Makromolekyylisynteesin seuranta kasveissa, kasvisoluissa ja protoplasteissa

KEMIAN OSASTO

TEIJA AARNIO

MAKROMOLEKYYLISYNTEESIEN SEURANTA KASVEISSA, KASVISOLUISSA JA PROTOPLASTEISSA

Diplomityö, joka on jätetty opinnäytteenä tarkastettavaksi diplomi-insinöörin tutkintoa varten Espoossa 9.12.1985

Työn valvojat:

Vt. professori Pertti Markkanen

Työn ohjaajat:

TkL Leena Mannonen

FT Marja-Leena Niku-Paavola

Tämän diplomityön tutkimusosa on tehty Valtion teknillisen tutkimus­

keskuksen Biotekniikan laboratoriossa 23.5. ... 31.10.1985 välisenä aikana.

Esitän parhaat kiitokseni työtäni valvoneelle tutkimusprofessori Veli Kauppiselle sekä työni tarkistaneelle vt. professori Pertti Markkaselle.

Haluan kiittää työni ohjaajia TkL Leena Mannosta ja FT Marja-Leena Niku-Paavolaa saamastani asiantuntevasta ohjauksesta. Lisäksi kiitän laboratorion työntekijöitä viihtyisästä työympäristöstä sekä kaikkia niitä henkilöitä, jotka ovat kannustaneet ja tukeneet työtäni.

"Harjoittelu merkitsee kaikkea. Persikka oli muinoin kitkerä manteli eikä kukkakaali ole kuin kaali, jolla on oppikoulusivistystä." -Mark Twain

Espoossa joulukuun 9. päivänä 1985.

Teija Aarnio

Tekijä ja lyön nimi : Teija Aarnio

Makromolekyylisynteesien seuranta kasveissa, kasvisoluissa ja protoplasteissa

Päivämäärä : 9.12.1985 Sivumäärä : 75

Osasin :

Kemian osasto Työn valvoja :

Vt. professori Pertti Markkanen Tutkimusprofessori Veli Kauppinen Työn ohjaaja :

TkL Leena Mannonen

FT Maria-Leena Niku-Paavola

Työn tarkoituksena oli seurata DNA-, RNA- ja proteiinisynteesejä Digitalis lanata-kasvin soluissa ja taimissa sekä niistä eriste­

tyissä protoplasteissa sekä tutkia protoplastien jakautumisen ja makromolekyylisynteesien välisiä vuorovaikutuksia.

Kirjallisuusosassa on tarkasteltu makromolekyylisynteesien teoriaa sekä seurantamenetelmiä. Tutkimusosassa kehitettiin seurantamene­

telmä, joka perustuu radioaktiivisten nukleosidien tai aminohappojen liittymiseen tutkittavaan makromolekyyliin. Radioaktiivisella

hiilellä (l^C) leimattuja tymidiiniä, uridiiniä ja leusiinia käytet­

tiin DNA-, RNA- ja proteiinisynteesin seurannassa. Tutkittavan materiaalin ottama kokonaisradioaktiivisuus ja makromolekyyleihin liittynyt radioaktiivisuus määritettiin nestetuikelaskentaan perus­

tuvalla suodatinpaperimenetelmällä.

Solujen, taimien ja protoplastien makromolekyylisynteesejä seurat­

tiin 3, 25 ja 28 vuorokautta. Kasvatuksen päätyttyä määritettiin tutkittavan materiaalin ottama kokonaisradioaktiivisuus ja makro­

molekyyleihin liittynyt radioaktiivisuus. Solujen ja protoplastien makromolekyyleihin oli liittynyt lähes 90 % otetusta radioaktiivi­

suudesta. Taimikokeissa liittyneen radioaktiivisuuden osuus kasvoi, kun taimet vanhenivat.

Käytetyllä menetelmällä saatiin karkea kuva kasvimateriaalin makro­

molekyyli synteeseistä. Kasvatusalustan radioaktiivisuuden muutos ei kuvaa suoraan makromolekyylisynteesejä, koska leimattujen nukleo­

sidien ja aminohappojen jakaantumista solunsisäisten poolien välillä ei tunneta. Jakautuvien ja jakautumattornien protoplastien radio­

aktiivisuuksissa ei havaittu selvää eroa.

Professuuri : 5.30 Biokemia

Author and name of the thesis : Teija Aarnio

A Study of Macromolecular Syntheses in Plants, Plant Cells, and Protoplasts

Date: 9.12.1985 Number of pages : 75

Department : Professorship :

Department of Chemistry 5.30 Biochemistry Supervisor :

Acting Professor Pertti Markkanen Research Professor Veli Kauppinen Instructor :

Lis.Techn. Leena Mannonen

Subst. Assoc. Professor Maria-Leena Niku-Paavola

The purpose of this work was to monitore DNA-, RNA- and protein syntheses in cells and seedlings of Digitalis lanata and in protoplasts isolated from them.

In the literature survey the theory of the synthesis of macro­

molecules is briefly presented and the methods of studying

macromolecular syntheses are reviewed. In the experimental part of the study a method of monitoring macromolecular syntheses was

developed. The method is based on the incorporation of a radioactive precursor into the macromolecule. Carbon-labelled

thymidine, uridine, and leucine were used to monitore DNA-, RNA- and protein synthesis, respectively. The radioactivity taken up from the medium and that incorporated into macromolecules was measured with a filter paper disc method based on liquid scintillation counting.

Macromolecular syntheses in cells, seedlings, and protoplasts were monitored for 3, 25 and 28 days, respectively. At the end of the

incubation the uptaken and incorporated radioactivities were determined. About 90 % of the uptaken radioactivity was

incorporated into the macromolecules of cells and protoplasts. In seedlings the fraction of the incorporated radioactivity increased as the seedlings grew older.

Macromolecular syntheses can be roughly monitored with the method developed. The change of the radioactivity of the medium during incubation does not, however, exactly reflect the macromolecular syntheses, because the compartmentalization of the labelled precursors within the intracellular metabolic pools is unknown.

Differences between the radioactivities of dividing and non-dividing protoplasts were not registered.

JOHDANTO . 1

KIRJALLISÜUSOSA 2

1. MAKROMOLEKYYLISYNTEESIT 2

1.1. Nukleiinihapot 2

1.2. Proteiinit 4

2. MAKROMOLEKYYLISYNTEESIEN SEURANTAMENETELMIÄ 6

2.1. Radiokemialliset menetelmät 6

2.1.1. Leimausmenetelmät 7

2.1.2. Nestetuikelaskenta 9

2.1.3. Suodatinpaperimenetelmä 11

2.2. Kemialliset menetelmät 12

2.2.1. Nukleiinihapot 12

2.2.2. Proteiinit 17

2.3. HiBiokemialliset menetelmät 19

2.4. Muita menetelmiä 20

TUTKIMUSOSA

3. MATERIAALIT JA MENETELMÄT 22

3.1. Kasvatusalustat, liuokset ja kemikaalit 22

3.2. Solususpension kasvatus 23

3.3. Taimien kasvatus 23

3.4. Solususpensioprotoplastien eristäminen ja viljely 23 3.5. Mesofylliprotoplastien eristäminen ja viljely 24 3.6. Syntetoitujen makromolekyylien leimaus 24

3.7. Radioaktiivisuusmääritykset 25

3.8. Lehtivihreän aiheuttama värisammutus ja sen korjaus

taiminäytteissä 28

4.1. Eslkokeet solususpensiolla 29

4.2. Taimien kasvatus 30

4.3. Radioaktiivisuusmääritykset 33

4.3.1. Solujen makromolekyylisynteesit 34 4.3.2. Taimien makromolekyylisynteesit 36 4.3.3. Solususpensioprotoplastien makromolekyylisynteesit 40 4.3.4. Mesofylliprotoplastien makromolekyylisynteesit 44

5. TULOSTEN TARKASTELU 48

5.1. Solujen makromolekyylisynteesit 48

5.2. Taimien makromolekyylisynteesit 48

5.3. Solususpensioprotoplastien makromolekyylisynteesit 49 5.4. Mesofylliprotoplastien makromolekyylisynteesit 51

5.5. Protoplastien jakautuminen 53

6. YHTEENVETO 56

7. KIRJALLISUUSLUETTELO 61

LIITTEET

Liite 1. Kasvatusalustat ja liuokset Liite 2. Siementen pintasterilointi

Liite 3. Solususpensioprotoplastien eristäminen ja viljely Liite 4. Mesofylliprotoplastien eristäminen ja viljely Liite 5. Solususpension radioaktiivisuusmääritykset Liite 6. Taimien radioaktiivisuusmääritykset

Liite 7. Protoplastien radioaktiivisuusmääritykset Liite 8. Taimien radioaktiivisuus

JOHDANTO

DNA (deoksiribonukleiinihappo), RNA (ribonukleiinihappo) ja proteiinit ovat makromolekyylejä, joihin solun elinkyky perustuu. Makromolekyylien

synteesit liittyvät toisiinsa seuraavasti:

replikaatio DNA

transkriptio translaatio

RNA --- — PROTEIINI

Jos yksikin makromolekyyleistä vahingoittuu tai sen synteesi lakkaa, solu kuolee.

Tätä työtä edelsivät kasvisoluista ja taimista eristetyillä protoplas- teilla tehdyt tutkimukset, joissa protoplastit eivät jakautuneet. Syitä protoplastien jakautumiskyvyn menetykseen ei tunneta. Hahnen ja Hoffmannin (1984) mukaan jakautuvissa protoplasteissa soluliman järjestyminen normali­

soituu. Jakautumattornissa protoplasteissa mikrotubulien polymerisaatio on estynyt. Mikrotubulit ovat hentoja putkimaisia proteiinimuodostelmiä, jotka muodostavat sukkularihmaston tumanjakautumisessa. Ne sijaitsevat solulimassa soluseinän lähellä ja vaikuttavat mm. selluloosan polymerisaa- tioon ja säikeitten järjestykseen. Solun DNA on myös eri vaiheissa proto­

plastien eristämishetkellä. Jos DNA on juuri kahdentunut, protoplastit saattavat jakautua kerran eristämisen jälkeen. Raon ja Michaylukin (1975) käsityksen mukaan protoplastien solukalvo vahingoittuu entsyymikäsittelyn aikana. Solun elinkyvylle välttämättömät pienimolekyyliset yhdisteet eivät pysy protoplastissa, joten kasvatusalustan on oltava mahdollisimman

täydellinen.

Tämän työn tarkoituksena oli kehittää radioaktiivinen leimausmenetelmä, jolla voidaan seurata protoplastien sekä niiden lähtömateriaalin, solujen ja taimien, makromolekyylisynteesejä. Kehitetyn menetelmän avulla halut­

tiin tutkia protoplastien jakau tumis kyvy11 ömyyden ja makromolekyylisyntee- sien välistä vuorovaikutusta.

Kirjallisuusosassa tarkastellaan makromolekyylisynteesien teoriaa ja

seurantamenetelmiä. Tutkimusosassa tutkittiin kasvimateriaalien makromole­

kyylisynteese jä kehitetyllä suodatinpaperimenetelmällä.

KIRJALLISUUSOSA

1. MAKROMOLEKYYLISYNTEE SIT

Tässä työssä makromolekyylit tarkoittavat nukleiinihappoja ja proteiineja.

Makromolekyylit ja niiden synteesit on esitetty yksinkertaistettuina siten, että seurantamenetelmien periaatteet käyvät ilmi.

1.1. Nukleiinihapot

DNA ja RNA ovat makromolekyylejä, joiden rakenneyksiköinä ovat nukleotidit.

Nukleotidi koostuu puriiniemäksestä (adeniini ja guaniini) tai pyrimldiini- emäksestä [sytosiini, tyrniini (DNA), urasiili (RNA)], riboosi (RNA) - tai deoksiriboosi (DNA)-sokerista ja epäorgaanisesta fosfaatista. Forsfori- happo yhdistää nukleosidit toisiinsa 3',5'-diesterisidoksella. Kuvassa 1 on esitetty DNA:n ja RNA:n rakenne.

a

Kuva 1. (a) DNA:n ja (b) RNA:n rakenne (Richter, 1982).

DNA sijaitsee kasvisolun tumassa ja RNA solulimassa. Nukleiinihappoja esiintyy lisäksi mitokondrioissa ja kloroplasteissa (Erkama, 1974; Richter, 1982).

DNA kahdentuu semikonservatilvisesti (kuva 2). DNA;n kaksoiskierre avautuu, jolloin mukleotidit liittyvät vanhan säikeen vastakkaisiin emäksiin vetysldoksálla (Bryant, 1982; Richter, 1982).

kasvusuunta kasvusuunta

Kuva_2. DNA:n kahdentuminen semikonservatilvisesti (Stanier et ai., 1983).

RNA syntetoituu tumajyväsessä. DNA:n kaksoiskierre avautuu, ja sen emäs- järjestys kopioituu vastakkaisena muodostuvaan RNA:han. Muodostuneita makromolekyylejä muokataan, jolloin mRNA (lähetti-RNA), rRNA(ribosomi-RNA) ja tRNA (silrtäjä-RNA) muodostuvat. Eri RNA-lajit kuljetetaan solulimaan, jossa ne osallistuvat proteiinisynteesiin (Dyer ja Leaver, 1982; Grierson, 1982).

Nukleotidit ja syntetoituneet nukleiinihapot hajoavat nukleosideiksi sekä vapaiksi puriini- ja pyrimidiiniemäksiksi. Hajoamistuotteita sekä solun ulkopuolisia nukleosideja ja emäksiä voidaan käyttää nukleotidisynteeseissä (salvage reactions, engl.) (Ashihara et al., 1981; Ross, 1981; Wasternack, 1982).

Ross (1981) jakaa reaktiot kolmeen ryhmään. Emäs voidaan muuttaa suoraan nukleotidiksi pyrofosforylaasin katalysoimassa reaktiossa. Nukleosidi- fosforylaasit katalysoivat reaktiota, jossa nukleosidi muodostuu emäksestä.

Nukleosidin ja ATP: n (adenosiini 5'-trifosfaatti) välisessä reaktiossa muodostuu nukleotidi ja ADP (adenosiini 5'-difosfaatti) vapautuu. Nukleo- sidikinaasit katalysoivat reaktiota.

L.2. Proteiinit

Proteiinien rakenneyksikköinä on noin 20 aminohappoa, jotka liittyvät toi- siinsa kovalenttisesti peptidisidoksella (-CO-NH-) (Richter, 1982).

AA,

I

AA,

AA4

o -

tRNA4

AA,

I

AA, AA,

AA«O

peptidyylin siirto

AA,

I

AA,

I

AA,

AA.

AA,

I

AA,

antikodoni 5

Kuva_3. Peptidiketjun piteneminen. Aminohapot (AA) on numeroitu liitty- misjärjestyksessä. Numeroidut kolmikot kuvaavat kodoneja mRNA- molekyyIissä. Yksityiskohdat on selitetty tekstissä

(Stanier et ai., 1983).

Kuvassa 3 on esitetty varsinainen proteiinisynteesi. Tunnistusvaiheessa aminoasyyli-tRNA kiinnittyy aminoasyylipaikalle (A-paikka), kun tRNA

tunnistaa antikodinille vastakkaisen mRNA:n emäsjärjestyksen. Peptidyylin siirtoreaktiossa peptidyylipaikalla (P-paikka) oleva peptidi siirtyy

А-paikalle. Aminohappojen välille muodostuu peptidisidos. Translokaatio- vaiheessa А-paikka vapautuu ja tRNA vapautuu P-paikalta (Weeks, 1981;

Marcus, 1982).

Kuvassa 4 on esitetty DNA-, RNA- ja proteiinisynteesien välinen vuorovaikutus.

Kaksisäikeinen

Q

DN А-molekyyli Ü Repli- Q Uusi

¡j

mRNA rRN A tRNA

1 Kiinnittyminen 'aminohappoihin (aa

Syntetoitunut proteiini Proteiinit

Translaatio /xu mRNA

Ribosomi

Kuva 4. DNA-, RNA- ja proteiinisynteesien välinen vuorovaikutus (Stanier et ai., 1983).

2. MAKROMOLEKYYLISYNTEESIEN SEURANTAMENETELMIÄ

Tässä katsauksessa on käsitelty menetelmiä, joita on yleisesti käytetty erilaisten kasvimateriaalien makromolekyylisynteesien seurannassa. Tutkit­

tava kasvimateriaali ja tulosten tarkkuusvaatimukset vaikuttavat seuranta­

menetelmän valintaan. Uusia molekyylibiologiassa käytettäviä menetelmiä ei ole tarkasteltu, koska niitä ei ole käytetty kasvien tutkimuksessa.

Radiokemiallisilla menetelmillä seurataan radioaktiivisten nukleosidien ja aminohappojen liittymistä makromolekyyliin. Synteesinopeus voidaan

arvioida liittymisnopeuden avulla. Syntetoituneet makromolekyylit voidaan määrittää määrällisesti kemiallisilla menetelmillä ja laadullisesti histo- kemiallisilla menetelmillä (Yeoman ja Aitchison, 1976; Street, 1977; Yeoman ja Macleod, 1977).

2.1. Radiokemialliset menetelmät

Radiokemialliset menetelmät ovat herkkiä Verrattuina kemiallisiin menetel­

miin (taulukko 1). Niiden avulla atomeja voidaan leimata molekyylien kemiallisten ominaisuuksien muuttumatta. Lisäksi niitä voidaan käyttää elävien organismien tutkimisessa (Cooper, 1977; Goulding, 1979).

Taulukko 1. Analyyttisten menetelmien herkkyyksiä (Cooper, 1977).

Analyyttinen herkkyystäja

menetelmä

spektrofotometria 10 *5 molekyyliä radiokemia

19C 10 *^atomia

3H 109 atomia

3 2p 10^ atomia

Isotoopit ovat alkuaineen eri muotoja, joiden ytimen neutronien lukumäärä vaihtelee. Pysymättömät isotoopit hajoavat itsestään toisiksi alkuaineik­

si. Ilmiö on tilastollinen. Radioaktiivinen säteily on hiukkas- tai aalto säteilyä. Tärkeimmät säteilylajit ovat alfa- ja beetahajoaminen sekä gamma säteily (Paakkola, 1970; Marttila, 1984).

Ainoastaan beetasäteilijöitä on käytetty kasvien makromolekyylisynteesien seurannassa. Syntyneen radioaktiivisuuden määrä voidaan mitata erityis- rakenteisella Geiger-Müller -putkella, valokuvausemulsloilla (autoradio- grafia) ja tuikelaskijalla (Cooper, 1977). Nestetuikelaskenta soveltuu hyvin biologisiin radioaktiivisuusmäärityksiin, minkä vuoksi sitä käsitel­

lään yksityiskohtaisesti. Autoradiograflaa tarkastellaan kohdassa 2.3.

Histokemialliset menetelmät.

2.1.1. Leimausmenetelmät

Beetahiukkaset ovat negatiivisesti varattuja elektroneja, jotka lähtevät atomiytimestä suurella nopeudella. Biologisissa tutkimuksissa käytettävien beetasäteilijoiden maksimienergiat ovat alhaiset (Paakkola, 1970; Goulding, 1979). Kasvien makromolekyylisynteesejä on seurattu seuraavilla leimoilla [suluissa on ilmoitettu niiden puoliintumisajät Gouldingin (1979) mukaan ]:

3H (12,26 a), 14C (5730 a), 32P (14,30 d) ja 35S (87,90 d).

Leimattavien solujen on oltava vakiotilassa leimauksen aikana, jolloin havaitut muutokset kuvaavat solun aineenvaihduntaa (Cooper, 1977). Jos radioaktiivisen leiman spesifinen radioaktiivisuus on liian korkea, säteily vahingoittaa solun aineenvaihduntaa. Lisäksi radioaktiivisen leiman on liityttävä ainoastaan tutkittavaan makromolekyyliin (Yeoman ja Macleod, 1977; Goulding, 1979). Deng ja Ives (1972) sekä Schwarz ja Haber (1973) ovat osoittaneet, että radioaktiivinen tymidiini fosforyloidaan dTTPrksi (deoksitymidiinitrifosfaatti) nukleosidifosfotransferaasin katalysoimassa reaktiossa. Fosforyloitunut tymidiini liittyy DNA:han. Cox et al:n (1973) mukaan uridiinikinaasi katalysoi reaktiota, jossa radioaktiivinen uridiini

fosforyloituu 5'-UMP:ksi (uridiinimonofosfaatti), joka fosforyloituu edelleen 5'-UTP:ksi (uridilnitrifosfaatti). Osa UTP:stä muuttuu CTP:ksl (sytidilnitrifosfaattl). Sekä UTP että CTP osallistuvat RNA-synteesiin.

Weidner ja Ziemens (1975) havaitsivat, että radioaktiivinen leusiini

soveltuu hyvin proteiinisynteesin seurantaan. Leusiini liittyy nopeasti ja spesifisesti proteiiniin. Vain pieni osa leusiinin hiiliatomeista vapautuu hengityksessä hiilidioksidina. Lisäksi leusiini ei muutu muiksi amino­

hapoiksi tai liity liukenemattomiin hiilihydraatteihin (Joy ja Pokes, 1965;

Larson ja Beevers, 1965). Liittymisen lag—vaihe on lyhyt, koska leusiinin aineenvaihduntapooli on pieni (Oaks, 1965).

Cox et al:n (1974) mukaan solun ulkopuolisen leiman kulkeutuminen solun sisälle, leiman tai sen johdannaisten jakaantuminen aineenvaihduntapoolien sisällä sekä poolien ja makromolekyylikierron (turnover, engl.) välinen vuorovaikutus vaikuttavat tulosten tarkkuuteen. Kasvatusalustan radio­

aktiivisuuden väheneminen ei siis kuvaa tarkasti leiman liittymistä makro­

molekyyliin. Yeoman ja Macleod (1977) korostavat, että luotettavia tulok­

sia saadaan mittaamalla solun sisäisten poolien radioaktiivisuus.

Dawesin (1956) mukaan tulosten tarkastelussa oletetaan yleisesti, että tutkittavien radioaktiivisten nukleosidien tai aminohappojen liittymis- ja hajoamisnopeudet ovat yhtä suuret ja että solu liittää niitä sattuman­

varaisesti makromolekyyleihin.

Pulssileimauksessa (pulse labeling, engl.) makromolekyyliin liitetään lyhyen leimauksen aikana nukleosideja tai aminohappoja, joiden spesifinen radioaktiivisuus on korkea. Leimattavan makromolekyylin puoliintumisaika määrittelee leimausajan. Pulssileimaus edellyttää, että tutkittava makro­

molekyyli syntetoituu sekä ennen leimausta että sen jälkeen ja että ainoastaan leimauksen aikana syntetoituneet makromolekyylin päät ovat

radioaktiivisia. Cooperin (1977) mukaan pulssileimaus kuvaa makromolekyylin synteesinopeutta. Street (1979) huomauttaa kuitenkin, että tulokset

kuvaavat nukleosidien tai aminohappojen kulkeutumisnopeutta solun sisälle ja leimaamattornien poolien kokoa synteesinopeuden lisäksi.

Tasapainoleimauksessa (equilibrium labeling, engl.) käytetään pitkää lei- mausaikaa ja nukleosideja tai aminohappoja, joiden spesifinen radioaktiivi­

suus on matala. Tasapainoleimaus edellyttää, että tutkittavan synteesin leimaus aloitetaan vasta, kun poolien spesifinen radioaktiivisuus on vakio, ja että leima jakaantuu tasaisesti syntetoituvaan molekyyliin. Jos poolit eivät saavuta tasapainotilaa ennen varsinaista leimausta, makromolekyylin spesifinen radioaktiivisuus vaihtelee kokeen lopetusajankohdan mukaan.

Cooperin (1977) mukaan tasapainoleimaus kuvaa makromolekyylin syntetoitu- mista.

Pulssi- ja tasapainoleimauksessa oletetaan yleisesti, että tutkittavan makromolekyylin hajoamisnopeus on nolla (Cooper, 1977).

Pulssi-laimennusleimauksessa (pulse—chase labeling, engl.) makromolekyylejä leimataan lyhyt aika nukleosideilla tai aminohapoilla, joiden spesifinen radioaktiivisuus on korkea. Leimauksen jälkeen radioaktiiviset nukleosidit tai aminohapot poistetaan tai laimennetaan 500- ... 1000-kertaisesti

nukleosideilla tai aminohapoilla, jotka eivät ole radioaktiivisia.

Näytteet otetaan eri aikoina leimauksen aloituksen jälkeen. Cooperin (1977) mukaan pulssi-laimennusleimaus soveltuu nukleosidin tai aminohapon ja makromolekyylin välisen vuorovaikutuksen tutkimiseen.

2.1.2. Nestetuikelaskenta

Nestetuikelaskennassa näytteestä vapautuvat beetahiukkaset törmäävät neste- tuikeaineeseen, joka sisältää pienen määrän aromaattista tuikeainetta

liuotettuna orgaaniseen liuottimeen. Beetahiukkasten energia virittää liuotinmolekyylit, jotka luovuttavat energiaa primääriselle tuikeaineelle (primary fluor, engl.). Muodostuneen valon aallonpituus on tavallisesti liian lyhyt, joten nestetuikeaineeseen lisätään sekundääristä tuikeainetta (secondary fluor, engl.). Se siirtää valon aallonpituuden valomonistimen herkkyysalueelle (Goulding, 1979; Rekonen, 1984).

Aromaattisia hiilivetyjä, etenkin tolueenia ja p—ksyleeniä, käytetään orgaanisina liuottimina. Niillä voidaan mitata ainoastaan rasvaliukoisia näytteitä (Rekonen, 1984). Vesipitoiset näytteet liuotetaan tavallisesti

p-dioksaaniin (Bray, 1960). Hall ja Cocking (1965) käyttivät lisäliuotin- aineita (hyamiinihydroksidi, kvaternääriset ammoniumemäkset), joilla

liuotetaan vaikeasti liukenevia kuivia näytteitä. Hansen ja Bush (1967) osoittivat, että veden käyttö lisää liukenevan kuivan näytteen määrää, lyhentää liuotusaikaa ja parantaa laskentatehokkuutta.

Käytetyin primäärinen tuikeaine on PPO (2,5-difenyylioksatsoli). Yleisim­

mät sekundääriset tuikeaineet ovat P0P0P [l,4-bis-2-(5-fenyylioksatsolyl)- bentseeni], dimetyyli-POPOP ja bis-MSB [p-bis~(o-metyylistyryl)-bentseeni ] (Cooper, 1977; Goulding, 1979; Pekonen, 1984).

Mitattujen tuikahduksien lukumäärä on teoreettisesti yhtä suuri kuin näyt­

teen ytimien hajoamisten lukumäärä mittauksen aikana. Mittaustulokset sisältävät kuitenkin tuikahduksia, jotka eivät ole peräisin näytteestä (tausta, kemiluminisenssi, fosforesenssi). Kaikkia näytteen ytimen hajoa­

misia ei myöskään havaita (sammutus!lmiöt) (Pekonen, 1984).

Taustatuikahduksia aiheuttavat laitteiston sähköiset ilmiöt ja varsinainen taustasäteily eli luonnollinen radioaktiivisuus. Kemiluminisenssi syntyy nestetuikeaineen, näytteen ja lisäaineiden välisissä kemiallisissa reak­

tioissa. Monet aineet lähettävät valoa, jos ne ovat aktivoituneet valossa.

Ilmiötä kutsutaan fosforesenssiksi (Pekonen, 1984).

Sammutusilmiöt estävät ja vähentävät energiansiirtoa. Tällöin valoenergia beetahiukkasta kohden vähenee ja hiukkanen jää havaitsematta. Seurauksena mittaustehokkuus heikkenee. Kemiallisessa sammutuksessa energia ei siirry liuottimesta primääriselle tuikeaineelle, vaan epäpuhtauksiin, näyteliuok- seen tai nestetuikeaineen lisäaineisiin (Neavy ja Budd, 1970). Myös

mitattava näyte voi olla voimakas kemiallinen sammuttaja (itseissammutus) (Pekonen, 1984). Likaiset, naarmuiset tuikepullon seinämät ja epätasainen, samea liuos aiheuttavat optista sammutusta (Goulding, 1979; Pekonen, 1984).

Värillinen näyteliuos pidättää osan syntyneestä valosta (värisammutus) (Neavy ja Budd, 1970; Goulding, 1979; Pekonen, 1984). Sammutuksen aiheut­

tama virhe voidaan korjata sisäisen ja ulkoisen standardin menetelmällä sekä kanavasuhdemenetelmällä (Pekonen, 1984). Liuoksen väri voidaan myös poistaa aktiivihiilellä (Bray, 1960) tai orgaanisella liuottimella kuten asetonilla (Kawashima ja Tamaki, 1967), etanolilla (Osborne, 1962) sekä vety- ja bentsoyyliperoksidilla (Hansen ja Bush, 1967). Näyte voidaan myös laimentaa (Bray, 1960).

Lisäksi tilavuuden muutokset, radioaktiivisen materiaalin tarttuminen tuikepullon seimämiin sekä näytteen saostuminen ja laskeutuminen tuike- pullon pohjalle vähentävät mittaustehokkuutta (Rekonen, 1984).

Nestetuik.elask.enta on tarkka ja tehokas radioaktiivisuuden mittausmenetel­

mä. Mittaustehokkuus on tavallisesti yli 50 %. Se soveltuu kaikenlaisille näytetyypeille (nesteet, kiinteät aineet, suspensiot, emulsiot, geelit, kromatogrammit), ja näytteen valmistus on yksinkertaista. Lisäksi se sovel­

tuu kaksoisleimattujen näytteiden analysointiin (Goulding, 1979). Kaksois- leimausmenetelmässä käytetään samanaikaisesti kahden eri alkuaineen

isotooppeja, joiden energiaspektrit ovat erilaiset. Menetelmä on erittäin herkkä ja vähentää kokeellisten virheiden vaikutusta (Aikman ja Patterson, 1967; Humphrey ja Davies, 1976; Macnicol, 1983).

2.1.3. Suodatinpaperimenetelmä

Nukleiinihappoihin ja proteiineihin liittynyt radioaktiivisuus voidaan määrittää suodatinpaperimenetelmällä, jonka Mans ja Novelli (1960, 1961b) kehittivät 1960-luvun alussa. Näyte kerätään suodatinpaperille (Whatman 3MM). Kun näyte on kiinnitetty suodatinpaperiin, radioaktiiviset syntetoi- tuneet makromolekyylit on helppo saostaa upottamalla suodatinpaperi TCA:han (trikloorietikkahappo). Näyte pestään suodattamalla erilaisilla liuoksilla ja siirretään tuikepu11oon mittausta varten. Myös lasikuitusuodatinpaperia (Whatman GF/C) käytetään mittauksissa. Korkea virtausnopeus sekä liuotti­

mien ja korkeiden lämpötilojen kestokyky ovat sen etuja (Trewavas, 1967).

Mansin ja Novellin (1961b) tutkimusten mukaan suodatinpaperi ei aiheuta sammutusta. Loftfield ja Eigner (1960) havaitsivat, että paperin asento aiheuttaa vaihteluja mittaustuloksissa. Vaihtelut voidaan estää, kun paperin muoto on vakio ja se asettuu vaakasuoraan tuikepullon pohjalle (Mans ja Novelli, 1961b). Mitattu radioaktiivisuus on paperille lisätyn radioaktiivisuuden lineaarinen funktio. Makromolekyylin spesifinen radio­

aktiivisuus ja kokonaismäärä sekä näytteen tilavuus eivät vaikuta (Mans ja Novelli, 1961b). Menetelmällä voidaan mitata näytteitä, joiden radioaktii­

visen materiaalin massa on 0,05 mg (kuva 5).

200-

ЮО-

C-leimattu proteiini/mg

Kuva__5. Suodatinpaperimenetelmän herkkyys (Mans ja Novelli, 1961b).

SuodatinpaperimeneCelmä on helppo ja nopea. Tarvittavan leiman ja kasva- tusmateriaalin määrä vähenee, koska näytemäärät ovat pieniä (jopa 100 pl).

Suuria näytemääriä (50 ... 100 kpl) voidaan käsitellä samanaikaisesti, mikä mahdollistaa leiman liittymisen kineettiset tutkimukset. Menetelmä

soveltuu eri radioaktiivisten leimojen mittaukseen (Mans ja Novelli, 1961b;

Byfield ja Scherbaum, 1966; Trewavas, 1967). Lisäksi suodatinpaperi ja siinä oleva näyte voidaan mitata suoraan nestetuikelaskimella (Wang ja Jones, 1959).

2.2. Kemialliset menetelmät

2.2.1. Nukleiinihapot

Kemiallisten menetelmien käyttö edellyttää, että tutkittava materiaali homogenoidaan ennen analysointia. Jotta nukleiinihapot eivät vahingoittui­

si esim. nukleaasien toiminnan tuloksena, materiaali on homogenoitava kylmässä nopeasti ja tehokkaasti. Häiritsevät yhdisteet (lipidit, pigmen­

tit, sokerit, vapaat nukleotidit, epäorgaaninen fosfaatti, orgaaniset fosfaattiyhdisteet) poistetaan happouutolla tai käsittelemllä orgaanisella liuottimena (Voikin ja Cohn, 1954; Hutchison ja Munro, 1961; Munro

ja Fleck, 1966). Nukleiinihapot erotetaan esikäsitellystä materiaalista ennen varsinaista analysointia.

Schmidtin ja Thannhauserin (1945) kehittämä menetelmä (kuva 6) perustuu nukleiinihappojen erilaiseen emäksisyyden kestävyyteen. Happo- ja rasva- liuotinkäsittelyn jälkeen näytettä käsitellään emäksellä. Emäs pilkkoo RNA:n happoliukoisiin osasiin, jolloin DNA jää happoon liukenemattomaksi.

Happolisäyksen jälkeen sakka sisältää DNA:n ja happoliukoinen osa RNA:n pilkkoutumistuotteet. Nukleiinihappojen määrä lasketaan epäorgaanisen fosfaatin perusteella.

Ogurin ja Rosenin (1950) kehittämä menetelmä (kuva 7) perustuu RNA:n liuke­

nemiseen kylmään PCA:han (perkloorihappo) ja DNA:n uuttamiseen kuumalla PCA:lla. Rasvauuton jälkeen pienet, happoliukoiset molekyylit poistetaan kylmällä PCA:11a. Näytettä käsitellään kylmällä PCA:lla RNA:n saostami- seksi. DNA erotetaan kuumalla PCA:11a. Nukleiinihapot määritetään spektrofotometrisesti.

Schneiderin (1945) kehittämässä menetelmässä (kuva 8) materiaali uutetaan kylmällä hapolla ja rasvaliuottimilla kuten Schmidt-Thannhauser -menetel­

mässä. Nukleiinihapot uutetaan samanaikaisesti kuumalla TCA:lla. DNA- ja RNA-maärät analysoidaan spesifisillä sokerireaktioilla (difenyyliamini- reaktio ja orsinolimenetelmä).

Kudos U utto

kylmällä hapolla Happoliukoinen osa

Rasvaliuottimet

Rasvat

Г

Happoliukoinen osa, joka sisältää RNA:n

Emäs- ja happokäsittely

I

Sakka, joka sisäl­

tää DN A:n Kuva 6. Schmidt-Thannhauser -menetelmä (1945).

Rasvauutto

Rasvat Uutto kylmällä 0,2 N PC A :11a

Happoliukoinen osa

Uutto 1 N PCA:lla 18 h *4°Cssa

RNA Uutto kaksi kertaa Q,5 N

PC A :11a 20 min 70°C:ssa

I I

DNA Jäännös

Kuva 7. Ogur-Rosen -menetelmä (1950).

Kudos Uutto

kylmällä hapolla Happoliukoinen

osa Rasvaliuottimet

Rasvat Uutto kuumalla

hapolla

Happouute, joka

sisältää DNA:n ja RNA:n Jäännös

Kuva 8. Schneider -menetelmä (1945).

EPÄORGAANINEN FOSFAATTI

Epäorgaanisen fostaatin määritys perustuu Fisken ja Subbarowin (1925) kehittämään menetelmään. Nukleiinihapon epäorgaaninen fosfaatti vapaute­

taan kuumalla, väkevällä hapolla. Epäorgaaninen fosfaatti reagoi ammonium molybdaatin kanssa happamassa liuoksessa, jolloin muodostuu fosfomolybdaat- tikompleksi. Kun kompleksi pelkistyy, muodostuu sininen väri. Värin

absorbanssi mitataan aallonpituudella 820 nm. Menetelmä on erittäin herkkä (0,5 ... 4 pg P) ja toistettavuus on hyvä (Munro ja Fleck, 1966).

ULTRAVIOLETTIABS0RPTI0

Nukleiinihapot absorboivat voimakkaasti ultraviolettialueella, koska purii- ni~ Ja pyrimidiiniemäksissä on konjugoituja kaksoissidoksia. Maksimiarvo on aallonpituudella 260 nm (Plummer, 1971).

Nukleiinihapot hydrolysoidaan hapolla. Nukleiinihappojen määrä voidaan mitata suoraan näytteestä. Ekstinktiokerroin ei ole vakio, vaan näytteen käsittely, pH ja ionivahvuus vaikuttavat sen suuruuteen (Webb ja Levy, 1958).

Nukleiinihappojen denaturaatio ja/tai hydrolyysi lisäävät ultravioletti­

valon absorbtiota (hypokrominen ilmiö). Lisäksi nukleotidiseokset sekä proteiinit ja peptidit, etenkin aromaattiset aminohapot, aiheuttavat mittausvirheitä (Munro ja Fleck, 1966). Virheitä voidaan vähentää mittaa­

malla näytteet kahdella aallonpituudella (Hutchison ja Munro, 1961).

SPESIFISET SOKERIREAKTIOT / DE0KSIRIB00SI

DNA-pitoisuus voidaan mitata deoksiriboosin ja kysteiinin, indolin, trypto- fäänin, karbatsolin, p-nitrofenyylihydratsiinin tai antronin välisellä reaktiolla (Hutchison ja Munro, 1961). Käytetyin kolorimetrisistä menetel­

mistä on difenyyliaminireaktio (Burton, 1956). Kun DNA:ta käsitellään difenyyliaminilla happamissa olosuhteissa, muodostuu sininen yhdiste, jolla on terävä absorption maksimiarvo aallonpituudella 595 nm. Menetelmä on herkkä. Mitattavan DNA:n määrä voi olla jopa 1...2 pg.

SPESIFISET SOKERIREAKTIOT / RIBOOSI

RNA-pitoisuus voidaan mitata riboosin ja aniliinin, karbatsolin, kysteiinin tai antronin välisellä reaktiolla (Hutchison ja Munro, 1961). Käytetyin kolorimetrisistä menetelmistä on orsinolimenetelmä (Dische ja Schwarz, 1937; Mejbaum, 1939). Riboosi ja deoksiriboosi vapautetaan nukleiiniha­

poista ja muutetaan furfuraaleiksi kuumentamalla väkevän hapon kanssa.

Furfuraalin ja orsinolin välisessä reaktiossa muodostuu vihreitä yhdistei­

tä. Absorbanssi mitataan aallonpituudella 670 nm. Ainoastaan puriini- nukleotidit reagoivat riittävän voimakkaasti. DNA aiheuttaa epätarkkuutta.

Orsinolireaktio ei ole spesifinen, vaan heksoosit, sakkaroosi, polysakka­

ridit, proteiinit, fosfaatit ja TCA häiritsevät mittauksia (Hutchison ja Munro, 1961). Lin ja Schjeide (1969) osoittivat, että menetelmän herk­

kyyttä voidaan lisätä korvaamalla yleiset! katalyyttinä käytetty rauta- kloridi (FeClg) kuparikloridilla (CuCl2*2H20).

FLUOROMETRIA

Fluorometriset menetelmät ovat erittäin tarkkoja. Niitä käytetään DNA-mää- rityksiin silloin, kun näytemäärä on pieni (Munro ja Fleck, 1966). Bayer et al. (1982) kehittivät yksinkertaisen ja herkän DNA-määritysmenetelmän, joka soveltuu erityisesti kasvimateriaalille. DNA ja fluoresoiva väriaine DaPI (4',6'-diamidino-2-fenyyli-indoli) muodostavat fluoresoivan komplek­

sin. Fluoresenssin voimakkuus mitataan aallonpituuksilla 350 nm ja 450 nm.

Pigmenttien ja proteiinien poisto kloroformilla ei häiritse mittausta.

Menetelmällä voidaan määrittää hyvin alhaisia DNA-pitoisuuksia, jopa 5 ng/ml.

KROMATOGRAFIA

Röttgerin ja Fritzin (1962) mukaan kasvimateriaalin hiilihydraatit ja ultraviolettivaloa absorboivat yhdisteet häiritsevät värireaktiota ja

ultraviolettiabsorbtion mittaamista. Jo aikaisemmin Deken-Grenson ja Deken (1959) olivat osoittaneet, että ainoastaan Schmidt-Thannhauser -menetelmä soveltui kasvimateriaalin nukleiinihappomäärityksiin. Smillie ja Krotkov (1960), Fritz ja Röttger (1963), Ingle (1963) sekä Holdgate ja Goodwin

(1965) osoittivat, että luotettavia tuloksia saadaan erottamalla yksityiset nukleotidit ioninvaihtokromatografisesti. Deken-Grenson ja Deken (1959) sekä Smlllie ja Krotkov (1960) käyttivät anioninvaihtopylvästä. Ingle (1963) sekä Holdgate ja Goodwin (1965) havaitsivat kuitenkin, että

menetelmä ei poistanut kaikkia häiritseviä yhdisteitä. He sekä Fritz ja Röttger (1963) käyttivät lyhyttä Dowex-I -pylvästä ja muurahaishappoa mononukleotidien erottamisessa.

Mande11 ja Hershey (1960) kehittivät MAK (metyloitu albumiini-kieselguhr)- pylvään nukleiinihappojen erottamiseksi ja tunnistamiseksi. Pylväs koostuu kielselguhrista ja albumiinista, joka on esteröity metanolilla. Nukleiini­

hapot tarttuvat suolasidoksilla neutraaleista liuoksista pylväsmateri- aaliin, josta ne eluoidaan nukleiinihapolle ominaisella suolapitoisuudella.

Erottuminen perustuu nukleiinihappojen kokoon, emäskoostumukseen ja sekundäärirakenteeseen.

2.2.2. Proteiinit

Ennen varsinaista mittausta proteiinit puhdistetaan. Kasvifysiologiassa käytetään yleisesti Siekevitzin (1952) kehittämää puhdistusmenetelmää.

Proteiinit säestetään 10 % (w/v) TCA:11a. Nukleiinihapot poistetaan suspensoimalla sakka kuumaan 4 % (w/v) TCA:han. Proteiinit säestetään uudelleen 10 % (w/v) TCA:11a ja pestään etanolilla, etanoli-eetteri- kloroformi -seoksella ja eetterillä. Lopuksi proteiinit kuivataan ilmassa.

ВIURET-MENETELMA

Biuret-menetelmä (Gornall et ai., 1949) perustuu emäksisen kuparisulfaatin ja peptidisidos ten väliseen reaktioon, jolloin muodostuu violetti väri.

Värin voimakkuus aallonpituudella 540 nm on verrannollinen proteiinin peptidisidosten lukumäärään. Puskureiden aiheuttamat värireaktiot sekä kupari-ionien pelkistyminen vähentävät mittaustarkkuutta Cooperin (1977) mukaan.

LOWRY-MENETELMÄ

Lowry et al:n (1951) kehittämä proteiinien määritysmenetelmä perustuu biuret-menetelmään. Kupari-proteiini -kompleksi muodostuu emäksisessä liuoksessa (biuret-reaktio) ja pelkistää fosfomolybdeeni-fosfovolframi -reagenssin. Tällöin muodostuu sininen väri, jonka voimakkuus mitataan aallonpituudella 750 nm. Menetelmä on herkkä, koska mitattavan proteiinin määrä voi olla jopa 0,2 pg. Eri proteiinien muodostama väri kuitenkin vaihtelee. Väri ei muutu lineaarisesti proteiinipitoisuuden funktiona.

Hartree (1972) osoitti, että lineaarisuus paranee, kun absorbanssi mitataan aallonpituudella 650 nm. Bensadownin ja Weinsteinin (1976) mukaan häirit­

sevien kemiallisten yhdisteiden vaikutus voidaan estää lisäämällä natrium- deoksikolaattia (125 pg/ml).

NINHYDRIINI-REAKTIO

Yemmin ja Cockingin (1955) kehittämässä mittausmenetelmässä ninhydriini (triketohydriinideenihydraatti) reagoi aminohappojen kanssa. Tällöin muodostuu purppuran punainen yhdiste, jonka absorbanssi mitataan aallon­

pituudella 570 nm. Eri aminohappojen muodostaman värin voimakkuus vaihte­

lee. Proliini ja hydroksiproliini muodostavat keltaisen värin, jonka absorbanssi mitataan aallonpituudella 440 nm.

"BROMUPHENOL BLUE"-MENETELMÄ

Floresin (1978) kehittämä menetelmä perustuu happo-emäs-indikaattori bromofenoli sinisen ja proteiinin väliseen reaktioon happamissa olosuh­

teissa. Muodostuneen sinisen värin voimakkuus mitataan aallonpituudella 610 nm. Menetelmä soveltuu mittauksiin, joissa proteiinimäärä vaihtelee välillä 10...80 pg.

"C00MASSIE BLUE"-MENETELMÄ

Bradford (1976) kehitti nopean ja herkän proteiinien määritysmenetelmän, jossa käytetään Coomassie Brilliant Blue G-250 -väriainetta. Se muodostaa proteiinin kanssa sinisen kompleksin. Absorbanssi mitataan aallonpituu­

della 595 nm. Ainoastaan detergentit häiritsevät mittauksia. Spector (1978) havaitsi, että väriaine—proteiini —kompleksin ekstinktiokerroin oli vakio liuoksissa, joiden proteiinimäärä oli 0,5 ... 50 pg.

2.3. Histokemialliset menetelmät

Väriaineiden tai radioaktiivisen leiman jakaantumista solun sisällä tutki­

taan histokemiallisilla menetelmillä (Anon., 1985). Histokemialliset menetelmät edellyttävät tarkkaa, siistiä työskentelyä ja tehokkaan, solua vahingoittamattoman kiinnitysaineen valintaa (Rogers, 1967). Soluleikkeen on oltava niin ohut, että soluelimet eivät peitä toisiaan (Barlow, 1970).

Rogersin (1967) mukaan soluleikkeen paksuus vaihtelee välillä 1 ... 5 pm.

Värjäysmenetelmässä tutkittavan solun makromolekyylit värjätään spesifi­

sellä väriaineella, joita on esitetty taulukossa 2. Värjäytyneiden makro­

molekyylien lukumäärä ja sijainti solun eri osissa määritetään valomikros—

kooppisesti. Värjäysmenetelmä soveltuu yksittäisten solujen välisten erojen (Yeoman ja Macleod, 1977) ja värjättyjen makromolekyylien aineen­

vaihdunnan (Puite ja Ten Broeke, 1983) tutkimiseen.

Taulukko 2. Makromolekyylejä värjääviä aineita

Makro- Väriaine Viite

molekyyli

DNA Feulgen McLeish ja Sunderland, 1961

Hoechst n:o 33258 Laloue et al., 1980

Hoechst n:o 33342 Puite ja Ten Broeke, 1983 DNA & RNA Azure-B Flax ja Himes, 1952

Gallocyanin Mitchell, 1968

Gallocyanin Chrome-Alum Chen, 1966

Kiefer et al., 1967 Methylene Blue Deitch, 1964

Proteiinit Mercuric Bromophenol Blue Mazia et al., 1953 Dinitrofluorobenzene Lyndon, 1970

Napthol Yellow S Yeoman ja Macleod, 1977

Autoradiografia perustuu radioaktiivisesta näytteestä lähtevien elektronien ja valokuvausemulsion väliseen reaktioon, jolloin hopeahalogenidit pelkis­

tyvät metalliseksi hopeaksi (Freifelder, 1982). Menetelmä soveltuu radio­

aktiivisia nukleosideja ja aminohappoja liittäneiden makromolekyylien paikallistamiseen solun eri osissa (Galli, 1984). Barlowin (1970) mukaan soluleikkeen valmistus ja valotusaika vaikuttavat tulosten tarkkuuteen.

Goulding (1979) totesi, että paksu soluleike ja hajasäteet vähentävät mittaustarkkuutta. Autoradiografia on yksinkertainen ja nopea menetelmä, jossa näytettä ei tarvitse hajottaa.

2.4. Muita menetelmiä

Elektroforeesi on sähköisesti varattujen makromolekyylien liikettä sähkökentässä. Elektroforeettisilla menetelmillä voidaan erottaa molekyylit toisistaan muodon tai varauksen perusteella ja määrittää molekyylilajien pitoisuudet (Freifelder, 1982).

Vyöhyke-elektroforeesissa (zone electrophoresis, engl.) pisara tai ohut kerros näyteliuosta asetetaan puolikiinteälle tai gelatiiniselle aineelle.

Sähkökentässä molekyylit vaeltavat kantaja-aineella. Tarvittava näytemäärä on pieni, ja liuenneiden aineiden erottuminen on täydellistä. Geelin

käyttö kantaja-aineena parantaa nukleiinihappojen ja proteiinien erottu­

mista. Yleisesti käytettyjä geelejä ovat tärkkelys, polyakryyliamidi, agaroosi ja agaroosi-akryyliamidi. Elektroforeettiset menetelmät eivät sovellu määrällisiin mittauksiin, koska kantaja-aineen vaikutusta on mahdotonta arvioida (Freifelder, 1982).

Wu ja Wang (1984) havaitsivat, että kasvisolujen isot vakuolit, jotka sisältävät proteolyyttisiä entsyymejä, fenoliyhdisteitä, pigmenttejä ja tanniineja, häiritsevät proteiinien geelielektroforeettista määritystä. He kehittivät proteiinien eristysmenetelmän, jossa kasvimateriaali jauhetaan kylmässä 10 % (w/v) TCA:ssa ja pestään asetonilla. Tällöin määritystä häiritsevät proteaasit sekä fenolioksidaasit ja —peroksidaasit inaktivoitu—

vat välittömästi, kun ne vapautuvat rikkoutuvan solun vakuoleista. Ibrahim ja Cavia (1975) käyttivät proteiinien eristyksessä natrium dietyyliditio- karbamaattia, joka estää polyfenolioksidaasin toiminnan.

Laemmlin (1970) ja O'Farrelin (1975) kehittämiä geelielektroforeesimenetel- miä käytetään yleisesti kasvifysiologiassa. Laemmli (1970) paransi

akryyliamidigeelielektroforeesin erotuskykyä käyttämällä natrium dodekyyli- sulfaattia, joka hajottaa proteiinit yksittäisiksi polypeptidiketjuiksi.

01 Farrell (1975) kehitti kaksisuuntaisen polyakryyliamidigeelielektro- foreesin proteiinien erottamiseksi. Erottuminen perustuu isoelektriseen pisteeseen (isoelektrinen fokusointi, ensimmäinen ajo) ja molekyylipainoon (natrium dodekyylisulfaatti elektroforeesi, toinen ajo). Menetelmä on erittäin herkkä, koska proteiini, jonka osuus kokonaisproteiinimäärästä on 10 ^... 10 ^ %, pystytään havaitsemaan. Polyakryyliamidigeelielektroforееsi soveltuu lisäksi RNA-molekyylien ja pienten DNA-fragmenttien erottamiseen (Freifelder, 1982).

Uusi tehokas kasvinukleotidien erotus- ja mittausmenetelmä on HPLC (High- Performance Liquid Chromatography, engl.) Niemanin ja Clarkin (1984)

kehittämässä menetelmässä hapan kasviuute kulkee kolmen pylvään läpi, jotka sisältävät huokoista polystyreeniä, veteenliukenematonta polyvinyylipoly- pyrrolidonia ja hiili-selluloosaa (charcoal-cellulose, engl.). Kaksi ensimmäistä pylvästä pidättää aromaattiset yhdisteet. Nukleotidit

tarttuvat kolmannen pylvään hiilen pintaan, josta ne poistetaan ammoniaali—

sella etanolilla. Nukleotidit erotetaan HPLC-anioninvaihtopylväässä. Lyhyt ajoaika, hyvä erotuskyky ja herkkyys ovat menetelmän etuja.

TUTKIMUSOSA

3. MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Työskentely oll aseptista radioaktiivisuusmäärityksiä lukuunottamatta.

Mahdollinen mikrobiologinen kontaminaatio osoitettiin maljakasvatuksilla (perunadekstroosimaljat, kasvatus 7 vuorokautta lämpötilassa +32°C).

Kontaminoituneita näytteitä ei ole huomioitu tuloksissa. Mikro-organismien aiheuttamat mittausvirheet estettiin pakastamalla (~22°C) näytteet tai käsittelemällä ne välittömästi näytteenoton jälkeen.

3.1. Kasvatusalustat, liuokset ja kemikaalit

Työssä käytetyt kasvatusalustat ja liuokset on esitetty liitteessä 1.

Seuraavia leimoja ja tuikenesteitä käytettiin radioaktiivisuus- määrityksissä:

- [metyyli -^Cjtymidiini [50 |iCi/ml (1,85 MBq/ml), spesifinen radioaktii­

visuus 60 mCi/mmol (2,22 GBq/mmol) ] (Amersham)

- [U-*]uridiini [50 |iCi/ml (1,85 MBq/ml), spesifinen radioaktiivisuus 529 mCi/mmol (19,6 GBq/mmol)] (Amersham)

- L-[U-^4Cjleusiini [50 pCi/ml (1,85 MBq/ml), spesifinen radioaktiivisuus 348 mCi/mmol (13,2 GBq/mmol)] (Amersham)

- Lipoluma (ksyleeni) (Lumac)

- Lumasolve (kvaternäärinen ammoniumhydroksidi) (Lumac)

Leimat laimennettiin 20,2 mM tymidiini-, 2,3 mM uridiini- ja 1,9 mM leusiiniliuoksilla.

Perunadekstroosimaljoja (Difco) käytettiin mikrobiologisen kontaminaation osoittamisessa.

Reagenssit olivat pro analysi -laatua ja käytetty vesi oli tislattua.

3.2. Solususpension kasvatus

Kantaa Digitalis lanata 10MSA41 käytettiin esikokeissa ja kantaa Digitalis lanata 10MSA42 varsinaisissa kokeissa. Kanta oli saatu TkL Lars Вjörkiltä (Kungliga Tekniska Högskolan, Stockholm). Soluja kasvatettiin MSI-alus- talla ravistelemalla (100 rpm) huoneenlämmössä pimeässä. Alustan tilavuus oli noin 50 ml. Kannat siirrostettiin kerran viikossa.

3.3. Taimien kasvatus

Digitalis lanata 517 —siemenien (Kieft Blokker, Holland) pintasterilointi on esitetty kaaviona liitteessä 2. Siemeniä idätettiin 6 vuorokautta huoneenlämmössä pimeässä.

Taimet kasvatettiin Piantcon-rasloissa (Flow Laboratories, Inc.). Neste­

mäisen MSO-alustan käyttö esti ravintoainegradienttien muodostumisen radio­

aktiivisissa leimauksissa. Taimet kasvatettiin kelluvalla kehikolla

(90 mm x 90 mm), joka oli valmistettu solumuovista (paksuus 3 mm) (Oy Lohja Ab) ja viiraverkosta (10 lankaa/cm) (Swiss Silk). Solumuovikehys toimi kellukkeena. Taimien juuret kasvoivat viiraverkon reikien läpi. Viira- verkko ommeltiin solumuoviin, jotta kasvatusalustaan ei pääsisi kasvua häiritseviä yhdisteitä. Kehikot steriloitiin etyleenioksidilla (+20°C, 20 h).

Taimia kasvatettiin huoneenlämmössä. Kasvatuksen aikana valojakso kesti 18 tuntia ja pimeäjakso 6 tuntia. Piantcon-rasiässä kasvo! 20 tainta.

Niiden kasvua seurattiin määrittämällä juurettoman taimen tuorepaino ja pituus.

3.4. Solususpensloprotoplastlen eristäminen ja viljely

Solususpensioprotoplastit eristettiin Mannosen (1985) mukaan (liite 3).

Solut (kanta Digitalis lanata 10MSA42) erotettiin suspensiosta suodatta­

malla. Plasmolyysin aikana solukalvo irtoaa soluseinästä.

Soluseinä poistettiin entsymaattisesti. Vapautuneet protoplastit erotet­

tiin muusta solumateriaalista suodattamalla ja puhdistettiin plasmolyysi- liuoksella. Puhdistetut protoplastit suspensoitiin Li-alustaan. Proto- plastitiheys määritettiin mikroskooppisesti Fuchs—Rosenthal -laskukammi- ossa.

Solususpensioprotoplasteja viljeltiin pimeässä petrimaljalla nestemäisessä Li-alustassa. Petrimaljan pohjalle valettu Li-agaroosikerros estää proto- plastien tarttumisen petrimaljan seinämälle ja stabiloi protolasteja.

Protoplastien kasvua seurattiin tarkastelemalla niitä valomikroskoopilla (Leitz Divaert).

3.5. Mesofylliprotoplastien eristäminen ja viljely

Mesofylliprotoplastit eristettiin Hannuksen (1985) mukaan (liite 4).

Taimia pidettiin kolme vuorokautta pimeässä ennen protoplastien eristä­

mistä. Pimeys lisää protoplastien kestävyyttä. Dekanterilasiin laitettiin 3...4 juuretonta tainta (0,6...2,2 g). Juuret poistettiin, koska haluttiin eristää mesofylliprotoplasteja taimien lehdistä. Käytettävät entsyymit eivät myöskään vaikuta juurisolukkoon. Entsyymien vaikutuspinta-alaa lisättiin viiltelemällä lehtiä veitsellä. Plasmolyysin aikana solukalvo irtoaa soluseinästä. Soluseinä poistettiin entsymaattisesti. Sakkaroosi- liuokseen vapautetut protoplastit erotettiin suodattamalla muusta solu- materiaalista. Sakkaroosiliuoksella puhdistetut protoplastit suspensoitiin Li-alustaan. Protoplastitiheys määritettiin mikroskooppisesti

Fuchs-Rosenthal -laskukammiossa. Mesofylliprotoplasteja viljeltiin valossa kuten solususpensioprotoplasteja.

3.6. Syntetoituvien makromolekyylien leimaus

DNA-, RNA- tai proteiinisynteesiä seurattiin lisäämällä kasvatusalustaan [metyyli-14Cjtymidiiniä,

[u-14C

L-[u- 14C

(50 pCi/ml). Kussakin leimauksessa seurattiin ainoastaan yhtä makromole- kyylisynteesiä.

Solususpension kasvatusalustaan (tilavuus noin 50 ml) lisättiin laimennet­

tua leimaa (0,5 pCi), ja makromolekyylien leimautumista seurattiin kolme vuorokautta. Taimien kasvatusalustaan (tilavuus noin 150 ml) lisättiin laimennettua leimaa (1,5 pCi), ja makromolekyylien leimautumista seurattiin 25 vuorokautta. Protoplastien viljelyalustaan (tilavuus noin 10 ml)

lisättiin laimennettua leimaa (0,1 pCi), ja makromolekyylien leimautumista seurattiin 28 vuorokautta.

3.7. Radioaktiivisuusmääritykset

Näytteiden radioaktiivisuus mitattiin Ultrobeta 1210-nestetuikelaskimella (LKB-Wallac). Käytetyt asetukset

- CH^-kanava 10 000 - CHj-ikkunat 3-21

- BG-tausta 22

- CH 2~kanava 800 000 - CUg-kanava 800 000 - mittausaika 1200 s

Mittauksissa käytettiin muovisia MILLI-6 -tuikepulloja. Ennen mittausta näytteet sekoitettiin koeputkisekoittajalla ja tuikepullo pyyhittiin 70 % (v/v) etanolilla kostutetulla pumpulilla optisen sammutuksen vähentä­

miseksi.

Radioaktiivisuus on ilmoitettu Ci (Curie)- ja cpm (counts per minute)- yksikoissä, jotka eivät ole SI-yksiköitä. Ne olivat kuitenkin käytännöl­

lisiä, koska työssä tutkittiin radioaktiivisuuden suhteellisia muutoksia.

KASVATUSALUSTAN RADIOAKTIIVISUUS

Kasvatusalustanäyte sekoitetun koeputkisekoittajalla. Mitattavaan näyt­

teeseen (100 pl) lisättiin 0,5 ml Lumasolve-liuosta ja 4,5 ml Lipoluma- liuosta. Sekoitettiin koeputkisekoittajalla ja annettiin seistä yön yli huoneenlämmössä pimeässä.

SOLUJEN JA TAIMIEN OTTAMA KOKONAISRADIOAKTIIVISUUS

Solususpension ja taimien radioaktiivisuusmääritykset on esitetty kaavioina liitteissä 5 ja 6.

Leimauksen päätyttyä solususpensio suodatettiin lasikuitusuodatinpaperille.

Solujen pinnalle tarttuneet epäpuhtaudet poistettiin pesemällä MSO-alus- talla. Alustan suolat huuhdeltiin pois vedellä. Solut kylmäkuivattiin (Speed Vac Concentrator, Savant).

Leimauksen päätyttyä juurettomat taimet yhdistettiin ja kylmäkuivattiin. .

Punnittiin tuikepulloon 0,1...10,0 mg kylmäkuivattua näytettä. Lisättiin 0,5 ml Lumasolve-liuosta. Näytteen annettiin uuttua yön yli

huoneenlämmössä pimeässä. Lisättiin 5,0 ml Lipoluma-liuosta ja mitattiin radioaktiivisuus.

PROTOPLASTIEN OTTAMA KOKONAISRADIOAKTIIVISUUS

Protoplastien radioaktiivisuusmääritykset on esitetty kaaviona liitteessä 7.

Leimauksen päätyttyä protoplastisuspensionäyte suodatettiin lasikuitu­

suodatinpaperille. Protoplastien pinnalle tarttuneet epäpuhtaudet pestiin viljelyalustalla. Alustan suolat huuhdeltiin pois plasmolyysiliuoksella.

Suodatinpaperi kuivattiin tuikepullossa. Lisättiin 0,5 ml Lumasolve- liuosta ja 4,5 ml Lipoluma-liuosta. Veden lisäys (0,1 ml) nopeuttaa uuttumista. Näytettä uutettiin yön yli huoneenlämmössä pimeässä.

SOLUISSA JA TAIMISSA SYNTETOITUJEN MAKROMOLEKYYLIEN RADIOAKTIIVISUUS

Syntetoitujen makromolekyylien radioaktiivisuusmääritykset perustuivat Cox et_al:n (1973), Ferrarin ja Widholmin (1973), Zelcerin ja Galunin (1976), Premecz et al:n (1978), Paszkowski et al:n (1980) ja Langebartelsin (1981) käyttämiin menetelmiin.

Punnittiin koeputkeen 0,1...10,0 mg kylmäkuivattua näytettä. Lisättiin 1 ml kylmää (0°C) 5 % (w/v) TCA:ta (trikloorietikkahappo) näytteeseen, jonka DNA tai RNA oli leimattu, tai 1 ml kylmää (0°C) 10 % (w/v) TCA:ta näytteeseen, jonka proteiinit oli leimattu. Makromolekyylit saostettiin yön yli kylmässä (+4°C). Näyte suodatettiin lasikuitusuodatinpaperille.

Näyte huuhdeltiin kylmällä (0°C) 5 % (w/v) TCA:11a ja pestiin 94 % (v/v) etanolilla ylimääräisen TCA:n neutraloimiseksi ja kuivumisen edistämiseksi.

Suodatinpaperi kuivattiin tuikepullossa. Lisättiin 0,5 ml Lumasolve- liuosta ja 4,5 ml Lipoluma—liuosta. Veden lisäys (0,1 ml) nopeuttaa uuttamista. Näytettä uutetiin yön yli huoneenlämmössä pimeässä.

PROTOPLASTEISSA SYNTETOITUJEN MAKROMOLEKYYLIEN RADIOAKTIIVISUUS

Lisättiin 1 ml kylmää (0°C) 10 % (w/v) TCA:ta protoplastisuspensio- näytteeseen (1 ml), jonka DNA tai RNA oli leimattu, tai 1 ml kylmää (0°C) 20 % (w/v) TCA:ta näytteeseen (1 ml), jonka proteiinit oli leimattu.

Makromolekyylit saostettiin yön yli kylmässä (+4°C) ja käsiteltiin edelleen kuten solu- ja taiminäytteitä.

3.8. Lehtivihreän aiheuttama värisammutus ja sen korjaus taiminäytteissä

Lehtivihreä aiheuttaa värisammutusta radioaktiiviisuusmäärityksissä, koska se absorboi fluoresenssivaloa (Goulding, 1979; Rekonen, 1984).

Värisammutusta tutkittiin punnitsemalla 0,1...3,4 mg kylmäkuivattuja leimaamattomia taimia. Näytteitä käsiteltiin kuten taimien kokonais- radioaktiivisuusmäärityksissä. Näytteisiin lisättiin laimennettua leimaa (0,001 pCi). Jokaiselle leimalle tehtiin oma mittaussarja.

Taiminäytteiden värikorjaus tehtiin Pengin (1970) esittämän menetelmän mukaan. Mitattuihin näytteisiin lisättiin laimennettua leimaa (0,001 pCi)

ja määritettiin radioaktiivisuus. Värikorjaus tehtiin kaikille taimi- näytteille.

Mesofylliprotoplastinäytteet laimenivat niin paljon, että värikorjaus oli tarpeeton. Solususpensioprotoplastit ja solut eivät sisältäneet lehtivih- reää.

4. TULOKSET

4.1. Esik.ok.eet solususpenslolla

Solut hajotettiin ultraäänellä, Potter-Elvehjelm -lasihomogenisaattorilla sekä jauhamalla huhmareessa hiekan kanssa ja ilman sitä. Vapautuneet makromolekyylit saostettiin kylmällä TCA:lla.

Mittauksissa pyrittiin absoluuttiseen kokonaisradioaktiivisuusmääritykseen.

Solujen märkäpaino sekä kasvatusalustan, näytteen ja pesuliuosten tilavuu­

det olivat niin epätarkkoja, että absoluuttinen kokonaisradioaktiivisuus- määritys osoittautui mahdottomaksi. Solujen rikkomismenetelmät olivat

työläitä, ja tuloksissa oli suuria vaihteluita, joten menetelmistä luovut­

tiin.

Näytteenottoa solususpensiosta leimauksen aikana ei onnistuttu vakioimaan.

Magneettisekoitus rikkoi solut. Solujen rikkoutuminen havaittiin solusus- pension keltaisen värin muuttumisena punaruskeaksi, ryynimäisyyden häviämi­

senä ja kasvatusalustan radioaktiivisuuden kohoamisena. Solususpension ravistelu ravistelijalla näytteenoton aikana keräsi solut keoksi.

Weidnerin ja Ziemensin (1975) sekä Macnicolin (1983) mukaan mittaustuloksia ei voida esittää tuorepainoa kohden, sillä näytteenotto-olosuhteet aiheut­

tavat vaihteluita tuorepainossa. Spencer (1973) havaitsi lisäksi, että kasvun aikana kokonaisproteiinimäärä vaihtelee niin paljon, että tuloksia ei voida ilmoittaa sitä kohden. Näyte kuivattiin radioaktiivisuuden tarkkaa ilmoittamista varten. Kylmäkuivattujen näytteiden kuivapaino oli pienempi kuin sellaisten näytteiden kuivapaino, joita oli pidetty yön yli lämpökaapissa (105°C). Lisäksi kylmäkuivatut näytteet soveltuivat

jatkokäsittelyyn. Vedellä pestyjen näytteiden kuivapaino oli alhaisempi kuin pesemättömien näytteiden. Vesipesun aikana solujen pintaan kiinnitty­

neet epäpuhtaudet huuhtoutuvat pois.

Kasvatusalustanäytteessä olevien solujen vaikutusta mittaustuloksiin tutkittiin sentrifugoimalla toinen näytteistä. Koska näytteen sentri- fugointi ei vaikuttanut huomattavasti mittaustuloksiin (kuva 9),

kasvatusalustanäytteitä ei sentrifugoitu.

Oo.

соo

33

tno -Otn c

<TS

3

tn 3

m>

m

* Kasvatusaika /vrk

Kuva_9. Kasvatusalustanäytteen radioaktiivisuus, kun näytettä ei sentri­

fugoitu (o) ja kun se sentrifugoitiin (□) solujen poistamiseksi.

Kasvatusalusta oli leimattu (a) [metyyli-14c]tymidiinillä, (b) [u-l4c]uridiinilla ja (c) L-[u-14c]leusiinilla.

4.2. Taimien kasvatus

Eri ikäisten juurettomien taimien tuorepainojen ja pituuksien aritmeettiset keskiarvot määritettiin. Rasiassa kasvoi 14...20 tainta. Aritmeettinen keskiarvo x ja keskihajonta s laskettiin kaavoilla (1) ja (2) (Mäkinen, 1978).

— E x . i

ja 2

8

2 2

(Ех£) n n - 1

(2)

missä x = aritmeettinen keskiarvo, s = keskihajonta,

n = kokonaisfrekvenssi (tutkittujen havaintojen lukumäärä), Xi = muuttuja (i. tutkittavan havainnon arvo).

Tulokset on koottu taulukkoon 3. Eri ikäiset taimet on esitetty kuvassa 10.

Taulukko 3. Eri ikäisten juurettomien taimien tuorepainojen ja pituuksien aritmeettiset keskiarvot (x) ja keskihajonnat (s).

Ikä tuorepaino pituus

vrk mg mm

X S X s

4 5,6 2,7 10,9 3,3

4,7 2,2 12,2 3,0

5,9 2,9 10,4 2,7

6,0 3,7 10,5 2,1

8,1 3,0 8,4 1,5

8,6 3,3 8,7 2,3

11 30,1 17,3 20,7 5,8

18 88,3 53,2 27,9 7,6

93,3 53,6 25,1 9,6

86,9 55,4 29,8 8,1

126 43,2 33,8 13,0

25 217 170 38,6 18,6

Kuva 10. Eri ikäisiä Digitalis lanata 517 -taimia.

(a) 4 idätettyä siementä, (b) 4,

(c) 11 ja

(d) 18 vuorokauden ikäisiä taimia.

Kuvissa (b)...(d) rasiassa kasvoi 9 tainta.

4.3. Radioaktiivisuusmääritykset

Kasvatusalustan radioaktiivisuus on ilmoitettu kahden rinnakkaisen mittauk­

sen aritmeettisena keskiarvona.

Tutkittavan kasvimateriaalin ottama kokonaisradioaktiivisuus ja makromolekyyleihin liittynyt radioaktiivisuus laskettiin kolmesta

rinnakkaisesta mittauksesta. Mittausten aritmeettinen keskiarvo (kaava (1)) ja keskihajonta (kaava (2)) määritettiin. Keskihajonnan määrittelemään vaihteluväliin kuuluvista mittaustuloksista laskettiin aritmeettinen keskiarvo (Mäkinen, 1978). Esimerkiksi DNA-leimattujen solujen

kokonaisradioaktiivisuus (a^yrp) ensimmäisessä kokeessa lasketaan seuraavasti:

- mittaustulokset (cpm/mg k.a.) : 3026, 2840, 2932 - aritmeettinen keskiarvo (cpm/mg k.a.) (kaava (1)) : x1 = 2933

- keskihajonta (cpm/mg k.a.) (kaava (2)): : s =93 - vaihteluväli 2933 ± 93 cpm/mg k.a.

- kaikki mitatut arvot kuuluvat vaihteluväliin, joten x2 = = 2933 cpm/mg k.a.

4.3.1. Solujen makromolekyylisynteesit

kun makromolekyylien leimaus aloitettiin, kolmen vuorokauden ikäiset solut olivat kiihtyvän kasvuvaiheen alussa Diettrich et ai.:n (1982) tutkimusten mukaan. Makromolekyylisynteesejä seurattiin kolme vuorokautta. Kasvatus- alustan radioaktiivisuuden muutos ajan funktiona on esitetty kuvassa 11.

Ensimmäisessä kokeessa 32,6 % (DNA-synteesi), 19,5 % (RNA-synteesi) ja 31,9 % (proteiinisynteesi) kasvatusalustan radioaktiivisuudesta oli jäljellä ensimmäisen leimausvuorokauden jälkeen. Kolmen vuorokauden

leimauksen päätyttyä 10,9 % (DNA-synteesi), 6,9 % (RNA- synteesi) ja 21,2 % (proteiinisynteesi) alkuperäisestä radioaktiivisuudesta oli jäljellä

kasvatusalustassa.

aи CO

o

IÜ

o

•5 m cm

<TJ

«

Leimausaika /vrk

Kuva_U. Solujen kasvatusalustan radioaktiivisuuden muutos ajan funktiona ensimmäisessä (o) ja toisessa (Q) kokeessa. Kokeissa seurattiin (a) DNA-,

(b) RNA- ja

(c) proteiinisynteesiä.

Toisessa kokeessa ainoastaan proteiinisynteesin seurannassa kasvatusalustan radioaktiivisuus väheni kuten ensimmäisessä kokeessa. Ensimmäisen ja

kolmannen leimausvuorokauden jälkeen 24,8 % ja 3,4 % kasvatusalustan radio­

aktiivisuudesta oli jäljellä alustassa. Kun seurattiin DNA- ja RNA-syn- teesejä toisessa kokeessa, solususpension tilavuus oli yli 50 ml. Tällöin soluja ei ravisteltu tehokkaasti ja niiden kasvu hidastui, mikä havaittiin lähes lineaarisena kasvatusalustan radioaktiivisuuden vähenemisenä. Kasva­

tusalustan tilavuuden lisäys havaittiin myös alkuperäisen radioaktiivi­

suuden alenemisena verrattuna ensimmäiseen kokeeseen.

Solujen ottama kokonaisradioaktiivisuus ja makromolekyyleihin liittynyt radioaktiivisuus määritettiin leimauksen päätyttyä (taulukko 4). Ensimmäi­

sessä kokeessa sekä toisen kokeen proteiinisynteesin seurannassa keskimää­

rin 90 % solujen ottamasta radioaktiivisuudesta oli liittynyt makromole­

kyyleihin. Kun seurattiin DNA— ja RNA-synteesiä toisessa kokeessa, kasvun hidastuminen havaittiin myös makromolekyylien radioaktiivisuuden

(cpm/mg k.a.) vähenemisenä.

Molemmat kokeet osoittivat, että mitä alhaisempi oli kasvatusalustan radio­

aktiivisuus leimauksen päätyttyä, sitä suurempi osuus radioaktiivisuudesta oli liittynyt makromolekyyleihin.

Taulukko 4. Solujen ottama kokonais radioaktiivisuus (a^.Q^) ja

syntetoltujen makromolekyylien radioaktiivisuus (a) kolmen vuorokauden leimauksen päätyttyä.

makro­

molekyyli

koe n: o

^OT a aT0T^a

cpm/mg k.a. cpm/mg k.a. %

DNA i 2933 2768 94,4

ii 634 338 53,3

RNA i 2630 2378 90,4

ii 1631 1448 88,8

Proteiini i 2222 1983 89,2

ii 5018 4859 96,8

4.3.2. Taimien makromolekyylisynteesit

Taimien makromolekyylisynteesejä seurattiin 25 vuorokautta. Taimien kasva tusalustan radioaktiivisuuden sekä tuorepainon, pituuden ja taimien

^C-tymidiiniradioaktiivisuuden muutos ajan funktiona on esitetty kuvassa 12. Radioaktiivisuuden arvot on laskettu aritmeettisena keskiarvona 2... 10 rinnakkaisen kasvatuksen mittaustuloksista, jotka kuuluivat keskihajonnalla määriteltyyn vaihteluväliin. Aseptisesta

työskentelystä huolimatta mikrobiologinen kontaminaatio häiritsi taimien makromolekyylisynteesien seurantaa. Täten RNA- ja proteiinisynteesien seuranta jouduttiin lopettamaan jo 14 ja 18 vuorokauden kuluttua. Koska kasvatusalusta oli kontaminoitunut, taimien radioaktiivisuutta ei

määritetty.

Kasvatusalustan radioaktiivisuus ei muuttunut neljän vuorokauden aikana.

Taimien kasvatusalustasta ottama radioaktiivisuus oli vähäistä, koska taimet olivat pieniä. Neljännen kasvatuspäivän jälkeen kasvatusalustan radioaktiivisuus väheni lähes lineaarisesti. Kasvatusalustan

radioaktiivisuus väheni nopeimmin proteiinisynteesin seurannassa ja hitaim min DNA-synteesin seurannassa. Taimien pituus lisääntyi lineaarisesti ja tuorepaino kasvoi eksponentiaalisesti ajan funktiona.

-100

-50

1,11,111

Kasvatusaika /vrk

Kuva 12. (a) Taimien kasvatusalustan radioaktiivisuuden muutos ajan funktiona DNA-(o), RNA- (□) ja proteiinisynteesin (Д) seurannassa.

(b) Taimien pituuden (I), tuorepainon (II) sekä kokonais-

radioaktiivisuuden (III) muutos ajan funktiona. Viivoitettu osuus kuvaa DNA:han liittynyttä radioaktiivisuutta.

cOJ e E3 E E

<0

cm S

dj

u

Kuva 13. Näytteisiin

Taiminäytteen massa /mg k.a.

Taimien lehtivihreän aiheuttama värisammutus.

lisättiin 0,001 pCi

(a) [metyyli-l4c]tymidiiniä, (b) [U-^4c] uridiinia ja (c) L-[u-11+c]leusiinia.

Taimien lehtivihreä aiheutti värisammutusta (kuva 13). Koska värisammumi- nen ei ollut selvästi lineaarista, korjaussuoria ei käytetty, vaan taimi- näytteillä mitatut arvot korjattiin sammutuskertoimella (3) (Peng, 1970).

(3)

missä Q = Ao = A =

sammutuskerroin,

tunnetun leiman radioaktiivisuus, [cpm],

tunnetun leiman radioaktiivisuus tutkittavassa näytteessä, [cpm].

Tunnetun leiman radioaktiivisuus tutkittavassa näytteessä (Aq) voidaan laskea kaavalla (4).

Aq = A^q^, — 1, (4)

missä ^тот = n^ytteen Ja lisätyn leiman kokonaisradioaktiivisuus, [cpm],

A = näytteen radioaktiivisuus, [cpm].

Korjatut arvot lasketaan kaavan (5) avulla.

a' missä a'

n

1 . A 1 - Q * n »

korjattu arvo, [cpm/ mg k.a.], näytteen massa, [mg k.a. ].

( 5 )

Mitattiin kolme rinnakkaismääritystä yhden rasian yhdistetyistä taiminäyt­

teistä. Mitatut arvot korjattiin kaavojen (3)...(5) avulla. Tunnetun leiman radioaktiivisuus (Aq) määritettiin jokaisessa mittauksessa. Esimer­

kiksi 4 vuorokauden ikäisen DNA-leimatun taimen kokonaisradioaktiivisuus U^Ot) lasketaan seuraavasti:

- mittaustulokset: A m

ätot

A0

1568 cpm 0,4 mg 3722 cpm 2528 cpm

- sammutuskerroin (kaava (3)):

(2528 - 3722 + 1568) cpm cpm Q = --- = 4601 ---

2528 cpm mg

- korjattu arvo (kaava (5)):

1 1568 cpm aT0T i - 0,148 0,4 mg

Vaihteluväliin kuuluvat korjatut arvot DNA-, RNA- ja proteiinileimattujen taimien radioaktiivisuusmäärityksissä on esitetty liitteessä 8. Tuloksista lasketut aritmeettiset keskiarvot on esitetty taulukossa 5.

Taimien makromolekyyleihin liittyneen radioaktiivisuuden osuus kasvoi DNA-synteesin seurannassa, kun taimet vanhenivat. Taimien

kokonaisradioaktiivisuus kuitenkin väheni, koska taimien koko kasvoi ja lehdet laajenivat. Makromolekyyleihin liittyneen radioaktiivisuuden osuus puolestaan kasvoi.

= 4601 cpm mg

Taulukko 5. Taimien ottama kokonaisradioaktiivisuus (а'^0ц.) ja

syntetoituihin makromolekyyleihin liittynyt radioaktiivisuus (a') yhden rasian taimia kohden. Arvot ovat värikorjattujen arvojen aritmeettisia keskiarvoja.

Makro­

molekyyli

Ikä vrk

a'a T0T cpm/mg k.a.

a'

cpm/mg k.a.

s ' тот^a

%

DNA 4 3756 1656 44,1

11 3117 2116 67,9

18 1897 1903 100,3

25 1302 876 67,3

RNA 4 2630 1494 56,8

Proteiini 4 4186 4533 108,3

4.3.3. Solususpensioprotoplastien makromolekyylisynteesit

Solususpensioprotoplastien makromolekyylisynteesejä seurattiin 28 vuoro­

kautta. Eri ikäisiä solususpensioprotoplasteja on esitetty kuvassa 14 (RNA-synteesin seuranta, ensimmäinen koe). Kun protoplastit vanhenivat, niiden koko kasvo!. Viikon kuluttua protoplastin pyöreä muoto alkoi hävitä

ja havaittiin ensimmäiset jakautumiset. Kolmen viikon kuluttua proto­

plastit olivat jakautuneet useita kertoja. Kun kasvatus lopetettiin, protoplastit olivat muodostaneet solurykelmiä.

Kasvatusalustan radioaktiivisuuden muutos ajan funktiona on esitetty kuvassa 15. Solususpensioprotoplastien kasvatusalustan radioaktiivisuus väheni lineaarisesti ensimmäisten kasvatuspäivien aikana. Seitsemännen (DNA-synteesi) ja neljännen (RNA-synteesi) päivän jälkeen saavutettiin vakiotila. Proteiinisynteesin seurannassa vakiotilaa ei saavutettu.

Kuva 14. Solususpensioprotoplas tit (a) 2, •

(b) 7, (c) 14, (d) 21 ja

(e) 28 vuorokauden ikäisinä. Jakautuvat protoplastit on osoitettu nuolilla (suurennos x20).

Kasvatusaika /vrk

Kuva 15. Solususpensioprotoplas cien kasvatusalustan radioaktiivisuuden muutos ajan funktiona ensimmäisessä (0) ja toisessa (□) kokeessa.

Kokeissa seurattiin (a) DNA-,

(b) RNA- ja

(c) proteiinisynteesiä.

Leimauksen päätyttyä protoplastien ottama kokonaisradioaktiivisuus ja makromolekyyleihin liittynyt radioaktiivisuus määritettiin (taulukko 6).

Taulukossa on myös esitetty protoplastitiheys (d), joka lasketaan kaavalla (7).

d

P

r • A • 1

(

)

missä d P

protoplastitiheys, [(ml)-1],

protoplastien lukumäärä lasketuissa ruuduissa, laskettujen ruutujen lukumäärä,

ruudun pinta-ala, [mm2], ruudun syvyys, [mm],

suspension tilavuus, josta tiheys on määritetty, [ml], suspension kokonaistilavuus [ml].

Kun sijoitetaan tunnetut arvot, saadaan

2 ml d =

16 • 0,0625 mm2 • 0,2 mm • 10~3 cm3/mm3 10 ml (7)

Kasvatuksen päätyttyä keskimäärin 90 % protoplastien kokonaisradioaktiivi­

suudesta oli liittynyt makromolekyyleihin. Rinnakkaisten kokeiden radio­

aktiivisuudet olivat samaa suuruusluokkaa.

Taulukko 6. Solususpensioprotoplastien ottama kokonaisradloaktiivisuus (aTOT^ syntetoituihin makromolekyyleihin liittynyt

radioaktiivisuus protoplast!tiheys

(a) 28 vuorokauden alkuhetkellä (dg)

leimauksen päätyttyä

Makro- Koe aTOT a a/aT0T dg

molekyyli n:o cpm/mg k.a . cpm/mg k.a. % 105/ml

DNA I 1096 1032 94,2 3,86

II 1075 1309 121,8 3,92

RNA I 3859 3474 90,0 4,18

II 4642 4511 97,2 4,12

Proteiinit I 10230 9031 88,3 2,58

10324 12122 117,4 4,80

4.3.4. Mesofylliprotoplastien makromolekyylisynteesit

Mesofylliprotoplastien makromolekyylisynteesejä seurattiin 28 vuorokautta.

Eri ikäisiä mesofylliprotoplasteja on esitetty kuvassa 16. Kasvatuksen aikana kloroplastit pienenivät ja järjestäytyivät uudelleen. Ensimmäisen viikon kuluttua protoplastien koko alkoi kasvaa. Protoplasteissa näkyi myös kuroutumia. Jakautumisia havaittiin kolmen ja neljän viikon ikäisissä protoplasteissa.

Kasvatusalustan radioaktiivisuuden muutos ajan funktiona on esitetty

kuvassa 17. Mesofylliprotoplastien DNA-synteesiä ei onnistuttu seuraamaan 28 vuorokautta, koska protoplastit kuolivat kasvatuksen alkuvaiheessa.

Kuvassa 17a on esitetty yksi DNA-synteesin seurantakoe, jossa kasvatus- alustan radioaktiivisuus saavutti vakiotilan jo kahden vuorokauden kulut­

tua. Kun protoplasteja tarkasteltiin mikroskoopilla, ne olivat menneet rikki tai kutistuneet kasaan. Kasvatusalustan radioaktiivisuus laski lähes lineaarisesti, kun seurattiin RNA-synteesiä. Proteiinisynteesin seuran­

nassa protoplastit menettivät elinkykynsä vähitellen toisen vuorokauden kuluttua. Osa protoplasteista rikkoutui, mikä havaittiin kasvatusalustan radioaktiivisuuden lisääntymisenä.

Kuva 16. Mesofylliprotoplastit (a) 2,

(b) 7, (c) 14, (d) 21 ja

(e) 2ti vuorokauden Ikäisinä. Jakautuvat protoplastit on osoitettu nuolella (suurennos x20).

Kuva 17. MesofylliproCopiastien kasvatusalustan radioaktiivisuuden muutos ajan funktiona ensimmäisessä (0) ja toisessa (□) kokeessa.

Kokeissa seurattiin (a) DNA-,

(b) RNA- ja

(c) proteiinisynteesiä.