otto TD, ym. BamView: viewing mapped read alignment data in the context of the reference sequence. Bioinformatics 2010; 26:676-7.
Chilamakuri C, Lorenz S, Madoui M-A ym. Performance comparison of four exome cap-ture systems for deep sequencing. BMC Genomics 2014; 15: 449
Cirulli ET, Singh A, Shianna KV ym. Screening the human genome: comparison of whole genome and whole transcriptome sequencing. Genome Biol 2010; 11: R57
Corder EH, Saunders AM, Risch NJ ym. . Protective effect of apolipoprotein E type 2 al-lele for late onset Alzheimer disease. Nat Genet. 1994; 7: 180–4.
Deane R, Sagare A, Hamm K ym.. apoE isoform-specific disruption of amyloid beta pep-tideclearance from mouse brain. J Clin Invest 2008; 118: 4002–13
Escott-Price V, Bellenguez C , Wang L. PLOS ONE (www.plosone.org) 2014; 6: e 94661 Evans DA, Funkenstein HH, Albert MS ym. Prevalence of Alzheimer’s disease in a com-munity population of older persons. Higher than previously reported. JAMA. 1989; 262:
2551–2556
Ferri CP, Prince M, Brayne Cym. Global prevalence of dementia: a Delphi consensus study. Lancet 2005; 366(9503): 2112–7.
Fiume M, Williams V, Brook A ym. Savant: genome browser for high-throughput se-quencing data. Bioinformatics 2010; 26:1938-44.
Fratiglioni L, Paillard-Borg S, Winblad B. An active and socially integrated lifestyle in late life might protect against dementia. Lancet Neurol 2004; 3(6): 343–53.
Gatz M, Reynolds CA, Fratiglioni L. ym. Role of genes and environments for explaining Alzheimers disease. Arch Gen Psychiatry 2006; 63: 168 -74
Genin E, Hannequin D, Wallon D ym. APOE and Alzheimer`s disease: a major gene with semidominant inheritance. Mol Psychiatry 2011; 16: 903-07
Glenner GG, Wong CW. Alzheimer’s disease and Down’s syndrome: Sharing of a unique cerebrovascular amyloid fibril protein. Biochem Biophys Res Commun 1984; 122: 1131–
35.
Goate A, Chartier- Harlin MC, Mullan M. ym. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene wiith familial Alzheimers disease. Nature 1991; 349; 704- 06
Goldgaber D, Lehrman M, McBride O ym. Characterization and chromosomal localization of a cDNA encoding brain amyloid of Alzheimer’s disease. Science 1987; 235: 877–80 Hardy J, Selkoe DJ. The Amyloid hypothesis of Alzheimer´s disease: Progress and Prob-lems on the Road to Therapeutics. Science 2002; 297: 353–356.
Hardy J, Bogdanovic N, Winblad B. Pathways to Alzheimer’s disease. J Intern Med 2014;
275: 296–303.
Harvard University (2011). Diagnosing Alzheimer's disease. Luettu 20.6.2014.
www.health.harvard.edu/newsletters/Harvard_Health_Letter/2011/July/diagnosing-alzheimers-disease
Hallikainen M, Suhonen J, Pirttilä T, Erkinjuntti T. Alzheimerin taudin kliinisen tutkimuk-sen uudistetut kriteerit. Suomen lääkärilehti 2011; 66:161- 165
Hiltunen M, Haapasalo A, Soininen H. Alzheimerin taudin uudet riskigeenit – tautia enna-koivat biomarkkerit? Duodecim 2013; 129: 583- 8
Huang H & Jiang Z. Accumulated Amyloid-β peptide and Hyperphosphorylated Tau Pro-tein: Relationship and Links in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease 2009;
16: 15–27
Illumina (2008). Illumina Sequencing Technology. Luettu 5.6.2014.
www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn
Illumina, Schroth G (2012). The Impact of Massively Parallel DNA Sequencing on Ge-nomic and Clinical Research.
Illumina (2013a). An introduction to Next-Generation Sequencing Technology. Luettu 4.6.2014. www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilm.
Illumina (2013b). TruSeq Nano DNA Sample Preparation Kit. Luettu 4.8.2014.
http://res.illumina.com/documents/products/datasheets/dtasheet_truseq_nano_dna_sample prep_kit.p.df
Illumina (2014a) Mi Seq® System- Focused power. Speed and simplicity for targeted and
small genome sequenc Luettu 12.8.2014.
http://res.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_miseq.pdf
Illumina (2014b). Sequencing by synthesis technology. Luettu 12.8.2014.
http://technology.illumina.com/technology/next-generation-sequencing/sequencing-technology.html
International Human Genome Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the hu-man genome. Nature 2004; 431, 931–945.
Jarrett JT, Berger EP, Lansbury PT Jr. The carboxy terminus of the b amyloid protein is critical for the seeding of amyloid formation: Implications for the pathogenesis of Alz-heimer’s disease. Biochemistry 1993; 32: 4693–4697.
Jiang Q, Lee CY, Mandrekar S et al. ApoE promotes the proteolytic degradation of A beta.
Neuron 2008; 58: 681–93.
Jonsson T, Atwal JK, Steinberg S, ym. A mutation in APP protects against Alzheimer’s disease and age-related cognitive decline. Nature 2012; 488: 96–9.
Kang J, Lemaire H, Unterbeck A ym. The precursor of Alzheimer’s disease amyloid A4 protein resembles a cell surface receptor. Nature 1987; 325: 733–736.
Lambert J-C, Amouyel P. Genetics of Alzheimer’s disease: new evidences for an old hy-pothesis? Curr Opin Genet Dev 2011; 21: 295–301
Levy-Lahad E. Wasco W, Poorkaj P ym. Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimers disease locus. Science 1995; 269: 973- 77.
Leibson CL, Rocca WA, Hanson VA, Cha R, Kokmen E, O’Brien PC, et al. The risk of dementia among persons with diabetes mellitus: a population-based cohort study. Ann NY Acad Sci 1997; 826:422–7.
Liu Q, Zerbinatti CV, Zhang J et al. Amyloid precursor protein regulates brain apolipopro-tein E and cholesterol metabolism through lipoproapolipopro-tein receptor LRP1. Neuron 2007; 56:
66–78
Luchsinger JA, Tang MX, Stern Y, Shea S, Mayeux R. Diabetes mellitus and risk of Alz-heimer’s disease and dementia with stroke in a multiethnic cohort. Am J Epidemiol 2001;
154(7):635–41.perspective. Eur J Pharmacol 2008; 585(1):119–29.
Luo C, Tsemnetzi D, Kyrpides N. Direct comparisons of illumina vs. Roche 454 sequenc-ing technologies on the same microbial community DNA sample. PLoS One 2012; 7:
e30087
Luthra R, Patel K, Reddy N ym. Next generation sequencing- based mutligene mutational screening for acute myeloid leukeimia using MiSeq: applicabapiltiy for diagnosis and dis-ease monitoring. haematologica 2014; 99(3): 465- 73.
Mayeux R. Stern Y. Epidemiology of Alzheimer Disease.Cold Spring Harb Perspect Med.
2012; 2(8): a006239.
McKhann GM, Knopman DS, Chertkow H, ym. The diagnosis of dementia due to Alz-heimer’s disease: Recommendations from the National Institute on Aging- Alzheimer‘s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer’s disease. Alzheimers Dement 2011; 7:208–44.
Metzker M. Sequencing technologies- The next generation. Nature 2010; 11: 31–46.
Mullan M, Crawford F, Axelman K ym. A pathogenic mutation for probable Alzheimer's disease in the APP gene at the N-terminus of beta-amyloid. Nat Genet. 1992; 1(5): 345-7.
Pavlopoulos G, Oulas A, Iacucci E ym. Unraveling genomic variation from next genera-tion sequencing data. BioData Mining 2013; 6: 13.
Pirttilä ja Erkinjuntti. Alzheimerin taudin kliininen kuva ja diagnoosi. Kirjassa Erkrinjuntti T, Kari A, Juha R, Soininen H. toim, Muistihäiriöt ja dementia. Helsinki Kustannus Oy Duodecim 2006, s.126–139
Pirttilä T. Lievä kognitiivinen heikentyminen – ennusteeltaan heterogeeninen oireyhtymä.
Duodecim 2008; 124:159–66.
Prince M, Guerchet M, Prina M. Policy Brief for Heads of Government: The Global Im-pact of Dementia Alzheimer’s Disease International (ADI), London. 2013: 2013–50.
Rapp A, Gmeiner B, Hüttinger M. Implication of apoE isoforms in cholesterol metabolism by primary rat hippocampal neurons and astrocytes. Biochimie. 2006; 88:473–483.
Riddell DR, Christie G, Hussain I, Dingwall C. Compartmentalization of beta-secretase (Asp2) into low-buoyant density, non caveolar lipid rafts. Curr Biol 2001; 11: 1288–93.
Riddell DR, et al. Impact of apolipoprotein E (apoE) polymorphism on brain apoE levels. J Neurosci. 2008; 28:11445–11453
Roche Diagnostics GmbH (2013a). SeqCap EZ Library Discover more, sequence less. Lu-ettu 20.6.2014.
www.nimblegen.com/products/lit/05227887001_SeqCapBroch_May2013.pdf
Roche Diagnostics GmbH (2013b). SeqCap EZ Designs - Neurology Panel Design Dis-cover more, sequence less in your neurological research. Luettu 11.8.2014.
www.nimblegen.com/products/lit/06870473001_NG_SeqCapEZ_Neurology_Flyr_Jan201 3.pdf
Roche NimbleGen (2013). SeqCap EZ Library SR User’s Guide version 4.2. Luettu 7.8.2014.
www.nimblegen.com/products/lit/06588786001_SeqCapEZLibrarySR_UGuide_v4p2.pdf Rutherford K, Parkhill J, Crook J ym. Artemis: sequence visualization and annotation. Bio-informatics 2000; 16:944-5.
Scheuner, D, Eckman, C, Jensen M. ym. Secreted amyloid beta-protein similar to that in the senile plaques of Alzheimer’s disease is increased in vivo by the presenilin 1 and 2 and APP mutations linked to familial Alzheimer’s disease. Nat. Med. 1996; 2:864–870.
Scarmeas N, Stern Y, Mayeux R, Luchsinger JA. Mediterranean diet, Alzheimer disease, and vascular mediation. Arch Neurol 2006b; 63: 1709–1717
Seppälä T. Herukka S-K. Remes A. Alzheimerin taudin varhaisdiagnostiikka. Duodecim 2013; 129:2003- 10
Sherrington R, Rogaev EI, Liang Y ym.Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset Familial Alzheimer’s disease. Nature 1995; 375: 754–760.
Spillantini MG, Goedert M. Tau Pathology and neruodegeneration. Lancet Neurol 2013;
12: 609–22
StrittmatterWJ, Saunders AM, Schmechel D ym. Apolipoprotein E: High-avidity binding to b-amyloid and increased frequencyof type 4 allele in late-onset familial Alzheimer dis-ease. Proc Natl Acad Sci 1993; 90: 1977–81.
Tanzi R, Gusella J, Watkins P ym. Amyloid β protein gene: cDNA, mRNA
distribution, and genetic linkage near the Alzheimer locus. Science 1987; 235: 880–
884.
Tanzi R, McClatchey A, Lamperti E ym. Protease inhibitor domain encoded by an amyloid protein precursor mRNA associated with Alzheimer’s
Disease. Nature 1988; 331: 528–530.
Tanzi RE, Bertram L. Twenty years of the Alzheimer’s disease amyloid hypothesis: A ge-netic perspective. Cell 2005; 120: 545–555.
Tanzi R. The Genetics of Alzheimer Disease, Cold Spring Harbor Perspectives in Med.
2012; 2:a006296
Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration Brief Bioinform 2013; 14 (2):
178–192
Tienari, Polvikoski. Alzheimerin taudin patogeneesi. Kirjassa: Erkinjuntti T,
Kari A, Juha R, Soininen H, toim. Muistihäiriöt ja dementia. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim 2006, s. 112–113, 115-116
van Praag H, Kempermann G, Gage FH . Running increases cell proliferation and neuro-genesis in the adult mouse dentate gyrus. Nat Neurosci 1999; 2: 266–270
Wolfe MS, Xia W, Ostaszewski BL, Diehl TS, Kimberly WT, SelkoeDJ. Two transmem-brane aspartates in presenilin-1 required for presenilin endoproteolysis and γ-secretase ac-tivity. Nature 1999; 398: 513–517.
Xiangtao L, Shizhong H, Zuoheng W, Joel G, Bao-Zhu Y. Variant Callers for Next-Generation Sequencing Data: A Comparison Study. PLOS ONE | www.plosone.org 2013;
8(9): e75619