Toistettavuus

Toistettavuudella tarkoitetaan vakio-oloissa suoritettujen peräkkäisten mittaustulosten yhtäpitävyyttä tietyn suureen suhteen. Vakio-olot tarkoittavat, että näyte on sama, menetelmä on sama, laboratorio ja tekijä on sama, ja analyysit suoritetaan lyhyellä aikavälillä. Toistettavuus määritettiin seuraamalla näytteiden pitoisuusarvoja. Analyysit suoritettiin kahdella eri pitoisuustasolla kolmella eri rinnakkaismäärityksellä kolmena eri päivänä. Näytematriiseina toimivat edellä mainitut belgialainen vohveli ja kaupallinen ekstra-neitsytoliiviöljy.

GC-MS/MS-laitteistolla MRM-menetelmällä saaduista mittaustuloksista (liitteet 4 ja 5) laskettiin keskimääräinen pitoisuus, keskihajonta ja variaatiokerroin kullekin pitoisuustasolle kunakin analyysipäivänä. Pitoisuus voitiin laskea yhtälöllä (2).

Esimerkiksi vohvelinäytteellä pitoisuustasolla 470 µg/kg oli mittauksille, jotka suoritettiin 22.2.2017 (1. analyysipäivä tälle matriisille), saatu kalibraatiosuoraksi 3-MCPD:n suhteen y = 24.7423*x+0.0309046. Lisäksi näytettä oli punnittu 0,1014 g ja mittauksissa 3-MCPD-piikin alaksi oli saatu 13439 ja 3-MCPD-d5-piikin pinta-alaksi oli saatu 2130. Sijoittamalla nämä arvot yhtälöön (2) saatiin:

(

)

= (µg/kg) ≈ 2502,52 µg/kg

Vastaavalla tavalla määritettiin kullekin muulle rinnakkaismäärityksen näytteelle pitoisuudet ja laskettiin näiden keskiarvot. Tulokset on esitetty oliiviöljynäytteille taulukoissa 15 ja 16, ja vohvelinäytteille taulukoissa 17 ja 18. Taulukkoihin laskettiin lisäksi keskihajonnat ja variaatiokertoimet kullekin rinnakkaisnäytesarjalle kunakin suorituspäivänä.

68 Taulukko 15. 3-MCPD-, 2-MCPD- ja 3-MBPD-PBA-johdannaisten pitoisuus eri

päivinä pitoisuustasolla 470 µg/kg. Matriisina ekstra-neitsytoliiviöljy.

1. päivä 2. päivä 3. päivä

Taulukko 16. 3-MCPD-, 2-MCPD- ja 3-MBPD-PBA-johdannaisten pitoisuus eri päivinä pitoisuustasolla 941 µg/kg. Matriisina ekstra-neitsytoliiviöljy.

1. päivä 2. päivä 3. päivä

Taulukko 17. 3-MCPD-, 2-MCPD- ja 3-MBPD-PBA-johdannaisten pitoisuus eri päivinä pitoisuustasolla 470 µg/kg. Matriisina belgialainen vohveli.

1. päivä 2. päivä 3. päivä

Taulukko 18. 3-MCPD-, 2-MCPD- ja 3-MBPD-PBA-johdannaisten pitoisuus eri päivinä pitoisuustasolla 941 µg/kg. Matriisina belgialainen vohveli.

1. päivä 2. päivä 3. päivä

69 Yhtälöllä (3) voitiin edelleen pitoisuusarvoista (pitoisuus rasvassa) johtaa pitoisuus tuotteessa (C_P) vohvelinäytteille kertomalla se uutetun rasvan massan ja esikäsittelyyn punnitun näytteen massan suhteella. Esimerkiksi kun pitoisuudeksi rasvaa kohti oli saatu 2502,52 µg/kg edellisellä laskuesimerkillä, ja kun kyseistä näytettä oli punnittu esikäsittelyyn 5,0782 g ja esikäsittelyssä siitä oli saatu uutettua 2,2334 g rasvaa (liite 5), voitiin pitoisuus tuotteessa laskea:

= 1100,61025 µg/kg ≈ 1100,61 µg/kg Tuotekohtaisten pitoisuuksien keskiarvot kullekin analyysipäivälle kullakin väkevyystasolla voitiin laskea vastaavalla tavalla. Näille laskettiin edelleen keskihajonnat ja variaatiokertoimet (taulukot 19 ja 20).

Taulukko 19. 3-MCPD-, 2-MCPD- ja 3-MBPD-PBA-johdannaisten tuotekohtainen pitoisuus eri päivinä pitoisuustasolla 470 µg/kg. Matriisina belgialainen vohveli.

1. päivä 2. päivä 3. päivä

Taulukko 20. 3-MCPD-, 2-MCPD- ja 3-MBPD-PBA-johdannaisten tuotekohtainen pitoisuus eri päivinä pitoisuustasolla 941 µg/kg. Matriisina belgialainen vohveli.

1. päivä 2. päivä 3. päivä

Toistettavuus oli erinomainen kahdella eri pitoisuustasolla, suhteellisen keskihajonnan (variaatiokertoimen, cv-%) vaihdellessa välillä 0,69 ja 7,40 (pitoisuus rasvaa kohden) ja välillä 0,43 ja 5,96 (pitoisuus tuotetta kohden) riippuen lisäystasosta ja yhdisteestä.

70 9.2.5. Sisäinen uusittavuus

Sisäinen uusittavuus mittaa tarkkuutta, joka määrityksissä saavutetaan, kun ne suoritetaan samassa laboratoriossa samalla menetelmällä useana eri päivänä. Sisäinen uusittavuus määritettiin laskemalla kahdella pitoisuustasolla väkevöityjen näytteiden pitoisuuksien keskiarvot kolmen suorituspäivän ajalta kullekkin näytematriisille.

Pitoisuuksien keskiarvot kolmen päivän ajalta määritettiin edellä lasketuista pitoisuusarvoista. Arvoille määritettiin myös keskihajonnat ja variaatiokertoimet (taulukot 21 – 24).

Taulukko 21. Yhdisteiden sisäinen uusittavuus pitoisuustasolla 470 µg/kg. Matriisina ekstra-neitsytoliiviöljy.

Yhdiste ka. (µg/kg) sd. (µg/kg) cv-%

3-MCPD 464,01 23,50 5,06

2-MCPD 407,60 13,99 3,43

3-MBPD 573,84 46,67 8,13

Taulukko 22. Yhdisteiden sisäinen uusittavuus pitoisuustasolla 941 µg/kg. Matriisina ekstra-neitsytoliiviöljy.

Yhdiste ka. (µg/kg) sd. (µg/kg) cv-%

3-MCPD 891,07 23,83 2,67

2-MCPD 827,36 25,44 3,08

3-MBPD 1147,63 72,16 6,29

Taulukko 23. Yhdisteiden sisäinen uusittavuus pitoisuustasolla 470 µg/kg. Matriisina belgialainen vohveli.

Yhdiste ka. (µg/kg) sd. (µg/kg) cv-%

3-MCPD 2954,37 364,56 12,34

2-MCPD 1174,27 94,10 8,01

3-MBPD 4157,70 218,09 5,25

Taulukko 24. Yhdisteiden sisäinen uusittavuus pitoisuustasolla 941 µg/kg. Matriisina belgialainen vohveli.

Yhdiste ka. (µg/kg) sd. (µg/kg) cv-%

3-MCPD 3427,53 476,06 13,89

2-MCPD 1595,64 135,95 8,52

3-MBPD 4718,04 184,60 3,91

71 Edelleen vohvelinäytteiden mittaustuloksista laskettiin keskiarvot tuotekohtaisille pitoisuuksille (C_P-arvot) kolmen päivän mittaustuloksista. Lisäksi määritettiin keskihajonnat ja variaatiokertoimet (cv-%) (taulukot 25 – 26).

Taulukko 25. Yhdisteiden sisäinen uusittavuus (pitoisuus tuotteesa) pitoisuustasolla 470 µg/kg. Matriisina belgialainen vohveli.

Yhdiste ka. (µg/kg) sd. (µg/kg) cv-%

3-MCPD 1247,77 133,82 10,72

2-MCPD 495,92 20,89 4,21

3-MBPD 1764,42 166,33 9,43

Taulukko 26. Yhdisteiden sisäinen uusittavuus (pitoisuus tuotteesa) pitoisuustasolla 941 µg/kg. Matriisina belgialainen vohveli.

Yhdiste ka. (µg/kg) sd. (µg/kg) cv-%

3-MCPD 1429,38 183,07 12,81

2-MCPD 665,36 40,63 6,11

3-MBPD 1973,11 135,06 6,84

CP-arvoissa voitiin havaita suurempaa keskihajontaa kuin pitoisuuksissa rasvaa kohden.

Tämä johtui todennäköisesti siitä, että uutetun rasvan massassa oli päiväkohtaista vaihtelua. Uuttovaiheessa voi siis olla vielä jonkin verran mahdollisuuksia optimointiin.

9.2.6. Takaisinsaanto

Saanto mittaa anaalysimenetelmän tehoa havaita tutkittavaa analyyttiä. Se mittaa talteen saadun analyytin määrää aineen oikeasta määrästä. Saanto määritettiin kahdella eri pitoisuustasolla väkevöidyn oliiviöljynollamatriisin ja vohvelimatriisin avulla, ja määrityksessä käytettiin hyväksi sisäistä standardia. MRM-menetelmää käytettiin pitoisuuksien määrittämiseen kappaleessa 9.2.4. Kun pitoisuudet tunnettiin, voitiin niistä johtaa takaisinsaanto (rec-%) yhtälön (5) avulla.

Esimerkiksi, kun pitoisuudeksi oli saatu vohvelinäytteelle väkevyystasolla 470 µg/kg (koe suoritettu 22.2.2017, liite 5: näytettä punnittu 0,1014 g) 2502,52 µg/kg, voitiin johtaa yhtälöllä (5) takaisinsaannoksi, kun nollanäytteiden keskimääräiseksi analyyttimääräksi tänä päivänä oli saatu 0,2097 µg:

-

72 Vastaavalla tavalla laskettiin muiden jokaisen päivän yksittäisten analyysien saannot, joista johdettiin sitten keskiarvot kullekin päivälle. Edelleen kaikista tietyn väkevyystason näytteistä voitiin johtaa kolmen päivän takaisinsaantojen keskiarvot.

Lisäksi laskettiin keskihajonnat (sd.) ja variaatiokertoimet (cv-%). Tulokset on esitetty taulukoissa 27 – 30.

Taulukko 27. Analyyttien takaisinsaannot pitoisuustasolla 470 µg/kg. Matriisina ekstra-neitsytoliiviöljy.

Taulukko 28. Analyyttien takaisinsaannot pitoisuustasolla 941 µg/kg. Matriisina ekstra-neitsytoliiviöljy.

Taulukko 29. Analyyttien takaisinsaannot pitoisuustasolla 470 µg/kg. Matriisina belgialainen vohveli.

73 Taulukko 30. Analyyttien takaisinsaannot pitoisuustasolla 941 µg/kg. Matriisina

belgialainen vohveli.

Pienistä standardipoikkeamista ja variaatiokertoimista voitiin päätellä, että keskimääräinen saanto niin kolmen päivän ajalta kuin kunakin analyysipäivänä oli hyvin yhtenevä.

9.2.7. Laskennallinen havaitsemis- ja määritysraja (LOD ja LOQ)

Havaitsemisraja on pienin pitoisuus, jolla voidaan riittävän luotettavasti todeta, sisältääkö näyte analyyttiä vai ei, ilman että määritetään tarkkaa pitoisuutta. Se on siis raja-arvo, jonka alittavilla pitoisuuksilla ei voida todeta positiivisia tuloksia.

Havaitsemisrajan määritys perustuu taustan hajonnan tutkimukseen. Havaitsemisraja voitiin määrittää pitoisuudeksi, joka oli yhtä suuri kuin nollanäytteen keskiarvo lisättynä kolme kertaa nollanäytteen keskihajonnalla yhtälön (7) mukaisesti.⁷¹ Määrityksiin käytettiin kaupalliseen ekstra-neitsytoliiviöljyyn valmistettuja näytteitä ja määritys perustui kolmena eri päivänä suoritettuihin mittauksiin.

Oliiviöljynollanäytteiden pitoisuuksien keskiarvot saatiin soveltamalla yhtälöä (2) luvun 9.2.4. mukaisesti. Tuloksista saatiin johdettua myös keskihajonnat kullekin yhdisteelle kolmen päivän ajalta. Nyt voitiin sijoittamalla yhtälöön (7) määrittää esimerkiksi 3-MCPD:lle LOD-vasteeksi:

LOD-vaste = 9,369136 µg/kg + 3*3,823304 µg/kg = 20,83905 µg/kg ≈ 20,84 µg/kg.

Vastaavalla tavalla voitiin yhtälöllä (9) selvittää määritysraja (LOQ), eli pienin pitoisuus analyyttiä, joka voidaan luotettavasti ja toistettavasti määrittämään näytteestä.

Kaavassa määritettiin LOQ-vaste laskemalla keskimääräinen taustakohina (6 nollanäytteen keskiarvo) ja lisäämällä siihen 10x nollanäytteiden keskihajonta. Saadut LOD- ja LOQ-vasteet on esitetty taulukkossa 31.

74 Taulukko 31. LOD- ja LOQ-vasteet ekstra-neitsytoliiviöljy-näytteellä.

Yhdiste LOD-vaste saadun LOD-vasteen arvon ja verrannon avulla voitiin edelleen selvittää laskennallinen LOD-pitoisuus kaavan (8) mukaisesti:

Sijoittamalla saadut arvot ccal4 = 365,7702 µg/kg ja vaste(ka.)cal4 = 3352,333 ja esimerkiksi 3-MCPD:n LOD-vaste = 20,83905, saatiin:

-

µ

.

Vastaavalla tavalla määritettiin laskennalliset määritysrajat LOQ-vasteen avulla yhtälöllä (10). Tulokset on esitetty taulukossa 32.

Taulukko 32. Laskennalliset havaitsemis- ja määritysrajat ekstra-neitsytoliiviöljynäytteellä.

Yhdiste LOD (µg/kg) LOQ (µg/kg)

3-MCPD 2,3 5,2

2-MCPD 1,9 5,7

3-MBPD 2,7 3,3

Laskennallisten havaitsemis- ja määritysrajojen arvojen suuruusluokka oli yllättävän alhainen. Mikäli ne pitävät paikkanssa, ovat ne erinomaisia, sillä EFSA vaatii 3-MCPD:n suhteen menetelmältä LOQ-raja-arvon 100 µg/kg.³ Laskennallisia pitoisuuksia määritettäessä verrannolla, matriisisuora oli valmistettu EURL-”nollaöljyyn”, kun ekstra-neitsytoliiviöljyn nollanäytteisiin käytettiin kaupallista oliiviöljyä. Se, että matriisit poikkesivat näin toisistaan, voi selittää laskennallisten arvojen suuruusluokan.

Suositellaankin, että ne todennetaan uusintamäärityksissä, kun menetelmä validoidaan laajemmin ennen käyttöönottoa. LOD- ja LOQ-vasteiden suuruusluokkaa sen sijaan voitiin pitää täysin uskottavana, sillä itse mittauksissa kaupallisesta ekstra-neitsytoliiviöljystä valmistetuista nollanäytteistä mitattujen analyyttien pitoisuudet olivat ajoittain hyvinkin alhaiset, mutta silti määritettävissä MRM-menetelmällä. LOD ja LOQ määritettiin vain oliiviöljymatriisesta, sillä ei ollut saatavilla vohvelimatriisin nollanäytteitä.

75 9.2.8. Oikeellisuus

Mittaustulosten oikeellisuus (engl. trueness) voitiin määrittää vertailututkimuksen tuloksia hyödyntämällä. EURL-PAH (engl. European Union Reference Laboratory for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) järjesti analyysimenetelmästä vuoden 2016 kesällä vertailututkimuksen.⁷³ Vertailututkimuksen tarkoituksena oli selvittää Euroopan virallisten vertailulaboratorioiden valmiutta analysoida MCPD- ja glysidyyliestereitä elintarvikkeista.

Vertailututkimuksessa oli samat näytematriisit kuin validoinnin määrityksessä: ekstra-neitsytoliiviöljynäyte ja luonnollisesti kontaminoitunut belgialainen vohveli. Taulukossa 33 on esitetty vertailunäytteistä mitatut pitoisuudet kullekin yhdisteelle sekä tutkimustulosten ohessa julkaistut vertailuarvot ja standardipoikkeamat. Taulukossa esitetyt pitoisuudet ovat rinnakkaisnäytteistä mitattujen pitoisuuksien keskiarvot.

Taulukko 33. Vertailututkimuksen tulokset MCPD-yhdisteille.

Yhdiste

Vertailemalla mitattuja pitoisuuksia yhtälön (6) mukaisesti vertailututkimuksen kokonaistuloksiin, voitiin laskea z-arvot (kuinka monta standardipoikkeamaa saatu tulos eroaa kokonaiskeskiarvosta) oliiviöljy- ja vohvelinäytteelle.

Esimerkiksi oliiviöljyn tapauksessa 3-MCPD:n vertailuarvo oli 963 µg/kg ja σP oli 154,9 µg/kg. Sijoittamalla xmääritetty-arvoksi vertailuöljystä mitattujen pitoisuuksien keskiarvo 958,09 yhtälöön (6) saatiin z-arvoksi:

Vertailututkimuksessa selvitettiin myös vohvelinäytteen pitoisuuksia tuotteessa (C_P -arvot). Arvo johdettiin pitoisuuden arvosta kertomalla se uutetun rasvan ja näytteen massan suhteella yhtälön (3) mukaisesti mitattujen arvojen ja vertailuarvojen avulla (taulukko 34). Näin voitiin myös varmentaa, että analyysin ensimmäinen vaihe, eli rasvan uutto kiinteästä näytteestä onnistuu toistettavasti.

76 Taulukko 34. Vertailututkimuksen tulokset MCPD-yhdisteille. Pitoisuus tuotetta kohti

(C_P-arvo).

Taulukossa 35 on esitetty vertailulukuihin perustuvat z-arvot. Kun z-arvo on itseisarvoltaan pienempi kuin 2, voidaan tulosta pitää tyydyttävänä. Jos arvo olisi yli 3, olisi tulos huono. Mitattujen tulosten oikeellisuuden voitiin siis todeta olevan erinomainen.

Taulukko 35. Vertailututkimuksen tulokset MCPD-yhdisteille.

Yhdiste z-arvo

Yhtälöllä (11) voitiin määrittää sisäisen uusittavuuden mittaustulosten avulla mittausepävarmuuden arvo analyysimenetelmän tuloksille.⁷⁰ Esimerkiksi kun pitoisuustasolla 470 µg/kg oli oliiviöljynäytteen sisäisen uusittavuuden variaatiokertoimeksi laskettu 5,063718 µg/kg (taulukko 21), saatiin:

≈ 10,13 µg/kg

Vastaavalla tavalla laskettiin muiden oliiviöljy- ja vohvelinäytteiden mittausepävarmuudet kahdella eri pitoisuustasolla. Taulukoissa 36 ja 37 on esitetty mittausepävarmuudet oliiviöljy- ja vohvelinäytteille kahdella eri pitoisuustasolla.

Taulukko 36. Laajennettu mittausepävarmuus (%) kahdella eri pitoisuustasolla.

Matriisina ekstra-neitsytoliiviöljy.

Yhdiste Pitoisuustaso 470 µg/kg Pitoisuustaso 941 µg/kg

3-MCPD 10,13 5,35

2-MCPD 6,86 6,15

3-MBPD 16,26 12,58

77 Taulukko 37. Laajennettu mittausepävarmuus (%) kahdella eri pitoisuustasolla.

Matriisina belgialainen vohveli.

Yhdiste Pitoisuustaso 470 µg/kg Pitoisuustaso 941 µg/kg

3-MCPD 24,68 27,78

2-MCPD 16,03 17,04

3-MBPD 10,49 7,83

Validointia suorittaessa oli saatavilla vain yhden vertailukokeen tulokset. Laajennettu mittausepävarmuus voidaan laskea tarkemmin, kun saatavilla on useamman vertailukokeen tulokset (saavutetut z-arvot ja vertailuarvot). Tällöin voidaan labotorioiden väliset tulokset huomioiden sulkea pois mahdollisuus systemaattisesta virheestä laboratorionsisäisessä menetelmässä.

9.3. GC-MS- ja GC-MS/MS-mittaustulosten vertailu

Työt aloitettiin GC-MS-laitteistolla, mutta lukuisista ongelmista johtuen, menetelmää ei aluksi saatu pystytettyä. Ongelmana oli esimerkiksi se, ettei laitteen herkkyyttä saatu kohdilleen, vaan matriisihäiriöt estivät kvantitatiivisen pitoisuuksien määrittämisen.

Herkkyyttä ja laitteiston toimintaa yritettiin tehostaa muun muassa puhdistamalla ionilähde ja vaihtamalla kolonni uudempaan. Kuitenkin suuri tausta häiritsi kvantitointia. Menetelmää pyrittiin optimoimaan virtausnopeuden ja lämpötilaohjelmoinnin avulla tuloksetta.

Lopulta analyysireaktiot suoritettiin uudelleen ja mittaukset ajettiin GC-MS/MS-laitteistolla MRM-menetelmällä. Tällöin voitiin todeta tarkat retentioajat yhdisteille.

Koska molemmissa laitteistoissa käytettiin samaa kolonnia, voitiin tarkat aikaikkunat määrittää GC-MS-laitteen SIM-menetelmään. Näin saatiin lopulta mitattua pitoisuudet tyydyttävällä tarkkuudella myös GC-MS-SIM-menetelmällä.

Liitteessä 7 on GC-MS-menetelmällä manuaalisesti integroimalla saatujen piikkien pinta-alat. Näistä voitiin edelleen yhtälöllä (2) laskea analyyttien pitoisuudet kolmen analyysipäivän rinnakkaisnäytteiden keskiarvoina (taulukot 38 ja 39). Pitoisuudet laskettiin vastaavalla tavalla kuin luvussa 9.2.4.

78 Taulukko 38. GC-MS-menetelmällä määritetyt pitoisuudet. Matriisina

ekstra-neitsytoliiviöljy.

Väkevyystaso 470 µg/kg Väkevyystaso 941 µg/kg Yhdiste 3-MCPD 2-MCPD 3-MBPD 3-MCPD 2-MCPD 3-MBPD

Taulukko 39. GC-MS-menetelmällä määritetyt pitoisuudet. Matriisina belgialainen vohveli.

Väkevyystaso 470 µg/kg Väkevyystaso 941 µg/kg Yhdiste 3-MCPD 2-MCPD 3-MBPD 3-MCPD 2-MCPD 3-MBPD

Vertaamalla taulukoissa esitettyjä tuloksia luvussa 9.2.5 esitettyihin tuloksiin, voitiin todeta, että GC-MS-menetelmällä saavutettiin kolmen päivän keskiarvona suhteellisen hyvä vastaavuus, mutta GC-MS-menetelmän keskihajonnat ja täten variaatiokertoimet ovat merkittävästi suuremmat. Mittaustulosten arvoissa on suurempaa hajontaa eri päivien välillä. SIM-menetelmällä mitatut tulokset eivät ole yhtä toistettavia ja yhteneviä jokaisella mittauskerralla verrattuna MRM-menetelmällä saatuihin tuloksiin.

GC-MS-menetelmällä saatiin epätarkemmat kromatogrammit ja tuloksista integroitiin piikkien pinta-alat manuaalisesti. Esimerkiksi SIM-menetelmällä ajetuissa kromatogrammeissa esiintyi tasaista taustahäiriötä m/z-suhteella 147, mikä häiritsi ajoittain 3-MCPD:n määritystä. Myös rasvahappometyyliestereistä johtuvat piikit olivat GC-MS-SIM-kromatogrammeissa merkittävämpiä häiriötekijöitä kuin MRM-kromatogrammeissa. GC-MS/MS-menetelmällä saavutettiin suurempi kvantitatiivinen tarkkuus, kun seurattiin vain tiettyjä primääristen ionien hajoamista tytärioneiksi.

Lisäksi tulosten käsittely oli MRM-menetelmällä yksikäsitteisempää kun saatiin selkeämmät kromatogrammit, joiden käsittelyssä oli apuna tehokas QuanLynx-ohjelmisto. Kaiken kaikkiaan analyyttien pitoisuuksien mittaaminen oli huomattavasti helpompaa ja tehokkaampaa GC-MS/MS-laitteistolla.

79

10. Johtopäätökset ja pohdinnat

Työssä pystyttiin onnistuneesti epäsuora analyysimenetelmä, jolla näytteen sisältämät 2-MCPD-, 3-MCPD- ja glysidyyliesterit hydrolysoitiin, ja vapaista muodoista valmistettujen fenyyliboorihappojohdannaisten pitoisuudet määritettiin kaasukromatografia-massaspektrometrisesti. Menetelmä soveltuu estereiden samanaikaiseen määritykseen oliiviöljy ja vohvelimatriiseista. Menetelmän todettiin validointivaiheessa olevan spesifinen haluttujen analyyttien suhteen ja kromatogrammien näyttävän selektiivisesti vain analyyttipiikit ilman suuria häiriöitä samoilla retentioajoilla. EURL-vertailukokeen vertailunäytteistä mitatuista tuloksista voitiin todeta menetelmän oikeellisuus, sillä saadut arvot vastasivat vertailuarvoja erinomaisesti. Määritysrajan voitiin todeta täyttävän EFSA:n vaatimukset erinomaisesti, sillä vaatimuksena LOQ-arvoksi 3-MCPD-esterille on 100 µg/kg, kun menetelmän LOQ-vasteeksi määritettiin työssä 48 µg/kg.

Happamissa oloissa suoritettu vaihtoesteröinti on tehokkain tapa hydrolysoida MCPD-yhdisteiden esterisidokset. Vapaat muodot analyyteistä uutetaan vaihtoesteröinnin jälkeen etyyliasetaatilla ja derivoidaan orgaanisessa liuottimessa. Vaihtoehtona olisi derivointi vesifaasissa. Pystytetyn menetelmän etuna on pienempi kulutus derivointireagenssia, mikä johtaa pienempään taustahäiriöihin kromatogrammissa, ja voidaan saavuttaa alhaisemmat havaitsemisrajat. Lisäksi orgaanista liuotinta kulutetaan analyysissä vain vähän, mikä on vihreän kemian periaatteiden mukaista.

Ennen menetelmän varsinaista käyttöönottoa olisi kuitenkin tarpeen suorittaa laajempi validointi. Esimerkiksi määritetty lineaarinen alue ei kattanut täysin koko mahdollista määritysaluetta. Suurin osa työssä tutkituista näytteistä kuitenkin asettui kalibraatioalueelle.

Työn aikana oli ongelmia saada menetelmä toimimaan myös GC-MS-laitteistolla.

Lopulta pitoisuudet voitiin tyydyttävällä toistettavuudella määrittää myös SIM-menetelmällä. Mahdollinen syy ongelmiin oli vanhentunut laitekanta, jolloin kromatografinen herkkyys ei riittänyt, kun määritettiin pieniä pitoisuuksia analyyttejä monimutkaisista matriiseista. Edelleen käytännön kvantitatiivisessa määrityksessä voitiin todeta, että GC-MS/MS-laitteistolla, MRM-menetelmällä ja QuanLynx-ohjelmistolla voitiin saavuttaa huomattavasti yksikäsitteisempi, herkempi ja spesifisempi tapa määrittää analyytit.

Pystytetyssä menetelmässä määritettiin esterit epäsuorasti. Tällöin ei saatu tietoa esimerkiksi siitä, mistä rasvahapoista esterit koostuvat, eikä tietoa mahdollisista mono- ja diesterisuhteista 2-MCPD- ja 3-MCPD-estereiden kohdalla. On todettu, että di- ja monoesterit esimerkiksi hydrolysoituvat eri tavalla, joten niillä voi olla toisistaan poikkeavat toksikologiset profiilit. Voisi siis olla hyödyllistä tuntea myös tutkittavien esterien mono- ja diesterisuhteet ja mahdollisesti rasvahappokoostumus. Kuitenkin pystytetyllä menetelmällä voidaan saada hyödyllistä tietoa erilaisten elintarvikkeiden

80 sisältämistä 2-MCPD-, 3-MCPD- ja glysidyyliesteripitoisuuksista. Kun on osoitettu sen pätevän oliiviöljy- ja vohvelimatriiseissa, voidaan lähteä validoimaan menetelmää myös muille matriiseille. Jatkossa voisi esimerkiksi kartoittaa 2-MCPD-, 3-MCPD- ja glysidolipitoisuuksia erilaisissa elintarvikkeissa Suomen ja Pohjoismaiden markkinoilla.

Näistä ei ole vielä tutkimustietoa vaikka pitoisuuksia on määritetty esimerkiksi Aasian ja Pohjois-Amerikan markkinoilla. Kartoitustutkimusten perusteella voisi kehittää tietokannat MCPD-yhdisteiden esiintymisestä, ja näitä tietokantoja voisi käyttää hyödyksi, kun arvioidaan yksilön riskiä altistua kyseisille yhdisteille.

81

Lähdeviitteet

[1] R. Jędrkiewicz, M. Kupska, A. Głowacz, J. Gromadzka and J. Namieśnik, Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2016, 56, 2268-2277.

[2] EUR-Lex: 2014/661/EU: Commission Recommendation of 10 September 2014 on the monitoring of the presence of 2 and monochloropropane-1,2-diol (2 and MCPD), 2- and 3-MCPD fatty acid esters and glycidyl fatty acid esters in food, Online,

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX%3A32014H0661 [HAETTU 28.11.2016]

[3] EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM), EFSA Journal, 2016, 14.

[4] X. Peng, J. Gan, Q. Wang, Z. Shi and X. Xia, Toxicology, 2016, 372, 1-11.

[5] A. Freudenstein, J. Weking and B. Matthäus, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2013, 115, 286-294.

[6] C. Crews, A. Chiodini, M. Granvogl, C. Hamlet, K. Hrnčiřík, J. Kuhlmann, A. Lampen, G.

Scholz, R. Weisshaar, T. Wenzl, P. R. Jasti and W. Seefelder, Food Additives & Contaminants:

Part A, 2013, 30, 11-45.

[7] Z. Teng and Q. Wang, Chemistry and Safety of 3-MCPD, CRC Press, 2014, p. 89-112.

[8] T. Buhrke, F. Frenzel, J. Kuhlmann and A. Lampen, Arch. Toxicol., 2015, 89, 2243-2251.

[9] B. Q. Lee and S. M. Khor, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2015, 14, 48-66.

[10] IARC (International Agency for Research on Cancer), 3-Monochloro-1,2-propanediol, 101, International Agency for Research on Cancer, Online,

http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol101/mono101-010.pdf, 2011. [Haettu 28.11.2016]

[11] A. Becalski, T. Zhao, F. Breton and J. Kuhlmann, Food Addit. Contam. , Part A, 2016, 33, 1499-1508.

[12] B. Matthäus, K. Vosmann, P. Weitkamp, D. Grundmann and H. J. Kersting, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2016, 118, 418-424.

[13] E. Ozcagli, B. Alpertunga, C. Fenga, M. Berktas, C. Tsitsimpikou, M. F. Wilks and Î.

Tsatsakis, Food Chem. Toxicol., 2016, 89, 1-7.

[14] E. Vicente, A. P. Arisseto, R. P. Z. Furlani, V. Monteiro, L. M. Goncalves, A. L. D. Pereira and M. C. F. Toledo, Food Res. Int., 2015, 77, 310-314.

[15] A. D. Troise and V. Fogliano, Trends Food Sci. Technol., 2013, 33, 63-74.

[16] A. K. K. Rahn and V. A. Yaylayan, Food Chem., 2015, 166, 301-308.

[17] K. Hrncirik and G. van Duijn, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2011, 113, 374-379.

82 [18] M. R. Ramli, W. L. Siew, N. A. Ibrahim, R. Hussein, A. Kuntom, R. A. A. Razak and K.

Nesaretnam, JAOCS J Am Oil Chem Soc, 2011, 88, 1839-1844.

[19] R. Pijpers, G. R. Longarela, R. G. A. De, T. S. Huat, T. H. Fang, M. D. Z. M. Z. Bin, A.

Noor, A. Krishnan, H. E. Berg and D. R. Appleton, Process of refining a crude palm fruit oil product, Google Patents, 2015.

[20] J. Šmidrkal, M. Tesarová, I. Hrádková, M. Bercíková, A. Adamcíková and V. Filip, Food Chem., 2016, 211, 124-129.

[21] B. Matthäus and F. Pudel, Lipid Technology, 2013, 25, 151-155 (DOI:10.1002/lite.201300288).

[22] W. Cheng, G. Liu and X. Liu, J. Agric. Food Chem., 2016, 64, 5919-5927.

[23] A. K. K. Rahn and V. A. Yaylayan, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2011, 113, 330-334.

[24] X. Zhang, B. Gao, F. Qin, H. Shi, Y. Jiang, X. Xu and L. Yu, J. Agric. Food Chem., 2013, 61, 2548-2555.

[25] Z. Zhang, B. Gao, X. Zhang, Y. Jiang, X. Xu and L. Yu, J. Agric. Food Chem., 2015, 63, 1839-1848.

[26] H. Zhang, P. Jin, M. Zhang, L-Z. Cheong, P. Hu, Y. Zhao, L. Yu, Y. Wang, Y. Jiang and X. Xu, J. Agric. Food Chem., 2016, 64, 5887-5892.

[27] C. Li, L. Li, H. Jia, Y. Wang, M. Shen, S. Nie and M. Xie, Food Chem., 2016, 199, 605-611.

[28] O. Özdikicierler, F. Yemisçioglu and A. Saygin Gümüskesen, Eur. Food Res. Technol., 2016, 242, 805-813.

[29] C. Li, Y. Zhou, J. Zhu, S. Wang, S. Nie and M. Xie, LWT - Food Sci. Technol., 2016, 69, 586-592.

[30] F. Pudel, P. Benecke, K. Vosmann and B. Matthäus, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2016, 118, 396-405.

[31] A. Ermacora and K. Hrncirik, Food Chem., 2014, 161, 383-389.

[32] M. Aniolowska and A. Kita, J. Am. Oil Chem. Soc., 2015, 92, 1621-1631.

[33] K. Nagy, L. Sandoz, B. D. Craft and F. Destaillats, Food Addit. Contam. , Part A, 2011, 28, 1492-1500.

[34] B. D. Craft, K. Nagy, L. Sandoz and F. Destaillats, Food Addit. Contam. Part A Chem.

Anal. Control Exposure Risk Assess., 2012, 29, 354-361.

[35] M. R. Ramli, W. L. Siew, N. A. Ibrahim, A. Kuntom and R. A. Abd. Razak, Food Addit.

Contam. Part A Chem. Anal. Control Exposure Risk Assess., 2015, 32, 817-824.

[36] H. Zhou, Q. Jin, X. Wang and X. Xu, Eur. Food Res. Technol., 2014, 238, 495-501.

83 [37] A. Ermacora and K. Hrncirik, Food Chem., 2014, 150, 158-163.

[38] A. P. Arisseto, P. F. C. Marcolino and E. Vicente, Food Addit. Contam. , Part A, 2015, 32, 1431-1435.

[39] J. Kuhlmann, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2011, 113, 335-344.

[40] S. W. C. Chung, B. T. P. Chan, H. Y. Chung, Y. Xiao and Y. Y. Ho, Food Addit. Contam. , Part A, 2013, 30, 1248-1254.

[41] N. Hinrichsen, Lipid Technology, 2016, 28, 65-67

[42] M. Kusters, U. Bimber, S. Reeser, R. Gallitzendorfer and M. Gerhartz, J. Agric. Food Chem., 2011, 59, 6263-6270.

[43] K. Miyazaki and K. Koyama, J. Am. Oil Chem. Soc., 2016, 93, 885-893.

[44] D. Tennant and J. P. Gosling, Food Addit. Contam. , Part A, 2015, 32, 1397-1405.

[45] H. Karl, S. Merkle, J. Kuhlmann and J. Fritsche, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2016, 118, 406-417.

[46] A. Sadowska-Rociek and E. Cieslik, J. Verbraucherschutz Lebensmittelsicherh., 2015, 10, 117-122.

[47] H. Y. Chung, S. W. C. Chung, B. T. P. Chan, Y. Y. Ho and Y. Xiao, Food Addit. Contam. , Part A, 2013, 30, 1508-1512.

[48] N. Kaze, Y. Watanabe, H. Sato, K. Murota, M. Kotaniguchi, H. Yamamoto, H. Inui and S.

Kitamura, Lipids, 2016, 51, 913-922.

[49] K. Wakabayashi, Y. Kurata, T. Harada, Y. Tamaki, N. Nishiyama and T. Kasamatsu, J.

Toxicol. Sci., 2012, 37, 691-698.

[50] K. E. Appel, K. Abraham, E. Berger-Preiss, T. Hansen, E. Apel, S. Schuchardt, C. Vogt, N.

Bakhiya, O. Creutzenberg and A. Lampen, Arch. Toxicol., 2013, 87, 1649-1659.

[51] H. Honda, M. Onishi, K. Fujii, N. Ikeda, T. Yamaguchi, T. Fujimori, N. Nishiyama and T.

Kasamatsu, Food and Chemical Toxicology, 2011, 49, 2536-2540.

[52] S. Onami, Y. Cho, T. Toyoda, J. Akagi, S. Fujiwara, R. Ochiai, K. Tsujino, A. Nishikawa and K. Ogawa, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2015, 73, 726-731.

[53] J. Sun, S. Bai, W. Bai, F. Zou, L. Zhang, Z. Su, Q. Zhang, S. Ou and Y. Huang, J. Agric.

Food Chem., 2013, 61, 9955-9960.

[54] H. Zhang, H. Yu, X. Wang, W. Zheng, B. Yang, J. Pi, G. He and W. Qu, PLoS One, 2012, 7, e43004.

[55] S. Xie, Y. Zhu, L. Ma, Y. Lu, J. Zhou, Y. Gui and L. Cao, Reprod Biol Endocrinol, 2010, 8, 37.

84 [56] S. Sawada, A. Oberemm, T. Buhrke, J. Merschenz, A. Braeuning and A. Lampen, Arch.

Toxicol., 2016, 90, 1437-1448.

[57] J. Ji, L. Zhang, H. Zhang, C. Sun, J. Sun, H. Jiang, M. H. Abdalhai, Y. Zhang and X. Sun, Toxicol. Res., 2016, 5, 689-696.

[58] A. Braeuning, S. Sawada, A. Oberemm and A. Lampen, Food Chem. Toxicol., 2015, 86, 374-84.

[59] J. Lu, Z. Wang, M. Ren, G. Feng, B. Ye, Y. Wang, B. Fang, X. Deng and S. Guan, Environ. Toxicol. Pharmacol., 2015, 40, 453-458.

[60] H. Zhou, Q. Jin, X. Wang and X. Xu, Food Control, 2014, 36, 111-118.

[61] H. Steenbergen, K. Hrnčiřík, A. Ermacora, S. de Koning and H. Janssen, Journal of Chromatography A, 2013, 1313, 202-211.

[62] A. Ermacora and K. Hrncirik, J. Am. Oil Chem. Soc., 2013, 90, 1-8.

[63] V. G. Samaras, A. Giri, Z. Zelinkova, L. Karasek, G. Buttinger and T. Wenzl, Journal of Chromatography A, 2016, 1466, 136-147.

[64] K. Hrncirik, Z. Zelinkova and A. Ermacora, European Journal of Lipid Science and Technology, 2011, 113, 361-367.

[65] N. Kaze, H. Sato, H. Yamamoto and Y. Watanabe, J. Am. Oil Chem. Soc., 2011, 88, 1143-1151.

[66] Agilent Technologies, Inc. © 2003 2nd ed., 5973 Mass Selective Detector Hardware Manual (G2589-90071)

[67] Waters Micromass Quattro micro GC Mass Spectrometer Operator’s Guide, Waters 71500069602 Revision A, © Waters Corporaton, 2004, US

[68] T. Taylor. LCGC North America. 2015, 33(6), 438.

[69] A. M. Nienow, I. C. Poyer, C. T. Jafvert. Chemosphere, 2009, 75(8), 1015-1020.

[70] Validation of chemical analytical methods, NMKL Procedure No. 5, 2005.

[71] T. Ehder (toim.), Kemian metrologian opas, MIKES, 2005.

[72] Komission päätös, tehty 14 päivänä elokuuta 2002, neuvoston direktiivin 96/23/EY täytäntöönpanosta määritysmenetelmien suorituskyvyn ja tulosten tulkinnan osalta (tiedoksiannettu numerolla K(2002) 3044) (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti) (2002/657/EY) [HAETTU 1.5.2017:

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/fi/TXT/?uri=CELEX%3A02002D0657-20020817]

[73] S. Bratinova, V. Samaras, T. Wenzl, Report on the inter-laboratory comparison organised by the European Union Reference Laboratory for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons - MCPD esters and glycidyl esters in food, JRC, 2016.

85

Liitteet

Liite 1. Lineaarisuus 10.02.2017 Liite 2. Lineaarisuus 01.03.2017 Liite 3. Lineaarisuus 21.03.2017

Liite 4. GC-MS/MS-mittauksilla saadut tulokset öljynäytteistä.

Liite 5. GC-MS/MS-mittauksilla saadut tulokset vohvelinäytteistä. Lisäksi vohvelin esikäsittelyyn punnittu massa näytettä sekä siitä uutetun rasvan massa.

Liite 6. Lisätyt määrät standardeja.

Liite 6. Lisätyt määrät standardeja.

In document 2-kloori-1,3-propaanidiolin, 3-kloori-1,2-propaanidiolin ja 2,3-epoksi-1-propanolin rasvahappoestereiden kaasukromatografia-massaspektrometrinen kvantitatiivinen analytiikka epäsuoralla menetelmällä (sivua 67-0)