Elintarvikkeiden säilyvyys: sinisen valon vaikutus hiivojen ja homeiden kasvuun kinkkuvoileipäkakun pinnalla

(1)

Elintarvikkeiden säilyvyys: sinisen valon vaikutus hiivojen ja homeiden kasvuun kinkkuvoileipäkakun pinnalla

Jokinen Tella

Ravitsemustieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto

Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos

Maaliskuu 2021

(2)

Itä-Suomen yliopisto, terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos

Ravitsemustiede

Jokinen, Tella C.: Elintarvikkeiden säilyvyys: sinisen valon vaikutus hiivojen ja homeiden kasvuun kink- kuvoileipäkakun pinnalla

Pro gradu -tutkielma, 54 sivua, 5 liitettä (8 sivua)

Tutkielman ohjaajat: FT Jenni Korhonen, FT Kati Väkeväinen, laatu- ja tuotekehityspäällikkö Katri Lun- nas

Maaliskuu 2021

Asiasanat: Candida albicans, sininen valo, fotodynaaminen inaktivaatio, fotoherkistäjä

Sinisen valon tehoa antimikrobisena menetelmänä elintarvikkeissa on tutkittu verrattain vähän. Sinistä valoa elintarvikkeiden säilyvyyden parantajana on tärkeää tutkia, sillä se voi olla mahdollinen antimikrobinen menetelmä elintarvikkeen aistinvaraista laatua vahingoittamatta. Kirjallisuuskatsauksen perusteella sinisen valon tehoon vaikuttavat monet tekijät, kuten tutkittu mikrobi ja käytetty valon aallonpituus. Tämän pro gradu -tutkielman tavoitteena oli tutkia sinisen valon tehoa kinkkuvoileipäkakuissa luonnostaan esiintyvien hiivojen ja homeiden kasvunestoon. Lisäksi kinkkuvoileipäkakkuja altistettiin Candida albicans -hiivalla. Tutkielman toisessa osassa oli myös mukana ulkoinen fotoherkistäjä, ri- boflaviini, jonka hypoteesina oli, että se tehostaa sinisen valon hiivojen ja homeiden kasvua inaktivoi- vaa vaikutusta. Tulosten perusteella sininen valo ei vähentänyt hiivojen ja homeiden kasvua kinkkuvoi- leipäkakussa. Riboflaviini, hypoteesin vastaisesti, edisti osittain mikrobien kasvua tilastollisesti merkit- sevästi. Johtopäätöksenä voidaan sanoa, ettei sininen valo itsessään tai riboflaviinin kanssa ole tehokas menetelmä ehkäisemään C. albicans -hiivan tai voileipäkakun luonnollisten hiivojen ja homeiden kasvua.

(3)

University of Eastern Finland, Faculty of Health Sciences School of Medicine

Institute of Public Health and Clinical Nutrition

Jokinen, Tella C.: Food preservation: the effect of blue light on the growth of yeasts and moulds on the ham savoury cakes

Master’s thesis, 54 pages, 5 appendices (8 pages)

Supervisors: PhD Jenni Korhonen, PhD Kati Väkeväinen and Quality and Product Development Man- ager Katri Lunnas

March 2021

Keywords: Candida albicans, blue light, photoinactivation, photosensitizer

The efficacy of blue light as an antimicrobial method has not been studied widely. It is important to study the microbial inactivation potential of blue light as it can be an antimicrobial preservation method without affecting harmfully to the sensory quality of food. According to the literature search, multiple factors can affect to the efficiency of blue light, for example the studied microbe and the used wavelength of the light. The aim of this study was to investigate the inactivation potential of blue light against naturally occurring yeast and moulds on savoury cake samples. Furthermore, savoury cake samples were inoculated by the yeast Candida albicans. In the second part of the study, the ex- ogenous photosensitizer riboflavin was included as it can improve the microbial inactivation potential of blue light. According to the results blue light did not decrease the number of yeasts and moulds in the savoury cake samples. Against the hypothesis, riboflavin partly increased the number of yeasts and moulds statistically significantly. In conclusion, the blue light alone or with riboflavin is not an effective method to inactivate C. albicans or naturally occurring yeast and moulds on savoury cakes.

(4)

Lyhenteet

C. albicans LED FH ELSAPA-hanke

Nm Pmy Log

Candida albicans Light emitting diode Fotoherkistäjä

Elintarvikkeiden säilyvyyden parantaminen ja laadun varmistaminen uusilla tekniikoilla -kehityshanke

Nanometri

Pesäkettä muodostava yksikkö Logaritmi

(5)

Sisältö

1 JOHDANTO 6

I KIRJALLISUUSKATSAUS 8

2 SININEN VALO 8

2.1 Fotodynaaminen inaktivaatio 9

2.2 Fotoherkistäjät 10

2.2.1 Solunisäiset fotoherkistäjät 11

2.2.2 Solunulkoiset fotoherkistäjät 12

3 HIIVAT JA HOMEET ELINTARVIKKEIDEN PILAAJAMIKROBEINA 15

3.1 Sinisen valon vaikutus hiivoihin ja homeisiin 21

3.2 Sinisen valon vaikutus bakteereihin 22

3.3 Sinisen valon vaikutus elintarvikkeiden aistinvaraiseen ja ravitsemukselliseen laatuun 23

II KOKEELLINEN OSA 29

4 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET 29

5 AINEISTO JA MENETELMÄT 30

5.1 Mikrobikanta ja kasvatusolosuhteet 30

5.2 Elintarvikenäytteiden valmistus 30

5.3 LED-valokaappi ja altistusolosuhteet 31

5.4 Elintarvikenäytteiden altistus 32

5.5 Aistinvarainen arviointi 33

5.6 Mikrobiologiset säilyvyyskokeet 34

5.7 Tilastolliset menetelmät 35

6 TULOKSET 36

7 POHDINTA 39

7.1 Tutkielman tulokset 39

7.2 Asetelmalliset erot 43

7.3 LED-tekniikka elintarviketeollisuudessa 44

(6)

7.4 Merkitys tulevaisuudessa 46

8 JOHTOPÄÄTÖKSET 47

LÄHTEET 48

LIITTEET

Liite 1. Kinkkuvoileipäkakun ainesosaluettelo ja kuva valmiista tuotteesta Liite 2. Kuva kinkkuvoileipäkakku-näytteistä ennen sinisen valon altistusta Liite 3. Kuvat voileipäkakkunäytteistä altistettuna siniselle valolle 6 ja 8 päivää Liite 4. Aistinvaraisen arvioinnin protokolla

Liite 5. Kuvia kinkkuvoileipäkakkunäytteistä eri aikapisteissä

(7)

1 JOHDANTO

Kuluttajat arvostavat ruokaa, jota on prosessoitu mahdollisimman vähän (Gouma ym. 2016). Elintarvik- keiden lisäaineita halutaan vältellä, mutta samaan aikaan elintarvikkeilta toivotaan pitkiä säilyvyysai- koja sekä helppoutta ja nopeutta valmistaa, jolloin jo elintarvikkeiden valmistusprosessi lisää mikrobiologisen kontaminaation riskiä (De Corato 2020). Elintarvikeperäiset patogeenit aiheuttavat useita sairastumisia ja kuolemia vuosittain (Hadi ym. 2020). Esimerkiksi hedelmien ja vihannesten käyttö on lisääntynyt terveyttä arvostavien ruokatrendien myötä, ja ne ovatkin yksi elintarvikepatogeenien ylei- nen tartunnan lähde (Luksiene ja Brovko 2013). Elintarvikkeiden säilyvyyttä parantavia menetelmiä ke- hitetään jatkuvasti ja yksi uusista menetelmistä on sininen valo (Josewin ym. 2018a). Sinisellä valolla tarkoitetaan näkyvän valon aallonpituutta 450–490 nm (Hietanen ym. 2009). Sininen valo tulee näky- vän aallon spektrissä violetin valon jälkeen (400–450 nm) ja usein kirjallisuudessa siniviolettia valoa kutsutaan siniseksi valoksi.

Sinisen valon etuna pidetään sen mahdollisuutta tappaa patogeenejä elintarvikkeissa vahingoittamatta elintarvikkeiden aistinvaraista laatua (Luksiene ja Paskeviciute 2011, Srimagal ym. 2016, dos Anjos ym.

2020). Verrattuna esimerkiksi pastörointiin, sinisen valon käsittelyssä ei käytetä kuumennusta, joka vai- kuttaisi elintarvikkeiden aistinvaraiseen tai ravitsemukselliseen laatuun (dos Anjos ym. 2020). Sinisellä valolla on täten laajemmat käyttömahdollisuudet eri elintarvikeryhmiin, kun taas pastörointi on usein käytössä vain nestemäisissä elintarvikkeissa. Sininen valo on myös helppo menetelmä ottaa käyttöön teollisuudessa, sillä LED-lamput saa asennettua esimerkiksi jääkaappeihin ja sinisen valon altistus voidaan tehdä yhtä aikaa tuotteiden varastointisäilytyksen aikana.

Kirjallisuutta sinisen valon käytöstä elintarviketutkimuksessa on vielä vähän. Sinistä valoa on tutkittu eri mikrobilajeja vastaan niin suspensioissa kuin erilaisissa elintarvikematriiseissa ja tulokset ovat vaih- televia. Sinisen valon tehoon vaikuttavat useat tekijät, kuten tutkittu mikrobilaji, elintarvikematriisi, käytetty aallonpituus, ympäristön lämpötila sekä altistusaika ja -annos (Kumar ym. 2015, Josewin ym.

2018a, Plavskii ym. 2018). Pääsääntöisesti sininen valo on ollut tehokas tappamaan patogeenejä yksin- kertaisten elintarvikematriisien pinnalta ja suspensioissa. Lisäksi osassa tutkimuksia on ollut käytössä fotoherkistäjä, joka lisää sinisen valon antimikrobista tehoa (Luksiene ja Paskeviciute 2011, Penha ym.

2017, Josewin ym. 2018a). Sinisen valon teho perustuu fotodynaamiseen inaktivaatioon, joka vaatii

(8)

happea ja fotoherkistäjän, jota voidaan lisätä tuotteeseen tehostamaan mikrobien inaktivoitumista (Luksiene ja Brovko 2013, Kim ym. 2015).

Tämän tutkielman tavoitteena oli tutkia sinisen valon mahdollisuutta antimikrobisena menetelmänä kinkkuvoileipäkakuissa. Tutkielma tehtiin yhteistyössä F.K. Trube Oy:n kanssa, joka osallistuu Pohjois- Savon liiton rahoittamaan ELSAPA-hankkeeseen (Elintarvikkeiden säilyvyyden parantaminen ja laadun varmistaminen uusilla tekniikoilla -kehityshanke). Kinkkuvoileipänäytteitä tutkittiin luonnollisesti esiintyvien hiivojen ja homeiden osalta sekä lisäksi osa näytteistä altistettiin C. albicans -hiivalla. Tutkimuk- sen toisessa osassa tutkittiin sinisen valon tehoa fotoherkistäjä riboflaviinin kanssa.

(9)

I KIRJALLISUUSKATSAUS

2 SININEN VALO

Näkyvällä valolla tarkoitetaan valoa, jota ihmissilmä kykenee aistimaan (Hietanen ym. 2009). Näkyvän valon aallonpituus vaihtelee 400–780 nanometrin välillä, joista violetin valon aallonpituus on 400–450 nm ja sinisen valon 450–490 nm. Violetti ja sininen valo tulevat näkyvän valon spektrissä heti UV-sätei- lyn jälkeen (100–400 nm). Valon lähteenä käytetään erilaisia lamppuja (Hietanen ym. 2009) ja monissa tutkimuksissa käytössä ovat olleet erilaiset LED-valaisimet (light emitting diode) (Srimagal ym. 2016, Zhang ym. 2016). Tutkimuksissa pääasialliset muuttujat koskien sinistä valoa ovat olleet valon intensiteetti ja säteilyannos sekä altistusaika. Valon intensiteetti voidaan ilmoittaa yksikössä mW/cm² ja sätei- lyannos ilmoitetaan yksikössä J/cm², joka lasketaan kertomalla valon intensiteetti altistusajalla (Josewin ym. 2018b).

Elintarvikkeiden säteilytyksestä on määrätty erikseen laissa, joka koskee gamma-, röntgen- tai elektro- nisäteilyä, muttei sinistä valoa. Elintarvikkeiden säteilytyksestä määrää kauppa- ja teollisuusministeriön asetus elintarvikkeen käsittelystä ionisoivalla säteilyllä (852/2000), joka pohjautuu Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiiviin 1999/2/EY ionisoivalla säteilyllä käsiteltyjä elintarvikkeita ja elintarvikkeiden ainesosia koskevan jäsenvaltioiden lainsäädännön lähentämisestä sekä direktiiviin 1999/3/EY ionisoivalla säteilyllä käsiteltyjä elintarvikkeita ja elintarvikkeiden ainesosia koskevan yhteisön luettelon vahvistamisesta. Suomessa on sallittua säteilyttää vain kuivattuja mausteita ja maustekasveja sekä - yrttejä pilaantumisen tai patogeenien kasvun estämiseksi. Säteilytystä valvotaan tarkasti ja säteilyttä- minen on ilmoitettava pakkausselosteessa tai pakkaamattomissa tuotteissa elintarvikkeen läheisyy- dessä esimerkiksi myyntiastiassa (Kauppa- ja teollisuusministeriön asetus 852/2000).

Sininen valo on mahdollinen keino parantaa elintarvikkeiden säilyvyyttä ruoan aistinvaraisia ominaisuuksia vahingoittamatta (Luksiene ja Paskeviciute 2011, Srimagal ym. 2016, dos Anjos ym. 2020). Ku- luttajat arvostavat minimaalisesti prosessoitua ja puhdasta ruokaa ilman elintarvikelisäaineita (Gouma ym. 2016, Arenas-Jal ym. 2020). Lisäksi ruokatrendeinä on ollut jo muutaman vuoden ajan kiireisen elämäntyylin myötä ulkona syöminen ja ruokaa laitetaan vähemmän kotona (Lolar 2016). Kuluttajien

(10)

toivomus helposti ja nopeasti valmistettavista raaka-aineista, kuten esimerkiksi valmiiksi pakatuista ja pilkotuista vihanneksista, lisäävät mikrobiologisen kontaminaation riskiä (De Corato 2020). Lisäksi ruoan säilyvyydessä on omat haasteensa, sillä globalisaation myötä ruoan kuljetusmatkat ovat pitkiä, mutta samaan aikaan ruoan pitää olla laadukasta ja tuoretta (Lolar 2016). Kuluttajien muuttuvien miel- tymysten takia elintarvikkeiden uusille säilyvyysmenetelmille, kuten elintarvikkeiden valottamiselle tai korkeapainekäsittelylle, on tilaa (Gouma ym. 2016).

Tutkimuksissa on havaittu, että sinisen valon vaikutukset voivat vaihdella riippuen mikrobilajista, valon säteilyannoksesta ja lämpötilasta (Kumar ym. 2015, Kim ym. 2017). Alla on esitelty aiheesta tehtyjä tutkimuksia elintarvikkeissa sekä mikrobisuspensioissa (kts. Taulukko 2). Myös sinisen valon vaikutuksia mikrobien rakenteeseen (Zhang ym. 2016) ja niiden lepo- ja germinaatiovaiheessa oleviin itiöihin on tutkittu (Schmidt-Heydt ym. 2011, Murdoch ym. 2013). Sininen valokäsittely vaikuttaa myös sienten ja hiivojen mykotoksiinien tuottoon (Schmidt-Heydt ym. 2011). Lisäksi eräässä eläinkokeessa saatiin tuloksia hiivatulehduksien hoidossa hiirien haavoissa (Zhang ym. 2016). Sinisestä valosta on myös saatu osaltaan positiivisia tuloksia antimikrobisena menetelmänä infektioiden hoidossa ja menetelmästä pu- hutaan kliinisellä puolella fotodynaamisena terapiana (photodynamic therapy) (Wang ym. 2018).

2.1 Fotodynaaminen inaktivaatio

Sinisen valon antimikrobinen vaikutus perustuu reaktiivisten happiradikaalien syntyyn ja ilmiötä kutsutaan fotodynaamiseksi inaktivaatioksi (Luksiene ja Brovko 2013, Kim ym. 2015). Fotodynaaminen inaktivaatio vaatii valoaltistuksen lisäksi happea sekä fotoherkistäjän (photosensitizer). Fotoherkistäjiä (FH) ovat esimerkiksi porfyriinit ja flaviinit (Plavskii ym. 2018). Fotodynaaminen inaktivaatio on esitetty kuvassa 1. Fotoherkistäjät absorboivat sinistä valoa johtaen fotoherkistäjän virittyneeseen tilaan ¹FH (singlet excited state). Virittyneen tilan energia voi vapautua fluoresenssina, jolloin fotoherkistäjä palaa perustilaan (FH⁰). Vaihtoehtoisesti fotoherkistäjä voi siirtyä ³FH-tilaan (excited triplet state). ³FH-tilasta fotoherkistäjä voi palata perustilaan vapauttaen energian fosforenssina, joka sisältää enemmän ener- giaa kuin fluoresenssi (Luksiene ja Brovko 2013). Vaihtoehtoisesti orgaanisten molekyylien kohdalla energia vapautuu erilaisiin molekyyleihin ja virittymisen takia soluihin syntyy reaktiivisia yhdisteitä.

Tyypin I mekanismille on ominaista hydroksyyliradikaalien (OH) syntyminen, kun taas tyypin II meka- nismissa syntyy yksittäisiä happimolekyylejä (O2). Kaksi mekanismia voi tapahtua myös yhtäaikaisesti.

Lisäksi on huomattu, että tyypin I tai tyypin II mekanismien esiintyvyyteen vaikuttavat esimerkiksi foto- herkistäjän rakenne sekä ympäristö (DeRosa ja Crutchley 2002, Huang ym. 2012). Solukuolema johtuu

(11)

siitä, että reaktiiviset happiradikaalit voivat reagoida solun sisäisten organellien, kuten DNA:n, proteii- nien tai lipidien kanssa (Kim ym. 2015). Lyhytaaltoisen näkyvän valon säteilyn sisältämät suurienergiset fotonit voivat olla haitallisia myös ihmissilmän verkkokalvolle sekä silmän aistiville tappi- ja sauvaso- luille (Hietanen ym. 2009).

Kuva 1. Yksinkertaistettu kuva fotodynaamisesta inaktivaatiosta (Luksiene ja Brovko 2013). FH = foto- herkistäjä, FH⁰ = perustila, ¹FH = yksittäisvirittynyt tila (singlet excited state), ³FH = kolmoisvirittynyt tila (triplet excited state).

2.2 Fotoherkistäjät

Fotoherkistäjät ovat orgaanisia valoa absorboivia yhdisteitä, joiden rakenteen hajotessa syntyy kuvassa 1 esitetty fotodynaaminen inaktivaatio (Luksiene ja Brovko 2013). Fotoherkistäjät voidaan jakaa solun- sisäisiin eli luonnostaan esimerkiksi mikrobeissa esiintyviin sekä solunulkoisiin fotoherkistäjiin. Foto- herkistäjiä on tunnistettu useita, joista osa on luonnollisia yhdisteitä sekä elintarvikekäyttöön Euroo- passa hyväksyttyjä ovat esimerkiksi porfyriiniset yhdisteet, flaviinit ja elintarvikevärinä käytetty kurkumiini (Luksiene ja Brovko 2013, Penha ym. 2017). Porfyriinisille yhdisteille on ominaista, että ne sisältä- vät hemi-rakenteen. Alla kuvassa 2 on esitetty yhden fotoherkistäjän, klorofylliini-natrium suolan, rakenne.

(12)

Kuva 2. Klorofylliini-natrium suola (mukailtu lähteestä Luksiene ja Brovko 2013).

2.2.1 Solunisäiset fotoherkistäjät

Solunsisäisistä fotoherkistäjistä on porfyriinit ja flaviinit näyttävät edistävän sinisen valon aiheuttamaa inaktivaatiota bakteereissa ja hiivoissa (Kumar ym. 2015, Zhang ym. 2016). Kumar ym. (2015) tutkimuksessa oletettiin aiemman kirjallisuustaustan perusteella, että koproporfyriinin määrä ja tuhoutuneiden mikrobien määrä saattavat korreloida suhteessa toisiinsa. Tässä tutkimuksessa kuitenkin saatiin päin- vastainen tulos. Esimerkiksi Staphylococcus aureus, joka oli herkempi siniselle valolle lämpötilassa 25

°C kuin Bacillus cereus, sisälsi vähemmän porfyriiniä kuin B. cereus. Koproporfyriinin määrä oli tilastollisesti merkitsevästi erilainen eri bakteereilla (p<0,05) ja grampositiiviset bakteerit sisälsivät koproporfy- riiniä eniten. Inaktivaation ja koproporfyriinin välillä ei ollut merkitsevää eroa (p<0,05) (Kumar ym.

2015).

(13)

Fotoherkistäjät on mahdollista tunnistaa C. albicans -hiivasolu-uutteesta fluoresenssimittauksella, jossa porfyriinit havaitaan aallonpituudella 405 nm ja flaviinit aallonpituudella 470 nm (Zhang ym.

2016). Myös toisessa tutkimuksessa (Murdoch ym. 2013) aallonpituudella 405 nm osoitettiin solujen sisältävän porfyriiniä. Aspergillus niger -itiöiden kohdalla ei saatu tuloksia, mutta sienirihmaston kohdalla porfyriinit olivat havaittavissa. Myös C. albicans ja Saccharomyces cerevisiae -hiivojen kohdalla saatiin tulos, jonka perusteella voidaan olettaa solujen sisältävän porfyriinisiä yhdisteitä (Murdoch ym.

2013). Porfyriini- ja flaviinipitoisuudet vaihtelevat eri mikrobien väillä (Plavskii ym. 2018). Sininen valo aktivoi porfyriinit aallonpituuden ollessa 405 nm ja flaviinit, kun aallonpituus oli 445 nm. Tutkittujen mikrobien välillä eniten fotoherkistäjiä tunnistettiin C. albicans -hiivan kohdalla, kun taas S. aureus - bakteerin kohdalla tuskin havaittiin porfyriinejä. Lisäksi porfyriineistä oli tunnistettavissa lähinnä vain koproporfyriiniä ja uroporfyriiniä (Plavskii ym. 2018).

Eräässä tutkimuksessa saatiin tulokseksi, että sinisen valokäsittelyn yhteydessä syntyneet flaviinimo- nonukleotidit saattavat vaikuttaa E. coli -bakteerin inaktivaatioon (Liang ym. 2015). Näyte altistettiin siniselle (462 nm) valolle 60 tai 120 minuutin ajan. Huomioitavaa on, että tässä tutkimuksessa ympäris- tön lämpötila nousi altistuksen yhteydessä jopa 50 °C, kun valon intensiteetti oli 2,0 mW/cm². Sinisen valoaltistuksen jälkeen E. coli -bakteerin määrä väheni ja väheneminen oli sitä suurempaa, mitä pi- dempi altistusaika oli. Lisäksi flaviinimononukleotidien suurempi konsentraatio vaikutti osaltaan inaktivaatioon. Tutkimuksessa selvitettiin lisäksi sinisen, vihreän ja punaisen valon vaikutusta flaviinimononukleotidien hajoamiseen, mikä määriteltiin käyttäen aallonpituuksia 200–600 nm. Tuloksien perusteella sininen valo näyttää vaikuttavan voimakkaammin flaviinimononukleotidien hajoamiseen, verrattuna punaisen (590–650 nm) ja vihreän (480–590 nm) valon aallonpituuteen tai pimeäkontrolliin. Tut- kimuksessa selvitettiin myös mahdollisesti flaviinimononukleotidien ja riboflaviinin hajotessa syntyviä superoksidianioneita. Sinisen valoaltistuksen jälkeen syntyneiden superoksidianionien määrä oli suurin (Liang ym. 2015).

2.2.2 Solunulkoiset fotoherkistäjät

Luksiene ja Paskeviciute (2011) selvittivät Listeria monocytogenes -bakteerin käyttäytymistä mansikoissa siniselle valolle altistettaessa. Mansikoiden pinnalle lisättiin bakteeria ja näytteet kastettiin natrium-klorofyllipohjaiseen (Na-Chl) elintarvikelisäaineeseen (1 mmol/l), joka on solunulkoinen fotoher- kistäjä. Kontrollinäytteitä oli kaksi, joista toinen käsiteltiin Na-Chl-elintarvikelisäaineella, muttei

(14)

altistettu siniselle valolle. Toinen kontrollinäyte altistettiin siniselle valolle, mutta jätettiin käsittele- mättä ulkoisella fotoherkistäjällä. Tutkimuksessa tutkittiin myös sinisen valon vaikutusta luonnollisesti esiintyvien hiivojen ja homeiden sekä mesofiilisten bakteerien kasvuun mansikoissa. Tuloksena saatiin, että yhdessä ulkoisen fotoherkistäjän kanssa L. monocytogenes -bakteerin määrä laski 1,8 log pmy/g valokäsitellyissä mansikoissa verrattuna kontrollinäytteisiin. Lisäksi mesofiilisten bakteereiden määrä laski 1,7 log pmy/g sekä homeiden ja hiivojen 0,9 log pmy/g käsitellyissä mansikoissa. Käsitellyissä mansikoissa oli myös havaittavissa vähemmän kasvustoa seuraavan kahdeksan päivän aikana. Käsittely joko vain ulkoisella fotoherkistäjällä tai sinisellä valolla ei vaikuttanut mikrobien tuhoutumiseen.

Hasenleitner ja Plaetzer (2019) tutkivat sinisen ja punaisen valon vaikutusta C. albicans -hiivaan. Käyte- tyt fotoherkistäjät olivat metyleenisininen ja natrium-magnesium-klorofylliini (E140). Tuloksena saatiin, että C. albicans -hiivan määrä väheni sinisen valon alla klorofylliinipohjaisen fotoherkistäjän läsnä ollessa. Klorofylliinipohjaisen fotoherkistäjän pitoisuuden ollessa 10 µM hiivan määrä väheni. Fotoherkis- täjän pitoisuuden ollessa 50 µM hiiva tuhoutui kokonaan. Punaisen valon alla C. albicans -hiivasuspensiota altistettiin metyleenisinisen (50 µM) kanssa ja hiivan määrä väheni. Tulokset ilmoitettiin suhteellisena inaktivaationa, jossa mikrobien määrän vähenemisen rajana pidettiin lukumäärää 3 log pmy/g ja mikrobeja ei ollut enää havaittavissa, kun inaktivaatio ylitti määrällisesti yli 6 log pmy/g (Hasenleitner ja Plaetzer 2019). Monet kemialliset yhdisteet ovat potentiaalisia fotoherkistäjiä ja metyleenisinisen li- säksi esimerkiksi Rose Bengal -väriaineen ja Photogem -tuotteen tehoa fotodynaamisessa inaktivaati- ossa on tutkittu (Costa ym. 2012, Luksiene ja Brovko 2013, Insińska-Rak ja Sikorski 2014, Tomb ym.

2018).

Osa yllä mainituista fotoherkistäjistä on myös käytössä elintarvikelisäaineina (Ruokavirasto 2020a).

Taulukkoon 1 on koottu elintarvikekäytössä olevia fotoherkistäjiä. Esimerkiksi riboflaviini eli B2-vita- miini tunnetaan E-koodilla E101. Riboflaviini on elintarvikeväreihin luokiteltava yhdiste, joka valmiste- taan luonnollisesta esiintymisestä huolimatta sekä kemiallisesti että mikrobiologisesti. Klorofyllit ja klorofylliinit (E140) sekä klorofylli- ja klorofylliinikuparikompleksit (E141) ovat myös elintarvikeväreihin luokiteltuja yhdisteitä. Värit saadaan esimerkiksi uuttamalla vihreitä lehtiä ja saatua väriä voidaan käyt- tää värjäämään muun muassa jälkiruokia ja hilloja. E141-koodilla varustelluille yhdisteille hyväksyttävä päivittäinen enimmäissaanti (acceptable daily intake) on 15 mg/kg/vrk. E101- ja E140-yhdisteiden kohdalla ei ole enimmäismäärärajoituksia (Ruokavirasto 2020a).

(15)

Erytrosiini (E127) on käytössä elintarvikeväriaineena (Ruokavirasto 2020a). Keinotekoisesti valmistettua erytrosiinia voidaan käyttää vain kirsikkasäilykkeissä tai sokeroiduissa kirsikoissa. Tutkimuksessa De Lucca ym. 2012 erytrosiinin tehoa testattiin Penicillium digitatum ja Fusarium graminearum -sienila- jeilla (De Lucca ym. 2012). Tuloksena saatiin, että sininen valo (460 nm) oli tehokas estämään tilastollisesti merkitsevästi P. digitatum -lajin kasvua vain yhdessä erytrosiinin kanssa, kun taas F. graminearum -laji oli herkkä sekä siniselle valolle yksinään että fotoherkistäjän kanssa, jolloin se inaktivoitui kokonaan (De Lucca ym. 2012).

Elintarvikevärinä tunnettu kurkumiini on myös tunnettu fotoherkistäjänä (Penha ym. 2017, Ruokavi- rasto 2020a). Kurkumiini on peräisin Curcuma longa -kasvista ja kurkumiinia voidaan käyttää esimerkiksi juomiin ja jälkiruokiin. Kurkumiinin ADI-arvo on 3 mg/kg/vrk (Ruokavirasto 2020a). Hyperisiini on myös aromaattinen, kasvipohjainen pigmentti ja fotoherkistäjä, jota tavataan mäkikuismassa (Hiperi- cum perforatum) (Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1334/2008). Hyperisiiniä ei saa lisätä elintarvikkeisiin sellaisenaan Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1334/2008 liitteen III kohdan A mukaan. Liitteen IV kohdan A mukaan mäkikuismasta valmistettujen aromaattisia ominaisuuksia sisältävien aromien ja elintarvikeainesosien käyttö on sallittua vain alkoholivirvokkeiden valmistuksessa. Hyperisiinillä ei ole todettu olevan haitallisia vaikutuksia eikä sille ole asetettu enim- mäissaantirajoituksia (Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1334/2008).

Taulukko 1. Esimerkkejä tutkimuksissa käytetyistä solunulkoisista fotoherkistäjistä. Elintarvikekäytössä sallitut fotoherkistäjät on esitetty taulukossa tummennettuna niille laadittujen E-koodien sekä mahdol- listen ADI-arvojen kanssa.

Solunulkoiset fotoherkistäjät E-koodi ADI-arvo (mg/kg/vrk)

Kurkumiini 100 3

Riboflaviini 101 qs

Erytrosiini 127 0,1

Klorofyllit ja klorofylliinit 140 qs

Klorofylli- ja

klorofylliinikuparikompleksit

141 15

Hyperisiini¹ - -

Metyleenisininen - -

Rose Bengal- väriaine² - -

Photogem - -

qs = quantum satis, voidaan käyttää hyvän valmistustavan mukaisesti

1 Käyttö sallittu vain alkoholivirvokkeiden valmistuksessa

(16)

3 HIIVAT JA HOMEET ELINTARVIKKEIDEN PILAAJAMIKROBEINA

C. albicans -hiiva valittiin tutkittavaksi mikrobiksi, sillä erilaiset sienet ovat yleisiä pilaajia leipomotuot- teissa (Bernardi ym. 2019) ja vihanneksia sisältävissä elintarvikkeissa (Tournas 2005). C. albicans -hiiva kuuluu sieniin, jotka luokitellaan eukaryootteihin (Saroj ja Dipti 2012). Eukaryooteille eli aitotumallisille on tyypillistä, että niiden tumaa ympäröi tumakalvo sekä soluelimet ovat myös kalvon ympäröimiä.

Useimmilla sienillä on myös soluseinä, joka on kitiiniä (Saroj ja Dipti 2012). Hiivoille otollisia kasvualus- toja ovat heksoosisokereita, vitamiineja ja kivennäisaineita sisältävät elintarvikkeet. Täten erilaiset he- delmät ja kasvikset luovat hiivoille ihanteellisen kasvumatriisin. Lisäksi hiivat viihtyvät myös happa- missa ja nestemäisissä olosuhteissa (Pitt ja Hocking 2009).

Katsausartikkelin Dadar ym. (2018) mukaan C. albicans -hiiva on merkittävä patogeeni maailmanlaajui- sesti. C. albicans -hiiva elää normaalisti ihmisen iholla ja limakalvoilla ja on siten opportunistinen patogeeni. C. albicans -hiiva saattaa aiheuttaa esimerkiksi hiivatulehduksen suun limakalvoille tai naisten sukuelimiin, jos ihmisen vastustuskyky alenee (Dadar ym. 2018). Hiivoista tunnetaan noin kymmenen sukua, jotka aiheuttavat prosessoitujen elintarvikkeiden runsasta pilaantumista vuosittain (Pitt ja Hocking 2009). Elintarvikkeissa on tavattu Candida-suvun hiivoista etenkin C. parapsilosis ja C. krusei - hiivoja (Pitt ja Hocking 2009), jotka voivat olla mahdollisesti myös patogeenisia ihmisille (Rajkowska ja Kunicka-Styczyńska 2018). Yleensä hiiva on peräisin luonnollisista lähteistä, jolloin prosessoitu elintar- vike on päässyt kontaminoitumaan hiivan kanssa. Hiivalla pilaantuneen elintarvikkeen voi havaita aistinvaraisesti, sillä usein tuote on pahanmakuinen ja erikoisen värinen, tuote voi samentua tai muuttua limaiseksi sekä turvota (Hernández ym. 2018). Kaikissa elintarvikkeissa tavataan luonnostaan mikrobeja, ja osa niistä ei ole haitallisia ihmisille (Ruokavirasto 2020c). Osa ei-patogeenisista hiivoista on myös elintarvikekäytössä, kuten esimerkiksi leivän valmistuksessa käytetty S. cerevisae -hiiva (Pitt ja Hocking 2009).

Taulukossa 2 on esitetty vertailu eri sinisen valon altistustutkimuksissa käytetyistä parametreista ja tuloksista inaktivaatiotehokkuutena. Taulukkoon on otettu mukaan viimeisten kymmenen vuoden ajalta vain tutkimukset, jotka ovat ilmoittaneet parametrit ja tulokset yksityiskohtaisesti, jotta vertailu on mahdollista.

(17)

Taulukko 2. Vertailutaulukko sinisen valon altistustutkimuksissa käytetyistä parametreistä sekä saaduista tuloksista inaktivaatiotehokkuutena ilmoitet- tuna. Taulukossa on esitetty vain vertailukelpoiset ja yksityiskohtaisesti (log pmy/ml) tuloksensa ilmoittaneet tutkimukset.

Mikrobi Matriisi Solunulkoinen

fotoherkistäjä

Valon aallonpituus (nm)

Intensiteetti (mW/cm²)

Säteilyannos (J/cm²)

Inaktivaatio- tehokkuus (log pmy/ml)

Altistus- aika (h)

Lähde

Bacillus cereus

Listeria monocytogenes Salmonella typhimurium Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

Mikrobi- suspensio

- 405 21 306 2,3 (25, 10 ja 4 °C)

1,9 (25, 10 ja 4 °C) 0,6 (25 °C)

0,5 (25 °C); 1,3 (10

°C); 1,2 (4 °C) ei inaktivaatiota 4,0 (25 °C); 2,1(10

°C);1,9 (4 °C)

9 Kumar ym.

2015

Listeria monocytogenes Hiivat ja sienet

Mesofiiliset bakteerit

Mansikka Natrium-klo-

rofylliini

400 12 14,4 1,8

0,86 1,7

20 min Luksiene ja Paskeviciute 2011 Saccharomyces cerevisiae

Candida albicans, Aspergillus niger (lepoku- roumaitiöt)

Mikrobi- suspensio

- 405 40

63

288 576 2,3 kJ

5,0 5,0 5,0

-

Murdoch ym.

2013

Staphylococcus aureus Escherichia coli

Candida albicans

Mikrobi- suspensio

- 405/445 50 366/606

99/609 99/366

90 % määrän lasku 0–3 Plavskii ym.

2018

(18)

Mikrobi Matriisi Solunulkoinen fotoherkistäjä

Altistus- aika (h)

Lähde

Staphylococcus aureus, Escherichia coli

Candida albicans

Mikrobi- suspensio

Klorofylliini:

1 µM 5 µM 10 µM 50 µM

433 9 6,6 7,0

4,0

ei vaikutusta 3,0

>6,0

15 min

Hasenleitner ja Plaetzer 2019¹

Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Typhimurium, Mycobacterium fortuitum

Maito - 413 100 600 >5,0 <100

min

dos Anjos ym. 2020²

Escherichia coli Maito - 405

460 460 405 433 460 405 433 460

10 W ja 50 mA

- 4,69 (5°C)

4,11 (5°C) 3,41 (5°C) 4,82 (10 °C) 4,24 (10 °C) 3.64 (10 °C) 5,27 (15 °C) 5,04 (15 °C) 4,64 (15 °C)

60 min 75 min 90 min 75 min 75 min 90 min 60 min 75 min 90 min

Srimagal ym.

2016³

(19)

Altistus- aika (h)

Lähde

Staphylococcus aureus Aeromonas hydrophila, Salmonella Typhimurium Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Vero-solut Kurkumiini 470 1,2 W 139

278 417 139 278 417 139 278 417 139 278 417 139 278 417

3,27 3,57

inaktivoitunut 3,33

inaktivoitunut inaktivoitunut 1,26

1,81 2,82 1,29 2,65

inaktivoitunut 0,24

0,3 0,33

10 min 20 min 30 min 10 min 20 min 30 min 10 min 20 min 30 min 10 min 20 min 30 min 10 min 20 min 30 min

Penha ym.

2017

Listeria monocytogenes Savustettu lohi Riboflaviini:

25 µM

100 µM

460 15

31

58

15

2400 0,8(4 °C) 0,48 (12 °C) 0,6 (4 °C) 0,78 (12 °C) 0,77 (4 °C) 0,45 (12 °C) 1,1 (4 °C) 1,2 (12 °C)

Kontrolloitu vastaamaan tavoiteltua säteilyan- nosta

Josewin ym.

2018a⁴

(20)

Altistus- aika (h)

Lähde

Tulane virus Mustikka Riboflaviini

Rose Bengal- väriaine

405 4,2 - 0,51 (plakin määrä)

1,01 (plakin määrä)

30 min Kingsley ym.

2017⁵

Listeria monocytogenes

Salmonella

Cantaloupe- meloni

Natrium- kupari- klorofylliini seos 100 µM

405

460

405

460

2,0

3,0

2,0

3,0

1210

5356

1210

5356

2,4 (4 °C) ilman fo- toherkistäjää 2,9 (20 °C) ilman fo- toherkistäjää 3,0 (20 °C)

2,7 (4 °C) ilman fo- toherkistäjää 2,3 (4 °C) 2,2 (20 °C) 2,3 (4 °C)

ilman fotoherkistä- jää

2,9 (4 °C) 1,1 (4 °C)

ei vaikutusta (20 °C)

- Josewin ym.

2018b⁶

Bacillus cereus

Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus

Mikrobi-

suspensio - 405 18 486 1,9

2,1 0,9

7,5 Kim ym.

2015

Listeria monocytogenes Salmonella

Escherichia coli Escherichia coli

Mango

405 405

20 20

2,6–3,5 kJ 1,7 kJ

1,0–1,6 (4, 10°C) inaktivoitunut (20°C)

36–48 24

Kim ym.

2017⁷

1 Tulokset ilmoitettu suhteellisena inaktivaationa(pmyco-/-/pmynäyte)

2 Tulokset ilmoitettueloonjäämisosuutena log (N0/N)

(21)

3 Tulokset ilmoitettueloonjäämisosuutena log (N/N0)

4 Taulukossa ilmoitettu vain tarkat numeraaliset tutkimustulokset

5 Virusten määrä arvioitiin muodostuneen plakin perusteella

6 Fotoherkistäjä vähensi Salmonella-bakteerin määrää kahdeksan tunnin ajan (405 nm, 20 °C), jonka jälkeen bakteerin määrä lähti maltilliseen nousuun

7 L. monocytogenes -bakteerin määrä laski huoneenlämmössä 12 tunnin ajan (405 nm, 20 °C), jonka jälkeen bakteerin määrä lähti maltilliseen nousuun

(22)

3.1 Sinisen valon vaikutus hiivoihin ja homeisiin

Aiempien tutkimustulosten perusteella sininen valo näyttää vähentävän hiivojen ja homeiden kasvua suspensioissa (Schmidt-Heydt ym. 2011, Murdoch ym. 2013, Zhang ym. 2016). Eräässä tutkimuksessa (Murdoch ym. 2013) tutkittavina kantoina olivat S. cerevisiae ja C. albicans -hiivat sekä A. niger -lepo- kuroumaitiöt. Tutkimuksessa selvitettiin 405 nm aallonpituuden vaikutusta sienten ja hiivojen kasvuun hapellisissa ja hapettomissa olosuhteissa sekä askorbiinihapon läsnä ollessa että ilman. Askorbiinihap- poa käytettiin tutkimuksessa antioksidanttina inhiboimaan reaktiivisten happiradikaalien syntyä. Läm- pötila oli kontrolloitu. Hapettomissa olosuhteissa käytettiin valoannosta, jolla aiemmissa tutkimuksissa oli saatu 5 log pmy/ml lasku hapellisissa olosuhteissa. S. cerevisiae -hiivan kohdalla 5 log pmy/ml mää- rän lasku saatiin säteilyannoksella 288 J/cm² hapellisissa olosuhteissa. Hapeton tila ei vaikuttanut tu- lokseen ja laskua oli edelleen havaittavissa. Myös askorbiinihapon läsnä ollessa hapettomissa olosuhteissa määrä laski 2,0 log pmy/ml ja hapellisissa olosuhteissa 2,7 log pmy/ml. Hapellisissa olosuhteissa 5 log pmy/ml inaktivaatioon tarvittava säteilyannos oli C. albicans -hiivalle 576 J/cm² ja A. niger -itiöi- den kohdalla 2 kJ/cm². Hapettomissa olosuhteissa sinisellä valolla ei ollut yhtä tehokasta vaikutusta C.

albicans ja A. niger -mikrobien kohdalla verrattuna hapellisiin olosuhteisiin. Inaktivaatio oli happea vaativaa, vaikka S. cerevisiae -hiivan kohdalla tulokset eivät olleet yhteneväisiä muiden kantojen kanssa. Lisäksi S. cerevisiae -hiiva oli herkin valokäsittelylle (Murdoch ym. 2013). Tutkimuksessa (Luk- siene ja Paskeviciute 2011) tutkittiin hiivojen ja homeiden inaktivaatiota mansikoiden pinnalla natrium- klorofylliinin kanssa. Hiivojen määrä laski sinisen valon altistuksen jälkeen, mutta määrän lasku oli mal- tillisempaa verrattuna bakteereihin.

Schmidt-Heydt ym. (2011) tutkivat homesienikantojen käyttäytymistä niiden altistuessa eri valon aal- lonpituuksille (syvänsininen 455 nm, sininen 470 nm, vihreä 530 nm, keltainen 590 nm, punainen 627 nm), joista sinistä valoa tutkittiin vielä erikseen alhaisella ja korkealla voimakkuudella. Tutkittavat kan- nat olivat Aspergillus carbonarius, A. steynii, A. paraciticus, Penicillium nordicum, P. verrucosum, P.

expansum, Fusarium graminearum ja Alternaria alternata. Käytetty valon intensiteetti oli 3,8 mW/cm². Tuloksena saatiin yleiskäsitys eri sienten ja hiivojen kasvuun erilaisten aallonpituuksien alla. Lisäksi sininen valo näytti estävän eri lajien kasvua, mutta valoaltistuksen loputtua kasvu jatkui. Sininen valo vaikutti heikosti Aspergillus-, Fusarium- ja Alternaria-sukuihin. Penicillium-suvun kohdalla kasvua näytti estävän sininen sekä punainen valo eikä P. verrucosum -home kasvanut syvänsinisen (455 nm) aallonpituuden alla (Schmidt-Heydt ym. 2011).

(23)

Zhang ym. 2016 tutkivat C. albicans -hiivan herkkyyttä siniselle valolle verrattuna ihmisen ihosoluihin, keratinosyytteihin, sekä mahdollista resistenttiyttä siniselle valolle in vitro -olosuhteissa. Ihmisten kera- tinosyytteja tutkittiin, jotta voitiin poissulkea sinisen valon mahdolliset haitalliset vaikutukset ihosoluihin. Ihmisten keratinosyytit olivat 42 kertaa resistentimpiä siniselle valolle kuin C. albicans -hiiva. Kera- tinosyyttien tulokset oli saatu tutkijoiden aiemmasta tutkimuksesta samoissa olosuhteissa. Mahdollista valoresistenttiyttä tutkittiin siten, että samaa näytettä kolmesta eri kannasta altistettiin yhteensä 10 kertaa valolle. Säteilyannos oli määritetty siten, että ensimmäisellä kerralla hiivasoluja jäi eloon noin 0,0004%. Selviytyneet hiivasolut viljeltiin uudestaan, jonka jälkeen ne altistettiin edelleen siniselle valolle käyttäen samaa säteilyannosta. Jokaisessa sarjan vaiheessa tehtiin sarjalaimennos ja maljaus, josta tulokset olivat laskettavissa. Tuloksissa saattoi olla huomattavissa pientä laskua herkkyydessä mutta tulos ei ollut tilastollisesti merkitsevä (Zhang ym. 2016). Sinisen (420 nm) ja punaisen (635 nm) valon on huomattu vähentävän tilastollisesti merkitsevästi myös C. albicans -hiivan biofilmin muodostusta polystyreenilevyllä verrattuna negatiivikontrolliin (Da Silveira ym. 2019). Näytteitä altistettiin siniselle ja punaiselle valolle kahdesti päivässä. (Da Silveira ym. 2018).

Eräässä tutkimuksessa (Romano ym. 2017) C. albicans -hiivan fotodynaamista inaktivaatiota tutkittiin mikrobisuspensiossa siten, että fotoherkistäjien pääsyä solujen sisälle tehostettiin aluksi aallonpituudella 420 nm. Tämän jälkeen suspensio altistettiin fotodynaamiselle inaktivaatiolle kolmella eri annok- sella aallonpituuden ollessa 660 nm. C. albicans -hiivan määrä väheni säteilyannosten kasvaessa ja suurin inaktivaatio havaittiin säteilyannosten ollessa 4 J/cm² ja 17 J/ cm² verrattuna pimeäkontrolliin ilman ensimmäistä säteilyannosta. C. albicans -hiivan määrä ei vähentynyt ilman fotoherkistäjää (Ro- mano ym. 2017).

3.2 Sinisen valon vaikutus bakteereihin

Sininen valon vaikutus bakteerien kasvuun riippuu lämpötilasta, käytetystä aallonpituudesta sekä sinisen valon vaikutus bakteerien kasvuun vaihtelee eri bakteerien välillä (Kumar ym. 2015, Plavskii ym.

2018). Kumar ym. 2015 tutkivat sinisen valon vaikutusta erilaisiin bakteerikantoihin: B. cereus, L. mono- cytogenes, St. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Typhimurium ja E. coli. Valon aallonpituu- tena käytettiin 405 nm ja 520 nm. Altistus tehtiin kolmessa eri lämpötilassa: 25, 10 ja 4 ˚C ja kesto oli 9 tuntia. Lämpötilaa kontrolloitiin, jotta näytteet eivät kuumenisi, ja näytteitä kerättiin tunnin välein. Tu- loksena saatiin, että B. cereus ja L. monocytogenes -bakteerit eivät olleet riippuvaisia lämpötilasta ja

(24)

niiden määrä laski joka lämpötilassa aallonpituuden olleessa 405 nm, kun taas St. aureus ja S. Typhi- murium -bakteerien määrä laski eniten lämpötilassa 25 °C aallonpituuden ollessa 405 nm. Kaiken kaikkiaan E. coli ja S. Typhimurium -bakteerien kohdalla inaktivaatio oli keskinkertaista ja P. aeruginosa -bakteerin kohdalla ei saatu merkitsevää vaikutusta tutkimuksessa kummallakaan valoaltistuksella (Ku- mar ym. 2015).

Toisessa tutkimuksessa (Plavskii yms. 2018) selvitettiin erilaisten aallonpituuksien vaikutusta mikro- bisuspensioihin. Tutkittavat mikrobilajeina olivat esimerkiksi St. aureus ja E. coli. Käytetyt aallonpituu- det tutkimuksessa olivat 405 ja 445 nm. Tuloksena saatiin, että 90 % inaktivaation aikaansaamiseksi tarvittava säteilyannos 405 nm aallonpituudella oli E. coli -bakteerin kohdalla 99 J/cm². St. aureus -bakteeri vaati 90 % inaktivaatioon 366 J/cm² säteilyannoksen. Aallonpituus 445 nm ei ollut yhtä tehokas ja vaati suuremman säteilyannoksen inaktivoidakseen 90 % tutkituista mikrobilajeista (St. aureus 606 J/cm² ja E. coli 609 J/cm²) (Plavskii yms. 2018).

Kim ym. 2017 tutkivat sinisen valon vaikutusta mangon pinnalle inokuloitujen bakteerien (E. coli, L.

monocytogenes, Salmonella spp.) kasvuun. Bakteerit altistettiin siniselle valolle (405 nm) kolmessa eri lämpötilassa 4, 10 ja 20 ˚C. Säteilyannos vaihteli 2,6–3,5 kJ/cm² välillä. Jääkaappilämpötilassa (4 ˚C) kaikkien bakteerien määrä väheni (p<0,05), jolloin E. coli ja Salmonella -bakteereita ei ollut lähes havaittavissa verrattuna kontrolliin 36 tunnin säteilytyksen jälkeen. Myös huoneenlämmössä (20 ˚C) kaikkien bakteerien määrä väheni (p<0,05) verrattuna kontrolliin, jolloin esimerkiksi Salmonella-bakteerin määrä mangon pinnalla oli 1,2 log pmy/cm² 24 tunnin säteilytyksen jälkeen ja mangokontrollissa ilman säteilytystä 4,3 log pmy/ cm². Huomattavaa on, että L. monocytogenes -bakteeri alkoi kasvaa uudestaan huoneenlämmössä 12 tunnin säteilytyksen jälkeen.

3.3 Sinisen valon vaikutus elintarvikkeiden aistinvaraiseen ja ravitsemukselliseen laa- tuun

Eräässä tutkimuksessa (Luksiene ja Paskeviciute 2011) selvitettiin mansikoiden hyllyikää ja värin muu- tosta valoaltistuksen jälkeen. Käsitellyt mansikat säilyivät kaksi päivää pidempään verrattuna kontrolleihin aistinvaraisesti arvioituna. Viiden päivän säilytyksen jälkeen kaikki kontrolliryhmän mansikat olivat käyttökelvottomia ja käsitellyistä mansikoista vain osa oli pilaantuneita. Mansikan väri ei

(25)

muuttunut valokäsittelyn jälkeen spektrofotometrillä tutkittuna. Lisäksi tutkimuksessa selvitettiin antioksidanttien, fenolien ja antosyaniinien määrää valolla käsitellyissä mansikoissa sekä kontrolliryh- mässä. Antioksidanttien määrä kasvoi 19 % aallonpituudelle 400 nm altistetuissa mansikoissa.

Fenoleista ja antosyaniineistä ei saatu merkitseviä tuloksia (Luksiene ja Paskeviciute 2011). Tulokset ovat yhteneviä tutkimuksen Kim ym. 2017 kanssa, jossa sinisen valon ei havaittu vaikuttavan haitallisesti mangon väriin tai ravitsemukselliseen laatuun, kuten esimerkiksi askorbiinihappo- tai flavonoidi- pitoisuuksiin verrattuna käsittelemättömiin mangoihin.

Lisäksi muiden yhdisteiden pitoisuuksien vaihtelua on tutkittu punaisen (627 nm) ja sinisen (470 nm) valoaltistuksen yhteydessä. Tutkimuksessa (Kopsell ja Sams 2013) tutkittiin sinisen valon vaikutuksia ravitsemuksen kannalta merkityksellisten yhdisteiden pitoisuuksiin tuoreessa parsakaalissa. Säteilyan- nos oli punaisella ja sinisellä aallonpituudella 350 µmol ml^-2 s^-1 tai vain sinisen valon altistuksella 41 µmol^-2 s^-1. Tuloksena saatiin, että klorofylli b:n määrä laski merkitsevästi sinisen valon altistuksen jäl- keen. Lisäksi siniselle valolle altistuminen nosti β-karotenoidien ja ksantofyllien määrää parsakaalissa verrattuna punaiselle valolle altistukseen (p<0,05). Glukosinolaattien (p<0,05) sekä joidenkin kiven- näisaineiden pitoisuudet nousivat myös, kuten esimerkiksi fosfaatin ja kaliumin siniselle valolle altistu- misen jälkeen (p<0,001). Painossa ei ollut kuitenkaan havaittavissa merkitsevää eroa. Parsakaalin ra- kenteessa oli huomattavissa eroa riippuen siitä, oliko ne kasvatettu sinisen ja punaisen valon alla vai vain sinisen valon alla ennen sadonkorjuuta. Sinisen valon alla kasvatettujen parsakaalien väri oli vaa- leampi ja ne saattoivat kasvaa pidemmiksi (Kopsell ja Sams 2013). Lisäksi tutkimuksessa Ballester ja Laufente 2017 appelsiineja käsiteltiin sinisellä valolla. Tuloksena saatiin, että sininen valo saattaa lisätä appelsiinin kuorikerroksessa fenyylipropanoidin (scoparone) pitoisuutta ja etyleenin tuotantoa.

Taulukossa 3. on koottu tuloksia sinisen valon vaikutuksista mikrobien kasvunestoon sekä elintarvikkeiden aistinvaraisiin ominaisuuksiin ja ravitsemukselliseen laatuun. Taulukossa on esitetty tutkittu mikrobi, matriisi sekä avattu tutkimusten tärkeimmät tulokset.

(26)

Taulukko 3. Vertailutaulukko sinisen valon vaikutuksista mikrobien kasvunestoon sekä elintarvikkeiden aistinvaraisiin ominaisuuksiin ja ravitsemukselliseen laatuun.

Lähde Tutkittava mikrobi Tutkittava matriisi Tulokset

Kopsell ja Sams 2013 - Parsakaali Sininen valo nosti merkitsevästi eri ravintoaineiden pitoisuuksia parsakaalissa verrattuna punaiseen valoon. Ravintoaineita olivat esimerkiksi β-karoteeni, glu- kosinolaatit ja monet kivennäisaineet kuten rauta ja sinkki. Parsakaalin painossa ei kuitenkaan ollut eroa eri valoilla kasvatettuna.

Kumar ym. 2015 Bacillus cereus,

Listeria monocytogenes P. aeruginosa

Mikrobisuspensio Valon inaktivaatiovaikutus riippui kannasta, valon intensiteetistä (405 tai 520 nm) sekä annoksesta ja siitä, oliko bakteeri gramnegatiivinen vai grampositiivi- nen. B. cereus ja L. monocytogenes -bakteerit eivät olleet lämpötilariippuvaisia ja niiden määrä laski joka lämpötilassa. Kummallakaan valon aallonpituudella ei ollut merkitsevää vaikutusta P. aeruginosa-bakteeriin. Koproporfyriini määrä oli korkeampi gram-positiivisilla bakteereilla.

Luksiene ja Paskeviciute 2011

Listeria monocytogenes Mansikka Ei merkitseviä tuloksia pelkässä Na-Chl liuoksessa, mutta valoon yhdistettynä L.

monocytogenes -bakteerin määrä laski 98 % ja mesofiiliset bakteerit 97 %. Hii- vat ja sienet vähenivät 0,86 log (86 %) käsitellyissä mansikoissa. Käsitellyt mansikat säilyivät 2 päivää pidempään verrattuna kontrolleihin aistinvaraisesti arvioituna. Heti valoaltistuksen jälkeen havaittiin 19 % kasvu antioksidanttiaktiivi- suudessa käsitellyissä mansikoissa. Käsittelyllä ei ollut vaikutusta mansikan vä- riin.

Murdoch ym. 2013 Saccharomyces cere- visiae,

Candida albicans, Aspergillus niger (lepokuroumaititöt)

Mikrobisuspensio 5 log pmy/ml inaktivaation saavuttamiseksi tarvittava säteilyannos S. cerevisiae -hiivalle oli 288 J/cm², C. albicans -hiivalle 576 J/cm² ja A. niger -itiöille 2 kJ/cm².

Ballester ja Lafuente 2017

Penicillium digitatum Appelsiini Tutkimuksessa appelsiineja käsiteltiin sinisellä valolla ennen homeen inokuloi- mista. Tuloksena saatiin, että sininen valo saattaa lisätä appelsiinin kuorikerroksessa fenyylipropanoidin (scoparone) pitoisuutta ja etyleenin tuotantoa. Yllä mainituilla tekijöillä ei merkitsevää vaikutusta sitrushedelmien resistenttiyteen P. digitatum -hometta vastaan sinisen valon alla.

(27)

Lähde Tutkittava mikrobi Tutkittava matriisi Tulokset Plavskii ym. 2018 Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Candida albicans

Mikrobisuspensio Aallonpituus 405 nm oli tehokkaampi inaktivoimaan mikrobeita kuin 445 nm.

Inaktivaation saavuttamiseksi (90 %) tarvittava säteilyannos 405 nm aallonpituudella oli E. coli -bakteerille, C. albicans -hiivalle 99 J/cm² ja St. aureus -bak- teerille366 J/cm².

Trzaska ym. 2017 Rhizopus microspores Mucor circinelloides, Scedosporium apiosper- mum,

Scedosporium prolificans, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Candida albicans

Mikrobisuspensio Scedosporium -ja Fusarium -luokkaan kuuluvat sienet olivat herkimpiä siniselle valolle, jolloin niiden germinaatio pysähtyi myös. Sininen valo ei vaikuttanut R.

microspores tai M. circinelloides -lajeihin.

Da Silveira ym. 2019 Candida albicans Biofilmi, polystyreenilevy Negatiivikontrolliin verrattuna sinisen (420 nm) sekä punaisen valon aallonpi- tuuksilla (635 nm) pidemmät altistusajat vähensivät merkitsevästi C. albicans- hiivan määrää (pmy/ml) sekä kuivapainoa (mg).

Hasenleitner ja Plaetzer 2019

Staphylococcus aureus, Escherichia coli

Candida albicans

Mikrobisuspensio C. albicans-hiivan sekä S. aureus-bakteerin määrä väheni sekä punaisen, että si- nisen valoaltistuksen jälkeen kahdella eri fotoherkistäjällä. E.coli -bakteerin määrä ei vähentynyt sinisen valon aallonpituudella.

dos Anjos ym. 2020 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeru- ginosa,

Salmonella Typhimurium, Mycobacterium fortuitum

Maito ja

mikrobisuspensio

Bakteerien määrä laski kahdessa tunnissa molemmissa matriiseissa. Maidossa bakteerit olivat herkempiä siniselle valolle kuin suspensioissa. Sininen valo ei vaikuttanut muihin maidon ravintoaineisiin haitallisesti verrattuna kontrolliin, mutta riboflaviinin määrä väheni sinisen valon altistuksen jälkeen maidossa.

Srimagal ym. 2016 Escherichia coli Maito Lyhyempi aallonpituus (405 nm) ja korkeampi lämpötila (15 °C) vähensivät E.

coli -bakteerin määrää maidossa eniten. Sinisellä valolla käsiteltyjen maitonäyt- teiden hyllyikä piteni pastöroituihin kontrollinäytteisiin verrattuna. Sininen valo ei vaikuttanut maidon fysikaaliskemiallisiin ominaisuuksiin verrattuna kontrolliin.

(28)

Lähde Tutkittava mikrobi Tutkittava matriisi Tulokset

Romano ym. 2017 Candida albicans Mikrobisuspensio Fotoherkistäjien pääsyä solujen sisään voidaan tehostaa alussa säteilyannok- sella (420 nm) ennen varsinaista fotodynaamista inaktivaatiota (660 nm). Sätei- lyannos alussa tehosti C. albicans -hiivan inaktivaatiota verrattuna alussa alistu- mattomiin pimeäkontrollinäytteisiin.

Penha ym. 2017 Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa

Vero-solut Sininen valo (470 nm) yhdessä väriaineena ja fotoherkistäjänä tunnetun kurkumiinin kanssa vähensivät bakteerien kasvua suspensioissa. Valon vaikutus riippui bakteerilajista ja valoannoksesta. Pelkkä kurkumiini tai sinisen valon altistus ei vaikuttanut bakteerien määrään.

Josewin ym. 2018a Listeria monocytogenes Savustettu lohi Sininen valo (460 nm) yhdessä riboflaviinin kanssa vähensi L. monocytogenes - bakteerin määrää ja antimikrobinen teho oli parempi riboflaviinin läsnä ollessa.

Sinisen valo ei yksinään muuttanut lohen väriä, mutta riboflaviinin kanssa väri muuttui.

Kingsley ym. 2017 Tulane virus Mustikka Sininen valo (405 nm) yhdessä riboflaviinin ja rose bengal- fotoherkistäjän kanssa vähensi viruksen määrää mustikoissa. Sininen valo yksinään ei ollut anti- mikrobisesti tehokas.

De Lucca ym. 2012 Penicillium digitatum Fusarium graminearum

Suspensio Sininen valo (460 nm) esti tilastollisesti merkitsevästi Penicillium digitatum -homeen kasvua vain yhdessä fotoherkistäjä erytrosiinin kanssa, kun taas Fusarium graminearum -home oli herkkä sekä siniselle valolle yksinään että fotoherkistä- jän kanssa, jolloin se inaktivoitui kokonaan.

Kim ym. 2017 Listeria monocytogenes Salmonella

Escherichia coli

Mango Sininen valo (405 nm) vähensi kaikkien tutkittavien bakteerien määrää jääkaap- pilämpötilassa. Huoneenlämmössä E. coli -bakteeri inaktivoitui, ja Salmonella- bakteerin määrä väheni. L. monocytogenes -bakteerin määrä väheni 12 tunnin ajan, jonka jälkeen sen määrä kasvoi maltillisesti. Sininen valo ei vaikuttanut mangon väriin tai ravitsemukselliseen laatuun haitallisesti.

Josewin ym. 2018b Listeria monocytogenes Salmonella spp.

Cantaloupe-melonin kuori

Sininen valo (405 ja 460 nm) vähensi L. monocytogenes ja Salmonella-bakteereiden kasvua Cantaloupe-melonin pinnalla verrattuna kontrolliin jääkaappi- lämpötilassa. Fotoherkistäjä kupari-klorofylliinin käyttö tehosti bakteerien inaktivaatiota jääkaappilämpötilassa sinisen valon aallonpituudella 405 nm.

(29)

Lähde Tutkittava mikrobi Tutkittava matriisi Tulokset Kim ym. 2015 Bacillus cereus

Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus

Mikrobisuspensio Tutkittavien bakteerien määrä väheni sinisen valon altistuksen jälkeen (405 nm) jääkaappilämpötilassa. L. monocytogenes -bakteeri oli herkin siniselle valolle. Li- säksi viitteitä DNA-vaurioista ei löytynyt vaan sinisen valon uskotaan vaikuttavan soluseinän vaurioitumiseen.

Liang ym. 2015 Escherichia coli Mikrobisuspensio Sinisen valoaltistuksen jälkeen E. coli -bakteerin määrä väheni ja bakteerin määrä väheni enemmän mitä suurempi oli altistusaika valolle ja myös flaviinimononukleotidien suurempi konsentraatio vaikutti osaltaan inaktivaatioon. Si- ninen valo saattaa vaikuttaa voimakkaammin flaviinimononukleotidien hajoamiseen, verrattuna punaisen (590–650 nm) ja vihreän (480–590 nm) valon aallonpituuteen tai pimeäkontrolliin. Sinisen valoaltistuksen jälkeen syntyneiden superoksidianionien määrä oli suurin.

Zhang ym. 2016 Candida albicans Mikrobisuspensio Ihmisten keratinosyytit olivat 42 kertaa resistentimpiä siniselle valolle verrattuna C. albicans -hiivaan. Tuloksissa oli huomattavissa pientä laskua herkkyy- dessä mutta tulos ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Lisäksi sininen valo voi olla mahdollinen hoitomenetelmä hiivatulehduksia vastaan haavojen hoidossa.

(30)

II KOKEELLINEN OSA

4 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

Tutkielman tavoitteena oli selvittää sinisen valon mahdollisuutta antimikrobisena menetelmänä kink- kuvoileipäkakuissa. Lisäksi tavoitteena oli tutkia, vaikuttaako eksogeenisen fotoherkistäjän lisäys kink- kuvoileipäkakuissa luonnostaan esiintyvien tai siihen lisätyn hiivan tuhoutumiseen. Hypoteeseina olivat Katriina Ojalan pro gradu -tutkielman (2019) pohjalta, että sininen valo on tehokas menetelmä estä- mään C. albicans -hiivan kasvua marmeladin pinnalla. Lisäksi kirjallisuuskatsauksen perusteella toinen hypoteesi oli, että eksogeeniset fotoherkistäjät edistävät mikrobien tuhoutumista elintarvikkeissa.

Tavoitteiden pohjalta laadittiin tutkimuskysymykset:

1. Voidaanko sinisen valon avulla vaikuttaa hiivojen kasvuun kinkkuvoileipäkakuissa?

2. Kuinka tehokkaasti sininen valo vaikuttaa hiivojen tuhoutumiseen ulkoisen fotoherkistäjän kanssa?

(31)

5 AINEISTO JA MENETELMÄT

Pro gradu -tutkielmassa aineistona on C. albicans -hiivalla kontaminoidut näytteet F.K. Trube Oy:n kinkkuvoileipäkakuista. Pro gradu -tutkielma tehtiin yhteistyössä ELSAPA-kehityshankkeen kanssa. EL- SAPA on Pohjois-Savon liiton pääosin rahoittama hanke (2019–2021), jonka tavoitteena on yritysyh- teystyössä etsiä uusia keinoja elintarvikkeiden säilyvyyden parantamiseen ja laadun varmistamiseen uusilla tekniikoilla. Hankkeen työpaketti 3:ssa keskitytään erityisesti elintarvikkeiden säilyvyyden parantamiseen UV- ja sinisen valon avulla.

5.1 Mikrobikanta ja kasvatusolosuhteet

Tutkimuksessa käytettävää C. albicans ATCC 90029 -hiivaa kasvatettiin laboratoriossa Sabouraud-mal- joilla (Sabouraud Dextrose Agar, LabM), johon oli lisätty bakteerien kasvua estävää antibioottia, klo- ramfenikolia (X009, LabM). Hiiva siirrostettiin maljalta OGYE-liemeen (Oxytetracycline Glucose Yeast Extract broth) ja inkuboitiin 30 °C 17 tunnin ajan. Tämän jälkeen hiivasuspensio sentrifugoitiin (4000 rpm) 4 °C viiden minuutin ajan. Suspensiosta poistettiin supernatantti ja koeputkeen lisättiin 10 ml NaCl-liuosta (0,9 %). Suspension absorbanssi säädettiin välille 0,1–0,15, joka vastaa noin 10⁴ pmy/ml hiivasoluja. Hiivasuspensiota inokuloitiin pipetillä tipoittain yhteensä 250 µl yhtä kakkunäytettä koh- den (á 25 g).

5.2 Elintarvikenäytteiden valmistus

F.K. Trube Oy kinkkuvoileipäkakut koostuivat kolmesta kerroksesta leipää ja välissä oli kahta erilaista täytettä. Kinkkuvoileipäkakut oli kuorrutettu tuorejuustolla ja juustoraasteella. Lisäksi pinnalla oli koris- teena kinkkusiivuja, kirsikkatomaatteja sekä persiljaa. Kakkujen myyntiaika oli 6+1 eli valmistuspäivästä kuusi päivää eteenpäin. Kakun ainesosaluettelo ja kuva valmiista tuotteesta löytyvät liitteestä 1. Kink- kuvoileipäkakun myyntipaino oli 500 grammaa.

Näytekakut olivat pakastettuja ja kaikki samaa erää. Sulatetut näytekakut kuorrutettiin ja koristeltiin kinkkusiivuilla, kirsikkatomaateilla ja persiljalla sekä pilkottiin mikrobiologista analyysiä edeltävänä päi- vänä. Näytekakkupaloja varten kakun reunoilta poistettiin kuorrute steriilillä veitsellä. Kakusta leikattiin steriilillä veitsellä 25±2,0 g näytepaloja, jotka aseteltiin pieniin steriloituihin 25 millilitran

(32)

dekantterilaseihin. Kakkunäytteistä on esitetty kuva liitteessä 2. Dekantterilasit aseteltiin läpinäkyviin voileipäkakkurasioihin, jotka ovat F.K. Trube Oy:llä vakituisesti käytössä, jotta sinisen valon tehoa voi- taisiin tutkia mahdollisimman käytännönläheisesti.

5.3 LED-valokaappi ja altistusolosuhteet

LED-valokaapissa (Porkka, Finland) oli kaksi lamppua poikittain hyllyjä kohtaan. Altistusta varten kink- kukakkunäytteitä sijoitettiin vaihdellen ylä- ja alatasolle (kts. Kuva 3). Sinisen valon pääasiallinen aallonpituus oli 405 nm ja valokaapin lämpötila oli noin 4 °C. Ylätason etäisyys oli 17 cm ja alatason 35 cm LED-lampusta. Valon intensiteetti mitattiin yksikössä mW/cm² kahdestatoista pisteestä sekä ylä- että alatasolla ja arvoista laskettiin keskiarvot: ylätaso 10,4±3,73 mW/cm² ja alataso 9,5±1,62 mW/cm². Suuren intensiteettivaihtelun vuoksi näytteiden paikkaa vaihdeltiin tasoilla sinisen valon altistuksen aikana. Kun valon intensiteetti kerrotaan altistusajalla, yksiköksi saadaan J/cm2, joka tarkoittaa altistus- annosta (Josewin 2018b).

E= Pt,

jossa E = säteilyannos (J/cm²), P = intensiteetti (W/cm²), t = altistusaika (s)

Näytteiden säteilyannoksiksi saatiin:

Y: 37 J/cm² A: 821 J/cm²

Y+A: 37 + 787 J/cm2 = 824 J/cm²

Kontrollinäytteet säilytettiin pimeässä jääkaapissa (Porkka Finland Oy, Suomi), jonka lämpötila oli noin 6 °C. Kontrolleina käytettiin pimeässä säilytettyjä, sekä vain kakun luonnollisen mikrobiston sisältäviä että C. albicans ATCC 90020 -hiivalla kontaminoituja näytteitä. Maljaukset tehtiin Sabouraud-maljoille (Sabouraud Dextrose Agar, LabM). Ensimmäinen vaihe toistettiin kolme kertaa (kts. Kuva 3.)

(33)

Kuva 3. Havainnollistettu kuva näytteiden altistuksesta LED-valokaapissa ja säilyvyyskokeiden näyt- teidenottopisteistä. Y= ylätaso, A=Alataso.

5.4 Elintarvikenäytteiden altistus

Ennen varsinaisia mikrobiologisia analyyseja tutkittiin sinisen valon altistusta useammassa aikapis- teessä ja näytteiden aistinvaraista ja mikrobiologista laatua seurattiin jokaisessa aikapisteessä. Liit- teessä 3 on kuva kakkunäytteistä, joita on altistettu siniselle valolle 6 ja 8 päivää. Kuvista on todetta- vissa, että sininen valo kuivatti kakkunäytteitä sekä aiheutti kinkussa ja persiljassa on huomattavia väri- muutoksia. Testiviikon tulosten perusteella kakkunäytteitä pidettiin sinisen valon alla varsinaisissa ana- lyyseissä korkeintaan 24 h.

Tutkielman varsinainen kokeellinen osuus jakaantui kahteen vaiheeseen. Ensimmäisessä vaiheessa näytteet altistettiin siniselle valolle LED-valolla valaistuissa jääkaapeissa. Näytteitä altistettiin siniselle valolle kolmella eri tapaa, jotka on havainnollistettu kuvassa 3 koodein Y, A ja Y+A. Näytteitä altistettiin siniselle valolle joko tunti ylätasolla (Y), 24 tuntia alatasolla (A) tai yhdistettynä tunti ylätasolla ja 23 tuntia alatasolla (Y+A). Erilaiset käsittelyt tehtiin, jotta nähtiin, miten eri altistusajat vaikuttavat loppu- tuotteeseen.