MAATILAPÖLYN VAIKUTUS KEUHKOEPITEELIN KYKYYN REAGOIDA VIRUSALTISTUKSEEN
Kirsi Wolczkiewicz Pro gradu-tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto
Ympäristö- ja biotieteiden laitos Lokakuu 2019
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta
Ympäristö- ja biotieteiden laitos, Ympäristötieteen pääaine
Kirsi Wolczkiewicz: Maatilapölyn vaikutus keuhkoepiteelin kykyyn reagoida virusaltistukseen
Pro Gradu-tutkielma: 50 sivua, 2 liitettä (4 sivua)
Tutkielman ohjaajat: Marjut Roponen (apulaisprofessori, FaT) ja Maria-Viola Martikainen (FT)
Lokakuu 2019
avainsanat: farmiefekti, maatilapöly, hengitystievirus, yhteiskasvatusmenetelmä, astma
TIIVISTELMÄ
Lasten astma ja allergiset sairaudet ovat yleisiä teollisuusmaissa ja ovat yleistymässä myös kehittyvissä maissa. Useat altisteet, kuten hengitystievirukset, voivat lisätä todennäköisyyttä sairastua astmaan. Kaupunkiympäristö voi altistaa sairauksien kehittymiselle, mutta maatilaympäristö voi antaa suojaavan vaikutuksen sairauksia vastaan. Maatiloilla kasvaneilla lapsilla on havaittu olevan vähemmän astmaa ja allergisia sairauksia kuin muilla lapsilla. Tätä ilmiötä kutsutaan farmiefektiksi. Sen takana saattaa olla jokin maatilaympäristön tekijä, joka muokkaa lapsen immuunipuolustusta siten, että riski sairastua allergisiin sairauksiin pienenee.
Suojaavia tekijöitä on havaittu olevan esimerkiksi mikrobit ja tilamaidon juonti, mutta immuunipuolustuksen mekanismia ei ole vielä selvitetty.
Farmiefektin on yleisesti ajateltu olevan suora yhteys altisteen ja sen aiheuttaman suojavaikutuksen välillä. Tämä Pro Gradu-työ perustuu kuitenkin hypoteesiin, jonka mukaan maatilapölyaltistus tehostaa solujen puolustuskykyä hengitystieinfektiota vastaan. Infektio ilmenee täten elimistössä heikommin, mikä pienentää riskiä sairastua astmaan. Tutkielman päätavoitteena oli selvittää, muuttaako maatilapölyaltistus solujen vastetta virus- ja bakteeriligandialtistusten aikana. Hypoteesia tutkittiin kokeellisessa tutkimusasetelmassa, jossa yhteiskasvatettuja keuhkon epiteelisoluja sekä makrofageja altistettiin kolmelle erilaiselle maatilapölylle sekä kolmelle virus- ja bakteeriligandille. Solujen reagointia altistuksiin tutkittiin mittaamalla solujen metabolista aktiivisuutta, elävyyttä, oksidatiivista stressiä, sytokiinejä ja solusykliä.
Tässä työssä saatiin selville, että maatilapölyllä oli vaikutus soluvasteisiin. Esimerkiksi solujen metabolinen aktiivisuus laski ja oksidatiivisen stressin määrä lisääntyi sekä pöly- että yhteisstimulaatioiden vaikutuksesta kontrolliin verrattuna. Myös solujen erittämän IL-6- sytokiinin määrä lisääntyi merkittävästi maatilapölyaltistuksesta.
Pölyn aiheuttamat soluvasteet olivat kuitenkin voimakkaita, jonka vuoksi ligandien aiheuttamat soluvasteet jäivät osittain piiloon. Tämä saattoi johtua liian suuresta pölyannoksesta. Vaikka pölyvasteet olivat voimakkaita, työssä saatiin kuitenkin viitteitä, että maatilapöly heikentäisi ligandin aiheuttamaa soluvastetta. Tämän takia aihetta tulisi tutkia lisää.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry
Department of Environmental and Biological Sciences, Environmental Science Kirsi Wolczkiewicz: How farm dust affects lung epithelial cells during viral infection Master of Science thesis: 50 pages, 2 annex (4 pages)
Instructors of thesis: Marjut Roponen (Associate Professor, PhD) and Maria-Viola Martikainen (PhD)
October 2019
keywords: farm effect, farm dust, respiratory virus, co-culture, asthma
ABSTRACT
The prevalence of childhood asthma and allergic diseases is high in industrialized countries and has been increasing in developing countries. Different environmental factors, such as respiratory viruses, are major reasons behind the increase of asthma prevalence. Urban environment may have an impact on the development of allergic diseases, but the farm environment can have a protective effect. The effect is known as the farm effect. It has been seen among children living on farms, since they have less asthma and allergic diseases compared to children living in urban environments. Some factors behind the effect, such as microbes and raw milk consumption, have been identified, but the mechanisms in immune system have remained unidentified.
In the common hypothesis, the farm effect is caused by some factor present in farm environments. In this thesis, an alternative hypothesis was used. We assumed, that farm dust has an effect in the immune response caused by a respiratory virus, which can result as an altered immune response and thus may contribute to a lower prevalence of childhood asthma.
This thesis focused on analyzing in-vitro cell responses caused by co-cultured epithelial cells and macrophages when exposed to three different farm dust samples and to three virus and bacteria mimicking ligands. Toxicological analysis, such as cellular metabolic activity, viability, oxidative stress, cytokines and cell cycle, were performed.
The results showed a significant cellular response caused by farm dust. Cellular metabolic activity was decreased, and the amount of oxidative stress was increased in co-stimulation compared to the control level. Farm dust also contributed to the increasing concentrations in IL-6-cytokine levels in co-stimulated cells.
Farm dust-induced responses were strong and partially covered the cellular responses caused by ligands. Some results showing the protective effect of farm dust were managed to obtain, which is why the topic should be studied in the future.
ESIPUHE
Tämä Pro-gradu on tehty Itä-Suomen yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksen Inhalaatiotoksikologian tutkimusryhmässä lokakuun 2018 ja lokakuun 2019 välisenä aikana.
Ohjaajina toimivat apulaisprofessori, farmasian tohtori Marjut Roponen ja filosofian tohtori Maria-Viola Martikainen.
Haluan kiittää ohjaajiani asiantuntevasta ja kannustavasta ohjauksesta sekä laboratorion työntekijöitä, jotka avustivat kokeiden suorituksessa. Lisäksi haluan kiittää Tarleena Tossavaista hänen tuesta ja avusta pölykeräyksessä ja laboratoriotyöskentelyssä.
Lopuksi haluan kiittää perhettäni, avopuolisoani ja ystäviäni tuesta koko tutkielman aikana.
Joensuussa 31.10.2019 Kirsi Wolczkiewicz
LYHENNELUETTELO
A549 Ihmisen alveolaarinen epiteelisolulinja DC Dendriittisolu
DGI Dekati Gravimeter Impactor DMSO Dimetyylisulfoksidi
HRV Rinovirus, Human Rhinovirus IFN Interferoni
IL Interleukiini LPS Lipopolysakkaridi
mDC Myeloidinen dendriittisolut
NK-solut Luonnolliset tappajasolut, Natural killer cells pDC Plasmasytoidinen dendriittisolu
PMA Forboli 12-myristaatti 13-asetaatti POLY(I:C) Polyinosiini-polysytidyylihapponatrium
PRR Pinnan rakenteita tunnistavat reseptorit, Pattern-recognition receptors RSV Hengitystievirus, Respiratory syncytial virus
ROS Happiradikaali TH Auttaja-T solu
THP-1 Ihmisen makrofagin kaltainen solulinja TLR Tollin kaltainen reseptori, Toll-like receptor TNF Tuumorinekroositekijä
SISÄLLYSLUETTELO
1. JOHDANTO ... 8
2. KIRJALLISUUSKATSAUS ... 9
2.1. Immuunipuolustus ... 9
2.1.2. Adaptiivinen immuunipuolustus ... 10
2.1.3. Mononukleaarinen fagosyyttijärjestelmä ... 10
2.1.4. Epiteelisolut ... 12
2.1.5. Tollin kaltaiset reseptorit ja niitä stimuloivat ligandit ... 13
2.1.6. Sytokiinit ... 13
2.2. Astma ja atooppiset sairaudet ... 14
2.2.1. Yleisyys, syyt ja kustannukset ... 14
2.2.2. Astman ja allergisten sairauksien patogeneesit ... 15
2.3. Hengitystievirusinfektioiden vaikutus allergioiden ja astman syntyyn ... 16
2.3.1. Hengitystievirusinfektioiden yleisyys ... 16
2.3.2. Hengitystievirukset RSV ja HRV ... 16
2.3.3. Yhteys allergisiin sairauksiin ... 17
2.4. Farmiefekti ... 18
2.4.1. Maatilan suojaava vaikutus ... 18
2.4.2. Suojaavat altisteet ... 19
2.4.3. Maatilapöly ... 20
3. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ... 21
4. AINEISTO JA MENETELMÄT ... 22
4.1. Tutkimusasetelma ... 22
4.1.1. Solujen yhteiskasvatus ... 22
4.1.2. Maatilapölyn keräys ja käsittely ... 22
4.1.3. Altistus ... 23
4.2. Toksisuustestit ... 24
4.2.1. Metabolinen aktiivisuus ... 24
4.2.2. Oksidatiivinen stressi ... 24
4.2.3. Elävyys ... 25
4.2.4. Sytokiinit ... 25
4.2.5. Solusykli ... 25
4.2.6. Tulosten käsittely ... 26
4.2.7. Tilastolliset menetelmät ... 27
5. TULOKSET ... 28
5.1. Metabolinen aktiivisuus ... 28
5.2. Oksidatiivinen stressi ... 29
5.3. Elävyys ... 30
5.4. Sytokiinit ... 31
5.5. Solusykli ... 32
6. TULOSTEN TARKASTELU ... 34
7. JOHTOPÄÄTÖKSET ... 39
LÄHTEET ... 40 LIITTEET
LIITE 1. Liuokset
LIITE 2. 24H toksisuusanalyysin tulokset
1. JOHDANTO
Astman ja allergisten sairauksien esiintyvyys on ollut viime vuosikymmenten aikana nousussa, mikä voi johtua muutoksista elintavoissa ja –ympäristössä. Sairauksien riskitekijöitä ovat geneettiset tekijät sekä erilaiset ympäristötekijät, kuten passiivinen tupakointi, ruokavalio, sisä- ja ulkoilman mikrobit sekä virukset, kuten hengitystievirukset (von Mutius & Vercelli, 2010).
Hengitystievirusten aiheuttamat infektiot lapsuudessa voivat muokata immuunipuolustukseen osallistuvien solujen kommunikaatiota ja toimintaa. Tämä voi johtaa immuunivasteen muuttumiseen ja siten altistaa astman ja allergisten sairauksien kehittymiselle. (Westphalen ym, 2014; Jartti & Gern, 2017)
Maatiloilla asuvilla lapsilla on todettu olevan vähemmän astmaa ja allergisia sairauksia kuin muilla lapsilla. Tätä ilmiötä kutsutaan farmiefektiksi (von Mutius & Vercelli, 2010). Maatilojen lapset voivat altistua erilaisille ympäristötekijöille, kuten maatilamaidolle, eläinten ja rehun pölylle sekä mikrobeille ja niiden aineenvaihduntatuotteille, jotka saattavat stimuloida immuunipuolustuksen toimintaa (Ege ym, 2011). Esimerkiksi maatilapöly voi sisältää bakteerien tuottamia endotoksiineja, kuten lipopolysakkaridia, joka voi muokata immuunipuolustuksen toimintaa siten, että astmariski saattaa laskea (Schuijs ym, 2015). Vaikka farmiefektin takana olevia mahdollisia ympäristötekijöitä on useita, efektin mekanismia immuunipuolustuksessa ei ole vielä selvitetty.
Farmiefektin takana on ajateltu olevan jokin altiste tai useita altisteita, joiden ansioista maatilalla asuvien lasten astma- ja allergiariski on matalampi. Tässä Pro Gradu-työssä hypoteesina oli tutkia, lieventääkö maatilapöly hengitystieviruksen aiheuttamaa vastetta. Työ suoritettiin käyttämällä in vitro-keuhkoepiteelimallia ja altistamalla sitä kolmella eri maatilapölyllä ja hengitysviruksia ja bakteereja stimuloivilla ligandeilla. Työssä haluttiin selvittää, onko maatilapölyn ja ligandin yhteisaltistuksella vaikutusta soluvasteisiin. Lisäksi haluttiin selvittää, onko eri maatilapölyjen ja ligandien aiheuttamilla soluvasteilla eroja keskenään.
2. KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1. Immuunipuolustus
Ihmisen keho pystyy käynnistämään erilaisia suoja- ja puolustusjärjestelmiä kohdatessaan taudinaiheuttajia. Näitä järjestelmiä kutsutaan immuunipuolustukseksi, joka voidaan jakaa synnynnäiseen ja adaptiiviseen immuunipuolustukseen. Niiden tehtävänä on erottaa vieraat rakenteet eli antigeenit kehon omista rakenteista. Antigeeneille kehitetään muistijälki, mikä helpottaa puolustuksen toimintaa tulevaisuudessa. Immuunipuolustuksen keskeisessä osassa on tulehdusreaktio. Synnynnäinen immuunijärjestelmä aiheuttaa tulehdusreaktion, mikä käynnistää immuunireaktion. Immuunireaktio aktivoi immuunipuolustuksen, minkä tuloksena on voimakkaampi tulehdusreaktio. (Duodecim Terveyskirjasto; Elimistön vastustuskyky (immuniteetti), 2019; Meri, 2011)
2.1.1. Synnynnäinen immuunipuolustus
Ihmisen immuunipuolustus koostuu luontaisesta eli synnynnäisestä immuniteetistä sekä adaptiivisesta eli hankitusta immuniteetistä. Synnynnäinen immuunipuolustus on epäspesifinen, sillä sen vaste on samanlainen taudinaiheuttajasta riippumatta ja se muodostuu nopeasti (minuuteista tunteihin). Sen toiminta kehittyy sikiöaikana sekä heti syntymän jälkeen.
Synnynnäisen immuunipuolustuksen toimintaan kuuluu erilaisia fysikaalisia puolustuskeinoja, kuten ihon ja limakalvojen kiinteä solurakenne, limakalvojen värekarvojen liike sekä luontainen bakteerikanta. Vasteeseen osallistuvat valkosolut, kuten NK-solut, neutrofiilit, basofiilit, esinofiilit, monosyytit, makrofagit ja dendriittisolut. Useat solut voivat osallistua molempien immuunipuolustusten toimintaan. Esimerkiksi makrofagit ja dendriittisolut toimivat syöjäsoluina synnynnäisessä immuunipuolustuksessa sekä toimivat antigeenejä esittelevinä soluina T-soluille, jolloin adaptiivinen immuunipuolustus aktivoituu. Myös muut toiminnot, kuten tulehdusreaktio ja erilaiset sytotoksiset menetelmät ovat samoja synnynnäisessä ja adaptiivisessa immuunipuolustuksessa. (Duodecim Terveyskirjasto;
Elimistön vastustuskyky (immuniteetti), 2019; Lumio, 2018; Moticka, 2016)
2.1.2. Adaptiivinen immuunipuolustus
Toisin kuin synnynnäinen immuunipuolustus, adaptiivinen immuunipuolustus toimii spesifisesti aikaisemmin tunnistettua rakennetta vastaan. Adaptiivisen immuunipuolustuksen toiminta muotoutuu sitä mukaa, kun se kohtaa patogeenejä. Sen toiminta perustuu T- ja B- solujen toimintaan ja se voidaan jakaa humoraaliseen ja soluvälitteiseen immuniteettiin.
Humoraalisessa immuniteetissä B-solut tuottavat vasta-aineita, jotka sitoutuvat patogeeneihin.
Näin patogeeni ei pääse sitoutumaan isäntäsolun reseptoreihin ja solut pystyvät tuhoamaan sen.
Soluvälitteisessä immuunivasteessa T-solut pystyvät tuhoamaan patogeenin tunnistamalla sen pinnalla olevan antigeenin. (Duodecim Terveyskirjasto; Elimistön vastustuskyky (immuniteetti), 2019; Solunetti, Histologia, Adaptiivinen immuunivaste)
Kun elimistö kohtaa patogeenin ensimmäisen kerran, immuunivasteen syntymiseen voi mennä 10-14 päivää. Jos se pääsee uudestaan elimistöön, immuunipuolustus synnyttää spesifisen immuunivasteen. Ilmiötä kutsutaan immunologiseksi muistiksi. Tämä mahdollistaa vastustuskyvyn samaa patogeeniä vastaan. Vasteen muodostuminen on nopeampaa seuraavassa kohtaamisessa. (Lumio, 2018)
2.1.3. Mononukleaarinen fagosyyttijärjestelmä
Immuunipuolustukseen osallistuvat monosyytit, makrofagit ja dendriittisolut kuuluvat mononukleaariseen fagosyyttijärjestelmään solujen samankaltaisten ominaisuuksien johdosta.
Järjestelmän solut ovat fagosyytteja eli solusyöjiä, eli ne pystyvät tuhoamaan patogeenejä.
Monosyytit voivat erilaistua dendriittisoluiksi tai makrofageiksi. Monosyytit kehittyvät luuytimessä ja liikkuvat verenkierrossa, mistä ne voivat siirtyä kudoksiin tulehduspaikalle.
Siellä ne voivat erilaistua ja kutsua tulehduspaikalle muita immuunipuolustuksen soluja.
Monosyytit osallistuvat pääasiassa synnynnäiseen immuniteettiin. Niitä on verenkierrossa n.
3-8 % ja ne voidaan jaotella kahteen ryhmään: M1 ja M2-monosyytteihin. M1-monosyytit erittävät tulehdusta edistäviä TNF- ja IL-6-sytokiinejä. M2-monosyytit esimerkiksi osallistuvat haavan paranemiseen. (Guilliams ym, 2014; Duodecim, Monosyytti, 2019; Solunetti, Histologia, Monosyytti)
Monosyyteistä erilaistuneet makrofagit tunnistavat ja tuhoavat vierasaineita ja muita partikkeleita, kuten mikrobeja, keuhkojen pölyhiukkasia ja ikääntyneitä punasoluja.
Tunnistuksen jälkeen makrofagit aktivoituvat ja erittävät tulehdusreaktiota voimistavia IL-1-, IL-6- sekä TNF--sytokiinejä. Sytokiinit pystyvät edelleen aktivoimaan lisää makrofageja.
Keuhkoissa sijaitsevat alveolaariset makrofagit muodostavat epiteelisolukon kanssa ensimmäisen puolustuksen patogeenejä vastaan (Meri ja Julkunen, 2011; Meri ja Julkunen, Fagosytootit, 2011; Schulz ym, 2017).
Dendriittisolut ovat ns. antigeenejä esitteleviä soluja. Solut tunnistavat ja fagosytoivat vieraan materiaalin ja vievät sen T-soluille imusolmukkeisiin, jonka jälkeen adaptiivinen immuunivaste aktivoituu. (Kuva 2). Dendriittisoluja esiintyy elimistössä eri kudoksissa, kuten ihossa, keuhkoissa ja imusolmukkeissa. Dendriittisoluja on kahta eri tyyppiä, jotka jaotellaan kehityslinjojen mukaan. Myeloidisesta kehityslinjasta peräisin olevat myeloidiset dendriittisolut, eli ns. perinteiset tyypin 1 ja 2 dendriittisolut (cCD1 & cCD2 eli mDCs). Ne pystyvät fagosytoimaan kiinteitä rakenteita sekä kudosnesteessä olevia aineita. T-solujen aktivointiin osallistuu toinen dendriittisolulinja, lymfaattisesta kehityslinjasta tulevat plasmasytoidit dendriittisolut (pDC). Ne tuottavat interferoneja ja muokkaavat tulehdusaluetta ja kudosvaurioita. (Salmi & Meri, 2011; Lin ym, 2017)
Kuva 2. Epiteeli- ja dendriittisolujen reaktio allergeenia vastaan. Epiteelisolut erittävät
sytokiinejä ja kemokiinejä, jotka aktivoivat synnynnäisen immuunivasteen. Dendriittisolu voi aktivoitua epiteelisolujen kautta tai itsenäisesti allergeenin kohtaamisesta. Dendriittisolu siirtyy imusolmukkeisiin, joissa Th 2-solujen kehitys alkaa. (Lambrecht & Hammad, 2010)
2.1.4. Epiteelisolut
Epiteelisolut ovat tärkeässä osassa synnynnäisessä ja adaptiivisessa immuunipuolustuksessa.
(Lin ym, 2017) Ne muodostavat epiteelisolukon, jossa ns. tiiviit liitokset (tight junction) säätelevät epiteelin läpäisevyyttä. Solukko suojaa hengitysteitä ja tekee fyysisen esteen patogeenejä vastaan. Epiteelisolut tuottavat mikrobialtistuksen aikana sytokiinejä sekä kemokiinejä ja pystyvät siten aktivoimaan dendriitti-, B- ja T-soluja. (Schleimer ym, 2007;
Kantele & Vaarala, 2011)
Immuunivaste voi muuttua epiteelisolukon muokkaamisen kautta. Esimerkiksi erilaiset hengitystievirukset pystyvät muuntelemaan epiteelisolukkoa, jolloin solukon toiminta voi heikentyä. (Feldman ym, 2015) Epiteelisolukon muuntelua ja immuunivasteen muuttumista voi tapahtua myös solujen kommunikoinnin kautta. Alveolaariset makrofagit pystyvät
kommunikoimaan keskenään epiteelisolujen kautta. Kommunikointi tapahtuu Ca2+-pulssien kautta. Tämä voi johtaa sytokiinituotannon vähenemiseen ja siten immuunivasteen muuntumiseen keuhkoissa. (Westphalen ym, 2014)
2.1.5. Tollin kaltaiset reseptorit ja niitä stimuloivat ligandit
Tollin kaltaiset reseptorit (Toll-like receptor, TLR) ovat osa synnynnäisen immuunipuolustuksen toimintaa ja niitä esiintyy esimerkiksi makrofagien ja dendriittisolujen pinnoilla. TLR:t kuuluvat rakenteita tunnistaviin reseptoreihin (pattern-recognition receptors, PRRs), jotka pystyvät tunnistamaan patogeenit niiden pintamolekyylien avulla. (Christmas, 2010) TLR:t voidaan jakaa esiintymispaikan mukaan. Solukalvossa ilmenevät TLR-1, TLR-2, TLR-4, TLR-5, TLR-6 ja TLR-10, ja endosomeissa ilmenevät TLR-3, TLR-7, TLR-8 ja TLR- 9. (Leiva-Juarez ym, 2018)
Reseptoreihin pystyvät spesifisesti sitoutumaan TLR-ligandit, kuten lipopeptidit, nukleiinihapot ja bakteeriperäiset proteiinit (Leiva-Juarez ym, 2018). TLR-4-reseptori tunnistaa esimerkiksi lipopolysakkaridin (LPS), joka on eristetty gram-negatiivisen bakteerin soluseinästä. TLR-3-reseptori tunnistaa virusten kaksijuosteista RNA:ta, kun taas TLR-7 ja -8- reseptoreihin sitoutuu virusten yksijuosteinen RNA. (Sun ym, 2011) Virustunnistuksen tutkimuksissa käytetään kaupallisia ligandeja, kuten polyinosiini-polysytidyylihapponatriumia, polyI:C (TLR-3) ja synteettisiä oligoribonukleotidejä, ORN (TLR-7/8).
2.1.6. Sytokiinit
Sytokiinit ovat solujen tuottamia proteiineja, jotka toimivat solujen toimintojen viestinviejinä.
Ne ohjaavat esimerkiksi solujen erilaistumista, kasvua ja aktiivisuutta ja ovat merkittävässä roolissa tulehdusreaktion säätelyssä. Sytokiinituotanto lisääntyy immuunivasteen aikana, jolloin tulehdusreaktio voimistuu tulehdussolujen aktivoituessa. (Silvennoinen & Hurme, 2003) Sytokiinit voidaan jaotella esimerkiksi interleukiineihin (IL), tuumorinekroositekijä alfaan (TNF-α), interferoneihin (IFN), kasvutekijä granulosyytteihin (G-CSF) ja erytropoietiiniin (EPO). Tulehdusreaktioon osallistuvat pro-inflammatoriset eli tulehdusta voimistavat sytokiinit, kuten IL-6 ja TNF-α. (Meri ja Julkunen, Sytokiinit, 2011) Anti-inflammatoriset eli tulehdusreaktiota hillitseviä sytokiinejä ovat esimerkiksi IL-4 ja IL-10 (Silvennoinen & Hurme,
2003). Sytokiinit voivat toimia tuotantopaikallaan, viereisissä soluissa tai kauempana elimistössä (Ferreira ym, 2018).
Interleukiinit ja interferonit osallistuvat merkittävästi tulehdusreaktioon. Interleukiinit pystyvät aktivoimaan ja heikentämään immuunipuolustuksen toimintaa. Niitä on 40 erilaista ja ne voidaan jaotella ominaisuuksien ja reseptorien mukaan (Ferreira ym, 2018).
Immuunipuolustusta aktivoivia interleukiineja on esimerkiksi IL-6, joka on tulehduksen akuutin faasin reaktiota voimistava sytokiini. Mm. keuhkon epiteelisolut voivat erittää sitä, jos solut ovat vaurioituneet tai saavat aikaan stressireaktion UV-valosta, ROS:ista, mikrobeista tai viruksista. (Hämäläinen & Moilanen, 2018; Gubernatorova, 2018) Interferonit pystyvät häiritsemään virusinfektion kulkua solussa, esimerkiksi estämällä virusten jakautumista ja lisääntymistä sekä tuhoamalla niitä. Interferonit voidaan jaotella tyypin 1 ja tyypin 2-ryhmiin.
Tyypin 1 interferoneja, kuten IFN-α: aa, erittävät makrofagit ja dendriittisolut TLR-3, -7 ja -8- reseptoreiden vaikutuksesta. (Hämäläinen & Moilanen, 2018)
2.2. Astma ja atooppiset sairaudet
2.2.1. Yleisyys, syyt ja kustannukset
Astma on yleisin krooninen keuhkosairaus maailmassa, ja lasten yleisin tarttumaton sairaus.
(WHO, 2017) WHO:n mukaan 235 miljoonaa ihmistä sairasti astmaa maailmanlaajuisesti vuonna 2017. Astmaa tavataan yhä enemmän länsimaissa verrattuna kehittyviin maihin, joissa kaupungistuminen ei ole yhtä merkittävää (von Mutius & Vercelli, 2010). Esiintyvyys on suurinta länsimaissa, esimerkiksi Australiassa (21,0%:lla asukkaista), ja pienintä kehittyvissä maissa, esimerkiksi Kiinassa (0,2%:lla asukkaista) (To ym, 2012). Esiintyvyyteen voi vaikuttaa se, että kehittyvissä maissa terveydenhuolto ja lääkitys eivät ole kaikkien saatavilla samalla tavalla kuin länsimaissa, jolloin sairaustapauksia jää rekisteröimättä (Papi ym, 2018). Astman lisäksi erilaiset atooppiset sairaudet ovat yleistyneet viime vuosikymmenten aikana.
Suomalaisista jopa 40 % on herkistynyt atooppisia allergioita kohtaan, mutta vain osa oireilee herkistymisen takia (Lönnrot, 2018).
Astman yleisyys on ollut nousussa viime vuosikymmenten aikana länsimaissa, mutta nykyään yleisyys on nousussa myös kehittyvissä maissa. Siellä yleisyyden lisääntymiseen on voinut vaikuttaa ympäristön muutokset kaupungistumisen johdosta sekä elintapojen muuttuminen.
Kaupungistumisen vaikutukset, kuten ilmansaasteet moottoriajoneuvoista, on liitetty astmariskin nousuun. Ruoanlaitossa ja lämmityksessä polttamalla muodostuneet sisäilmansaasteet voivat nostaa astmariskiä kehittyvissä maissa. (Cruz ym, 2017) Lisäksi antibioottien käyttö, passiivinen tupakointi, imetys, ruokavalio, erilaiset allergeenit ja mikrobit sisä- ja ulkoilmassa sekä hengitysteiden ja suoliston mikrobitasapainon heikentyminen on liitetty suurentuneeseen sairastumisriskiin (Lin ym, 2017; Feng ym, 2016).
Astma aiheuttaa paljon suoria ja epäsuoria kustannuksia. Suoria kustannuksia ovat esimerkiksi sairaala- ja lääkärikäynnit, laboratoriotestit ja lääkitys. Epäsuoria kustannuksia ovat esimerkiksi työhön liittyvät kulut, kuten sairauspoissaolot ja työkyvyttömyys sekä ennenaikainen kuolema.
Yhdysvalloissa astman aiheuttamat kustannukset olivat 56 miljardia dollaria vuonna 2011 (Nunes ym, 2017). Euroopassa samana vuonna kustannukset olivat kokonaisuudessaan 72,2 miljardia euroa (European Lung Foundation, 2013).
2.2.2. Astman ja allergisten sairauksien patogeneesit
Astma on hengitysteiden krooninen sairaus, jossa keuhkoputkiston limakalvo on tulehtunut.
Pitkään jatkunut voimakas astma voi aiheuttaa rakenteellisia muutoksia, esimerkiksi limakalvovaurioita. (Haahtela, 2014) Astma jaetaan allergiseen ja ei-allergiseen astmaan.
Aikuisilla allergista astmaa esiintyy noin puolella sairastavista, lapsilla noin 80 % sairastavista (Duodecim, Astma sairautena, 2014).
Allergista astmaa sairastavalla on usein myös atooppista allergiaa. (Duodecim, Astma sairautena, 2014) Allergia on immuunijärjestelmän käynnistämä yliherkkyysreaktio allergeenia, eli allergisen reaktion aiheuttavaa antigeeniä, vastaan. Allergeeni voi olla esimerkiksi siitepöly, ruoka-aine, eläinten pöly tai jokin kemikaali. Allergisen reaktion voi aiheuttaa IgE-vasta-aine, jolloin puhutaan välittömästä IgE-välitteisestä allergiasta eli atooppisesta allergiasta. Kun allergeeni kohtaa syöttösolun, IgE-vasta-aineet reagoivat ja syöttösolusta vapautuu histamiinia ja välittäjäaineita. Oireet alkavat nopeasti, yleensä viimeistään tunnin kuluessa altistumisesta. Oireita on esimerkiksi kutina, allerginen nuha, nokkos- ja atooppinen ihottuma ja vakavissa tapauksissa anafylaktinen reaktio. Toinen allergiatyyppi on viivästynyt soluvälitteinen allergia, jossa Th-solut ovat herkistyneet kemikaaleille. Tämä allergiatyyppi ei ole henkeä uhkaava, mutta voi rajoittaa elämänlaatua vakavuudesta riippuen. Allergiareaktio tulee yleensä kosketuskontaktista allergeenia kohtaan,
jolloin oireet alkavat usean tunnin kosketuksen tai toistuvien lyhyiden jaksojen jälkeen. Oireita ovat muun muassa kutina ja punoitus. Tavallisimpia allergeeneja ovat nikkeli, pesuaineiden ja kosmetiikan sisältämät säilöntäaineet ja hajusteet. (Lönnrot, 2018; Davies)
Atopia viittaa herkistymiseen ja voimakkaaseen IgE-vasta-aineen tuottoon yleisille altisteille eli antigeeneille ympäristössä, joihin suurin osa ihmisistä ei reagoi. Atopia ilmenee yleensä lapsuudessa tai nuoruudessa, ja se on usein perinnöllistä. Tyypillisesti henkilöille voi kehittyä astma tai atooppinen ekseema eli iho-oireita. (Davies; Lönnrot, 2018)
2.3. Hengitystievirusinfektioiden vaikutus allergioiden ja astman syntyyn
2.3.1. Hengitystievirusinfektioiden yleisyys
Akuutti alahengitystietulehdus (acute lower respiratory infection, ALRI) on merkittävä syy alle 5-vuotiaiden lasten kuolleisuuteen maailmanlaajuisesti. Respiratory Syncytial Virus, RSV, on yleisin patogeeni lapsilla, jotka ovat sairastuneet ALRI:in. Noin 33,1 miljoonan alle 5-vuotiaan lapsen arvioitiin sairastaneen RSV:n vuonna 2015. Vuosittaiset maailmanlaajuiset RSV- epidemiat nostavat sairastuvuutta ja kuolleisuutta merkittävästi. (Shi ym, 2017; Dulek ym, 2011) Suomessa n. 10-30 % pienistä lapsista saa alahengitystieinfektion, joka vaatii sairaalahoitoa. Aikuisilla ja vanhemmilla lapsilla RSV aiheuttaa usein ylähengitystieoireita (Vainionpää ym, 2010). Rinovirus (Human Rhinovirus, HRV) aiheuttaa eniten ylähengitystietulehduksia maailmassa. Noin 2/3 lasten flunssatapauksista on HRV:n aiheuttamia, siksi se on myös yksi yleisimmistä kuolinsyistä lapsilla (Jacobs ym, 2013).
2.3.2. Hengitystievirukset RSV ja HRV
Respiratory Synctytial Virus (RSV) on Paramyxoviridae-sukuun kuuluva yksijuosteinen RNA- virus, joka aiheuttaa akuutteja hengitystieinfektioita. RSV pystyy infektoimaan ja tuhoamaan epiteelisolukkoa hengitysteissä, mikä aiheuttaa pienillä lapsilla tiehyiden tukkeutumista ja hengitysvaikeuksia (Saijan ym, 2008; Vainionpää ym, 2010) Taudin vakavuuden vaihtelu voi johtua yksilöllisitä eroista tai viruksen kyvystä aiheuttaa immuunivastehäirintää, kuten immuunivasteen kiihdyttämistä erittämällä sytokiinejä ja kemokiinejä ja aktivoimalla makrofageja, neutrofiilejä ja dendriittisoluja. (Vainionpää ym, 2010) Hengitysteiden
epiteelisolukko on hengitystievirusten vaikutuskohde, jolloin RSV pystyy sitoutumaan TLR-3- reseptoriin keuhkoissa (Feldman ym, 2015).
Rinovirus on Picornaviridae-sukuun kuuluva kaksijuosteinen RNA-virus, joka voidaan jakaa A-, B- ja C-lajeihin. Virus aiheuttaa flunssaa eli nuhakuumetta sekä infektioita ylemmissä ja alemmissa hengitysteissä. Infektiot voivat olla myös vähäoireisia tai oireettomia. (THL, 2013) Virus ei tuhoa epiteelisolukkoa, vaan häiritsee solujen ja soluliitosten toimintaa (Saijan ym, 2008). HRV pystyy sitoutumaan TLR-7- ja 8 reseptoreihin (Jacobs ym, 2013).
2.3.3. Yhteys allergisiin sairauksiin
Lapsena sairastetut hengitystievirukset, kuten HRV ja RSV, saattavat nostaa sairastumisriskiä astmaan. (Stein ym, 1999; Jackson ym, 2008; Lin ym, 2017) Esimerkiksi Stein ym. (1999) tutkimuksessa alle 3-vuotiaana sairastettu RSV nosti hengityksen vinkumisen määrää ensimmäisen 10 vuoden aikana. Jackson ym. (2008) tutkimuksessa niillä alle kolmivuotiailla lapsilla, joilla oli todettu hengityksen vinkunaa sekä RSV, HRV tai molemmat virukset, oli korkeampi riski sairastua astmaan kuusivuotiaana. Lähes 90 % HRV:n sairastaneista kolmevuotiaista sairasti astmaa kuusivuotiaana. (Jackson ym, 2008) Lisääntynyt Th2-solujen tuotanto voi liittyä astman kehittymiseen, mikä huomattiin Legg ym. (2003) tutkimuksessa RSV:n osalta. RSV aiheutti vain lievän Th1-vasteen mutta lisäsi Th2-solujen tuotantoa osalla tutkimukseen osallistuneista alle vuoden ikäisistä lapsista.
Virusten lisäämän astmariskin takana voi olla useita syitä. Virus ja muut allergeenit voivat saada yhdessä aikaan synergisen vaikutuksen, mikä voi ilmetä hengityksen vinkumisena.
Hengityksen vinkumisen voidaan katsoa olevan yksi astmaa edeltävistä oireista. Synergistinen vaikutus voi näkyä myös astmaa sairastavilla, sillä se voi pahentaa vakavan astman oireita.
(Comberiati ym, 2017) Myös virusten ominaisuudet voivat johtaa vakavaan tulehdukseen, joka voi myöhemmin altistaa astman kehitykselle. (Jartti & Gern, 2017) Yleensä HRV:n aiheuttama reaktio terveillä aikuisilla ja lapsilla epiteelisolukossa on heikko, jolloin Th2- ja Th1-reaktiot jäävät vähäisiksi. Herkemmillä ihmisillä, kuten pienillä lapsilla, vanhuksilla ja heikomman immuunijärjestelmän omaavilla ihmisillä, Th-reaktiot voivat olla voimakkaampia, jolloin virustartunta saattaa olla vakavampi. (Lin ym, 2017) Tämä voi johtaa allergisten sairauksien kehittymiseen pienillä lapsilla. Myös tietyt geenit voivat edesauttaa hengitystieviruksen sairastamisen jälkeen puhjenneen astman kehitystä. (Feldman ym, 2015)
2.4. Farmiefekti
2.4.1. Maatilan suojaava vaikutus
Ympäristöllä voi olla suojaava vaikutus astmaa ja allergisia sairauksia vastaan. ”Farmiefekti”
tarkoittaa maatilan antamaa suojaavaa vaikutusta lapsuuden astmaa ja atooppisia sairauksia vastaan. Maatiloilla asuneilla lapsilla on todettu olevan pienempi riski sairastua astmaan ja allergioihin kuin lapsilla, jotka asuvat samalla alueella, mutta eivät maatilalla. (Genuneit, 2012;
von Mutius & Vercelli 2010) Suojaava vaikutus on nähty perinteisillä maatiloilla, kun taas modernille maatilaympäristölle altistuminen saattaa jopa kasvattaa lasten astmariskiä. (Gozdz ym, 2015) Tämä voi viitata siihen, että suojaava vaikutus allergisia sairauksia vastaan voi riippua maatila-altistuksen laadusta ja siellä olevista altisteista. (Ruokolainen ym, 2016) Farmiefektin ilmenemiseen saattaa vaikuttaa lapsuudenaikainen altistuminen perinteisille maatilaympäristöille (von Mutius & Vercelli, 2010; Ober ym, 2017). Maatilojen lapset asuvat usein lähellä navettoja, missä on usein pelkästään nautakarjaa. Tällaisia perinteisiä maatiloja on paljon Alppien läheisyydessä Sveitsissä, Itävallassa ja Saksassa. (von Mutius & Vercelli, 2010) Myös perinteistä kulttuuria vaalivilla amisseilla on nähty farmiefektin vaikutus, sillä heillä on tavattu vähemmän astmaa ja allergisia sairauksia valtaväestöön verrattuna (Ober ym, 2017). Hutteriitit ovat geeniperimältään amissien kaltaisia ja noudattavat samankaltaista elämäntapaa, mutta heillä ei ole nähty farmiefektiä. Amisseilla on paljon pieniä, perinteisiä maatiloja, kun hutteriiteilla taas on isoja ja teollistuneita maatiloja (Stein ym, 2016).
Maatila-altisteiden uskotaan muokkaavan immuunipuolustusta vastasyntyneillä ja lapsilla varhaislapsuuden aikana, sillä eroavaisuuksia on huomattu maatiloilla kasvaneiden ja muualla kasvaneiden vastasyntyneiden välillä. Esimerkiksi Ober ym. (2017) tutkimuksessa TLR-7 ja - 8-ekspressio oli merkittävämpää vastasyntyneillä, jotka olivat altistuneet raskausaikana maatilaympäristölle. Myös TLR-5 ja 9-ekspressiot olivat kasvaneet, mikä yhdistettiin pienentyneeseen riskiin atooppisia ihosairauksia vastaan (Ober ym, 2017). Varhaislapsuuden lisäksi äidin raskauden aikaisen maatila-altistuksen on todettu antavan suojaavan vaikutuksen lapselle (Douwes ym, 2007).
Lapsuuden maatila-altistuksen suojaavan vaikutuksen on todettu pysyvän aikuisuuteen asti (von Mutius & Vercelli 2010). Jos maatila-altistus tapahtuu varhaislapsuudessa ja uudelleen
aikuisuudessa, altistusten yhteinen suojaava vaikutus voi pienentää sairastumisriskiä enemmän kuin altistuttaessa vain yhtenä ajanjaksona. Myös jatkuva altistuminen maatilaympäristölle voi vähentää sairastumisriskiä. Yli 40 vuotta kestänyt maatila-altistus vähensi selvästi astman sairastumisriskiä. (Dowes ym, 2007)
2.4.2. Suojaavat altisteet
Maatiloilla on monia altisteita, jotka voivat edesauttaa suojaavan vaikutuksen kehittymistä.
Näitä ovat esimerkiksi maatilamaidon juominen, altistuminen karjan tai rehun pölylle sekä erilaisille endotoksiineille ja muille mikro-organismeille (Muller-Rompa ym, 2018).
Esimerkiksi GABRIEL-tutkimuksessa maatilamaidon juominen ja altistuminen naudoille on yhdistetty astmalta suojaavaan vaikutukseen. Suojaavaa vaikutusta ei kuitenkaan huomattu muita allergisia sairauksia vastaan (Illi ym, 2012).
Amissien farmiefektin takana saattaa olla useiden altisteiden yhteisvaikutus. Heidän ruokavalionsa koostuu vähän prosessoidusta ruoasta, kuten raakamaidosta, ja he altistuvat varhaislapsuudesta lähtien useille eläinlajeille (Ober ym, 2017). Ober ym. (2017) tutkimuksen mukaan monipuolinen mikrobialtistus bakteereille ja viruksille saattaa olla amissien farmiefektin takana. Myös Stein ym. (2015) tutkimuksen mukaan ympäristö voi muokata synnynnäisen immuunipuolustuksen vastetta amisseilla johtaen maatilan suojaavaan vaikutukseen astmalta.
Mikrobialtistuksen merkittävänä tekijänä voi olla LPS, endotoksiini, jolle altistutaan esimerkiksi pölyn kautta. Useissa tutkimuksissa on huomattu, että immuunijärjestelmän toimintaan vaikuttava LPS suojaa allergisten sairauksien kehittymiseltä (Schuijs ym, 2015; Lin ym, 2016; Lin ym, 2017). Schuijs ym. (2015) tutkimuksessa LPS vähensi A20-entsyymin määrää, jolloin epiteelisolujen ja dendriittisolujen välinen kommunikaatio muuttui.
Epiteelisolut tuottivat vähemmän sytokiinejä, mikä vähensi dendriittisolujen aktivoitumista.
Myös Kääriö ym. (2016) in vitro-tutkimuksessa dendriittisoluja aktivoitui vähemmän LPS- altistuksen jälkeen verrattuna kontrolliin. Lin ym. (2016) tutkimuksessa havaittiin, kuinka pitkäaikainen altistaminen LPS:lle in vitro muutti epiteelisolujen toimintaa. Tämä näkyi allergisen reaktion lievenemisenä. LPS ei välttämättä suoraan vaikuta tulehdusreaktion ilmenemiseen, vaan se voi esimerkiksi vähentää pro-allergisten TLR 3-ligandien toimintaa sekä useiden sytokiinien vaikutusta (Coornaert ym, 2009).
2.4.3. Maatilapöly
Maatiloilla esiintyy paljon pölyä sekä kasviperäisistä että eläinperäisistä lähteistä (von Mutius
& Vercelli, 2010). Erilaisia pölyn lähteitä ovat esimerkiksi heinien ja kuivikkeiden käsittely, siivoustoimenpiteet ja eläinten käsittely. Kaikille näille altistutaan maatiloilla jatkuvasti, mutta esimerkiksi joidenkin työtehtävien, kuten ruokinnan aikana, pölypitoisuudet ilmassa nousevat hetkellisesti. Maatilapölyhiukkasen koko voi vaihdella 1 m ja 50 m välillä. (Australian Centre for Agricultural Health and Safety; von Mutius & Vercelli, 2010) Esimerkiksi Pfister ym. (2017) tutkimuksessa käytetyn maatilapölyn koko oli pientä; 3-7,5 m kokoiset partikkelit muodostivat 58,9-68,3 % pölystä. Noin 50 % alle 4 m hiukkasista pystyy tunkeutumaan alveolien kudoksiin keuhkoissa (Pfister ym, 2017).
Pölyn seassa voi olla erilaisia bakteereja, homeita ja sieniä sekä niiden aineenvaihdunnan tuotteita (von Mutius & Vercelli, 2010). Martikainen ym. (2018) tutkimuksessa maatilapöly koostui pääasiassa kasviperäisistä bakteereista, kuten Erwinia ja Brady-rhizobiaceae- bakteereista. Pakarinen. (2008) julkaisussa pölystä eristettiin bakteereja, esimerkiksi Bacillus licheniformis, Acinetobacter Iwoffii ja Lactobacillus, joilla on raportoitu olevan allergioilta suojaavia vaikutuksia. Th1-reaktio voi selittyä TLR:n synergistisillä vaikutuksilla maatilapölyn diversiteetistä johtuen (Pakarinen, 2008). Maatiloilla kasvaneilla lapsilla on huomattu useiden TLR:ien aktivoituminen, mikä saattaa johtua mikrobialtistuksesta (Ege ym, 2011).
Kaikki maatilaympäristöt eivät suojaa astman ja allergisten sairauksien kehittymiseltä. Vaikka pöly voi olla suojaavana tekijänä farmiefektin takana, se myös aiheuttaa erilaisia keuhkosairauksia maatilatyöntekijöillä. Tulehduksia voi esiintyä nenän, kurkun, ylähengitysteiden ja alahengitysteiden epiteelikudoksessa, sillä pienen koon takia pöly pystyy kulkeutumaan syvälle keuhkoihin. Maatilapöly voi pahimmillaan aiheuttaa työntekijöillä astman tai TODS:in eli toksisen orgaanisen pölyn syndrooman. (Australian Centre for Agricultural Health and Safety) Myös pakatun heinän käyttö sekä kanien ja lampaiden läheisyys maatiloilla on yhdistetty astman ja allergioiden sairastumisriskiin (Lluis ym, 2014).
3. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET
Maatiloilla kasvaneilla lapsilla tavataan vähemmän allergisia sairauksia ja astmaa kuin muilla lapsilla. Se saattaa johtua maatilaympäristössä esiintyvästä yhdestä tai useammasta tekijästä, jotka muokkaavat lasten immuunijärjestelmää ja mahdollisesti johtavat pienentyneeseen sairastumisriskiin. Vaikka ympäristö voi vähentää sairastumisriskiä, useat ympäristötekijät, kuten hengitystievirusten aiheuttamat infektiot lapsuudessa, saattavat nostaa sairastumisriskiä astmaan ja allergisiin sairauksiin. (von Mutius & Vercelli, 2010; Jartti & Gern, 2017)
Tämä Pro Gradu-työ perustuu hypoteesiin, jonka mukaan maatilapöly suojaa hengitystievirusinfektioilta ja sitä kautta pienentää lasten riskiä sairastua astmaan. Tätä hypoteesia tutkittiin kokeellisessa tutkimusasetelmassa, jossa yhteiskasvatettuja keuhkon epiteelisoluja sekä makrofageja altistettiin erilaisille maatilapölyille ja virus- ja bakteeriligandeille. Päätavoitteena oli selvittää, tehostaako maatilapölyaltistus yhteiskasvatettujen solujen puolustuskykyä virus- ja bakteeriligandeja vastaan.
4. AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1. Tutkimusasetelma
4.1.1. Solujen yhteiskasvatus
Ihmisen alveolaarista tyypin II epiteelisolulinjaa A549 (ATCC, CCL-185, USA) kasvatettiin yhdessä ihmisen monosyyttisen leukemian solulinjan THP-1 (DSMZ, ACC-16, Saksa) kanssa (co-culture). Yhteiskasvatuksessa THP-1 solut erilaistettiin makrofagin kaltaisiksi soluiksi, jolloin THP-1-solut mimikoivat mononukleaarisen fagosyyttijärjestelmän soluja.
Yhteiskasvatuksen tarkoituksena oli mallintaa keuhkojen alveolien epiteelisolujen ja immuunisolujen yhteisreaktiota altisteisiin ja näin saada todenmukaisempi kuva altistuksen vaikutuksista.
Solulinjat kasvatettiin Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma Aldrich, USA) - mediumissa, joka sisälsi 10 % Fetal Bovine Serum (FBS, Sigma-Aldrich, USA), 1 % Penisilliini/streptomysiiniä (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) sekä 1 % L-Glutamiinia (Invitrogen). Tutkimuksessa käytetyt liuokset liitteessä 1. THP-1-solut erilaistettiin fenotyypiltään makrofagin kaltaiseksi stimuloimalla niitä phorbol 12-myristaatti-13-asetaatilla (PMA, 0,5 g/ml) yhden tunnin ajan. A549-solut jaettiin 12-kuoppalevylle (1,2 x 105 solua/ml) ja neljän tunnin kiinnittymisen jälkeen päälle lisättiin erilaistettuja THP-1-soluja (0,24 x 105 solua/ml). Solujen yhteiskasvatus aloitettiin 45 tuntia ennen maatilapölyaltistusta (+37 °C, 5 % CO2).
4.1.2. Maatilapölyn keräys ja käsittely
Maatilapölynäytteet oli kerätty Itä-Suomen alueella sijaitsevilta maatiloilta. Navetta 2 oli perinteisin kolmesta navetasta. Siellä oli vähiten nautoja ja lypsyavustaja. Navetta 3 oli suurin.
Siellä oli automatisoitu lypsy, naudat pääsivät vapaasti kulkemaan automaatille ja kone suoritti lypsyn. Navetta 1 sijoittui nautamäärältään kahden muun navetan väliin.
Pölykeräykset suoritettiin sekä passiivisella että aktiivisella keräyksellä. Navetoista 1 & 2 pöly kerättiin passiivisella keräyksellä ja navetasta 3 aktiivisella keräyksellä. Passiivisessa keräyksessä pölyä rapsuteltiin pinnoilta, kuten suljettujen ikkunoiden ikkunalaudoilta, pöydiltä sekä lehmien parreilta petrimaljoille. Passiivisen keräyksen pölyn kokoluokka oli alle 63 µm.
Aktiivisessa keräyksessä käytettiin DGI-keräintä (Dekati gravimeter impactor), joka pumpun
avulla kerää pölyjaoteltua pölyä impaktiotasoille. Tutkimukseen yhdistettiin kolme pienintä tasoa, jolloin pölyn kokoluokka oli alle 50 µm. Keräyksen jälkeen pöly uutettiin pois tasoilta metanolilla. Stimulaatiota varten rapsutetut pölyt luotettiin PBS:llä pitoisuuteen 2 mg/ml ja DGI-keräimellä kerätty pöly liuotettiin 5 % DMSO-liuokseen sekä W153-veteen, jolloin pitoisuudeksi tuli 2 mg/ml.
4.1.3. Altistus
Soluja altistettiin ensin maatilapölylle (50 g/ml) 24 tunnin ajan (+37 °C, 5 % CO2) (Kuva 3).
Annos valittiin pilottikokeen perusteella. Maatilapölyaltistuksen jälkeen soluja altistettiin PBS:sään liuotetuille TLR-ligandeille 6 tai 24 tunnin ajan (+37 °C, 5 % CO2) (Taulukko 1).
Altistusten jälkeen pohjaan kiinnittyneet solut irrotettiin kuoppalevyltä Trypsin-EDTA- liuoksella (Sigma-Aldrich, USA). Viiden minuutin inkuboinnin jälkeen trypsiini inaktivoitiin FBS-liuoksella, solut irroiteltiin pohjasta ja otettiin käsittelyyn toksisuustestejä varten.
Kuva 3. Aikajana altistuksista ja toksisuustesteistä.
Taulukko 1. Yhteenveto toll-like reseptoreista ja ligandeista.
Reseptori Ligandi Annos Toimittaja Ilmentää Vastaa
TLR 3 POLY(I:C) 25 g/ml Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, USA
Kaksijuosteinen RNA
HRV
TLR 4 LPS 0,02 g/ml Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, USA
Endotoksiini Bakteeri TLR 7/8 ORN 0,5 M/ml Miltenyi Biotec,
USA
Yksijuosteinen RNA
RSV
4.2. Toksisuustestit
4.2.1. Metabolinen aktiivisuus
MTT-testi eli (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) -testi mittaa solujen metabolista aktiivisuutta. (Riss ym, 2004) Elävät solut pystyvät metaboloimaan MTT- liuosta formasaaniksi, joka näkyy violettina värinä nesteessä. Testissä kuoppalevylle lisättiin solususpensiota sekä MTT-liuosta (1 mg/ml), jonka jälkeen kuoppalevyä inkuboitiin kaksi tuntia (+37 °C, 5 % CO2). Sen jälkeen kuoppiin lisättiin SDS-bufferia ja levyä inkuboitiin yön yli, jonka jälkeen absorbanssi mitattiin 570 nm aallonpituudella spektrofotometrillä (Synergy H1, Biotek).
4.2.2. Oksidatiivinen stressi
DCF eli 2’,7’-dichlorofluorescein -testi mittaa intrasellulaarista oksidatiivista stressiä. Testissä fluoresoimaton 2’7’-dichlorodihydrofluorescein (DCFH2) hapettuu ROS (Reactive Oxygen Species) avulla herkästi fluoresoivaksi DCF-yhdisteeksi. Fluorensenssia mittaamalla saadaan laskettua intrasellulaarisen oksidatiivisen stressin määrän. (Hoet ym, 2013) Testissä soluille lisättiin DCF-liuosta (0,5 mM, Sigma-Aldrich, USA), jonka jälkeen levy luettiin 485 nm ja 530 nm aallonpituuksilla (Synergy H1™, Biotek®, USA). Sen jälkeen levy laitettiin inkubaattoriin
(+37 °C, 5 % CO2) 30 minuutiksi ja luettiin uudelleen. Tämä toistettiin, jonka jälkeen suoritettiin viimeinen luku (60 min).
4.2.3. Elävyys
Solujen elävyys määritettiin PI-analyysin avulla. PI (Propidium Iodide)-liuos pääsee kuoleviin tai kuolleisiin soluihin, jolloin pystytään määrittämään elävien solujen määrä näytteessä. DCF- analyysissa käytettyyn kuoppalevyyn lisättiin PI-liuosta, jonka jälkeen levyä inkuboitiin huoneenlämmössä 20 minuutin ajan ja luettiin spektrofotometrillä (Synergy H1, Biotek, aallonpituuksilla 540 nm & 620 nm). Sen jälkeen levylle lisättiin Triton X-100-liuosta (Amresco) ja toistettiin 20 minuutin inkubaatio sekä levyn luku spektrofotometrillä.
4.2.4. Sytokiinit
Sytokiinianalyysit tehtiin valmistajien ohjeiden mukaan (eBiosciences Human IFN- Module Set ELISA ja Human IL-6 Uncoated ELISA). Ensimmäisessä vaiheessa analyysilevyn kuoppien pohjaan kiinnitettiin vasta-aine (coating). Seuraavana päivänä epäspesifiset sitoutumispaikat täytettiin (blocking), jonka jälkeen kuoppiin pipetoitiin standardinäytteet ja varsinaiset näytteet. Inkubaation jälkeen levyt pestiin ja kuoppiin lisättiin ensin sekundäärinen vasta-aine ja sen jälkeen HRP-konjugaatti (IL-6) tai suoraan HRP-konjugaatti (IFN-).
Inkubaation jälkeen levy pestiin ja kuoppiin lisättiin substraattiliuosta. Viimeisessä vaiheessa kuoppiin lisättiin lopetusliuosta, ja absorbanssi luettiin spektrofotometrillä (450 nm, Synergy H1™, Biotek®, USA).
4.2.5. Solusykli
Solusyklianalyysiä varten solut fiksattiin 70 % etanolilla ja säilytettiin +4 C asteessa. Analyysiä varten solusyklinäytteet pestiin PBS-liuoksella (1500 rpm, 5 min, +4 C), jonka jälkeen lisättiin RNAase A:ta, jolloin loppupitoisuudeksi tuli 0,15 mg/ml. Näytteitä inkuboitiin tunnin ajan +50
°C, kannella peitettynä. PI-liuoksen lisäyksen jälkeen näytteitä inkuboitiin 30 minuutin ajan
inkubaattorissa (+37 °C, 5 % CO2). Solusyklianalyysissa käytettiin BD FACSCanto II- virtaussytometriä (BD Biosciences, San Diego, USA) ja FACSDiva-ohjelmistoa v.8.0.1 (BD- Biosciences) Solusyklin tulokset analysoitiin FlowJo v.10 (LLC) –ohjelmalla.
4.2.6. Tulosten käsittely
Metabolinen aktiivisuus saatiin kaavalla (1):
𝑀𝑒𝑡𝑎𝑏𝑜𝑙𝑖𝑛𝑒𝑛 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑖𝑣𝑖𝑠𝑢𝑢𝑠 =𝑘𝑎𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘−𝑘𝑜𝑟𝑗𝑎𝑡𝑡𝑢
𝑘𝑎𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑙𝑖 − 𝑘𝑎𝑝ö𝑙𝑦 (1)
missä kablank = blankkikorjattujen arvojen keskiarvo, kakontrolli = kontrollien keskiarvo, kapöly = pölyn keskiarvo
Oksidatiivinen stressi saatiin kaavalla (2):
𝑂𝑘𝑠𝑖𝑑𝑎𝑡𝑖𝑖𝑣𝑖𝑛𝑒𝑛 𝑠𝑡𝑟𝑒𝑠𝑠𝑖 = (15∗𝑘𝑎60𝑚𝑖𝑛)+(30∗𝑘𝑎30𝑚𝑖𝑛)−(45∗𝑘𝑎0𝑚𝑖𝑛)
𝑘𝑎𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑙𝑖 (2)
missä ka60min = keskiarvo, 60 min, ka30min = keskiarvo, 30 min, ka0min = keskiarvo, 0 min, kakontrolli = kontrollien keskiarvo
Elävyys saatiin kaavalla (3):
𝐸𝑙ä𝑣𝑦𝑦𝑠 = 100 − (𝑘𝑎𝑛ä𝑦𝑡𝑒,1.𝑙𝑢𝑘𝑢−𝑘𝑎𝑝ö𝑙𝑦,1.𝑙𝑢𝑘𝑢
𝑘𝑎𝑛ä𝑦𝑡𝑒,2.𝑙𝑢𝑘𝑢−𝑘𝑎𝑝ö𝑙𝑦,2.𝑙𝑢𝑘𝑢) ∗ 100 (3)
missä kanäyte, 1.luku = 1. luvun näytteen keskiarvo, kapöly, 1.luku = 1. luvun pölyn keskiarvo, kanäyte, 2.luku = 2. luvun näytteen keskiarvo, kapöly, 2.luku= 2. luvun pölyn keskiarvo.
Sytokiinien määrä saatiin kertomalla mitattu konsentraatio analyysissa käytetyllä laimennoskertoimella.
Tutkimuksen suorituksessa ilmeni muutamia ongelmia. Navetan 1 pölynäytteellä altistetussa soluviljelmässä kasvoi tuntematonta home- tai hiivarihmastoa. Näyte saatiin analysoitua kuuden tunnin kohdalla, mutta 24 tunnin kohdalla näyte oli täynnä kasvustoa, ja piti jättää analysoimatta. Tutkimuksessa ei haluttu käyttää samaa pölynäytettä uudestaan, joten käyttöön otettiin DGI-keräimellä kerätty pölynäyte. Koska TLR-4-ligandialtistus tehtiin kokonaisuudessaan ensimmäisen kokeen aikana, TLR-4 ligandin ja DGI-pölyn yhteisstimulaation tuloksia ei ole saatavilla. TLR-7/8-ligandi ei ollut saapunut ensimmäisen kokeen alkaessa, joten pölystä 1 ei saatu TLR-7/8-stimulaation tuloksia. IFN--analyysista ei saatu mitattavia tuloksia, sillä kaikki arvot olivat määritysrajan alapuolella. IL-6-analyysissä 13 näytteen konsentraatio ylitti määritysalueen ylimmän pisteen ja niille kaikille annettiin konsentraatioksi suoran ylimmän pisteen arvo.
4.2.7. Tilastolliset menetelmät
Tilastolliset analyysit tehtiin GraphPad Prism v.8 -ohjelmalla. Analyyseissä vertailtiin stimuloituja näytteitä kontrollinäytteisiin, yhteisstimuloituja näytteitä pölyllä stimuloituihin näytteisiin sekä ligandilla stimuloituihin näytteisiin. Tilastolliset analyysit tehtiin yksisuuntaisella ANOVA-testillä, joka oli korjattu Bonferronilla. Tulos oli tilastollisesti merkitsevä, jos p < 0,05.
5. TULOKSET
5.1. Metabolinen aktiivisuus
Pöly- ja yhteisstimulaatiot vähensivät merkittävästi solujen metabolista aktiivisuutta kontrolliin verrattuna. (Kuva 4) Pölystimulaatioiden välillä oli eroja; pölyllä 2 stimuloitujen solujen metabolinen aktiivisuus oli suurempi kuin pölyllä 1. Ligandistimulaatiot eivät merkittävästi muuttaneet solujen metabolista aktiivisuutta kontrolliin verrattuna. Yhteisstimulaatioissa metabolinen aktiivisuus oli alhaista. Pölyllä 3 stimuloidessa metabolinen aktiivisuus yhteisstimulaatiossa ei poikennut pelkän pölyn stimulaatiosta. Myös pölyllä 2 stimuloidessa metabolinen aktiivisuus laski TLR-4-ligandin yhteisstimulaatiossa, verrattuna pelkkään pölyyn 2. Kuitenkin TLR-7/8-ligandistimulaatiossa metabolinen aktiivisuus pölyllä 2 oli lähes kontrollitasolla. Samansuuntaiset tulokset nähtiin myös 24 tunnin stimulaatiossa (Liite 2).
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 3
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 4
Pöly 1 Pöly 2
K, TLR 7/8 Pöly 1
Pöly 2 Pöly 3 0
50 100 150
Metabolinen aktiivisuus 6 h
Metabolinen aktiivisuus (%)
TLR 3 TLR 4 TLR 7/8
Pöly
N/A
****
**
**
****
**** ****
**
Kuva 4. Metabolinen aktiivisuus 6 h ligandialtistuksen jälkeen. Pylväät ovat keskiarvoja, virhepalkit osoittavat keskiarvon keskivirheen. Tulokset on verrattu kontrolliin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun • = p ≤ 0,05, •• = p ≤ 0,01, ••• = p ≤ 0,001, •••• = p ≤ 0,0001.
Yhteisaltistusten tulokset on verrattu saman ligandin pelkällä ligandilla altistettuihin soluihin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01 *** = p ≤ 0,001, **** = p ≤ 0,0001. Yhteisaltistusten tulokset on verrattu saman navetan pelkällä pölyllä altistettuihin soluihin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun = p ≤ 0,05, = p ≤ 0,01 = p ≤ 0,001,
= p ≤ 0,0001. Pöly 1 = Navetta 1, Pöly 2 = Navetta 2, Pöly 3 = DGI-keräimellä kerätty pöly navetasta 3; TLR 3 = POLY:IC, TLR 4 = LPS, TLR 7/8 = ORN. Kuvasta puuttuu TLR-4 ja pöly 3:n yhteisstimulaatio = N/A
5.2. Oksidatiivinen stressi
Oksidatiivisen stressin määrä nousi lähes kaikilla stimuloiduilla soluilla kontrolliin verrattuna (Kuva 5). Pölystimulaatiossa oksidatiivisen stressin määrä nousi eniten pölyllä 3 stimuloiduilla soluilla. Ligandistimulaatiossa TLR-7/8-ligandilla stimuloitujen solujen oksidatiivisen stressin määrä lisääntyi merkittävästi kontrolliin verrattuna. Yhteisstimulaatioissa oksidatiivisen stressin määrä oli pölyn läsnäollessa suurempi ligandien aiheuttamiin vasteisiin verrattuna.
Pölyllä 3 stimuloitaessa oksidatiivisen stressin määrä oli korkein myös yhteisstimulaatiossa.
TLR-7/8-ligandilla oksidatiivisen stressin määrä nousi myös pölyn 2 vaikutuksesta merkittävästi. Oksidatiivisen stressin määrä oli suurempi kaikilla stimuloiduilla soluilla 6 t aikapisteessä verrattuna 24 t aikapisteeseen (Liite 2).
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 3
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 4
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 7/8
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 0
50 100 150
Oksidatiivinen stressi 6 h
Fluoresenssi kontrolliin verrattuna (%)
N/A N/A
Pöly TLR 3 TLR 4 TLR 7/8
***
*
***
*
Kuva 5. Oksidatiivinen stressi 6 h ligandialtistuksen jälkeen. Pylväät ovat keskiarvoja, virhepalkit osoittavat keskiarvon keskivirheen. Tulokset on verrattu kontrolliin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun • = p ≤ 0,05, •• = p ≤ 0,01, ••• = p ≤ 0,001, •••• = p ≤ 0,0001.
Yhteisaltistusten tulokset on verrattu saman ligandin pelkällä ligandilla altistettuihin soluihin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01 *** = p ≤ 0,001, **** = p ≤ 0,0001. Yhteisaltistusten tulokset on verrattu saman navetan pelkällä pölyllä altistettuihin soluihin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun = p ≤ 0,05, = p ≤ 0,01 = p ≤ 0,001,
= p ≤ 0,0001. Pöly 1 = Navetta 1, Pöly 2 = Navetta 2, Pöly 3 = DGI-keräimellä kerätty pöly navetasta 3; TLR 3 = POLY:IC, TLR 4 = LPS, TLR 7/8 = ORN
5.3. Elävyys
Solujen elävyys oli korkeampi pölyjen 2 ja 3 sekä TLR-3 ja TLR-7/8-ligandien yhteisstimulaatioissa kontrolliin verrattuna. (Kuva 6). Pölystimuloitujen solujen välillä ei ollut eroja, kuten ei ollut myöskään ligandistimuloitujen solujen välillä. Yhteisstimuloitujen solujen elävyys oli merkittävästi korkeampi pölyillä 2 ja 3 stimuloitaessa, kuin ligandi- ja pölystimuloiduilla soluilla. 24 tunnin kohdalla vain pölystä 2. saatiin tuloksia (Liite 2). 24 t stimulaatiossa yhteisstimuloitujen solujen elävyys oli korkeampi kuin kaikilla vertailukohteilla.
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 3
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 4
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 7/8
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 0
50 100 150
Elävyys 6 h
Elävyys (%)
N/A N/A N/A N/A
Pöly TLR 3 TLR 4 TLR7/8
** ** * ********
Kuva 6. Solujen elävyys 6 h ligandialtistuksen jälkeen. Pylväät ovat keskiarvoja, virhepalkit osoittavat keskiarvon keskivirheen. Tulokset on verrattu kontrolliin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun • = p ≤ 0,05, •• = p ≤ 0,01, ••• = p ≤ 0,001, •••• = p ≤ 0,0001. Yhteisaltistusten tulokset on verrattu saman ligandin pelkällä ligandilla altistettuihin soluihin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01 *** = p ≤ 0,001, **** = p ≤ 0,0001.
Yhteisaltistusten tulokset on verrattu saman navetan pelkällä pölyllä altistettuihin soluihin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun = p ≤ 0,05, = p ≤ 0,01 = p ≤ 0,001, = p ≤ 0,0001. Pöly 1 = Navetta 1, Pöly 2 = Navetta 2, Pöly 3 = DGI-keräimellä kerätty pöly navetasta 3; TLR 3 = POLY:IC, TLR 4 = LPS, TLR 7/8 = ORN
5.4. Sytokiinit
IL-6-sytokiinin määrä lisääntyi merkittävästi maatilapölyn vaikutuksesta pöly- ja yhteisstimuloiduilla soluilla kontrolliin verrattuna (Kuva 7). Pölystimulaatiossa pölyllä 1 oli suurin sytokiinikonsentraatio. TLR3- ja TLR7/8-ligandeilla stimuloidut solut tuottivat hieman enemmän sytokiinia kuin kontrollisolut. Yhteisstimulaatioissa konsentraatiot olivat lähes samat kuin pölykonsentraatioissa, ainoastaan pölyn 2 sytokiinikonsentraatio oli merkittävästi pienempi TLR-7/8-ligandilla stimuloidessa verrattuna pölystimulaatioon. Niiden yhteisstimulaatio vaikutti merkittävästi, mikä näkyi sytokiinikonsentraation laskuna.
Yhteisstimulaatiossa pölyn vaikutus näkyi kaiken kaikkiaan merkittävänä sytokiinikonsentraation nousuna. 24 t aikapisteessä pölyllä 3 stimuloitujen solujen sytokiinikonsentraatio oli suurempi kuin pölyllä 2 stimuloiduilla soluilla. (Liite 2)
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 3
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 4
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 K, TLR 7/8
Pöly 1 Pöly 2
Pöly 3 0
2000 4000 6000
IL-6 6 h
Konsentraatio (pg/ml)
Pöly TLR 3 TLR 4 TLR 7/8
N/A N/A
********
********
****
**
****
Kuva 7. IL-6-sytokiinikonsetraatio 6 h ligandialtistuksen jälkeen. Pylväät ovat keskiarvoja, virhepalkit osoittavat keskiarvon keskivirheen. Tulokset on verrattu kontrolliin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun • = p ≤ 0,05, •• = p ≤ 0,01, ••• = p ≤ 0,001, •••• = p ≤ 0,0001.
Yhteisaltistusten tulokset on verrattu saman ligandin pelkällä ligandilla altistettuihin soluihin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01 *** = p ≤ 0,001, **** = p ≤ 0,0001. Yhteisaltistusten tulokset on verrattu saman navetan pelkällä pölyllä altistettuihin soluihin, tulos on tilastollisesti merkittävä, kun = p ≤ 0,05, = p ≤ 0,01 = p ≤ 0,001,
= p ≤ 0,0001. Pöly 1 = Navetta 1, Pöly 2 = Navetta 2, Pöly 3 = DGI-keräimellä kerätty pöly navetasta 3; TLR 3 = POLY:IC, TLR 4 = LPS, TLR 7/8 = ORN
5.5. Solusykli
Pöly vaikutti stimuloitujen solujen solusykliin (Kuva 8). Ligandistimulaatiossa SubG0/G1- vaiheessa eli apoptoosivaiheessa tulokset eivät poikenneet kontrollista eikä toisistaan.
Keskimäärin pöly- ja yhteisstimulaatioiden tulokset eivät poikenneet kontrollista, paitsi pölyn 3 tulokset pöly- ja yhteisstimulaatioissa olivat merkittävästi korkeampia kontrolliin ja muihin pöly- ja yhteisstimulaatiotuloksiin verrattuna (Kuva 8A). Lähes kaikkien G1/G0-vaiheessa eli lepo- ja kasvuvaiheessa olevien solujen tulokset olivat merkittäviä kontrolliin verrattuna (Kuva 8B). Pölystimulaatioissa tulokset olivat korkeampia kuin kontrollilla. Ligandistimulaatiossa taas tulokset olivat alle kontrollin. Pölyn vaikutus näkyi yhteisstimulaatiossa, sillä kaikkien yhteisstimuloitujen solujen tulokset olivat ligandistimulaatioita suurempia. Pölyn 3 vaikutus oli yhteisstimulaatioissa suurin, pölyn 2 pienin. S-G2/M-vaiheessa, eli solun siirtyessä replikaatiosta jakautumiseen, pöly- ja yhteisstimulaation soluja oli vähemmän kuin ligandistimulaation soluja (Kuva 8C). Pölystimulaatioissa tulokset ovat merkittävästi kontrollia pienemmät, kun taas ligandistimulaatioissa tulokset ovat kontrollin mukaiset.
Yhteisstimulaatioissa pölyn vaikutus näkyi, sillä lähes kaikki tulokset olivat alle kontrollin.
Suurin vaikutus näkyi pölyllä 3 stimuloitaessa, pienin pölyllä 2.
