Koska EKP3-kannan havaittiin reagoivan EKP8-kantaa voimakkaammin mutatoimalla genomiaan, ilmiötä tarkasteltiin tarkemmin altistamalla EKP3 erilaisille faagiyhdistelmille ja yksittäisille faageille. Geneettisesti sopeutuvan
EKP3-kannan jatkokäsittelyn tarkoituksena oli selvittää, kuinka kyseinen bakteerikanta kehittää resistenssimekanisminsa yksittäiselle faagille (EKP3P5), sekä faagikoktailille (EKP3P1, EKP3P2, EKP3P4, EKP3P5, EKP8P1, EKP8P2, EKP8P3 ja EKP8P4). Kahden eri koeasetelman tuloksena tavoiteltiin laajempaa kuvaa faagiresistenssin muodostumisesta sekä CRISPR-lokuksen toiminnasta.
Faagikoktailaltistuksen yhteydessä pyrittiin myös kehittämään uusi EKP3 p.c mutantti altistamalla EKP3 samaiselle faagikoktailille.
Vaiheittaisen kokeen aikana suoritetut infektiotestit epäonnistuivat useamman kerran. Nestekasvatusten joukossa ollut EKP3P5-faagi vaikeutti tasaisen bakteerikasvuston muodostumista ja sai aikaan isoja plakkeja tai laikuittaista kasvua hankaloittaen tulosten analysointia. Täten tippatestejä toistettiin puhdasviljelmien avulla, joita tehtiin tuoreistamisen yhteydessä. Tulokset laadittiin selkeimpien infektiotestien perusteella. Vaiheittaisen kokeen ensimmäisessä faagikoktailaltistuksessa EKP3 kykeni kehittämään faagiresistenssin kasvatusliuoksessa olleen EKP3P5:n lisäksi EKP3P2- ja EKP8P2-faageille (Kuva 12).
Näiden faagien infektiokyvyissä tapahtuneet muutokset johtuvat todennäköisesti EKP3:n mutaatioista, jotka ovat 10 % ravinnepitoisuuden ja EKP3P5:n aikaansaamia. Havaittujen muutosten lisäksi huomatiin, kuinka EKP3 kasvoi EKP3P5- ja EKP8P3-lysaattien vaikutuksesta jopa paremmin muihin verrattuna (Kuva 12). Vaiheen 2. kasvatuksessa EKP3 oli jälleen mutatoitunut ja muuttunut resistentiksi EKP8P1-faagia, sekä osittain myös EKP3P4-faagia vastaan (Kuva 12).
Viimeisessä vaiheessa nestekasvatus tuoreistettiin 10 % ja 100 % LB-liuokseen, jotta voitiin tarkastella ravinnepitoisuuden kasvun vaikutusta resistenssimuutoksiin.
Tulokset kuitenkin osoittautuivat lähes samanlaisiksi, mikä voi johtua siitä, että edeltävät kahdeksan vuorokauden käsittelyt olivat muokanneet EKP3-bakteeria jo huomattavasti. Pieniä eroavaisuuksia ilmeni paikoittain mahdollisesti ravinnepitoisuuksien vuoksi: EKP3P4 ei muodostanut plakkeja 100 % LB:ssä kasvaneessa kasvatuksessa, toisin kuin 10 % LB:n kasvatuksessa (Kuva 12). Tämän lisäksi 10 % kasvatuksessa havaittiin EKP3P5-lysaatissa runsaampi bakteerikasvusto, jota ei 100 % kasvatuksessa ilmennyt, mutta molemmissa havaittiin runsaampaa kasvua EKP3P2-lysaatin läsnä ollessa (Kuva 12). Bakteeri
tavoittelee mahdollista tasapainoa muokkaamalla puolustuskoneistoa ja kasvuaan, vaikka herkistyikin EKP8P1-faagille jälleen 10 % kasvatuksen tapaan (Kuva 12).
Tulokset osoittautuivat mielenkiintoisiksi, koska bakteeri kehitti resistenssimekanismeja faageja vastaan, joihin se ei edes ollut kontaktissa vasta kuin infektiotestin aikana. Tämä kuvastaa, kuinka faagit hyödyntävät isäntäbakteerin samaisia kohdereseptoreita. Bakteerin kehittämät mutaatiot vaikuttavat suoraan EKP3P5:n lisäksi myös EKP3P2, EKP3P4, EKP8P1 ja EKP8P3 faagien infektiokykyyn. Täten voidaan todeta, kuinka bakteerin muuntuvat resistenssimekanismit toimivat tehokkaasti kohteena olevan faagin lisäksi myös muita faageja vastaan, mikä voi heikentää faagiterapian tehokkuutta hoitonäkökulmasta katsottuna.
Uuden EKP3 p.c:n kehittäminen villityypin EKP3-kannasta epäonnistui useamman kerran. Kuudesta altistuskokeesta vain puolet selvisivät faagikoktailkäsittelystä.
Selvinneistä bakteereista vain yhtä tarkasteltiin vielä tarkemmin. Noin 13 tuntia kestänyt faagikoktailaltistus saa aikaan bakteerissa huomattavia muutoksia.
Bakteerikasvatukset tuoreistettiin ennen varsinaista analysointia, jotta mutatoituneiden bakteerien määrä saatiin optimaaliseksi analyysejä varten.
Infektiotestit osoittivat, kuinka tavoiteltu ”uusi” EKP3 p.c mutantti ei ollut täysin resistentti kaikille faageille, sillä EKP3P1 kykeni yhä tehokkaasti infektoimaan sitä (Kuva 12). Faagiterapian näkökulmasta katsottuna EKP3:n selviytyminen faagikoktailaltistuksesta on huolestuttavaa. Bakteeri ei kuitenkaan kyennyt kehittämään resistenssiä EKP3P1-faagia vastaan, joten faagiterapian kannalta tulisi löytää EKP3P1:n kaltaisia, sinnikkäästi infektoivia, faageja.
Faagiresistenssimekanismien kehittymistä tarkasteltiin sekvensoimalla vaiheiden 1.
ja 3. kasvatuksia, jotka olivat kasvaneet 10 % LB:ssä kokeen aikana. Lisäksi myös uuden EKP3 p.c mutantin homogeeninen nestekasvatus analysoitiin DNA-sekvensoinnin avulla tarkemmin. Sekvenssejä vertailtiin villityypin EKP3-kannan genomiin, minkä avulla tarkasteltiin faagiekäsittelyjen aikaansaamia mutaatioita (Liite 1, Liite 4). Mutaatioiden määriä tarkasteltaessa voitiin huomata, kuinka SNV:t olivat jokaisessa bakteerinäytteessä yleisimpiä mutaatioita (Taulukko 8).
Vaiheittaisen kokeen ensimmäinen bakteerikasvatus sisälsi kvantitatiivisesti enemmän mutaatioita kuin kolmannen vaiheen kasvatus, erityisesti SNV:n suhteen (Taulukko 8). Tämä on voinut johtua EKP3:n stressivasteesta, jonka tuloksena bakteeri on EKP3P5-faagin vaikutuksesta ja alhaisen ravinnepitoisuuden vuoksi joutunut sopeutumaan säätelemällä geeniekspressiota ja tuottamalla genomisia mutaatioita. Suurempien mutaatioiden, kuten UNV:n, insertioiden, deleetioiden sekä korvautumisen, kokonaismäärät olivat huomattavasti pienemmät DNA-sekvenssejä, mutta uuden EKP3 p.c-mutantin kehittymisen yhteydessä näiden mutaatioiden esiintyminen oli huomattavasti runsaampaa (Taulukko 8).
Vaiheittaisessa kokeessa homotsygoottisten mutaatioiden osuudet (28 %) pysyivät yhtäläisinä, vaikka tarkastelun kohteena olivat toisistaan eroavat heterogeeniset nestekasvatukset (Taulukko 8). Uuden EKP3 p.c-kannan homogeenisestä bakteeripopulaatiossa tapahtuneista geneettisistä mutaatioista 52 % ilmeni homotsygoottina, mikä kuvastaa bakteerien suurta vaihtelua yhden bakteeripesäkkeen sisällä (Taulukko 8).
Geenimutaatioita tarkasteltaessa voitiin havaita, kuinka EKP3P5-faagi aiheutti vaiheittaisen koeasetelman tuloksena suuria muutoksia 1. vaiheen bakteerikasvatuksessa (Liite 4). Tuoreistamisen seurauksena koodaavissa geeneissä tapahtuneita mutaatioita ei ilmennyt läheskään yhtenevästi 3. vaiheen bakteerikasvatuksessa, mikä oli yllättävää samaisessa faagipaineessa (Liite 4).
Bakteerien kyky palautua faagien vaikutuksesta on tuloksista suoraan nähtävissä.
Koodaavissa geeneissä tapahtuneiden mutaatioiden vähäisyys 3. vaiheen bakteerikasvustossa tarkoittaakin sitä, että bakteerit muuntavat aikaisemmin mutatoituneet geenit takaisin villityypin EKP3-bakteerin kaltaisiksi.
Faagialtistuskokeiden tulokset erosivat toisistaan funktionaalisten geenimutaatioiden määrän suhteen. EKP3P5-faagilla käsitelty EKP3 mutatoitui runsaammin koodaavista geeneistä, mutta palautui käsittelyjen yhteydessä tehokkaasti, toisin kuin faagikoktailaltistuskokeessa, jossa kyseisten geenimutaatioiden määrä oli alhaisempi (Liite 4). Faagikoktailaltistus vaikutti vain viiden eri kohdeproteiinin geenisekvensseihin, mitkä voivatkin olla osallisena faagiresistenssin kehittymiselle (Taulukko 8, Liite 4). EKP3P5-faagi-infektion
tuloksena kehittyneet mutaatiot voivatkin alhaisen homotsygoottisuudensa vuoksi olla useamman bakteerin kehittämiä mutaatioita (Taulukko 8, Liite 4). Erilaisia mutaatioita kehittäneet bakteerit kykenevät omalla tavallaan puolustautumaan faageilta, luoden samalla ”faagivapaan” ympäristön mutatoitumattomille bakteereille. Ei voida tarkasti sanoa, millaisia spesifisiä muutoksia EKP3P5 aiheuttaa EKP3-bakteerille vaihtelevien mutaatioiden vuoksi.
Homotsygoottisuuden ollessa korkeampi, voidaan muodostaa selkeämpiä johtopäätöksiä. Kun tarkastellaan kategorioita, joihin geenimutaatiot ovat kohdistuneet, huomataan, kuinka suurin osa mutaatioista ilmenevät samoissa kategorioissa tai jopa samoissa geeneissä (Liite 4). Bakteerisolun ulkorakenne, kuljetusjärjestelmä, kofaktorit ja proteiinin metabolia muuntuivat faagipaineiden vaikutuksesta runsaiten (Liite 4). Edellä mainitussa koeasetelmassa (ks. 4.4.1) ilmennyt kolaanihapon biosynteesiin osallistuvan WcaJ-transferaasin, NAD(P)H-flavinioksidoreduktaasin ja rRNA:n, geenisekvensseissä ilmeni runsaimmin mutaatioita molemmissa faagialtistuskokeissa (Liite 4). Alkuperäisessä EKP3 s.e-mutantissa esiintynyt WcaJ mutaatio voisi hyvin kuvastaa, kuinka kyseisessä geenissä tapahtuva muutos on yleinen K. pneumoniae -bakteerin faagiresistenssin kannalta (Liite 4; Tan ym. 2020). Yllättävintä näissä faagialtistuskokeissa oli EKP3:n muuntumattomat CRISPR-lokukset. EKP3 ei hyödyntänyt CRISPR-mekanismia näissä in vitro -kokeissa suojautuakseen faageilta, mikä puolestaan vahvistaa faagiterapian näkökulmasta katsottuna faagihoitojen tehoamista EKP3:n infektioiden hoidossa.