Koiraan välityksellä tapahtuva ei-geneettinen periytyminen siialla (Coregonus lavaretus)

(1)

KOIRAAN VÄLITYKSELLÄ TAPAHTUVA EI-GENEETTINEN PERIYTYMINEN SIIALLA (Coregonus lavaretus)

PIHLA PENTTILÄ

Pro gradu- tutkielma Itä-Suomen yliopisto Bio- ja ympäristötieteiden laitos

2018

(2)

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO Ympäristö- ja biotieteiden laitos

PENTTILÄ, PIHLA: Koiraan välityksellä tapahtuva ei-geneettinen periytyminen siialla (Coregonus lavaretus)

Pro gradu- tutkielma, (40 op.) 31 s.

Heinäkuu 2018

___________________________________________________________________________

Ei-geneettiseksi periytymiseksi kutsutaan ilmiötä, jossa vanhempi vaikuttaa jälkeläisensä ominaisuuksiin välittämällä tekijän, joka aiheuttaa muutoksen jälkeläisen fenotyypissä muut- tamatta DNA sekvenssiä. Mekanismeja voivat esimerkiksi olla epigeneettiset, eli geenien il- menemiseen vaikuttavat tekijät, tai esimerkiksi hormonit, proteiinit ja RNA, jotka voivat siir- tyä sukusolujen solunesteen tai solukalvojen mukana. Vielä ei tunneta, miten fenotyypin muutokset tarkalleen ottaen tapahtuvat.

Pro gradu- tutkielmani liittyy tutkimukseen, jossa tutkittiin ei-geneettistä koiraan välityk- sellä tapahtuvaa periytymistä siialla (Coregonus lavaretus), joka on kylmiin olosuhteisiin sopeutunut lohikala. Tutkimuksessa koiraiden maitia lämpökäsiteltiin kahdessa erilämpöises- sä (3,5°C, 6,5°C) vedessä 15 h ennen mätimunien hedelmöittämistä. Viiden naaran mätimunia hedelmöitettiin kymmenen koiraan kummallakin lämpökäsitellyllä 3,5°C, 6,5°C maidilla ja kalanpoikasten kehitystä seurattiin ja vertailtiin ryhmien välillä. Tutkimuksessa saatiin selville, että kylmäkäsittelyllä maidilla hedelmöitetyt poikaset olivat isompia ja vahvempia.

Tutkielmassani tutkittiin ei-geneettisen periytymisen mekanismeja selvittämällä uintikyvyn eron aiheuttajia. Kalanpoikasten uinti on aerobista, joten uintikyvyneron pitäisi selittyä eroina aerobisessa suorituskyvyssä. Tutkielmassa mittasin sitraattisyntaasin (CS) ja sytokromi c- oksidaasi (COX) entsyymien aktiivisuudet kalanäytteissä. Kummatkin entsyymit ovat soluhengityksen tehokkuuden säätelijöitä ja mitokondrioiden lukumäärien kuvastajia.

Tutkimuksessa näytteinä käytettiin homogenisoituja siianpoikasia. CS-entsyymin aktiivisuus mitattiin Ellmannin reagenssin (DTNB:n) avulla. DTNB muuttuu entsyymin toimiessa TNB:ksi, joka on absorboiva aine 412 nm aallonpituudella. Absorption kasvaminen reaktion kuluessa mitattiin spektrofotometrillä. COX-entsyymin aktiivisuus mitattiin pelkistyneen sytokromi c:n hapettumisnopeuden avulla.

Kummankaan entsyymin (CS ja COX) ja lämpökäsittelyjen välillä ei löytynyt yhteyttä.

Myöskään yhdestä tai kummastakin vanhemmista johtuvia satunnaisvaikutuksien ei havaittu vaikuttaneen kumpaankaan entsyymiaktiivisuuteen. CS:n aktiivisuuden ja ruskuaisen koon välillä ei havaittu merkitsevää yhteyttä, mutta COX:n ja ruskuaisen koon välillä havaittiin heikko negatiivinen yhteys. Maidin lämpökäsittelyt eivät vaikuttaneet hedelmöitettyjen kalanmunien kokoon, sillä tulosten mukaan vain äiti vaikutti munien kokoon.

Tutkielma ei pysynyt paljastamaan uintikyvyn eron aiheuttajia, sillä lämpökäsittelyryh- mien ja väliltä ei löytynyt merkitseviä eroja entsyymiaktiivisuuksissa. Uintikykyyn voivat vaikuttaa monet muutkin asiat, kuten kalan koko, ruskuaisen koko ja hapenottokyky. Kalan- poikasten kokojen ja uintikyvyn välillä ei löytynyt yhteyttä, vaikka kylmäkäsitellyt poikaset olivat isompia.

Avainsanat: ei-geneettinen periytyminen, sukupolven ylittävä plastisuus, sitraattisyntaasi, sytokromi c-oksidaasi, entsyymiaktiivisuus, ruskuainen

(3)

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND

Department of Environmental and Biological Sciences

PENTTILÄ, PIHLA: Non-genetic inheritance via gametes in Goregonus lavaretus MSc. Thesis, (40 cp.), 31 pp.

July 2018

__________________________________________________________________________________

Non-genetic inheritance can be defined as a phenomenon in which parents are affecting to the phenotype of their offspring by transferring factor(s) that do not change the DNA sequence of the offspring. Possible factors can be epigenetic which influence gene expression or other non-genetic factors which are transferred via gamete membranes or cytoplasm, such as hor- mones, RNA, and proteins. It is not yet known, how the non-genetic changes in phenotype occur.

My master’s thesis is a part of larger research, in which non-genetic inheritance via milt in European whitefish (Coregonus lavaretus ) was studied. European whitefish is a salmonid fish adapted to cold conditions. In the study, milt of males was incubated in two different water temperatures (3.5°C, 6.5°C) 15 h prior to fertilization. Eggs of five females were fertilized with both 3.5°C and 6.5°C- treated milt of the ten males and the development of offspring was monitored and compared. The results showed that offspring that were fertilized with cold- treated milt were larger and had stronger swimming performance than the offspring fertilized with warm-treated milt.

The aim of my master’s thesis was to examine the potential non-genetic mechanisms behind observed swimming performance differences between groups. In fish larvae the swimming performance is an aerobic feature, so differences in swimming performance could be explained by differences in the effectiveness of the cellular respiration. Citrate synthase (CS) and cytochrome c oxidase (COX) are both important pace marker enzymes of cellular respiration and their activity can be used as a way to measure mitochondria densities. So, I measured enzyme activities of these enzymes from the fish larvae samples.

I used homogenized whitefish larvae as samples. Activity of CS was measured with Ellman’s reagent (DNTB). DTNB turns into TNB as enzyme works. The increase in TNB’s absorption was measured with spectrophotometer at 415 nm wavelength. Activity of COX was measures by the oxidation rate of reduced cytochrome c. The decreasing absorption was measured with spectrophotometer at 550 nm wavelength.

There were no observable connections between the two enzymes and milt incubation groups. Also random effects origin from the either or both parents did not affect the enzyme activities. Furthermore, there was no connection between CS activity and yolk volume. In- stead, there was a slight negative correlation between COX activity and yolk volume. Also different milt incubations did not affect fish egg sizes, because according to results only mother influenced to the size of eggs.

The master’s thesis did not reveal the mechanisms behind swimming performance differ- ence, because the enzyme activities were not connected with treated milt fish groups. Other factors like fish or yolk size can also affect to swimming performance. Cold-treated larvae were statistically larger but the size was not linked to the swimming performance.

Key words: Non-genetic inheritance, transgenerational plasticity, citrate synthase, cytochrome c-oxidase, enzyme activity, yolk

(4)

SISÄLLYSLUETTELO

1 JOHDANTO ………...…2

2 EI-GENEETTINEN PERIYTYMINEN……….………. ………....4

2.1 Fenotyyppinen plastisuus………..………...5

2.2 Sukupolven ylittävä plastisuus……….……5

2.3 Vanhempainvaikukset………..6

2.4 Siittiöiden fenotyyppiin vaikuttaminen………7

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA HYPOTEESIT………...…8

4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT………...9

4.1 Aineisto………...9

4.2 Mätimunien mittaaminen………...10

4.3 Laboratoriotyöt………...11

4.3.1 Sitraattisyntaasi………...11

4.3.2 Sytokromi c-oksidaasi………....13

4.3.3 Proteiinimääritys……….14

4.4 Kuvaajien käsittely ja entsyymiaktiivisuuden laskeminen……….14

4.5 Aineiston tilastollinen käsittely………..15

5 TULOKSET………...…15

5.1 Lämpötilakäsittelyt ja entsyymiaktiivisuus………15

5.2 Ruskuaispussin koko ja entsyymiaktiivisuus……….22

5.3 Kalanmunien koot………..23

6 TULOSTEN TARKASTELU………24

6.1 Tulosten luotettavuus……….27

7 JOHTOPÄÄTÖKSET………28

KIITOKSET………..28

LÄHDELUETTELO……….…29

(5)

5 1 JOHDANTO

Siika (Coregonus lavaretus L), jota käytetään koe-eläimenä tutkielmassa, on lohikalojen heimoon kuuluva Euraasian pohjoisosissa elävä kala (Yrjölä ym. 2015). Siiat ovat kylmiin olosuhteisiin sopeutuneita ja monet populaatiot elävät tällä hetkellä lämpötilasietokykynsä ylärajoilla (Cingi ym.

2010). Siika viihtyy puhdasvetisissä ja happirikkaissa vesissä, joista löytyy kesäisinkin viileää vettä.

Siika on syksyisin kuteva kalalaji, jonka kudun tarkempi ajankohta määräytyy siikamuodon, lämpö- tilan ja päiväpituuden perusteella (Yrjölä ym. 2015). Yleensä kuteminen tapahtuu juuri ennen ve- sien jäätymistä. Hedelmöittyneet munat painuvat pohjaan, josta ne kuoriutuvat jäiden lähtemisen aikoihin

Ilmastonmuutos uhkaa nykyisiin olosuhteisiin sopeutuneita lajeja ja olosuhteiden muutokset voivat olla nopeita ja ne saattavat aiheuttaa paljon sukupuuttoja, jos lajille ei löydy enää sopivaa elinympäristöä (Salinas & Munch 2012). Kyky sopeutua muuttuviin olosuhteisiin on tärkeää lajin selviämiselle erityisesti näin muuttuvan ilmaston aikoina. Kaloille ilmaston muutos todennäköisesti tarkoittaa jonkinasteista veden lämpötilan nousemista, joka vähentää hapen liukoisuutta veteen ja sen saatavuutta vedestä (Farrel 2009). Ilmaston muutos saattaa muuttaa lajien maantieteellisiä le- vinneisyysalueita, kun eteläiset kalat siirtyvät pohjoisemmaksi (Rijnsdorp ym. 2009).

Evolutiivisen sopeutumisen muutoksiin mahdollistaa lajin monipuolinen geneettinen perimä, mi- kä lisää todennäköisyyttä sille, että ainakin joiltain populaation yksilöillä esiintyy geenimuotoja, jotka mahdollistavat sopeutumisen muuttuviin olosuhteisiin. Geneettinen sopeutuminen on kuitenkin yleensä hidasta ja vie useita sukupolvia (Luquet & Tariel 2016). Evoluutioon liittyvän sopeutumisen lisäksi muita sopeutumiskeinoja ovat muuttaminen uusille alueille (Parmesan 2006) ja fenotyyppinen plastisuus (Nicotra ym. 2010). Ei-geneettinen periytyminen on yksi mahdollinen sopeu- tumiskeino, mutta se on saanut tutkimuksissa toistaiseksi vähemmän huomiota (Salinas ym. 2013).

Muutamia poikkeuksia lukuun ottamatta kalat ovat vaihtolämpöisiä, joten niiden ruumiinlämpö- tila on käytännössä sama kuin niitä ympäröivän veden lämpötila (Block ym. 1993, Cossins 2006).

Ympäröivän veden lämpötila onkin kaloille merkittävä tekijä, joka vaikuttaa esimerkiksi kalojen aineenvaihduntaan, suorituskykyyn ja kasvuun (Guderley & Johnston 1996, Reist ym. 2006, Johns- ton & Ball 2009, Fusco & Minelli 2010).

Lämpötilan vaikutuksia kalojen kasvamiseen ja kehitykseen on tutkittu useissa tutkimuksissa esimerkiksi (Imsland ym.1999, Janhunen ym. 2010, Salinas & Munch 2012). Esimerkiksi Janhusen ym. (2010) artikkelissa tutkittiin kahden eri haudontalämpötilan (2 °C ja 7 °C) vaikutuksia nieriän (Salvelius alpinus) hedelmöitettyjen mätimunien elinvoimaisuuteen, poikasten pituuteen ja alkion kehittymisnopeuteen. Tutkimuksessa saatiin selville, että hedelmöitettyjen munien kuolleisuus oli

(6)

6

selvästi suurempi 7 °C:ssa haudotuista munista syntyneillä poikasilla, ja lisäksi kyseiset poikaset olivat myös kuoriutuessaan 2 °C:ssa haudottuja poikasia pienempiä (Janhunen ym. 2010). Imslan- din ym. (1999) havaitsivat, että nuoret piikkikampelat (Scophthalmus maximus) kasvoivat nopeammin 19 °C lämpöisessä vedessä verrattuna 10 °C veteen.

Kokeen kalanpoikasilla on kymmenen isää ja viisi äitiä. Koiraiden lypsetty maiti jaettiin kahteen lämpökäsittelyyn (3,5 °C ja 6,5 °C). Naaraat hedelmöitettiin jokaisen koiraan kahdella eri tavalla käsitellyllä maidilla, jolloin syntyy 100 kombinaatiota. Koeasetelman avulla pyrittiin vertailemaan lämpökäsittelyn, äidin, isän ja äiti-isä vuorovaikutuksen välittämiä vaikutuksia.

Soluhengitys on aineenvaihdunnan reaktio, jonka avulla eliöt vapauttavat ravinnon sisältämän energian käyttöönsä, jolloin samalla syntyy hiilidioksidia ja vettä. Soluhengityksessä on kolme vai- hetta glykolyysi, sitruunahappokierto ja elektronisiirtoketju (Nelson & Cox 2008). Glykolyysissä glukoosi, rasvahapot hapetetaan ja muodostetaan asetyyli-koentsyymi A:ta. Sitruunahappokierrossa asetyylikoentsyymi A hapetetaan hiilidioksidiksi ja vapautuva energia talletetaan NADH ja FADH2

molekyyleihin. Sitraattisyntaasi on sitruunahappokierron ensimmäinen entsyymi, joka yhdistää asetyylikoentsyymi-A:n ja oksaloetikkahapon tuottaen sitraatin (Nelson & Cox, 2008). Sitraattisyntaasi toimii mitokondrion matriksissa (Pelletier ym. 1995). Sitraattisyntaasi on sitruunahappokierron no- peuden säätelijäentsyymi (Eigentler ym. 2012) ja sitä on myös käytetty mittarina kuvaamaan mitokondrioiden lukumäärää (Vigelsø ym. 2014). Soluhengityksen kolmannessa vaiheessa elektronisiir- toketjussa happimolekyyli pelkistetään vedeksi NADH ja FADH2 molekyylien kuljettamien H+

ionien avulla. Vaiheessa vapautuva energia sidotaan ATP molekyyleihin. Sytokromi c-oksidaasi on elektronisiirtoketjun viimeinen entsyymi, joka siirtää sytokromi c:ltä elektronin hapelle pelkistäen sen samalla vedeksi. Sytokromi c-oksidaasi sijaitsee mitokondrion sisäkalvolla (Pelletier ym. 1995).

Mitokondrioiden määrän lisääntyminen on tutkittu usein olevan yhteydessä lisääntyneeseen sytokromi c-oksidaasin aktiivisuuteen (Hardewig ym.1999).

Pro-gradu tutkielmani on osa tutkimusta jossa tarkoitus oli tutkia, voiko kaksi erilaista maidin lämpökäsittelyä ennen hedelmöittämistä aiheuttaa muutoksia jälkeläisten ominaisuuksiin. Kalan- poikasille tehtiin uintikoe, josta saatiin tulokseksi, että kylmäkäsitellyllä maidilla hedelmöitetyt poikaset olivat vahvempia uimareita. Oma osuuteni oli selvittää, että voisiko sitraattisyntaasi ja sytokromi c-oksidaasi entsyymien aktiivisuudet selittää ryhmien välisessä uintikyvyssä havaitun eron.

Sitraattisyntaasi ja sytokromi c-oksidaasi valittiin tutkittaviksi entsyymeiksi, koska ne ovat tärkeitä soluhengityksen tehokkuuden säätelijöitä (Eigentler ym. 2012, Vigelsø ym. 2014). Lisäksi tutkin, havaitaanko kalanmunien koossa isän, äidin tai vanhempien yhteisvaikutuksia, jollaisia on havaittu aiemmin esimerkiksi (Pakkasmaan ym. 2001) tutkimuksessa.

(7)

7 2 EI-GENEETTINEN PERIYTYMINEN

Genotyyppiä on pitkää pidetty merkittävimpänä yksilön fenotyyppiin ja ominaisuuksiin vaikuttava- na tekijänä. Ympäristö vaikuttaa yhdessä genotyypin kanssa minkälaiseksi yksilön fenotyyppi muodostuu (Nicotra ym. 2010). Esimerkiksi ihmisillä ravinnon määrä ja laatu voi vaikuttaa pituuskas- vuun ja ihmisen lopulliseen pituuteen (Campbell & Reece 2011). Ahvenien väritys taas vaihtelee elinympäristön veden värin mukaan. Humuspitoisissa vesistöissä ahvenen väritys on tummempi kuin kirkkaissa vesissä elävillä (Laine 2013). Sukupolven ylittävä plastisuus on yksi ei-geneettisen periytymisen mekanismi, siinä vanhemmat vaikuttavat jälkeläisiensä fenotyyppiin muiden tekijöi- den kuin geenien avulla (Mousseau & Fox 1998, Salinas ym. 2013).

Ei-geneettinen periytyminen voidaan määritellä jonkun muun tekijän kuin vanhemman siirtämän DNA:n aiheuttamiksi periytyviksi muutoksiksi, jotka vaikuttavat yksilön fenotyyppiin (Bondu- riansky & Day 2009). Fenotyyppiset muutokset eivät siten selity muutoksina jälkeläisen geeneissä.

Periytyvät muutokset voivat olla peräisin vanhemmilta ja ainakin jossain tapauksissa kaukaisemmil- ta esi-isiltä (Bonduriansky & Day 2009).

Ei-geneettisellä periytymisellä on erilaisia mekanismeja kuten esimerkiksi epigeneettisien ja so- maattisien tai solunesteeseen liittyvien tekijöiden siirtyminen vanhemmasta jälkeläisiin (Youngson

& Whitelaw 2008). Epigeneettiset tekijät aiheuttavat muutoksia geenien säätelyssä ja nämä tekijät voivat periytyä jälkeläiselle (Nicotra ym. 2010). Esimerkkejä epigeneettisistä tekijöistä ovat mm.

muutokset DNA:n metylaatiossa tai DNA:han sitoutuneissa histoniproteiineissa, jotka vaikuttavat kromatiinin rakenteeseen (Cavalli 2006, Youngson & Whitelaw 2008). Epigeettisiä merkkejä voidaan purkaa, joten suurin osa epigeneettisistä vaikutuksista ei periydy (Youngson & Whitelaw 2008). Kaikista lokuksista epigeneettiset merkit eivät kuitenkaan välttämättä purkaudu. Solunestee- seen ja somaattisiin eli muihin kuin ituradan soluihin liittyviä siirtyviä tekijöitä ovat esimerkiksi RNA, hormonit ja lipidit, jotka voivat siirtyä vanhemmista jälkeläisiin esimerkiksi sukusolujen, solunesteen ja solukalvojen (Bonduriansky & Day 2009).

Ei-geneettistä periytymistä kannattaa tutkia, koska se on yksi mahdollinen mekanismi, jonka avulla lajit pystyvät mahdollisesti sopeutumaan mm. ilmaston muutokseen (Salinas ym. 2013). Ei- geneettisellä periytymisellä voi lisäksi olla merkittäviä vaikutuksia evoluutiolle, mutta sen tärkeyttä evoluutiossa on myös epäilty, koska ei-geneettisen periytymisen aikaan saamia fenotyyppejä on pidetty ohimenevinä ja epävakaina (Bonduriansky & Day 2009). Ei-geneettisen periytymisen vaiku- tuksien kestoa onkin syytä tutkia lisää.

(8)

8 2.1 Fenotyyppinen plastisuus

Eliöt elävät hyvin harvoin muuttumattomassa ympäristössä, sillä yleensä ne kokevat ainakin jonkin- laisia päivittäisiä tai vuodenaikaan liittyviä muutoksia, joita voivat olla esimerkiksi muutokset läm- pötiloissa ja hapen saatavuudessa (Cossins ym. 2006). Fenotyyppinen plastisuus on tärkeää, koska sen avulla eliö pystyy elämään ja lisääntymään vaihtelevissa olosuhteissa (Schlichting & Smith 2002). Lisäksi fenotyyppinen plastisuus voi suojata perimää luonnonvalinnan geneettistä muuntelua karsivalta vaikutukselta, jolloin geneettinen muuntelu pysyy tallessa tulevaisuutta varten (Cossins ym. 2006).

Fenotyyppiseksi plastisuudeksi kutsutaan ilmiöitä, jossa tietty genotyyppi pystyy tuottamaan erilaisia fenotyyppejä altistuessaan erilaisille ympäristöolosuhteille (Agrawal 2001, Pigliucci ym.

2006, Nicotra ym. 2010, Reed ym. 2010). Fenotyyppinen plastisuus voi näkyä muutoksina useissa yksilön ominaisuuksissa kuten käyttäytymisessä, fysiologiassa, morfologiassa ja kasvussa (Agrawal 2001, Miner ym. 2005, Piggliuci 2006).

Esimerkkinä fenotyyppisestä plastisuudesta on matelijoilla esiintyvä ilmiö, jossa munia ympä- röivän hiekan lämpötila määrittää jälkeläisen sukupuolen (Janzen & Phillips 2006). Toinen esimerkki on vesikirpuille petokalan kemiallisten signaalien läsnä ollessa kehittyvä terävä ’kypärä’ ja altistamattomia kontrolliyksilöitä pidempi peräpiikki (Agrawal 2001). Kaloilla esiintyvästä feno- tyyppisestä plastisuudesta voidaan mainita esimerkiksi Imre ym. (2002) tutkimus, jossa osoitettiin, että vuolaammassa virrassa kasvatetuille puronieriöille (Salvenius alpinus) kehittyi korkeammat pyrstöt kuin hitaammin virtaavassa vedessä kasvaneille lajikumppaneille.

Fenotyyppinen plastisuuden aiheuttamat mekanismit ovat suhteellisen huonosti tunnettuja (Aubin-North & Renn 2009). Mekanismien uskotaan kuitenkin olevan samantyyppisiä läpi eliökun- nan (Schlichting & Smith 2002). Tutkimuksissa on havaittu muutoksia geeniekspressiossa, proteii- neissa ja hormonitoiminnassa (Gilbert 2005). Nämä havainnot voisivat liittyä fenotyyppisen plastisuuden mekanismeihin. Varsinaisien mekanismien lisäksi vielä tunnetaan huonosti, miten ympäris- tön muutokset aiheuttavat mekanismien käynnistymisen (Aubin-North & Renn 2009).

2.2 Sukupolven ylittävä plastisuus

Sopeutuminen muuttuviin ympäristöolosuhteisiin voi tapahtua geneettisesti luonnonvalinnan kautta useiden sukupolvien aikana, mutta geeniperimän muuttuminen luonnonvalinnan seurauksena on hidasta (Luquet & Tariel 2016). Fenotyyppinen plastisuus sen sijaan mahdollistaa nopeamman so-

(9)

9

peutumisen muutoksiin (Sunday ym. 2014). Fenotyyppisen plastisuuden on perinteisesti katsottu vaikuttavan vain eliön eliniän ajan (Bonduriansky ym. 2012). Myöhemmissä tutkimuksissa on kuitenkin saatu selville, että fenotyyppinen plastisuus voi joskus myös periytyä jälkeläisille (Sharma ym. 2014, Forsman 2015, Luquet & Tariel 2016). Tällöin puhutaan sukupolven ylittävästä plastisuudesta (transgenerational plasticity), joka tarkoittaa, että vanhemman tai esi-isien kokema ympä- ristö vaikuttaa jälkeläisen fenotyyppiin, vaikka jälkeläisen genotyyppi ei muutu (Mousseau & Fox 1998, Salinas ym. 2013).

Sukupolven ylittävää plastisuutta voi ilmetä, kun ympäristössä on vaihtelua sukupolvien välillä (Salinas ym. 2013). Sukupolven ylittävä plastisuuden katsotaan oleva tärkeä mekanismi, jonka avulla populaatiot voivat kestää ympäristötekijöiden muutoksia (Salinas & Munch 2012, Sharma ym.

2014), ja sen avulla populaatiot voivat saada aikaa sopeutua muutoksiin geneettisesti (Chevin ym.

2010).

Lämpötila on eniten tutkittu ympäristötekijä ylisukupolven plastisuuden tutkimuksissa (Salinas ym. 2013). Esimerkiksi Salinas & Munch (2012) tutkivat lämpötilan aiheuttamaa ylisukupolven plastisuutta loistohammaskarpilla Cyprinodon variegatus. Kalavanhempia pidettiin kolmessa eri lämpöisessä vedessä (24, 29, 34℃), jossa mätimunat hedelmöittyivät. Hedelmöittyneet mätimunia siirrettiin (24, 29, 34℃) altaisiin, jotta saatiin muodostettua kaikki vanhempi-lämpötila - kombinaatiot. Tutkimuksessa saatiin selville, että vanhemmat pystyvät muokkaamaan poikasiensa lämpötilan sietokykyä, sillä poikaset kasvoivat nopeammin samassa lämpötilassa, jossa vanhemmat olivat itse eläneet (Salinas & Munch 2012).

Mekanismit, joiden avulla sukupolven ylittävää plastisuutta tapahtuu, ei tunneta tarkasti. Tutki- muksissa mahdollisiksi mekanismeiksi on esitetty epigeneettisiä tekijöitä: kuten DNA:n- metylaatiota, muutoksia kromatiinin rakenteessa ja histonien sitoutumista DNA-juosteeseen (Richards 2006). Muiksi mekanismeiksi on esitelty prioneita (Rando & Verstrepen 2007), hormoneja ja lähetti-RNA:ta (Sharma ym. 2014).

2.3 Vanhempainvaikutus

Vanhempainvaikutus (parental effect) on yksi ei-geneettisen periytymisen mekanismi ja se on samalla myös ylisukupolven plastisuutta. Vanhempainvaikutus voidaan välittää jälkeläisille siirtämäl- lä sukusolujen mukana esimerkiksi histonirakenteita, hormoneja ja RNA:ta ja (Bonduriansky & Day 2009). Vaikutus ei perustu DNA:han vaan periytyvät tekijät vaikuttavat esimerkiksi geenien ilme- nemiseen jälkeläisessä.

(10)

10

Vanhempainvaikutukseen kuuluu äidinvaikutus (maternal) ja isänvaikutus (paternal). Äidinvai- kutusta on tutkittu huomattavasti enemmän kuin isänvaikutusta ja äidinvaikutuksen olemassaolo on tunnistettu ei-geneettiseksi periytymisen muodoksi jo pitkään (Crean & Bonduriansky 2014).

Kuoriutumisen jälkeen vanhempainvaikutus voi näkyä esimerkiksi kalanpoikasen pituudessa ja painossa (Bang ym. 2006). Kalanpoikasen koko kuoriutumisen aikoihin voi vaikuttaa eroihin kuol- leisuudessa saman lajin kalanpoikasten välillä, sillä koosta on hyötyä. selviytymisessä. Yleensä ole- tetaan, että kalanpoikasen kokoon vaikuttaa eniten äidinvaikutus, sillä munasolu on äidin tuottama.

Isän mahdollista vaikutusta ei yleensä oteta tässä yhteydessä huomioon (Bang ym. 2006).

Äidinvaikutusta on tutkinut esimerkiksi Sharma (ym. 2014). He tutkivat äidinvaikutusta kolmi- piikillä (Gasterosteus aculeatus). Tutkimuksen tulosten mukaan poikaset kasvoivat elämänsä alussa parhaiten samassa lämpötilassa, missä äiditkin olivat eläneet. Näin ollen äidit voivat pyrkiä plasti- sesti ’ohjelmoimaan’ jälkeläisiään kasvamaan paremmin olosuhteissa, jotka poikaset todennäköises- ti joutuvat poikasvaiheessaankin kohtaamaan (Sharma ym. 2014). Salinas & Munch (2012) tutkimuksessa saatiin selville, että kummatkin vanhemmat muokkasivat poikastensa vastetta lämpöti- laan.

Isänvaikutusta sanotaan tapahtuneen, kun ei-geneettinen tekijä siirtyy isältä poikasille ja aiheuttaa muutoksen niiden fenotyypissä (Crean & Bonduriansky 2014). Isänvaikutuksen olemassa oloa on epäilty, mutta todisteiden kasvava määrä osoittaa, että isänvaikutusta esiintyy useilla organis- meilla (Crean & Bonduriansky 2014).

Äidin mahdolliset vaikutusreitit jälkeläiseen on helpompi ymmärtää kuin isän, sillä munasolusta jälkeläinen saa paljon muutakin kuin vain DNA:ta. Munasolun mukana tulee soluneste ja soluelimet kuten mitokondriot. Sen sijaan siemennestettä on pitkään pidetty vain geenien kuljettajana, jolla ei ole ollut muita tehtäviä (Marshall 2015). Siemenneste voi kuitenkin kuljettaa hedelmöittyvään mu- nasoluun mukanaan esimerkiksi sentrosomeja ja RNA:ta (Kumar ym. 2013). Sentrosomi eli keskus- jyvänen on solun keskellä sijaitseva mikrotubulusten organisointikeskus, joka koostuu kahdesta sentriolista (Campbell & Reece. 2011). Keskusjyvänen osallistuu solujen jakautumiseen erottamalla sisarkromatidit toisistaan mitoosin aikana.

2.4 Siittiöiden fenotyyppiin vaikuttaminen

Siittiöt kohtaavat elinikänsä aikana kaksi erilaista ympäristöä, ympäristön koiraan sisällä, kun siit- tiöt tuotetaan ja varastoidaan sekä vapauttamisen jälkeisen ympäristön (Marshall 2015). Kummatkin ympäristöt voivat aiheuttaa muuntelua siemennesteen fenotyyppiin. Ulkoinen ympäristö on merkit- tävä kaloille, jotka vapauttavat siittiönsä ympäröivään veteen, jossa siittiöt altistuvat erilaisille ym-

(11)

11

päristötekijöille. Siittiöiden morfologiassa, liikkuvuudessa ja pitkäikäisyydessä esiintyy merkittäviä eroja yksilöiden välillä (Pitnick ym. 2009). Osa siittiöiden muuntelusta selittyy geneettisillä eroilla koiraiden välillä, mutta myös ei-geneettistä vaikutusta esiintyy, sillä siittiöiden fenotyypin on havaittu olevan yhteydessä myös koiraan fenotyyppiin tai koiraan ympäristöolosuhteisiin (Marshall 2015).

Siittiöiden erilaisia fenotyyppejä suositaan erilaisissa tilanteissa (Crean & Marshall 2008). Siit- tiöt kilpailevat keskenään mahdollisuudesta hedelmöittää munasoluja, joten koiraille on eduksi pyr- kiä maksimoimaan siittiöidensä menestystä sopeuttamalla siittiöidensä ominaisuuksia tilanteeseen sopivaksi. Johnson ym. (2013) osoittivat, että jos siittiöillä oli vapauttamisen jälkeen pääsy saman tien munasolujen luokse, niin silloin suosittiin siittiöitä, joilla oli pienempi pää, verrattuna tilanteeseen, jossa siittiöillä ei ollut välitöntä pääsyä munasolujen luokse (Johnson ym. 2013). Crean &

Marshall (2008) osoittivat, että koiraat vastaavat kilpailun lisääntymiseen muokkaamalla siittiöiden- sä fenotyyppiä, mikä lisäsi niiden hedelmöittämistodennäköisyyttä.

Mekanismeja, joilla siittiöiden fenotyypit vaikuttavat jälkeläisiin, ei vielä tunneta (Marshall 2015). On kuitenkin löydetty todisteita, että esimerkiksi siemennesteessä oleva RNA voisi vaikuttaa siittiöihin ja ehkä sitä kautta myös jälkeläisiin (Youngson & Whitelaw 2008). DNA:n metylaatio voisi myös olla mahdollinen mekanismi (Marshall 2015).

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA HYPOTEESIT

Tässä pro gradu -tutkielmassa tarkoituksena oli tutkia mahdollista maidin välityksellä tapahtuvaa ei- geneettistä periytymistä siialla. Tutkimuksessa koiraiden maitia lämpökäsiteltiin kahdella eri tavalla. Tarkoitus on tutkia, aiheuttaako lämpökäsittely eroja poikasten välillä. Homogenisoiduista ka- lanpoikasnäytteistä mitattiin sitraattisyntaasin ja sytokromi c-oksidaasin entsyymiaktiivisuudet FLUOstar Omega UV/vis -spektrometrillä.

Ennen omaa osuuttani tutkimuksen tutkimuskysymyksenä oli, voiko lämpökäsittely aiheuttaa ei- geneettistä periytymistä, joka näkyisi eroina kalanpoikasten ominaisuuksissa. Tutkimuksessa selvi- si, että kalanpoikasten uintikyvyssä oli merkittävä ero, sillä kylmäkäsitellyllä maidilla hedelmöitetyt poikaset olivat vahvempia uimareita (p<0,001).

Oma osuuteni oli tutkia mahdollisia mekanismeja ryhmien välisten uintikykyerojen taustalla.

Tutkimuskysymykseni on, aiheuttaako lämpökäsittely ei-geneettistä koiraan kautta tapahtuvaa pe- riytymistä, joka näkyisi eroina ryhmien välisissä entsyymiaktiivisuuksissa. Ensimmäinen hypoteesi on, että kalanpoikasten entsyymiaktiivisuuksista löytyisi ero käsittelyryhmien väliltä, koska uinti- kyvyssä havaittiin ero käsittelyryhmien välillä. Toinen hypoteesi on, että ruskuaisen koko olisi yh-

(12)

12

teydessä entsyymiaktiivisuuksiin, koska ruskuaisen koko on yhteydessä poikasen energia varaston kokoon. Mitä isompi ruskuainen sitä enemmän poikasella on energiaa käytettävissään ja sitä isompi sen entsyymiaktiivisuus voi olla.

4 AINEISTO JA MENETELMÄT 4.1 Aineisto

Tämän osion työvaiheissa en ole ollut itse mukana. Kokeen emosiiat lypsettiin Luonnonvarakes- kuksen Tervon kalanviljelylaitoksella 12.–13.11.2015, josta sukutuotteet kuljetettiin Itä-Suomen yliopiston Joensuun kampukselle 13.11. Poikasten hedelmöitys ja kasvatus on tehtyItä-Suomen yliopiston allastiloissa. Kokeessa oli kymmenen koirasta ja viisi naarasta, joista syntyi yhteensä 50 perhettä. Koiraista lypsetty maiti jaettiin kahteen eri lämpökäsittelyryhmään. Maitia inkuboitiin minigrip-pusseissa 15 tuntia 3,5 °C ja 6,5 °C vedessä ennen mätimunien hedelmöittämistä. Kunkin naaraan mätimunat hedelmöitettiin jokaisen koiraan kylmä- ja lämminkäsitellyllä maidilla, mistä syntyi yhteensä 100 yhdistelmää. Kaikki hedelmöitykset replikoitiin kahdesti, joten lopullisessa haudonnassa oli 200 mätimunaerää. Hedelmöittäminen ja poikasten kasvattaminen on tehty samois- sa olosuhteissa.

Kalanpoikasille tehtiin 3-10 päivän vanhoina uimatesti, jossa testattiin niiden uintikestävyyttä.

Uimatestissä kalanpoikaset laitettiin yksi kerrallaan halkaisijaltaan 9 mm putkeen, jossa virtasi vettä nopeudella 6,2 cm s^-1(kuva 1 ja kuva 2). Poikaset ajautuivat laitteiston perällä olevaa verkkoa vas- ten, kun ne eivät enää jaksaneet uida vastavirtaan. Testissä otettiin aika, miten pitkään poikanen jaksaa uida vastavirtaan. Uimatestin jälkeen poikaset lopetettiin trikaiinimetaanisulfonaatin (MS- 222) yliannostuksella ja säilöttiin liuokseen, jossa oli 70 % denaturoitua etanolia ja 1 % neutraloitua formaliinia. Säilötyistä poikasista mitattiin pituus, massa ja ruskuaispussin tilavuus.

Pakastetut kalanpoikaset homogenisoitiin punnitsemalla 10 kappaletta kalanpoikasia koeputkeen ja lisäämällä joukkoon niiden tuoremassaa vastaava määrä natriumfosfaattipuskuria 50 mM pH 7,2 Kalat homogenisoitiin moottorikäyttöisellä teflonlasihomogenisaattorilla tasalaatuiseksi noin 100:lla männän edestakaisella liikkeellä. ja sen jälkeen liuos sentrifugoitiin +4 °C lämpötilassa rpm:n nopeudella 15 minuutin ajan. Lopuksi supernatantti jaettiin kolmeksi rinnakkaiseksi sarjaksi, jotka pakastettiin -80 °C pakastimeen.

(13)

13

Kuva 1A ja 1B Laitteisto, jonka avulla mitattiin kalanpoikasen uintikykyä ja kalanpoikanen testissä.

Poikanen poistettiin testin jälkeen putken alaosassa olevan poistoletkun kautta.

4.2 Mätimunien kuvaaminen ja munien halkaisijan mittaaminen

Noin kaksi kuukautta munien hedelmöittymisen jälkeen kalanmunat kuvattiin ja niiden koko mitattiin. Kamera oli kiinnitetty pystysuorasti jalustaan pöydän viereen kuvan 3 osoittamalla tavalla.

Pöydälle kameran alle laitettiin petrimalja, jonka pohjalle oli teipattu millimetripaperia. Haudonta- altaista otettiin lokero kerrallaan satunnaisesti 10 kappaletta munia maljalle millimetripaperin pääl- le, jolloin saatiin kuvan 4 kaltaisia kuvia. Veden aiheuttaman valon taittumisen vaikutus munien kokomittauksiin eliminoitiin pitämällä maljan vesimäärä samalla tasolla täyttämällä malja kylkeen laitettuun viivaan asti. Mahdollisesti kuolleita tai pian kuoriutuvia munia vältettiin, koska nämä munat olivat haaleampia, ja niitä oli hankalampi mitata, sillä ne saattavat olla soikeita.

ImageJ-nimistä ohjelmaa käytettiin kalanmunien halkaisijoiden mittaamiseen. Kuvat avattiin so- vellukseen ja niitä zoomattiin. Aluksi ohjelmisto kalibroitiin millimetripaperin ruutujen avulla ja sen jälkeen jokaisesta munasta mitattiin halkaisija pysty- ja vaakasuuntaan. Jos kalanmuna oli sel- västi soikea tai reunoiltaan epäselvä, sitä ei mitattu. Excelissä halkaisijoista laskettiin kalanmunien pinta-ala ja tilavuus kaavoilla.

Mätimunan pinta-ala(cm²) = π*(halkaisija (cm)/2)² Mätimunan tilavuus(cm³)= 4/3π*(halkaisija(cm)/2)³

(14)

14

Kuva 2A ja 2B Kuvausjärjestely kalanmunien kuvaamisesta ja esimerkki tulokseksi saaduista kuvista.

4.3 Laboratoriokokeet

4.3.1 Sitraattisyntaasi

Sitraattisyntaasi katalysoi asetyylikoentsyymi A:n ja oksaloetikkahapon yhdistymistä, jossa muodostuu sitraattia ja koentsyymi A:ta. Reaktiossa muodostuva koentsyymi A reagoi liuokseen lisätyn Ellmanin reagessin [5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)] eli DTNB:n kanssa, jolloin muodostuu TNB:tä (tionibentsoehappo/thionibenzoic acid), joka on absorboiva aine 412 nm aallonpituudella, joten TNB:n absorption lisääntymisestä voidaan laskea sitraattisyntaasin aktiivisuus.

Koentsyymi A-SH + DTNB → TNB + Koentsyymi A-S-S-TNB (Eigentler ym. 2012)

Analyysiliuosta valmistettiin 2 ml annoksina pipetoimalla liuokset järjestyksessä 2 ml:n eppen- dorf putkiloon (taulukko 1), joka sekoitettiin lopuksi huolellisesti. Valmis analyysiliuos säilytettiin mittausten aikana huoneenlämmössä.

Sitraattisyntaasin määrityksissä käytettävät liuokset: oksaloasetaattiliuos, asetyylikoentsyymi A- liuos ja DTNB-liuos valmistettiin käyttäen Eigentlerin ym. (2012) esittämää protokollaa. Protokol- lan mukaisista liuoksista DTNB-liuosta säilytettiin kokeiden ajan huoneenlämmössä ja sitraatti-

(15)

15

syntaasi, asetyylikoentsyymi A ja oksaloetikkahappoliuokset pipetoitiin putkiloihin ja ne säilytettiin -20 °C pakastimessa.

Mittauksissa käytettiin seuraavia FLUOstar Omega -laitteen asetuksia: aallonpituus 412 nm, mit- tausaika 3 minuuttia ja mittausten tiheys 11 sekuntia. Mitatun käyrän jyrkintä osaa käytettiin absor- banssiyksiköiden maksimaalisen kasvun arvioimisessa per minuutti. Tätä absorbanssin kasvua tulkittiin sitraattisyntaasin aktiivisuutena.

Mittausprotokollan toimiminen varmistettiin valmistamalla erä protokollan mukaisen analyysiliuosta (Eigentler ym. 2012), jota pipetoitiin kuoppalevylle mitokondrioita sisältävän liuoksen pääl- le. Testimittaus tuotti nousevan käyrän, josta voitiin päätellä, että sekä menetelmä että liuokset toi- mivat.

Ennen mittausten aloittamista piti selvittää sopiva kalahomogenaatin määrä suhteessa analyysi- liuokseen. Kalahomogenaattia kokeiltiin 2, 8, 20 ja 50 µl annoksina. Alle 50 µl annoksissa reaktiota ei tapahtunut, tai käyrä heitteli, joten reaktio ei ollut mitattavissa luotettavasti. Kalahomogenaattia käytetään siis mittauksissa 50 µl.

Kalanäytteet mitattiin satunnaisessa järjestyksessä. Ne sulatettiin ja sekoitettiin huolellisesti ja niitä säilytettiin jäähauteessa. Kuoppalevylle pipetoitiin 50 µl homogenisoitua kalanäytettä kaksi kertaa samasta näytteestä ja 200 µl analyysiliuosta. Kerrallaan mitattiin 5 kappaletta kalanäytteitä.

Taulukko 1. Analyysiliuoksen valmistamiseen käytettyjen kemikaalien alkuperäinen pitoisuus, kemikaalien lopullinen pitoisuus valmiissa 2 ml annoksessa analyysiliuosta ja kemikaalien pipetoimis- järjestys.

Analyysiliuos Käytetyt kemikaalit

0,5 mM 10 mM pH 8.0 oksaloasetaattiliuosta (Sigma D4126)

0,25 % Triton 10% x-100

0,305 mM 12,2 mM Asetyylikoentsyymi A liuos (Sigma A2181) 0,101 mM 1,01 mM pH 8,1 DTNB-liuos (Sigma D8130)

80 tilavuus- % H20 Standardi

Sitraattisyntaasi 8,5 mU/µl

Sigma (C3260) laimennettiin 1:1000 käyttäen 100 mM Tris-HCl pH 7.0

Standardina ajoissa käytettiin laimennettua sitraattisyntaasi entsyymiä sisältävää liuosta (taulukko 1.) Sen avulla voi laskea sitraattisyntaasin absoluuttisen aktiivisuuden. Lisäksi sen avulla pystyttiin myös seuramaan olosuhteiden samanlaisena pysymistä mittausten aikana. Mittauksissa standardia käytettiin 2 µl joka toisessa mittauksessa. Jokaista uutta analyysiliuosta kohti suoritettiin nol-

(16)

16

lausmittaus pelkällä analyysiliuoksella. Nollausmittauksen avulla voitiin tarkistaa, ettei analyysiliu- oksessa tapahdu mittauksen aikana mitään reaktioita.

4.3.2 Sytokromi c-oksidaasi

Sytokromi c-oksidaasin aktiivisuus määritettiin hyödyntäen kolorimetristä menetelmää, jolla määri- tetään pelkistyneen sytokromi c:n hapettumisnopeus. Pelkistetyllä sytokromi c:llä on absorptiopiik- ki 550 nm:ssä, kun taas hapettunut sytokromi c ei absorboi tällä aallonpituudella. Näin ollen sytokromi c-oksidaasin aiheuttama pelkistyneen sytokromi c:n hapettuminen voidaan havaita näytteessä fotometrisesti absorption vähenemisenä 550 nm aallonpituudella.

100 mM sytokromi c-liuosta valmistettiin liuottamalla naudan sydämestä eristettyä sytokromi c:tä (Sigma C3131) 100 mM (pH 7.0) natriumfosfaattipuskuriin. Sytokromi c:n on oltava pelkisty- neessä muodossa analyysejä varten. Pelkistys tehtiin lisäämällä 100 mM liuokseen 5µl annoksissa 1M DTT:tä. DTT sekoitettiin ja sen annettiin vaikuttaa hetken. Tämä käsittely toistettiin kahdesti.

Sytokromi c oli pelkistynyt riittävästi, kun liuoksen UV-VIS 550/560 suhde on välillä 6-10. UV- VIS 550/560 suhde tarkistettiin Nanodrop spektofotometri ND-100 -laitteella. Pelkistyksen oltua riittävä liuoksesta puhdistettiin DTT pois. Puhdistus tehtiin sentrifugoimalla liuos G50 pylvään läpi.

Puhdistuksen jälkeen liuos jaettiin putkiloihin, jotka suljettiin nestetypen päällä hapen poistamisek- si. Lopuksi putket säilöttiin -80 °C pakastimeen.

Substraattiliuoksena käytetään 60 nM sytokromi c-liuosta, joka valmistettiin laimentamalla 100 mM sytokromi c-liuosta 100 mM (pH 7.0) natriumfosfaattipuskurilla. Sytokromi c-liuos säilytettiin + 21 °C vesihauteessa, jotta mittauslämpötila pysyi mahdollisimman tasaisena.

Mittauksissa FLUOstar Omega -laitteella mitattiin absorbanssin väheneminen aallonpituudella 550 nm joka 20 sekunti aluksi 5 minuutin ajan. Reaktio tapahtui sen verran nopeasti, että mittausai- ka laskettiin 3 minuuttiin. Mitatun käyrän jyrkintä osaa käytettiin absorbanssiyksiköiden maksimaalisen laskun arvioimisessa per minuutti. Tätä absorbanssin laskua tulkittiin sytokromi c-oksidaasin aktiivisuutena.

Analyyseissä käytettiin kahta standardia: standardikalanäytettä ja vetyperoksidia, joiden avulla tarkkailtiin, että mittauslaite ja sytokromi c -liuos toimii kunnolla ja että olosuhteet pysyvät mahdollisimman samanlaisina. Standardikalanäytettä käytettiin 50 µl joka toisella mittauskerralla. Vety- peroksidistandardia käytettiin kerran jokaista uutta 60 nM sytokromi c-laimennosta kohden. Vety- peroksidistandardia käytettiin kerralla 2µl.

Ennen mittausten aloittamista piti selvittää sopiva kalahomogenaatin määrä suhteessa substraatti- liuokseen. Kalahomogenaattia kokeiltiin 10, 20 ja 50 µl annoksina, joiden päälle pipetoitiin 200 µl

(17)

17

substraattiliuosta. Sopiva määrä määriteltiin reaktion aiheuttaman käyrän tasaisuuden perusteella.

Varsinaisissa mittauksissa kuoppalevylle pipetoitiin 50 µl homogenisoitua kalanäytettä kaksi kertaa samasta näytteestä ja 200 µl substraattiliuosta. Kalanäytteet mitattiin satunnaisessa järjestyksessä.

Ne sulatettiin ja sekoitettiin huolellisesti ja sulana niitä säilytettiin jäähauteessa. Kerrallaan mitattiin 5 kappaletta näytteitä. Mitatut näytteet vietiin mittausten jälkeen -20 °C pakastimeen odottaman proteiinipitoisuuden määrittämistä.

4.3.3 Proteiinipitoisuuden määrittäminen

Sytokromi c-oksidaasin entsyymiaktiivisuuden mitatuista näytteistä mitattiin myös proteiinipitoisuudet Bradford-menetelmällä, jotta entsyymiaktiivisuudet pystyttäisiin laskemaan suhteutettuna näytteen proteiinipitoisuuteen. Sitraattisyntaasin aktiivisuuteen käytetyistä näytteistä mitattiin myös proteiinipitoisuuksia, jotta voitiin vertailla ovatko proteiinipitoisuudet rinnakkaisissa näytteissä riit- tävän lähellä toisiaan.

Proteiinipitoisuudet määritettiin sekoittamalla 1 ml Bradford-liuosta (He, Fanglian 2011) ja 1 µl sulatettua näytettä ja vertaamalla niiden absorbanssia 595 nm aallonpituudella referenssi-näytteisiin FLUOstar Omega laitteella. Referenssinäytteet valmistettiin pipetoimalla 1 ml Bradford liuosta seit- semään putkeen ja lisäämällä niihin 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 µl 1 mg/ml BSA-liuosta.

Mittauksissa laitteen kuoppalevylle pipetoitiin 200 µl jokaisesta referenssiputkesta ja lisäksi 200 µl kalanäyteputkesta noin 50 kuoppaan kerrallaan. Lisäksi nollausnäytteeksi pipetoitiin 200 µl 0- referenssiä.

4.4 Kuvaajien käsittely ja entsyymiaktiivisuuden laskeminen

Omega data analysis -ohjelma tuotti jokaiselle mitatulle näytteelle oman käyrän absorbanssin muu- toksien mukaan. Sitraattisyntaasimäärityksissä käyrä laski ja sytokromi c-oksidaasin kanssa se nousi. Käyrä laski tai nousi aluksi jyrkemmin ja muutos hidastui reaktion edetessä. Saadusta käyrästä erotettiin silmämääräisesti jyrkimmin muuttuva osa. Ohjelma antoi lukuarvon valitulle käyrän suo- ralle.

Tämä käyrän ajanjakson valinta tehtiin kaikille näytteille yksittäin. Jos pipetoitaessa joihinkin kuoppiin oli jäänyt häiritseviä ilmakuplia tai kuvaaja teki muuten outoja piikkejä, kyseisiä arvoja ei otettu mukaan tuloksiin.

Näytteen relatiivinen entsyymiaktiivisuus laskettiin jakamalla absorbanssin muutos näytteen pro- teiinipitoisuudella. Samaa kaavaa käytettiin sekä sitraattisyntaasille että sytokromi c-oksidaasi

(18)

18

Relatiivinen aktiivisuus(∆abs*min^-1*µg^-1) = mitattu absorbanssin nousu-lasku (∆abs* min^-1) *100000 proteiinipitoisuus (µg/µl)*50 µl

4.5 Aineiston tilastollinen käsittely

Tuotetun entsyymiaktiivisuusaineiston laskenta ja yhdistäminen muuhun aiemmin kalanpoikasista koottuun dataan tehtiin Microsoft Office Excel 2010- ohjelmalla. Tilastollinen käsittely suoritettiin R-ohjelman Imer-paketilla, jolla voi testata aineistoissa esiintyviä kiinteitä - ja satunnaistekijöitä.

Tilastollisessa käsittelyssä käytettiin lineaarista sekamallia (linear mixed model) ja REML- funktiota. Lineaariset sekamallit ovat joustavia analyyttisiä työkaluja, joiden avulla voi tutkia muut- tujien välisiä suhteita.

Tilastollisilla testeillä haluttiin selvittää, löytyykö lämpökäsittelyryhmien välillä eroja entsyymiaktiivisuuksissa. Aineiston pitää olla jakautunut likimain normaalisti, jotta lineaarisia sekamalleja voi käyttää. SPSS-ohjelman avulla testattiin aineiston normaalijakautuneisuus. Kiinteäksi muuttu- jaksi otettiin siittiöiden lämpökäsittely ja satunnaismuuttujiksi isä- ja äitivaikutus sekä niiden yhteisvaikutus. Lisäksi alkuperäisessä mallissa oli mukana em. satunnaismuuttujien ja lämpökäsitte- lyiden väliset vuorovaikutukset. Koska kyseisiä interaktioita ei löydetty, jätettiin ne pois lopullisesta mallista. Näin pystyttiin selvittämään, löytyykö datasta lämpökäsittelyryhmien välisiä eroja entsyymiaktiivisuudessa. Lisäksi testasimme löytyisikö eri entsyymien ja ruskuaisen koon välillä riippuvuutta.

5 TULOKSET

5.1 Lämpökäsittelyt ja entsyymiaktiivisuudet

Tulokset eri tekijöiden vaikutuksista entsyymiaktiivisuuksiin on koottu näkyville taulukkoon 2.

Aluksi lineaariseen sekamalliin syötettiin kaikki mahdolliset vaikutukset eli lämpökäsittely, isän- vaikutus, äidinvaikutus sekä isä x äiti parin yhteisvaikutus. Lämpötilan sekä äidin, isän ja äiti x isä parin välillä ei löytynyt merkitseviä yhteisvaikutuksia (p=0,70, p= 1,00 ja p= 1,00), joten mallia voitiin yksinkertaistaa poistamalla ne mallista.

CS entsyymiaktiivisuuden keskiarvo on kylmäkäsitellyillä poikasilla 2,85±0,73 ∆abs*min^-1*µg^-1. ja lämpimässä käsittelyssä on 2,70±0,58∆abs*min^-1*µg^-1. Vanhemmista johtuvia satunnaisvaikutuksia CS-entsyymiaktiivisuudelle ei havaittu. Myöskään lämpökäsittely ei vaikuttanut CS:n entsyymiaktiivisuuteen.

(19)

19

COX:n kanssa meneteltiin samalla tavalla tilastollisessa käsittelyssä. Aluksi malliin syötettiin kaikki lämpökäsittelyn ja äidin, isän ja äiti x isä parin väliset mahdolliset vaikutukset, mutta koska lämpökäsittelyiden sekä äidin, isän ja äiti x isä parin välillä ei löytynyt merkitseviä yhteisvaikutuksia (kaikissa p=1,00), ne poistettiin mallista. COX entsyymiaktiivisuuksien keskiarvot olivat kyl- mäkäsitellyillä poikasilla 2,41±0,69 ja lämminkäsitellyillä poikasilla 2,39±0,53 ∆abs*min^-1*µg^-1

∆abs*min^-1*µg^-1. COX entsyymiaktiivisuudessa ei havaittu vanhemmista johtuvia satunnaisvaikutuksia eikä entsyymiaktiivisuuden ja myös lämpökäsittelyn vaikutus oli tilastollisesti ei-merkitsevä.

Entsyymiaktiivisuuksien yhteen lasketut keskiarvot ja keskihajonnat kylmä- ja lämminkäsitte- lyille esitetään kuvassa 3. Kuvasta näkee, että keskiarvot olivat hyvin lähellä toisiaan eri käsittely- ryhmillä. Koiraan numero 7 jälkeläisten entsyymiaktiivisuuksien keskiarvot ja keskihajonnat esite- tään taulukossa 3.

Entsyymiaktiivisuuksien keskiarvoista ja keskihajonnoista esimerkkinä taulukossa 3 esitetään koiraan numero 7 jälkeläisten entsyymiaktiivisuudet ja keskihajonnat. Kuvassa 4 ja 5 esitetään taulukko 3:n sisältämät tiedot. Kuvista näkee, miten keskihajonnat vaihtelevat mittauksissa samasta perheestä.

Taulukko 2. Äidin, isän ja äiti x isän yhteisvaikutuksen sekä lämpökäsittelyn vaikutus sitraattisyntaasin ja sytokromi c-oksidaasin entsyymiaktiivisuuksiin. Tilastollisen merkitsevyyden raja on p<0,05.

Sitraattisyntaasi

SATUNNAISVAIKUTUKSET χ² p-arvo

Äiti 0,00 1,00

Isä 0,00 1,00

Äiti x isä 0,11 0,70

KIINTEÄT VAIKUTUKSET t-arvo p-arvo

Lämpökäsittely – 1,12 0,27

Sytokromi c-oksidaasi

Äiti 2,0e^-02 0,90

Isä 2,3e^-13 1,00

Isä x äiti 2,3e^-13 1,00

Lämpökäsittely 0,54 0,59

(20)

20

Kuva 3. Sytokromi c-oksidaasin ja sitraattisyntaasin entsyymiaktiivisuuksien yhteenlasketut keskiarvot ja keskihajonta kahden eri lämpökäsittelyissä. Pylväissä esitetyt keskiarvot ja keskihajonnat ovat laskettu 200 entsyymiaktiivisuudesta.

Taulukko 3. Isän nro 7 jälkeläisten keskiarvot ja keskihajonnat kummankin entsyymin osalta. Kes- kiarvot ja hajonnat ovat laskettu neljästä saman yhdistelmän entsyymiaktiivisuudesta. Keskiarvon yksikkö on ∆abs*min^-1*µg^-1.

Äiti Isä Käsittely CS keskiarvo CS keskihajonta COX keskiarvo

COX keskihajonta

1 7 kylmä

2,38 0,42 1,51 0,43

1 7 lämmin

3,09 0,96 2,38 0,09

3 7 kylmä

1,74 0,42 3,36 0,09

3 7 lämmin

2,19 0,62 2,38 0,50

4 7 kylmä

3,03 0,69 2,79 0,45

4 7 lämmin

3,55 1,35 2,12 0,84

5 7 kylmä _2,89 _0,66 _2,88 _0,76

5 7 lämmin

2,47 0,18 2,45 0,84

6 7 kylmä

4,74 0,57 2,26 0,72

6 7 lämmin

3,77 0,46 3,13 0,09

(21)

21

Kuva 4. Sitraattisyntaasi entsyymiaktiivisuuksien ja keskihajontojen erot saman isän nro7. hedel- möittämillä äideillä (1,2,3,4,5) eri lämpökäsittelyissä kylmä (3,5 °C) ja lämmin (6,5 °C). Keskiarvot ja keskihajonnat ovat laskettu neljästä aktiivisuusarvoista, joista kaksi on samasta näytteestä saatuja tuloksia.

Kuva 5. Sytokromi c-oksidaasi entsyymiaktiivisuuksien ja keskihajontojen erot saman isän nro 7.

hedelmöittämillä äideillä (1,2,3,4,5) eri lämpökäsittelyissä kylmä (3,5 °C) ja lämmin (6,5 °C). Kes- kiarvoihin ja keskihajonnat ovat laskettu neljästä aktiivisuusarvoista, joista kaksi on samasta näyt- teestä saatuja tuloksia.

(22)

22 5.2 Ruskuaisen koko ja entsyymit

Tulokset ruskuaisen koon ja entsyymiaktiivisuuksien välisistä vaikutuksista on koottu esille taulukkoon 4. Satunnaisvaikutuksissa variaatio oli olematonta kummankin entsyymin kohdalla.

Sitraattisyntaasin osalta ruskuaisen koon ja äidinvaikutuksen, isänvaikutuksen ja äiti x isä parin väliltä ei löytynyt yhteysvaikutuksia (ruskuaisen koko x äiti, p=0,80 ja muut yhteisvaikutukset p=1,00). Ruskuaisen koon ja vanhempien väliset yhteisvaikutukset poistettiin siis mallista. Pelkistä vanhemmista johtuneita satunnaisvaikutuksia ei havaittu. Ruskuaisen koon ja sitraattisyntaasin aktiivisuuden väliltä ei löydetty merkitsevää yhteyttä.

Sytokromi c-oksidaasin ja ruskuaisen koon välisistä äidinvaikutus (p=0,90), isänvaikutus (p=0,50) ja äiti x isä parin yhteisvaikutuksista (p=0.30) väliltä ei löytynyt merkitseviä yhteisvaikutuksia, joten ne poistettiin mallista. Vanhemmista johtuvia satunnaisvaikutuksia ei havaittu. Syto- kromi c-oksidaasin ja väliltä löytyi heikko negatiivinen yhteys (p=0,036) Heikko negatiivinen yhteys sytokromi c-oksidaasin ja ruskuaisen koon välillä näkyy (kuva 6).

Taulukko 4. Sitraattisyntaasin ja sytokromi c-oksidaasin entsyymiaktiivisuuksien väliset kiinteät vaikutukset ja äidistä, isästä ja äiti x isä parista johtuvat satunnaistekijät. Tilastollisesti merkitsevä tekijä on lihavoitu. Tilastollisesti merkitsevyyden raja on p<0,05.

Ruskuaisen koko ja sitraattisyntaasi

Äiti 2,3e^-13 1,00

Isä 0,00 1,00

Isä x äiti 0,11 0,70

Ruskuaisen koko -0,98 0.33

Ruskuaisen koko ja sytokromi c-oksidaasi

Äiti 0,00 1,00

Isä 0,00 1,00

Isä x äiti 0,00 1,00

Ruskuaisen koko 2,11 0,036

(23)

23

Kuva 4. Ruskuaisen koon ja sytokromi c-oksidaasi relatiivisen entsyymiaktiivisuuden välillä havaittiin heikon negatiivisen yhteys.

5.3 Kalanmunien koko

Tiedot kalanmunien koista kummassakin käsittely ryhmässä on koottu taulukkoon 5. Kalanmunien halkaisijoiden, pinta-alojen ja tilavuuksien keskiarvot olivat lämpökäsittelyryhmien välillä hyvin lähellä toisiaan (taulukko 5). Lämpökäsittelyiden ja kalanmunien halkaisijan väliltä ei havaittu äi- din, isän ja äiti x isä parin yhteyksiä (lämpökäsittely ja isä p=0,8, lämpökäsittelyn ja äidin ja äiti x isä parin välillä p=1,0)(taulukko 6). Isästä ja äiti x isä parista johtuvia satunnaisvaikutuksia ei havaittu kalanmunien halkaisijassa (taulukko 6). Sen sijaan äiti-vaikutus munien kokoon oli tilastollisesti erittäin merkitsevä (p<0.001).

Taulukko 5. Kylmä ja lämminkäsitellyillä maideilla hedelmöitettyjen kalanmunien halkaisijoiden, pinta-alojen ja tilavuuden keskiarvot ja keskihajonnat.

Kylmäkäsitellyt poikaset Lämminkäsitellyt poikaset

Halkaisija 0,308±0,021 cm 0,309±0,023 cm

Pinta-ala 0,074±0,012 cm² 0,075±0,011 cm²

Tilavuus 0,016±0,003 cm³ 0,016±0,004 cm³

(24)

24

Taulukko 6. Hedelmöittyneiden kalanmunien halkaisijoiden tilastollisen käsittelyn tulokset. Van- hemmista johtuva muuntelu ja lämpökäsittelyiden kiinteät vaikutukset. Tilastollisen merkitsevyyden rajana on p<0,05.

6 TULOSTEN TARKASTELU

Ennen omaa osuuttani kalanpoikasille tehdyssä uintikokeessa havaittiin, että kylmäkäsitellyt maidin poikaset olivat vahvempia uimareita (p<0,001). Niiden uintiajan keskiarvo oli 69 sekuntia ja uinti- aika lämminkäsitellyillä poikasilla oli 39 sekuntia. Lämpökäsittelyryhmien väliltä löytyi myös tilastollisesti merkitsevä ero poikasten pituudessa ja massassa (p<0,021 ja p<0,023). Kylmäkäsitellyllä maidilla hedelmöitetyt poikaset olivat keskimäärin pitempiä ja painavampia verrattuna lämpimän lämpökäsittelyn poikasiin. Tutkimuksessa saatiin selville, että maidin lämminkäsittely aiheutti muutoksia poikasten ominaisuuksissa. Kylmäkäsittelyn katsotaan olevan luonnollinen siialle, koska ve- sien lämpötilat ovat luonnossa kutuaikana lähempänä 3,5 °C kuin 6,5 °C.

Kalojen lihaksisto aikuisilla kaloilla koostuu pääasiassa punaisista ja valkoisista lihaskuiduista (Bone & Moore 2008). Väriero johtuu lihaskuitujen erilaisesta myoglobiini sisällöstä. Myoglobulii- ni on happea varastoiva proteiini (Campbell & Reece 2011). Punaista lihaskudosta kutsutaan hi- taaksi lihaskuiduksi ja sitä käytetään hitaassa aerobisessa uinnissa. Valkoista lihaskudosta taas kutsutaan nopeaksi ja sitä käytetään nopeisiin uintipyrähdyksiin, jolloin energia tuotetaan pääasiassa glykolyysin avulla (Bone & Moore 2008). Punaisen lihaskuidun aerobinen kapasiteetti on paljon valkoista lihaskuitua suurempi (Goolish 1991). Sitraattisyntaasin ja sytokromi c-oksidaasin aktiivisuudet punaisessa lihaskudoksessa ovat 25–35 % korkeampi verrattuna valkoiseen lihaskudokseen (Johnston & Moon 1980). Punaista lihaskudosta on aikuisissa kaloissa yleensä selvästi vähemmän kuin valkoista, sillä punaista lihaskudosta on monissa kaloissa vain 5 % kokonaismassasta (Love 1980, Goolish 1991). Joillakin lajeilla kuten hauella (Esox lucius) ei ole aikuisena ollenkaan punaista lihaskudosta (Goolish 1991).

Kalanpoikasessa punaiset lihaskuidut, jotka saavat happensa ihon läpi vedestä, ympäröivät yksi- soluisena kerroksena koko poikasen kehoa (Wieser & Kaufman 1998). Kalanpoikasen keskellä on valkoista lihaskuitua, jossa on paljon enemmän mitokondrioita kuin aikuisen kalan valkoisissa li-

Kalanmunien halkaisija

Äiti 122 <2e-¹⁶

Isä 8,22e^-4 1

Äiti x isä 3,87e^-12 1

Lämpökäsittely -0,964 0,336

(25)

25

haskuiduissa. Pienen kalanpoikasen uinnin katsotaan olevan käytännössä pelkästään aerobista (Goo- lish 1991, Wieser & Kaufman 1998). Poikasen kasvaessa aerobinen kyky vähenee ja tarve kasva- valla anaerobiselle energian tuotannolle kasvaa (Goolish 1991).

Mittasin pro-gradu tutkielmassani kalanpoikasista sitraattisyntaasin ja sytokromi c-oksidaasin entsyymiaktiivisuudet, jotta voitaisiin selvittää voisiko mitokondrioiden lukumäärä selittää eron ryhmien välisessä uintikyvyssä. Sitraattisyntaasin- ja sytokromi c-oksidaasin aktiivisuutta voidaan käyttää arvioimaan mitokondrioiden lukumääriä (Hardewig ym.1999, Vigelsø ym. 2014). Pro-gradu tutkielmaan suunniteltiin kaloilla tehdyt tutkimuksen pohjalta. Arveltiin, että selitys eroille uintiky- vyssä saattaisi löytyä mitokondrioiden lukumäärien eroavaisuuksista, sillä mitokondrioiden luku- määrän lisääntyminen johtaa usein aerobisen suorituskyvyn nousemiseen.

Lämpökäsittelyryhmien väliltä ei löytynyt merkitseviä eroja sitraattisyntaasin ja sytokromi c- oksidaasin entsyymiaktiivisuuksissa. Myöskään vanhemmista johtuvia satunnaisvaikutuksia ei poikasten entsyymiaktiivisuuksissa havaittu, sillä vaihtelu näytteiden välillä oli hyvin pientä kummankin entsyymin kohdalla. Tulosten perusteella vaikuttaisi, että maidin lämpökäsittely ei aiheuttanut mitokondrioiden lukumäärän laskemista lämpökäsitellyillä poikasilla. Joku muu tekijä siis ilmeises- ti selittää eron uintikyvyssä lämpökäsittelyryhmien välillä.

Esimerkiksi Hinterleitner (ym. 1986) ja Johnston & Moon (1980) ovat tutkineet sitraattisyntaasin ja sytokromi c-oksidaasin aktiivisuuksia kaloissa toisesta näkökulmasta kuin pro-gradu tutkielmassa tehtiin. Hinterleitner (ym. 1986) tutkivat entsyymiaktiivisuuksien muutoksia siikojen sukuun kuulu- villa lajeilla (Coregonidae) kalojen kasvaessa. He saivat selville, että sitraattisyntaasi ja sytokromi c-oksidaasi aktiivisuudet olivat korkeimmillaan nuorilla kalanpoikasilla ja niiden aktiivisuudet las- kivat kasvamisen myötä. Muutokset johtuvat kasvamisen vaikutuksista aineenvaihduntaan ja uimi- seen (Hinterleitner ym. 1986). Sytokromi c-oksidaasi aktiivisuus vastakuoriutuneilla kalanpoikasten valkoisissa lihaskuiduissa oli korkea ja se laski ollen käytännössä poissaoleva 90 päivän kuluttua (Goolish 1991). Johnston & Moon (1980) tutkivat harjoittelun vaikutusta energia-aineenvaihdunnan entsyymiaktiivisuuksiin puronieriällä (Salvenius fontinalis). Tutkimuksessa saatiin selville, että harjoittelu vaikutti laskevasti glykolyytisien entsyymien aktiivisuutta valkoisessa lihaskudoksessa.

Glykolyyttisien entsyymien aktiivisuudet kasvoivat punaisissa lihassoluissa, mutta harjoittelu ei vaikuttanut merkitsevästi sitraattisyntaasin ja sytokromi c-oksidaasin aktiivisuuksiin, joten tutkimuksessa arveltiin, ettei harjoittelu vaikuta punaisten lihasolujen aerobiseen kapasiteettiin.

Kalanpoikasen uintikyky on usein yhteydessä sen kokoon, sillä suurempi poikanen on usein vah- vempi uimaan, koska isommalla kalalla on suurempi voimantuottokyky (Garrido ym. 2015). Pro- graduun liittyvässä tutkimuksessa ei kuitenkaan havaittu, että uintikyvyn ja kalanpoikasten koon välistä riippuvuutta.

(26)

26

Lämpökäsittelyryhmien massojen keskiarvojen erotus on 0,15 mg ja pituuksien erotus 0,13 mm ja kylmäkäsitellyt poikaset ovat isompia kummankin mittarin mukaan. Tilastollisesti poikasten pituuksien ja massan välillä havaittiin merkitsevä ero (p<0,021 ja p<0,023), mutta käytännössä ko- koerot olivat niin pieniä, että yksinomaan kokoero ei todennäköisesti selitä ryhmien välisiä uintiky- kyeroja.

Hedelmöittyneet kalanmunat ja munista kuoriutuneet kalanpoikaset saavat kehitykseen tarvitse- man energiansa ruskuaispussista (Kamler 2008). Poikasen kasvunopeus on siis riippuvainen ruskuaisesta. Tilavuudeltaan suuremman ruskuaispussin omaavilla poikasilla on enemmän aikaa aloittaa ulkoisen ruoan hankinta ja niillä pitäisi olla enemmän energiaa käytettävissään ilman ulkoista ruo- kaa. Ruskuaispussi sisältää esimerkiksi lipoproteiineja, fosfoproteiineja ja triglyseriinejä (Kamler ym. 2008). Suurempi ruskuaispussi tarjoaa enemmän ravintoa, jolla voitaisiin ajatella olevan posi- tiivinen vaikutus poikasten uintikykyyn. Ruskuaispussien tilavuudessa ei kuitenkaan löytynyt mer- kitsevää eroa lämpökäsittelykäsittelyryhmien välillä, joten ruskuaispussin koko ei siis selitä ryhmien välisiä eroja uintikyvyssä.

Pienten kalanpoikasten uintikyky on pääasiassa aerobista, joten se on siis riippuvainen lihasten hapensaannista (Goolish 1991, Wieser & Kaufman 1998). Jos käsittelyryhmien välillä esiintyisi eroja kaasujenvaihdossa, niin se voisi selittää lämpökäsiteltyjen poikasten nopeamman väsymisen.

Kalanpoikasten kaasujenvaihto tapahtuu aluksi ihonpintasolukon läpi, sillä kidukset kehittyvät vasta myöhemmin (Romboug 2004). Tutkimuksessa ei tutkittu kalanpoikasten hapenottokykyä, joten ei voi sanoa olisiko se voinut selittää eron ryhmien välisessä uintikyvyssä.

Kalanmunan koko kertoo usein sen sisällä olevan poikasen koosta. Yleensä mitä suurempi muna, sitä suurempi poikanen siitä kuoriutuu (Chambers & Leggett 1998). Kalanpoikasen suurempi koko antaa kilpailuedun saman lajin pienempiin poikasiin verrattuna, sillä kooltaan isompi poikanen pystyy käyttämään laajempaa ravintovalikoimaa sekä välttämään paremmin saalistajia (Pakkasmaa ym.

2001). Kalanmunan kokoon vaikuttaa usea tekijä, kuten äidin koko, ikä ja geneettinen perimä (Chambers 1997 Pakkasmaan ym. 2001 mukaan). Ruskuainen on merkittävä juuri hedelmöittyneen kalanmunan osa (Kamler 2009).

Maidin lämpökäsittelyn ei havaittu vaikuttaneen hedelmöittyneiden kalanmunien halkaisijoihin.

Pro gradu tutkielman tulosten mukaan äiti aiheutti satunnaisvaikutuksia kalanmunien koolle, mikä sopii aikaisempiin tutkimuksiin ja käsityksiin, jonka mukaan äiti vaikuttaa muniensa kokoon (Pak- kasmaa ym. 2001). Pro-gradu tutkielmassa ei havaittu isän, tai vanhempien yhteisvaikutusta kalanmunien koolle, joita havaittiin Pakkasmaa (ym. 2001) tutkimuksessa.

(27)

27 6.1 Tulosten luotettavuus

Entsyymiaktiivisuuden mittaamiseen käytettiin tutkielmassa menetelmiä, joita ei ole aikaisemmin käytetty sadoille näytteille. On tärkeää, että kaikki mittaukset ovat vertailukelpoisia keskenään, joten mittausolosuhteet pitäisi pystyä pitämään vakiona ja kaikki näytteet käsitellä samalla tavalla.

Esimerkiksi aika liuosten pipetoimisesta yhteen ja mittauksen aloittamisen välillä vaihteli. Entsyy- miaktiivisuuksien ja lämpökäsittelyryhmien välillä ei havaittu eroja, joten epäselväksi jäi, oliko entsyymiaktiivisuuksissa eroja, vai oliko käytetyt mittausmenetelmät epätarkkoja.

Pro-gradussa käytetyssä menetelmässä oli joitakin heikkouksia, kuten esimerkiksi se, että ent- syymiaktiivisuusmittauksissa täytyi toimia hyvin nopeasti, sillä reaktio käynnistyi heti, kun liuokset kohtasivat toisensa. Kerralla mittasin aina 5 näytettä ja usein mukana oli myös standardina joko sitraattisyntaasi entsyymi, tai kalanäyte. Standardien avulla tarkkailtiin mittausolosuhteiden samanlaisena pysymistä ja liuosten toimivuutta. Kaivoja oli siis käytössä 11. Pipetoinnissa meni noin 10 sekuntia, joten ensimmäiseksi pipetoiduissa näytteissä reaktio ehti aina tapahtua muita näytteitä pitempään. Lisäksi jouduin silloin tällöin puhkomaan ilmakuplia ennen kuin pystyin käynnistä- mään. Ensimmäisien näytteiden mitatut tulokset jäivät jossakin määrin todellista pienemmiksi.

Näytteitä olisi ehkä pitänyt mitata kerralla vähemmän, jolloin toisaalta mittauksiin olisi mennyt paljon kauemmin.

Uimakokeiden aikana poikaset olivat 3-10 päivää vanhoja. Uintikokeen jälkeen kalanpoikasia otettiin näytteiksi entsyymiaktiivisuusmittauksiin kahdessa erässä ja kertojen välissä aikaa oli noin kaksi viikkoa. Tutkimuksen alkuperäisenä tarkoituksena oli vertailla entsyymiaktiivisuuksia kahden näytteenottokerran välillä, jotta nähtäisiin olisiko ajan kulumisella vaikutusta poikasten entsyymiaktiivisuuksiin. Vertailua ei voitu tehdä, koska ensimmäisen näytteenottamiskerran näytteiden ho- mogenisoiminen epäonnistui. Ensimmäisen näytteenottokerran epäonnistumisen seurauksena epä- selväksi jää, että olisiko entsyymiaktiivisuuksista lämpökäsittelyryhmien välillä voinut löytyä eroa heti uintikokeen jälkeen. Sitraasisyntaasi ja sytokromi c-oksidaasi aktiivisuudet on havaittu laske- van kalanpoikasten kasvaessa (Hinterleitnet ym.1985), joten kahden viikon aikana näiden kahden entsyyminaktiivisuudet saattoivat jo laskea ja mahdollisesti ryhmien väliset entsyymiaktiivisuuserot hävitä.

Kalanpoikaset elivät kokeen ajan vain ruskuaisensa turvin. Ruskuaisen riittävyyteen vaikuttaa esimerkiksi veden lämpötila. Muikun poikasilla Coregonus albula, jotka olivat 8 °C vedessä ruskuaispussista riitti noin 15 päiväksi (Huuskonen & Karjalainen 1993). Tutkimuksen kalanpoikasten veden lämpötila oli ennen uintikoetta ja sen jälkeen 6 ºC, joten ruskuaisesta riitti todennäköisesti

(28)

28

poikasille ravintoa pariksi viikoksi. Voi siis olla niin että myöhäisemmän näytteenottokertana poikaset saattoivat olla jo nääntyneitä.

7 JOHTOPÄÄTÖKSET

Gradussa saatujen tulosten perustella näyttää siltä, etteivät koiraan maidin erilaiset lämpökäsittelyt ennen hedelmöittämistä aiheuttaneet periytyviä muutoksia jälkeläisten sitraattisyntaasin ja sytokromi c-oksidaasin entsyymiaktiivisuuksiin. Ennen pro-gradu tutkielman osuutta tutkimuksessa havaittiin, että kylmäkäsitellyllä maidilla hedelmöitetyt poikaset olivat vahvempia uimareita verrattuna lämpökäsitellyllä maidilla hedelmöitettyihin poikasiin. Pro-gradu tutkielmassa tehdyt entsyymiak- tiivisuusmittaukset eivät näytä selittävän eroja uintikyvyissä, sillä entsyymiaktiivisuuksissa ei havaittu eroja lämpökäsittelyiden välillä. Muutokset uintikyvyissä voisivat perustua muutoksiin aerobisessa suorituskyvyssä. Aerobisen suorituskyvyn tärkeitä määrittelijöitä ovat mitokondriot. Tut- kielmassa mitattujen CS:n ja COX:n entsyymiaktiivisuuksien avulla voidaan tehdä päätelmiä mitokondrioiden lukumääristä. Tulosten perusteella lämpökäsittelyryhmien välillä ei havaittu eroja entsyymiaktiivisuuksissa. Tulosten perusteella voisi päätellä, ettei mitokondrioiden lukumäärissä ollut eroja lämpökäsittelyryhmien välillä.

Entsyymiaktiivisuudet mitattiin kalanpoikasista, jotka tapettiin kahden viikon kuluttua uintiko- keesta, joten ei voida olla varmoja, että onko kalanpoikasten entsyymiaktiivisuus saattanut muuttua kokeen jälkeen, vai eikö entsyymiaktiivisuuksissa ole ollut missään vaiheessa eroa. Mekanismit, joilla maidin lämpökäsittely sai aikaan näkyvän muutoksen kalanpoikasten ominaisuuksissa, jäi tutkielman perusteella epäselväksi. Jatkossa pitäisi ehdottomasti jatkaa uintikykyyn vaikuttavien mekanismien etsimistä. Lisäksi kokeen voisi vielä tehdä uudestaan niin, että poikaset analysoitaisiin heti uintikokeen jälkeen, jotta voitaisiin varmistaa, ettei kahden viikon välinen aika uintikokeen ja näytteiden oton välillä vaikuttaneet entsyymiaktiivisuuksien tasoittumiseen.

KIITOKSET

Haluaisin kiittää ohjaajiani Jukka Kekäläistä, Hannu Huuskosta ja Steffi Goffartia avusta ja neu- voista tutkielman kanssa. Steffiä haluan kiittää erityisesti avusta laboratoriotöiden kanssa. Lisäksi haluaisin kiittää kalanpoikaset homogenisoinutta Anita Kervistä ja muita jotka ovat osallistuneet aineistoni kasaamiseen. Lisäksi haluan kiittää Olli Nykästä henkisestä tuesta koko tutkielma proses- sin aikana.

(29)

29 LÄHTEET

Agrawal, A. 2001: Phenotypic Plasticity in the Interactions and Evolution of Species. –Science 294:

321-326.

Alderdice, D.F. 1988: Osmotic and Ionic Regulation in Teleost Eggs and Larvae. – Teoksessa:

Hoar, W.S., Randall, D.J (toim.), Fish Physiology 10 A: 163–251. Academic Press, Lontoo.

Aubin-North, N., Renn, S. 2009: Genomic reaction norms: using integrative biology to understand molecular mechanisms of phenotypic plasticity. –Molecular ecology 2009.

Bang, A., Grønkjær, P., Clemmesen, C., Høre, H. 2006: Parental effect on early life traits of Atlantic herring (clupea harengus L.) larvae. –Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 334: 51-63.

Block, B.A., Finnerty, J.R., Stewart, A.F.R., Kidd, J. 1993: Evolution of endothermy in fish:

Mapping physiological traits on a molecular phylogeny. –Science 260: 210-214.

Bonduriansky, R., Day, T. 2009: Nongenetic Inheritance and Its Evolutionary Implications. – Annual Review of Ecology, Evolution and Systematics 40: 103-125.

Bonduriansky, R., Crean, A.J., Day, T. 2012: The implications of nongenetic inheritance for evo lution in changing environments. – Evolutionary Applications 5: 192-201.

Bone, Q., Moore, R.H. 2008: Biology of Fishes. – 478 s. Taylor & Francis Group. Cornwall.

Cavalli, D. 2006: Chromatin and epigenetics in development: blending cellular memory with cell fate plasticity. – Development 133: 2089-2094

Chevin, L., Lande, R., Mace, G.M. 2010: Adaption Plasticity and Extinction in a Changing Envi- ronment: Towards a Predictive Theory. – Plos Biology 8: 1-10.

Chambers, R.C., Leggett, W.C. 1996: Maternal Inﬂuences on Variation in Egg Sizes in Temperate Marine Fshes. – American Zoology 36: 180–196.

Cingi, S., Keinänen, M., Vuorinen, P.J. 2010: Elevated water temperature impairs fertilization and embryonic development of whitefish Coregonus lavaretus.– Journal of Fish Biology 76: 502- 521.

Cossins, A., Franser, J., Hughes, M., Gracey, A. 2006 Post-genomic approaches to understanding the mechanisms of environmentally induced phenotypic plasticity. – Journal of Experimental Bi- ology 209: 2328-2336.

Crean, A., Marshall, D.J. 2008: Adaptive gamete plasticity in a broadcast spawning marine invertebrate. – Proceedings of the National Academy of Science 105: 13508–13513.

Crean, A., Bonduriansky, R. 2014: What is a paternal effect?. Trends in Ecology &

Evolution 29: 554-559.

Eigentler, A., Drax, A., Wiethüchter, A., Kuznetsov, A.V., Lassing, B., Gnaiger, E. 2012:

Laboratory Protocol: Citrate Synthase A Mitochondrial Marker Enzyme. Mitochondrial Physiology Network 17.04:1-11.

Farrell A.P. 2009: Environment, antecedents and climate change: lessons from the study of tempe rature physiology and river migration of salmonids. – The Journal of Experimental Biology 212:

3771–3780.

Forsman, A. 2015. Rethinking phenotypic plasticity and its consequences for individuals, popula- tions and species. –Heredity 115: 276–284.

Fusco, G., Minelli, A. 2010: Phenotypic plasticity in development and evolution: facts and con- cepts. Philosophical transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 365: 547-556.

Garrido, S., Ben-Hamadou, R., Santos, A.M.P., Ferreira, S., Teodósio, M.A., Cotano, U., Irigoien, X., Peck, M.A., Saiz, E., Re, P. 2015: Born small die young: Intrinsic, size-selective mortality in marine larval fish. Science Reports 5: 1-10, doi: 10.1038/srep17065.

Gilbert, S.F. 2005: Mechanisms For The Environmental Regulation Of Gene Expression: Ecologi cal Aspects Of Animal Development. –Journal of Biosciences 30, 65-74.