• Ei tuloksia

Mikrobirenniinin tuottaminen

N/A
N/A
Info
Lataa
Protected

Academic year: 2022

Jaa "Mikrobirenniinin tuottaminen"

Copied!
111
0
0

Kokoteksti

(1)

MATTI SIIKA-AHO

M IKROBI RENN I I N I N TUOTTAMINEN

Diplomityö, joka on jätetty opin­

näytteenä tarkastettavaksi diplomi insinöörin tutkintoa varten

Espoossa

21

.

10.1983

Työn valvojat:

Dosesili>' (Tutkimusprofessori") Matti Linko

Professori Pekka Linko

(2)

Tekijä ja työn nimi : Matti Si ikä-a ho

M 1 KROB1 RENN 1 1 N 1 N TUOTTAMINEN

Päivämäärä : 21.10.1983 Sivumäärä : 97 s.

Osasto : Professuuri: 5.70

Kernian osasto Elintarviketeknologia (biotekniikka)

Työn valvoja : tutkimusprofessori Matti Linko ja professori Pekka Linko

Työn ohjaaja : 3 5 c Michael Bailey

Työn tavoitteena oli kehittää mikrobi renn i i nin tuottopro- sessia, joka olisi taloudellisesti toteuttamiskelpoinen kotimaassa.

Kuudesta tutkitusta kannasta paras tuottaja oli Rhizomucor miehei (VTT-D-82193 ) , jonka entsyymi oli proteolyyttisiltä

ominaisuuksiltaan kaupallisten mikrobi renniinien luokkaa.

Parhaat tuottoa 1ustan komponentit olivat vehnä, soija ja rankki. Typpi lähteenä oli diammoniumvetyfosfaatti .

Orgaanisten lisäaineiden ei havaittu lisäävän tuottoa , mutta alustan sakeus vaikutti selvästi entsyymiaktiivisuu­

teen ja kasvun nopeuteen. Alustan koostumus ei vaikuttanut tuotetun entsyymin mitattuihin ominaisuuksiin.

Tuoton optimi 1ämpöti 1 a oli 3 0°C , optîmi-pH 5,0-5,5 ja paras seko i tusnopeus kokeilluista oli Eschwei1er-fermentorissa 700 min"1. Siirroste oli 20 % alustasta ja sen oli oltava

iältään yli 9 vrk parhaan tuoton saavuttamiseksi. Fermen­

tor i 1 i uos puhdistettiin uit ra suodatuksella, happokäsitte- lyllä ja saostama11 a fosfaatteja kalsiumkloridin avulla.

Entsyymi oli stabiilein pH-alueella 3~7 ja sen aktiivi­

suuden pH-optimi oli 5,9-6,0. Entsyymin 1ämpöstabi i 1 ius riippui voimakkaasti pH : s ta ja suolakonsentraatiosta.

Entsyymin omakustannushinnaksi laskettiin ilman pakkaus- vaihetta i>9 mk/106 yksikköä. Suomessa käytetyn kaupal­

lisen mikrobiren niinin (Suparen) hinta on 65 mk/10 yksi kköä.

(3)

Tähän diplomityöhön liittyvät kokeet on tehty VTT : n biotekniikan laboratoriossa Otaniemessä 1.1.1983 ja 31.7.1983 välisenä aikana.

Kiitän työtä valvoneita tutkimusprofessori Matti Linkoa ja professori Pekka Linkoa rakentavasta kritiikistä ja ohjeista työn aikana, työn ohjaajaa BSc Michael Baileya monista arvokkaista neuvoista ja avusta kokeiden suun­

nittelussa, Dl Eero Karvosta avusta taloudellisen tar­

kastelun laadinnassa ja koko biotekniikan laboratorion henkilökuntaa miellyttävästä yhteistyöstä ja työskentely-

ilmapiiristä.

E s poos sa 21 .10.198 3

Matti S iika-aho

(4)

JOHDANTO ... 1

KIRJALLISUUSOSA ... 2

1. Juoksete-entsyymi ja juuston valmistus ... 2

1.1 Kymosi ini ... 2

1.2 Juustoprosessi ... 2

1.3 Kymosiin in vaikutus maitoon ... 4

1.3.1 Maidon aineosat ... 4

1.3.2 Maidon rakenne ... 7

1.3.3 Saostumisen mekanismi ... 8

1.4 Juuston kypsyminen ... 9

2. Vas ikanrenniin in säästömahdol1isuudet ... 13

2.1 Perinteisen kymosiinin korvikkeet ... 13

2.2 Juoksetteen käytön vähentäminen ... 15

3. Juoksetteelta vaadittavat ominaisuudet ... 16

3.1 Prosess¡olosuhteet ja juoksete-entsyymit ... 16

3.2 Vaatimukset mikrobirenn i ine i 11 e ... 17

4. Mikrobi renn i in it ja niiden tuotto ... 18

4.1 Biokemialliset ominaisuudet ... l8 4.2 Kaupalliset entsyymit ... 20

4.3 Mucor pusillus -renn i in it ... 21

4.4 Mucor miehei -renniinit ... 22

4.5 Endothia parasitica -renniinit ... 23

4.6 Muut homeet ja sienet renniin ien tuottajina ... 24

4.7 Bakteerientsyymit ... 25

4.8 Geenins i irtotekniikka ... 26

5. Tuoton optimointi ... 26

6. Jälkikäsittely ... 28

7. Renniinien ominaisuuksien mittaaminen ... 29

(5)

9. Koejärjestelyt ... 32

9.1 Materiaa! it ... 32

9.2 Ravi stel ukasvatukset ... 35

9.3 Fermentorikasvatukset ... 36

10. Analyysimenetelmät ... 37

10.1 Maitoa seostava aktiivisuus ... 37

10.2 Saostumaa hydrolysoiva aktiivisuus ... 39

10.3 Proteolyyttinen aktiivisuus ... 10.1* Liukoinen proteiini ... ^2

11. Mikrobikannan valinta ... ^3

12. Kasvualustan vaikutus tuottoon ... ^ 12.1 Hiili lähde ... W 12.2 Epäorgaaninen typpi ... 50

12.3 Lisäaineet ... 51

12.4 Vaahdonestoaine ... 53

12.5 Alustan sakeus ... 53

13. Lämpötilan vaikutus tuottoon ... 55

13.1 Optimilämpötilan etsintä ... 55

13.2 Lämpötilaprofii 1 it ... ... 57

il*. pH:n vaikutus tuottoon ... 58

11*. 1 Rav i stel ukasvatukset ... 58

11*.2 Kokeet fermentorissa ... 58

15. S iirrosteen vaikutus tuottoon ... 61

15.1 S i i rrosteen ikä ... 6l 15.2 S i i rrosteen koko ... ... 61

16. Sekoituksen ja ilmastuksen vaikutus tuottoon 61

(6)

17.2 Kasvu 1 iuoksen puhdistus kai s iumkloridin avulla .... 67

17.3 Entsyymin sitominen hentoniittiin ... 68

17.4 Fermentor i 1 Î uoksen happokäsittely ... 69

17.5 Fermentor i 1iuoksen säilyvyys ... 70

18. Tuotetun entsyymin ominaisuuksia ... 71

18.1 Lämpötilan sieto ... 71

18.2 pH:n sieto ... 73

18.3 Proteolyytt i sen aktiivisuuden lämpöti laoptimi ... 74

18.4 Proteolyyttisen aktiivisuuden pH-optimi ... 75

18.5 Työssä tuotettu entsyymi verrattuna kaupallisiin renniineih in ... 76

19. Mikrobirenniin in tuoton taloudellinen tarkastelu ... 78

19.1 Lähtökohdat ... 78

19.2 Prosessin kuvaus ... 79

19.3 Investointikustannukset ja käyttöpääoma ... 82

19.4 Tuotannon muuttuvat kustannukset ... 83

19.5 Tuotannon kiinteät kustannukset ja maksut ... 84

19.6 Tuotannon kokonaiskustannukset ja entsyymin hinta ... 85

YHTEENVETO ... 86

EHDOTUKSIA JATKOTUTKIMUKSIKSI ... 89

KIRJALLISUUSLUETTELO ... ... ... 90

3 liitettä

(7)

JOHDANTO

Ren n i i n¡ä käytetään juustonvalmistuksessa juoksettamaan maito siksi proteiinipitoiseksi saostumaksi, josta tulee jatkokäsittelyn ja kypsyttämisen jälkeen juusto. Tämän entsyymi 1 iuoks en , juoksetteen, ominaisuudet vaikuttavat ratkaisevasti juuston rakenteeseen ja makuun.

Perinteisesti juoksetteena on käytetty maitovasikan juoksu- mahasta uutettua entsyymiä. Koska maailmanlaajuisesti

juus ton va 1 mis tus on lisääntynyt voimakkaasti ja toisaalta pienten vasikoiden teurastaminen vähentynyt, vasikanren- niinin hinta on noussut. Tämän vuoksi juustolat ovat

ryhtyneet käyttämään erilaisia va sika nrenn i i nin korvikkeita.

Näistä tärkeimmät ovat naudan ja sian ruuansulatuskanavasta eristetyt pepsiinit ja eräiden homeiden tuottamat entsyymit.

Suomessa ei valmisteta mikrobi renn i i nejä . Tämän työn

tarkoituksena oli kehittää mikrobiren n i inin tuottop ros e s sia , joka olisi taloudellisesti toteuttamiskelpoinen kotimaassa.

Entsyymin tuoton optimiolosuhteiden tutkimisen lisäksi työssä verrattiin valmistettua entsyymiä markkinoilla

oleviin mikrobi renn i ine i hin ja laadittiin entsyymin tuotta­

misen alustava kustannusarvio.

(8)

1. JUOKSETE-ENTSYYM I JA JUUSTON VALMISTUS

1 .1 KymosI I n¡

Perinteisesti juoksete eristetään uuttamalla suolaliuoksella maidolla ruokitun vasikan juoksumahasta . Tällöin vasikat on teurastettava alle 30 päivän iässä, jottei entsyymi ehdi muuttua pepsi i n iksi , joka on naudanmahan normaali proteo-

lyyttinen entsyymi. Juoksetteen olennainen aktiivinen tekijä on kymosi i n i (E.C. 3.^.23 • ^) , joskin se sisältää

tavallisesti myös pepsi i n i ä . Kymosi i ni on hapan proteinaasi , joka luokitellaan aspartaattiproteinaasiksi, sillä sen

aktiivinen kohta sisältää kaksi asparagiinihappoyksikköä.

(Cheeseman, 1981)

Kymosi i ni on vasikanmahassa läsnä p rokymosi i n ina, josta muodostuu kymosi i nia , kun siitä lohkeaa happamissa olo­

suhteissa pois peptidiketju. Puhdistettu kymosi i n i voidaan jakaa fraktioiksi DEAE-se 11u1oosak roma tog ra f i a n avulla.

Tällöin saadaan Cheesemanin (1981) mukaan kaksi tai luulta­

vimmin kolme isoentsyymiä, jotka yleisiltä ominaisuuksil­

taan ovat samankaltaiset, mutta joiden spesifiset aktiivi­

suudet eroavat toisistaan.

Kymosi i nia käytetään juustonvalmistuksessa koagu1 oimaan maidon kaseiinit ja muodostamaan niistä geeli. Lisäksi kymosi i n i 11 a ja muilla juoksetteessa olevilla entsyymeillä on merkitystä juuston kypsymisvaiheessa.

1.2 Juustoprosess i

Lyhyesti kuvattuna prosessi on seuraava: Kymosi i n i saos taa hapatetun maidon, kun riittävästi ka 1 siumionéja on läsnä.

Lämpötilan nostaminen ja pH : n lasku saavat aikaan pehmeän saostuman, jossa koagu1 o ituva kaseiini sitoo sisäänsä maidon muut komponentit. Syne reesiva i heessa geeli pyrkii

puristautumaan kasaan, mitä edistää pH : n lasku edelleen maitohappobakteerien toiminnan vuoksi ja lämpötilan nousu.

(9)

Tällöin vesi ja osa siihen liuenneista aineista eroaa saos­

tumasta heraksi. Heran erottumista helpotetaan tavallisesti saostuman leikkaamisella tai muulla mekaanisella käsitte­

lyllä. Kuvassa 1 on esitetty kaavio juustonvalmistuksesta.

MAITO BAKTEERIT

(МАРАТЕ) Г

LAKTOOSI

MAITOHAPPO

HAPPO- SYNEREESI

RASVA

--- 1---

PROTEI IN IT

(KASEI INI)

I

SUOLAT

(Ca)

RENN I INI SUOLA (NaCl) LÄMPÖ PARAKASEIINI

KOAGULOITUNUT MAITO .

PEHMEÄ SAOSTUMA

LÄMPÖ- SYNEREESI KOVA HAPAN

SAOSTUMA TUOREJUUSTO **-

Kuva 1. Kaavamainen esitys juus top roses sis ta (Scott, 1979) .

Heran erottamisen jälkeen saostumaa käsitellään siten, että sen mikrobit saadaan toimimaan halutulla tavalla ja pH laske­

maan sopivalle tasolle. Näitä toimenpiteitä ovat saostuman vesipitoisuuden alentaminen, sen suolaaminen ja lopullisen muodon määrääminen. Tässä vaiheessa käytetyt menetelmät vaihtelevat juustotyypin ja -merkin mukaan ja vaikuttavat oleellisesti kunkin merkin tyypillisiin piirteisiin (Olson,

1979).

Osa juusiomassan rasvoista ja proteiineista hajoaa kypsy- tysva i heessa, jolloin varsinainen juuston rakenne ja maku syntyvät. Useimmissa juustoissa tapahtuvia mikrobiologisia, entsymaattisiä tai kemiallisia tapahtumia ei tunneta tarpeek­

si hyvin, jotta niitä voitaisiin suoraan säädellä. Epäsuorasi juuston kypsymistä säädellään kypsytys 1ämpöti 1 an ja -ajan,

(10)

kypsytyshuoneen suhteellisen kosteuden ja juustossa tai sen pinnalla kasvavien mikrobien valinnan avulla. Kypsytys­

ta va t ja olosuhteet va i htelevät paljon j uustotyypistä riip­

puen (0

1

son

, 1979)•

1.3 Kymosiinin vaikutus maitoon 1.3.1 Mai don a i neosat

Taulukossa 1 on esitetty maidon aineosat. Taulukon arvot voidaan ajatella eräänlaisiksi keskiarvoiksi, sillä maidon koostumus va i h te 1 ее vuodenaikojen, ruokinnan, eläinyksilöi- den yms. mukaan huomattavasti. Maidon proteiinien koostumus on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 1. Lehmänmai don koostumus (Scott, 1 979).

ryhmä % maidosta tärkeimmät aineet

maitorasva 3,75 enimmäkseen triglyseridejä (Czt"C20’ C18-1 ,2,3,20-2,3)

1ipid i t 0,05 lesitiini, kefaliini, sfingomylÎini, sterol it

proteiin it 3,2 kaseiin it (2,6%)

a-laktalbumiini, ß-laktoglobuliini, seerumin albumiini, muut typpiyhdisteet laktoosi 5,1

suolat 0,9 Ca2+, Mg2+, Na+, K+, fosfaatit, sitraatit, kloridit, sulfaatit

ves i 87,0

muita rakenneosia pigmentit, karoteeni, riboflaviini , ksantofy11 i

entsyymit 1¡pääsit, proteinaasit, reduktaasit,

fosfataasit, 1aktoperoksi daasi , katalaasi, oksi daas it

vitamiin it D, E, K, C, B-ryhmä

soi ut epiteelisolut, leukosyytit, mikrobit kaasut С>2, М2, C02, haihtuvat komponentit

(11)

Taulukko 2. Rasvattoman maidon proteiinikoostumus (Morr, 1979).

rasvaton maito, pH 4,6, 20°C

saostuma hera

kaseiinit yhteensä 75...85 % heraproteiinit yht. 15...22 % joista: ag^ 45...55 % seerumin albumiinit 0,7...1,3 %

ß 25...35 % ß-laktoglobumiini 7...12 % к 8...15 % a-1 aktal bumiin i 2... 5 % у 3... 7 % îmmunoglobuli ini t 1,9.»«3,3 %

proteoosi pepton i 2... 6 %

Kaseiinien mo 1ekyy1 i painot vaihtelevat 20000:n ja 3 0 0 0 0 : n välillä. Aminohappojen määrä on as]~A-kasei i nissa 186 , ag1-B, C ja D-va ri ante i ssa 199, ß-kasei i niketjussa 209 , joista 35 prol iinia (Ribadeau-Dumas et at. , 1 973) • Maidon y-kaseiini kuten myös useat muut polypeptidit ovat osasia

ß-kasei iniketjusta. к-kasei Î n i koostuu 105 aminohapon para-<-kaseiiniketjusta sekä siihen liittyvästä 64 amino­

hapon makropeptidi stä. Tämä makropeptidi voi olla kahden­

lainen, eron ollessa vain yksi aminohappo, ja siihen on sitoutunut useammanlaisia hiilihydraatteja (Mercier et at., 1973). Taulukossa 3 on esitetty eri kaseiinien yleisiä ominaisuuksia.

Taulukko 3. Maidon perus ka seiinien ominaisuuksia (Cheeseman, 1981) .

ominaisuus

a"s1

kasei ini

6- к-

molekyy1 i pai no 23600 24100 21000

fosfori sisältö {%) 1,0 0,6 0,22

ei-pol aar i sten sivuketjujen osuus

0,34 0,45 0,35

liukoisuus, 0,03 M CaCl-, 4°C 0,17 1iukenee 1iukenee pH 7 (g/l) 3jOc

0,04 0,2 1iukenee arvioitu osuus kaseiinin

kokonaismäärästä {%)

50 32 15

(12)

Maidossa olevista heraproteiineista tärkein on g-lakto- globuliini. Se saostuu kohtuullisella lämpökäsittelyllä ja voidaan näin saada mukaan j uu s toma s saan. Sen suurin merkitys juustonvalmistuksen kannalta on sen taipumus sitoa suoloja, erityisesti kalsiumia (Scott, 1979).

Toinen tärkeä heraproteiini a~1 akta 1 bum i i ni on pienehkö

proteiini, joka ei normaalisti saostu. Käytettäessä sairaan eläimen maitoa, joka voi sisältää paljon heraproteiineja, näitä voi tulla huomattavia määriä mukaan saos tumaan.

Tästä seuraa vesipitoisuuden kasvu juustossa, mikä taas johtaa epätavalliseen bakteeri- ja entsyymiaktiivisuuteen kypsymi svaiheessa (Scott, 1979) •

Maidon sisältämät entsyymit ovat peräisin joko sitä erit­

täneestä eläimestä tai ne ovat siinä olevien mikrobien

tuottamia. Ne voivat myös olla kuolleiden solujen hajotessa vapautuneita solunsisäisiä entsyymejä. Osa niistä, samoin kuin maidon mikrobeistakin, kestää normaalissa prosessoin­

nissa käytettävän kuumennuksen. Maidon entsyymit ja mik­

robit ovat välttämättömiä juuston kypsymisvaiheessa , sillä hygieenisesti 'puhtaasta' maidosta tehty Cheddar-juusto ei maultaan vastaa normaalista meijerimaidosta valmistettua juustoa (Fryer, 1969) .

Kivennäisaineista tärkeimmät ovat fosfaatti ja kahden- 2 +

arvoiset kationit, erityisesti Ca . Maidon seerumissa on kalsiumista ioneina noin 8 %, kolloidisena (fosfaattina) 65 % ja 27 % ei-ionisena erilaisissa komplekseissa fos­

faatti - s i t ra a t i n ja kloridien kanssa (Scott, 1979).

Riittävä ka 1 s i um i on i en konsentraatio on välttämätön saos­

tuman muodostumiseksi. Kalsium vaikuttaa todennäköisesti maidon kykyyn saostua, eikä niinkään itse kymosiinientsyymin toimintaan. Fosfaatin, kationien ja eri proteiinien välistä tasapainoa, saati sen muuttumismekanismeja, ei täysin

tunneta. Joka tapauksessa kalsiumionikonsentraatio vaikuttaa oleellisesti kaseiinien liukoisuuksiin, ja suurin osa maidon kalsiumista on sitoutunut komplekseiksi kaseiinien ja

(13)

2 +

fosfaattien kanssa. Ca : n sijalla voivat toimia myös Ba2 + ja S r 2 + (Scott, 1979) .

1.3.2 Maidon rakenne

Yli 90 % ag1-, ß- ja к-kase m neista on maidossa miselleinä.

Kasei inimisel1i on monimutkainen järjestelmä, jonka stabii­

lius riippuu proteiinien ja maidon epäorgaanisten kompo­

nenttien välisestä vuorovaikutuksesta. Suhteellisen pie­

net kaseiinimolekyylit muodostavat keskenään aggregaatteja, jotka ka 1 sium i onien läsnäollessa muodostuvat laajemmiksi submiselleiksi, läpimitaltaan 10...15 nm. Kaisiumfos faa tin kanssa näistä muodostuu vielä laajempia kolloidisia m i s e 1 -

lejä. Ne koostuvat 450 ... 1 0 0 0 0 kasei i niyksiköstä ja niiden läpimitta on 1 0 0 ... 25 0 nm (Morr, 1979). Ne sitovat it­

seensä paljon vettä (1,9 g/1 g proteiinia).

Schmidtin et ai. (1973) mukaan 80 % miselleistä on läpi­

mitaltaan alle 20 nm, joskin ne tilavuudeltaan ovat vain 3 % kaikkien m i s e 11 ien yhteenlasketusta tilavuudesta.

Näiden pienten mi sel lien käyttäytyminen saostuman muodos­

tuessa saattaa osin selittää kaseiinien hukan heraan.

Mis e 11 ien rakenne on osin tuntematon. Nykyisen käsityksen mukaan к-ka se i in i on sijoittunut pääasiassa niiden ulko­

pintaan ja stabiloi mis e 11 in suojaten kaseiineja saos tu­

rn i se 1 ta . Lisäksi on todisteita siitä, että mis e 11 ien pin­

nalla on ulokkeita, jotka sisältävät runsaasti к-kase iinia . Näiden ulokkeiden käyttäytyminen koagu1 o i turn i sessa selit­

täisi muodostuvan saos tuman ominaisuuksia (Cheeseman, 1981) .

Maidon rasva on sus pendoituneena hiukkasiksi , joiden läpi­

mitta on 100...10000 nm (keskiarvo 2000...4000 nm). Niitä suojaa fosfoi ipi deistä , 1 i pop rote i i neis ta , kaseiineista ja

immunoglobuliineista muodostunut membraani. Sen ulko­

pinta on helposti liukenevaa löysästi sidottua proteiinia, mutta se sisältää myös lujasti rasvoihin sitoutuneita

hydrofobisia lipoproteiineja (Morr, 1 982).

(14)

1.3.3 Saostunisen mekanismi

Saostuminen voidaan jakaa kahteen vaiheeseen: к-kasei ini- ketjujen katkeaminen sekä m i s e 1 1 ien koagu1 o ituminen ja geeli уtyminen. Kymosiini katkaisee ensimmäiseksi

k

- kaseiinin para-K-kaseiiniksi ja 64 aminohapon g 1 уko- peptidi ketjuksi sidoksen Phe Q

5

~^eti об ^ohda ' ta • Reak­

tioon vaikuttavat к-kaseiinin aminohapot ^'sio2~^eU103~

^'•l0í.-^105‘il2Í.106-A'a107‘"el08-pro109-

NiinpS kun joku näistä on jollakin tavoin sitoutunut muihin molekyy-

leihin, kymosiinin toiminta hankaloituu tai estyy kokonaan.

Entsymaattinen vaihe tapahtuu myös kylmässä, mutta maitoa

on hyvin vaikeaa saada saos tumaan lämpötilan ollessa alle 15°C (Richardson, 1 975). Prosess itekni sest i tämä on tärkeä

piirre ajateltaessa immobi 1 i so i dun entsyymin käyttöä.

Kun 85-90 % entsyymi reaktiosta on tapahtunut, kaseiinit alkavat agg regoitua miselleiksi. Vasta kun 97 % к-kaseii - nistä on hydrolysoitunut, misellit agg regó i tuvat saostumaksi

(Da 1 g 1 eis h, 1979). Tämä edellyttää, että lämpötila on tarpeeksi korkea ja riittävä määrä kalsiumioneja on läsnä.

Saostuminen etenee, kunnes muodostuu geeli, jonka sisälle jäävät maidon rasva- ja vesiosat sekä niihin liuenneet aineet ja mikrobit. Geelin ominaisuudet riippuvat käyte­

tyistä olosuhteista ja ovat kullekin juustotyypi1 le ominai­

set, samoin kuin tapa, jolla hera erotetaan juustomässästä.

Saostuman fysikaalinen ja fysikaalis-kemiallinen rakenne ratkaisee, miten kypsymi svaiheessa olennaiset aktiiviset entsyymit, mikrobit ja vesi sitoutuvat siihen. Tämä taas vaikuttaa oleellisesti juuston kypsymiseen ja sen rakenteen muodostumiseen.

Maito koaguloituu, kun к-kaseiinin* suojaava vaikutus lakkaa.

Para-K-kaseiini ei pysty ka 1 s i um i onien läsnäollessa stabi­

loimaan misellejä, jotka takertuvat toisiinsa ja paljon suurempien ra svahiukkas ten proteiinipitoisiin memb raaneihin muodostaen eräänlaisia ketjuja. Nämä yhtyvät sopivissa olo­

suhteissa tiheämmäksi proteiiniverkoksi, joka edelleen

(15)

vetäytyy kasaan, jolloin sen sisään jäänyt hera puristuu ulos. Tätä synerees¡vaihetta tehostetaan usein esim. leik­

kaamalla tai puristamalla saostumaa, jolloin hera vapautuu nopeammin geelin huokosista.

Geelin muodostumista voidaan nopeuttaa nostamalla lämpö- tilaa tai Ca -konsentraatiota. Toisaalta tällöin myös geelin rakenne muuttuu. Matala pH saattaa aiheuttaa liian karkean saostuman, kun taas kalsiumin lisääminen tekee saostuman lujemmaksi (Cheeseman, 1981).

G reen i n ja Mo ran tin (19 81) havaintojen mukaan ka se i i ni­

mi s e 1 1 ien agg regóiturninen seurasi niiden satunnaisista

törmäyksistä. Reaktio ei suosinut mitään erityistä misellin kokoa siihen osallisten partikkelien tai lopputuloksena

muodostuvien aggregaattien suhteen. Partikkelien diffuusio ratkaisi reaktionopeuden, eikä niiden välinen reaktio.

He päättelivät, että kaseiinien väliset sidokset olisivat todennäköisesti seurausta ionisista tai hydrofobisista vaikutuksista, eivätkä kova 1 en11 i s i a .

1.4 Juuston kypsyminen

Maidon rakenneosien hajoaminen kypsyvässä juustossa, mistä seuraa sen tyypillinen maku ja rakenne, on monien reakti­

oiden tulos. Vain osa näistä reaktioista on entsymaatti- sia (Adda et ai., 1982) . Ratkaisevaa ei ole niinkään jonkin tietyn entsyymin yksittäinen toiminta, vaan eri tekijöiden yhteisvaikutus. Kypsymisvaiheessa vaikuttavat entsyymit tulevat hapatteen bakteereista, itse maidosta tai sen

mikrobeista, kypsytykseen käytetyistä mikrobeista ja j u o k- setteesta. Kuvassa 2 on esitetty tärkeimmät en tsymaattiset reaktiot ja niiden vaikutukset kypsymisvaiheessa .

Juustojen aromiaineet syntyvät pääosin maidon rasvojen ja proteiinien hajoamistuotteista usein tuntemattomien meka­

nismien kautta . Rasvoista ovat peräisin metyy1 iketonit (erit. homejuustot), erilaiset esterit sekä y- ja 6-laktonit

(16)

Protei init

Rasvat

Sokerit

Proteoosit I

Pepton it Peptidit Aminohapot

I

Rasva- A1dehydit

Esterit Ammoniakki

Vetysulfidi

MAKU

AROMI

RAKENNE

JUOKSETE normaalit MAIDON MIKRO-ORGANISMIT (renniini) ENTSYYMIT ja МАРАТЕ

Kuva 2. Kaavio juuston makuun ja rakenteeseen vaikut­

tavista entsymaatti sis ta reaktioista kypsymis- vaiheessa (Scott, 1979).

(Cheddar). Proteolyysissä syntyy aineita, jotka joko

sellaisenaan ovat flavorin ja aromin kannalta tärkeitä tai iotka ovat aromiaineiden prekurso reita . Lisäksi proteo­

lyysissä voi vapautua proteiineihin aiemmin sitoutuneita makuun vaikuttavia yhdisteitä. Peptidit ovat usein sel­

laisenaan aromiaineita, kun taas aminohaoot toimivat paremminkin lähtöaineina, kun syntyy makuun vaikuttavia yhdisteitä: amiineja, aldehydejä, rikkiyhdisteitä (esim.

metaanitioi i, di me tyv1 i su1 f i d i ) tai aromaattisia aineita (fenoli, kresoli, asetofenoli, indoli) (Adda et at., 1982).

Nykyisen käsityksen mukaan juuston redox-potentiaa 1 in tulee olla riittävän alhainen, jotta aromiaineita synnyttävät kemialliset reaktiot tapahtuisivat (Manning. 1979). Mitä vilkkaampaa mikrobito i min ta juustossa on, sitä voimak­

kaammin redox-potentiaa 1 i laskee ja kypsyminen nopeutuu.

Myös pH:n merkitys tässä suhteessa on suuri, sillä se sää­

telee entsyymiaktiivisuuksia ja suolojen, erityisesti

(17)

Kypsymisen kannalta tärkeän saostuman vesipitoisuuden määräävät mm. koaguloivan entsyymin ominaisuudet, koagu-

lointiolosuhteet, heran erottamistapa ja saostuman käsit­

tely. Kun vettä on runsaasti läsnä, saos tumaan jääneet entsyymit pystyvät toimimaan tehokkaasti ja vapauttamaan mikrobien kasvua kiihdyttäviä yhdisteitä. Myös mikrobien elinolosuhteet paranevat vesipitoisuuden kasvaessa. Niinpä paljon vettä sisältävät juustot kypsyvät kuivempia nope- ammin (Scott, 1 979).

Liian suuri tai vääränlainen entsyymiaktiivisuus koagu- lointivaiheessa saattaa aiheuttaa hankalia ongelmia.

Voimakas proteo 1yysi lisää heraan liukenevien peptidien määrää ja pienentää näin saantoa. Lisäksi saostumasta voi tulla liian pehmyt ja hauras, tai kaseiini ei pysty sito­

maan itseensä normaalilla tavalla suoloja ja rasvoja, jol­

loin ni iden jäädessä heraan juuston saanto pienenee ja maku muuttuu (Scott, 1979).

Maidon koagu1 o i n ti in käytetystä kymosiinistä on 2-3 % yhä aktiivisena kypsymisvaiheessa (Scott, 1 979) • Aluksi

kymos i i n i ka t*koo ^-kase i i n i n (ensin sidoksista Phe^ ~ Phe2it ja Phe^-Va 1 2g) suhteellisen pitkiksi polypeptidi- ketjuiksi. Se hydrolysoi ß-kasei i nia vain vähän. Hapate- mikrobien peptidaasit pilkkovat muodostuneet polypeptidit edelleen lyhyemmiksi tai vapaiksi aminohapoiksi .

Juuston kitkeryys johtuu yleensä proteolyysissä syntyvistä o 1 igopepti de i stä . Nämä ns, katkeropeptidit koostuvat

9-20 aminohaposta. Kaikki tämän kokoiset kaseiinin hydro- 1yysituot teet eivät suinkaan ole kitkeriä; miksi toiset ovat ja toiset eivät, on epäselvää. Katkeropepti de i 11 e on yhteistä hyd rofobisuus ja se, että C-terminaal inen amino­

happo useimmiten on leusiini, i so 1 eusiini , väliini, fenyl- alaniini tai lysiini (Vihma, 1976). Katkeropeptidejä voi muodostua kaikista kaseiineista, ja kaikki juoksete-entsyymit

(18)

väittävät pääasialliseksi lähteeksi as - ka se i i nia. Scottin (1979) mukaan kitkeryyden kehittyminen on todennäköistä, kun voimakkaasti proteolyyttiset entsyymit katkovat kase-

iiniketjut epätavallisista sidoksista.

Kitkerää makua voivat myös aiheuttaa juuston kypsyessä kehittyvät muut yhdisteet: aminohapot, amiinit, amidit, substitutoidut amidit, pitkäketjuiset ketonit ym. (Adda et ai. , 1982). Toisaalta peptidit sellaisenaan tai rea­

goituaan muiden komponenttien kanssa vaikuttavat osaltaan halutun ja kullekin juustolle tyypillisen maun muodostu­

in iseen.

Kitkeryyden kannalta ovat hapatteen peptidaasit oleelliset, sillä ne hajottavat katkeropeptidejä 1yhytketjui s iksi ei- kitkeriksi yhdisteiksi. Kun joidenkin hapate- tai home- kantojen entsyymit eivät tähän pysty tai proteolyysissä syntyy katkeropeptidejä nopeammin kuin niitä hajoaa, tulok­

sena on kitkerä maku. Niinpä on tärkeää löytää kullekin juoksetteelle sopivat prosessiolosuhteet ja niihin oikea hapate, sillä sekä Vihma (1976), Scott (1979) että Adda et ai. (1982) ovat sitä mieltä, että kitkeryyden synnyssä ovat prosessiolosuhteet merkittävämpiä kuin proteolyysi.

Ilmeisesti tämä ei kuitenkaan päde voimakkaisiin eî-spesi- fisiin bakteeriproteinaase i h i n (Scott, 1979) •

Lipaasit ovat liiallisesti esiintyessään hyvin haitallisia, aiheuttaen eltaantunutta makua kypsymis vaihees sa

(Sternberg, 1 976). Kuitenkin juoksetteen proteo1yy11 i set ja 1 i po1yy11iset epäpuhtaudet vaikuttavat oleellisesti makuun, sillä kemiallisesti puhtaan kiteytetyn kymosiinin avulla tehty juusto ei maultaan vastaa normaalilla tavalla valmistettua (Berridge, 1955). Useissa juustolaaduissa jonkinasteinen lipolyysi on välttämätön, jotta haluttu maku muodostuisi. Lipaasit vaikuttavat proteinaasien tavoin monimutkaisessa yhteistoiminnassa, jossa entsyymit ovat

(19)

peräisin j uoksetteen lisäksi hapatteesta , kypsytykseen käytetyistä homeista tai muista mikrobeista sekä maidosta.

Ne vapauttavat juustoon rasvahappoja, jotka toimivat edel­

leen lähtöaineina erilaisissa reaktioissa, joiden tulok­

sena syntyy mm. aromiaineita (Adda et ai., 1982).

Juuston rakenteen ja lujuuden muuttumiseen kypsymisen

aikana vaikuttavat erityisesti pH, vesipitoisuus, kalsium- ion i kon s entraatio ja juustoon jääneen aktiivisen kymosiinin määrä. pH säätelee entsyymiaktiivisuuksia ja suolojen liu- koi.suutta. Kalsiumpitoisuuden noustessa juuston lujuus kasvaa, sillä kalsium toimii sitovana aineena. Juustossa toimiva kymosiini on tärkein pehmenemisen aiheuttaja hydro-

lysoidessaan etenkin tukirakenteena toimivaa as -\ ~kase i i n i a (Adda et ai., 1982) .

2. VAS I KANRENN I I N I N SÄÄSTÖMAHDOLIL I SUUDET

2.1 Perinteisen kymosiinin korvikkeet

Juustoja on valmistettu va s ikanmahajuoksette i 11 a jo tuhan­

sia vuosia. Taito on niin laajalle levinnyt ja traditiol­

taan vahva, että juuston maun, aromin, koostumuksen tai rakenteen radikaali muuttaminen on hyvin vaikeaa. Tämä rajoittaa pahiten uusien kymosiinivalmisteiden käyttöön­

ottoa. Tosin viime vuosikymmeninä vasikanmahajuoksetetta on ollut saatavissa yhä niukemmin ja sen hinta on kysynnän kasvaessa noussut, minkä vuoksi se on osin korvattu muilla valmiste!1 la.

Useista kasveista voidaan eristää maitoa koaguloivia ent­

syymejä, mutta niillä ei ole kaupallista merkitystä kymo­

siinin korvikkeina. Sen sijaan eläinkunnan tuotetta,

pepsiiniä, käytetään laajalti. Sitä eristetään pääasiassa sian tai naudan ruuansulatuskanavasta, mutta sitä saadaan muistakin eläimistä. Esimerkiksi Israelissa tuotettiin jo

1974-1975 puolet juustosta käyttäen kanan sisälmyksistä

(20)

uutettua entsyymiä (Scott, 1979) ja Buzov et ai. (1982) raportoivat onnistuneista juustokokeista ankan pepsi ini 1 la.

Pelkkää pepsi i niä käyttäen ei juustonteko täysin onnistu.

Saostuminen on hitaampaa, muodostunut saostuma on heikompi ja rasvatappiot heraan suuremmat kuin käytettäessä vasikan- mahajuoksetetta. Lisäksi juustosta tulee maultaan mieto.

Pepsi i nin aktiivisuus katoaa nopeasti pH : n kohotessa yli 6,5 : n, minkä vuoksi sitä ei voida käyttää kaikkia juusto­

laatuja valmistettaessa (Sardinas, 1972).

Pepsiini on luonnollinen epäpuhtaus (6 %) vasikanmahajuok- setteessa, joten siihen on aktiivisuuden lisäämiseksi luon­

tevaa sekoittaa pepsi i niä. Jo 1 960-1 uvu1 ta alkaen on näiden entsyymien seosta, enimmäkseen suhteessa 1:1, käytetty

USA:ssa yleisesti juustonvalmistuksessa (Scott, 1979).

Vasikanmahoj en puutteen vuoksi kehitys on kulkenut kohti yhä enemmän pepsi i niä sisältäviä eläinperäisiä entsyymejä.

Itse asiassa kaupallinen vasikanrenniini saattaa nykyisin sisältää sangen paljon pepsi i n i ä . Vas ikanmahaj uoksetteiden koostumusta tutkittiin kromatografisin menetelmin 1970—

luvulla Hollannissa (de Koning, 1978), Ranskassa (Ribadeau- Dumas ja Garnot, 1973), Irlannissa (O'Leary ja Fox, 1974) ja Tanskassa. Tutkituissa valmisteissa oli pepsi i niä 10-6 0 %, useimmissa yli 35 %. Suomessa vuonna 1976 käyte­

tyistä 1 00-prosenttisten kaupallisten kymosi i nipohja i sten"

juoksetteiden maitoa saostavasta aktiivisuudesta oli pep­

si iniakti ¡visuutta 26-27 &. Pepsiini-renniIniseoksi1 la (50:50) vastaava luku oli 65*73 % (Honkavaara ja Kaista, 1976). Kaikissa Argentiinassa testatuissa kaupallisissa 1 8 kymosi i nipöhjaises sa juoksutteessa pepsi i nin osuus maitoa saostavasta aktiivisuudesta oli 84-95 %. Tämä

johtui siitä, että entsyymit oli eristetty täysikasvuisten nautojen mahasta (Muset, 1982) .

Vaikkakin monet mikrobit tuottavat proteinaaseja, vain harvat niistä ovat riittävästi perinteisen kymosi i nin kaltaisia. Kaupallisesti merkittäviä kymosi i nin korvik­

keita tuottaa kolme hometta: Muaor pusillus, Muaor miehei

(21)

ja Endothia parasitica. Tyypillinen ongelma m i k robij uok- setteita käytettäessä on liika proteolyyttinen aktiivisuus, joka aiheuttaa hydrolysoi tuvan kaseiinin hävikkiä heraan ja makuvirheitä valmiissa juustossa. Lisäksi muodostunut saos­

tuma saattaa olla fysikaalisesti heikko tai kykenemätön sitomaan itseensä riittävästi maidon rasvoja ja kivennäis­

aineita.

Ch r i s ten sen i n (1974) mukaan v. 197** käytettiin USA : s sa erilaisia juoksetteita seuraavasti : 15 % kymosiinia, 25 % kymosiini-pepsiini-seosta ja 60 % mikrobientsyymejä.

Nelsonin (1975) mukaan vastaavat luvut olivat: 15 % kymo­

siinia, 40 % kymosi ini-pepsi ini-seosta ja 40 % Mucor- renni inej ä.

Suomessa mikrobijuoksetteista käytetään miltei yksinomaan E. parasitical tuottamaa Suparenia. Käytön määrästä on vaikea saada tarkkaa tietoa. Valion, jonka osuus juuston tuotannosta on 8 5 %, kulutus on 6500- 1 1 000 dm /a. Valio 3 valmistaa vuodessa 23,7 miljoonaa kg Emmental-juustoa, josta 87 % Suparen illa. Muiden juustojen valmistuksessa se ei käytö mikrobijuoksetteita. Sveitsissä kaikki Emmen ta 1 - juusto tehdään m i k robi renn i i nien avulla (Vihma, 1 983) .

2.2 Juokset teen käytön vähentäminen

Juoksetetta voidaan säästää muuttamalla prosessiolosuhteita juustonva1 mistuksessa. Maitoon lisätty CaC^ lyhentää

saos turnisaikaa, mutta vaikuttaa myös kypsymisominaisuuksi in, minkä vuoksi sitä ei voida käyttää kaikkia juustolaatuja valmistettaessa (Green, 1977). Muita vastaavia keinoja ovat koagulointilämpötilan nostaminen, maidon pH : n laskeminen ja koagulointiajan pidentäminen. Toisaalta nämä toimenpiteet vaikuttavat myös saostuman rakenteeseen.

Maidon konsentroiminen ultrasuodatuksella ennen koaguloin- tia voi vähentää renn i i n i n tarvetta jopa 80 % ja tällöin myös heraan jäävän aktiivisen entsyymin talteenotto tulee

(22)

kannattavammaksi (C hoj nows ki et a Z., 19 81) . Maidon käsit­

tely immobi 1 i so i du 11 a ren ni ini 11ä tai proteinaas i 11 a alle 10°C: s sa ja säestäminen sen jälkeen lämpötilaa nostamalla on myös eräs mahdollisuus (esim. D1 Souza ja Pereira, 1982)._

3. JUOKSETTEELTA VAADITTAVAT OMINAISUUDET

3.1 Prosessiolosuhteet ja juoksete-entsyymit

Samanlaisten juustojen valmistaminen eri juoksettei ta käyt­

täen vaatii eri prosessiolosuhteet. Samaten juustonteon olosuhteiden muutos muuttaa juuston laatua, vaikka käytetyn kymosiinin määrä ja laatu pysyisikin samana. Käytännössä pyritään standardisoimaan sekä olosuhteet että entsyymi, ja j uustonvaImistus perustuu oleellisesti käytännön kokemuk­

seen ja ammattitaitoon (Sternberg, 1976).

Verrattaessa eri juoksetteiden käyttöä on olennaista tuntea proteolyyttisen aktiivisuuden luonne ja sen suhde maitoa saosta vaan aktiivisuuteen, sekä näiden muuttuminen prosess i-

2 +

olojen vaihtuessa. Erityisesti Ca -kon sen t raa t i on , pH : n tai lämpötilan vaihdos muuttaa sekä koaguloivien entsyymien ominaisuuksia että niiden tarvetta. Näitä muutoksia ei hallita teoreettisesti, vaan käytännön kokeet ratkaisevat kunkin entsyymin soveltuvuuden ja sille parhaat prosessi- o 1osuhteet.

On edullista, jos juoksetteen entsyymit ovat riittävän lämpölabii leja, jolloin niiden aktiivisuuksia voidaan muut­

taa lämpökäsittelyllä. Niiden tulisi kestää myös lievästi alkaliset olosuhteet. Koaguloivan aktiivisuuden ja saostuman

rakenteen tulisi riippua mahdollisimman vähän maidon kalsium- pitoisuudesta, sillä kalsiumin määrä maidossa vaihtelee eri karja rotujen, vuodenaikojen ym. seikkojen mukaan (Scott, 1979) .

(23)

kasvuliuosta sellaisenaan tai siitä esimerkiksi ultrasuoda- tuksella tai seostamalla saatua entsyym ikonsen t ra a 11ia.

Mukaan tulee usein kasvualustan komponentteja ja mikrobien aineenvaihdunnan tuotteita kuten erilaisia entsyymejä.

Näistä erityisesti proteinaasit ja lipaasit voivat aiheut­

taa makuhaittoja ja muitakin ongelmia.

Itse ren n i i ni-proteinaa sin tulee olla mahdollisimman spesi­

finen, joskin proteolyyttistä aktiivisuutta tarvitaan sopiva vähäinen määrä. Tavallisesti m ikrobiperäi s i 11ä kymosi i ni- valmisteilla proteolyysi kypsyvässä juustossa on liian voima kasta. Tällöin saattaa olla kyse toisesta, kymosiinista vain hiukan eroavasta proteolyyttisestä entsyymistä, joka on kuitenkin sen kanssa niin samankaltainen, ettei niiden erottaminen toisistaan ole onnistunut. Näiden kymosiinin- omaisten proteinaasien muodostuminen riippuu tuottajakan-

nasta, ja kuten joissain tapauksissa on osoitettu, vieläpä fermentointiolosuhteista ja alustastakin (Pozsàr-Hajnal ja Hegedüs-Völgyesi, 1975).

Hera on juustonvalmistuksen monikäyttöinen sivutuote,

eivätkä juoksetteesta heraan joutuvat entsyymit saa alentaa sen käyttöarvoa. Niinpä on tärkeää, että herassa haitalli­

set juoksetteen proteinaasit, lipaasit, sellulaasit ym.

voidaan inaktivoida yksinkertaisesti ja kohtuullisin kustan­

nuksin esimerkiksi lämpökäsittelyn avulla.

M ikrobi renn i i nien tapauksessa on syytä kysyä, voidaanko niille asetettuja laatuvaatimuksia lieventää tai muuttaa.

Joka tapauksessa niillä on mahdollista tuottaa ravitsevia ja maukkaita juustoja, jotka maultaan kylläkin saattavat poiketa perinteisistä juustomerkeistä. Tällöin annettai­

siin myöten m i krobi ren n i i nien ominaisuuksille ja markkinoi­

taisiin uusia ja kiinnostavia tuotteita. Kuitenkin talou­

delliset riskit ovat tällöin suuret suhteessa mahdolliseen

(24)

tuottoon, etenkin kun kuluttajien makua juustojen suhteen pidetään konservatiivisena (Scott, 1979)•

Mikrobirenniinien onnistunut käyttö vaatii muutoksia juus­

ton va 1 m i s tu s p ro ses s i i n (Cheeseman, 1981; Sternberg, 1976).

Lisätutkimuksen ja käytännön juustokokeiden perusteella prosessitekniikkaa voidaan muuttaa yhä soveliaammaksi vasi- kan renn i i nin korvikkeille. Tällaista kehitystä hidastaa juustokokeiden työläys ja kalleus sekä perusteellisen tiedon puute itse prosessista ja juuston kypsyessä tapahtuvista kemiallisista ja entsymaattisistä reaktioista. Niinpä

traditionaaliseen amma11i peri n tees een nojautuen pitäydytään mahdollisimman paljon vanhassa ja hyväksi koetussa (Scott,

1979). Näin ollen tärkein vaatimus mikrobi renn i i n i 11 e on, että sen on muistutettava vasikanmahaj uoksetetta niin pal­

jon kuin mahdollista.

k . M I KROB I RENN UNIT JA NIIDEN TUOTTO

k.1 Biokemialliset ominaisuudet

Hyvin monet mikrobit tuottavat maitoa koaguloivia entsyy­

mejä, mm. Sardinas (1968) testasi 921 kantaa , joista yli puolet tuotti maitoa koaguloivaa aktiivisuutta. Maidon saostamista on jopa käytetty proteolyyttisen aktiivisuuden osoittamiseen. Usein on kysymys valikoimattomasta proteo- lyysistä, jolloin liiallisen hydrolyysin ja makuhaittojen takia ei entsyymiä voida käyttää j uustonvalmistuksessa.

Vain muutama mikrobi tuottaa kymosiinin korvikkeeksi ke 1 - paavaa entsyymiä, jonka proteo1 yy 11 i set ominaisuudet muis­

tuttavat tarpeeksi paljon kymosiinin ominaisuuksia.

Kuvassa 3 on esitetty erilaisten maidon koagu1 o i nt i i n käy­

tettyjen puhdistettujen kymosiinien ja proteaasien vaikutus hapettuneeseen insuliinin В-ketjuun. Philippos ja Christ

(1977) selvittivät aminohappojen osuudet erilaisissa kaupal lisissä maitoa saostavissa entsyymeissä ja totesivat, että

(25)

Ö

N Csl

-tt -4" 04 -T

ti r*«* ru r*> O 04 ö

04 (Ti 04 ---1 04 r> 04

C Х-Ч O' +3

0) -3- JZ ^ 0)

V) чО U) cn

C 04 C c П) o 3 L. 1- tn X—*4 cu

<D r- c c L. O 03 4-1 <D E cm 1-

“Э ^ ru (U <u ■— U ru г^ч ru

<U 1 E E -C ti *— ru 0) c - 04 -C

4-» СП 4-1 4-1 3 4-1 L.

C L- ru O O <D 1-

ru o o o -í¿ U -C 4U o

> m Li. Ll. z o Z 3 cc V) X

« O

<u 03 03 03 •tt CO

-o s s S •tt

x: Г<Ь T<> v-Д •tt •tt •tt

îfô C C c *tt r-¿’tt *tt я;<3) J? COti •tt-tt

03 CO 03 ti <31 tt rO

V) tn S я я •tt •tt ti я

vi O tn £3- o tt, E E tt. 03

m E CL

C >- > o)

(U -* CL S: s: s: s: РУ CQ

85

"i

" H

*P Я 5*• o.

s| * **■

л ^”O

■jr

?

**o e

= Й

• •3~>

»- 2-Д

=i - **■

=3

•*?«3 ->

„i —-i si

•ж -? g.

►Ö-8

•i -i i

•I

■3

"1 L_

C C

Шc c

<D

0)(П

<u 0)c 3 O)

Q-

4->3

3

m

>

c<D

c<u

3cn

<U

O

Co

"O E c • 0) c

-M 3 V) 3

— •—I

<0 4-1

— <D

—1- I Ш CÛ m

ÍD

>

3

(26)

ne eroavat selvästi toisistaan. Kuva 3 ja nämä tulokset osoittavat, että biokem î a 11 i ses ti on kyse selvästi eri entsyymeistä, joiden kokonaisvaikutus maitoon on kuitenkin samankaltainen. Taulukossa A on esitelty eri entsyymien ominaisuuksia.

Taulukko A. Juoksete-entsyymien ominaisuuksia.

Koonnut Vihma (1976).

" entsyymi kymo- si ini

M. pusill. Lindt

M.

miehei

E. para­

sitica

proteolyysin pH-optimi

substraattina kaseiini 3,5 3,5

.

2,5

K-kaseiini - A,5 -

hemoglobiini A ,0 A.O A,5 2,0 stab i i 1isuusalue (pH) 5,3-6,3 A,0-6,0 3,0-6,0 A,0-5,5

(juoksettamisakt. säilyy)

molekyy1ipai no 31000 29000 AOOOO 37000

A.2 Kaupalliset entsyymit

Kaupallista merkitystä oli v. 1982 kolmen homeen entsyy­

meillä, jotka on esitelty taulukossa 5. Ne ovat hallin­

neet markkinoita jo 70-1uvun alusta lähtien, eikä uusia vastaavia tuotteita ole löytynyt. Sternbergin (1976)

mukaan tämä on osaltaan hidastanut uusien mikrobirenniinien tuottajien etsintää. Toinen syy hänen mukaansa on juuston tuottajien haluttomuus tällöin tarvittaviin kalliisiin ja laajoihin juuston valmistus kokeisiin. Toisaalta nykyisten

(1976) valmisteiden laatua kritisoidaan hänen mukaansa jatkuvasti, ja koko ajan on patentoitu uusia tuottaja- kantoja .

Markkinoilla on ollut myös Bacillus-kantojen tuottamia entsyymejä. S. subtilis\n tuotetta, nimellä Milkozym, on käytetty Tjekkos kova kia s sa rajoitettuja määriä juuston- valmistukseen (Hav1 ova ja Dolezalek, 1973). Sitä on ollut markkinoilla myös nimellä Microzyme (Scott, 1979).

(27)

Taulukko 5. Kaupallisia mikrobi renn i i nejä. Tiedot koonnut Lommi (1 982) . Juoksetteen voi­

makkuus on ilmeisesti määritetty Soxhletin menetelmällä. Valmistajat: P = Pfizer Inc., SP = Société Rap i dase, NL = Noury S van

der Lande, Meito Sangyon prosessi, N = Novo Industri A/S, KJ = N.Kjaergaard-Jensen

Eftr. A/S, M = Miles Laboratories Inc.

HL = Chr. Hansen's Laboratories Inc.

Homeet: EP = Endothia parasitica, ML = Mucor pusillus var. Lindt, MM = Mucor miehet.

Каира 11 inen nimi Voimakkuus 1 :

olomuoto käyttö valmis­

taja

home

Suparen

- green label 15 000 jauhe emmental P EP - blue label 120 000 jauhe emmental P EP Noury 90 000 jauhe femmental

ledam NL ML

Fromase 50 000 jauhe edam SP MM

Renn i 1 ase 7 000 1 i uos edam N MM

Miki Ekstract 6 000 1 iuos edam KJ MM

Hann i lase - - - HL MM

Sure-Curd - - - HL EP

Me i to - - - - ML

Rap i da se - - - - MM

Marzyme - - - M MM

B. polymyxan tuottamaa entsyymiä on myynyt japanilainen Godo Suse i Co. lähinnä koeta rko ituksi in nimellä Milcozym (I mai ja Irie, 1972). Bakteeriperäisten renn i i nin korvikkeiden tuotannossa on ilmennyt hankaluuksia entsyymi 1 iuosten puh- distusvaiheessa, ja niiden haittana on valikoimaton proteo-

lyyttinen aktiivisuus, joten niiden kaupallinen merkitys on vähäinen (Scott, 1979).

4.3 Mucor pusillus - renn i i n it

Mucor pusillus

var. L i n d t: n tuottama juoksete tuli markki­

noille vuoden

1967

tienoilla. Entsyymiä käytettäessä juusto-

saanto on pienempi kuin vasikankymosi ini 1 la, etenkin saostuman

rasvat pyrkivät liukenemaan heraan . Liiallista proteolyyt-

(28)

tis tä aktiivisuutta on voitu poistaa valmisteesta absorboi­

malla kasvu 1 iuoksesta haitallisia entsyymejä mm. silikaat- teihin, piioksidiin, hentoni¡tti in tai zeol i i tte i hin

(Scott, 1979). M. pusillus -renniinin ja vasikanmahaj uok- setteen seos saos taa maitoa tehokkaammin kuin entsyymien yhteenlaskettu aktiivisuus edellyttäisi. Tätä synergististä vaikutusta on selitetty mm. sillä, että ne seostaisivat

maitoa eri mekanismeilla (Trop ja Pinsky, 1971).

Muaor pusillus var. Lindt tuottaa kymosiininsa kiinteällä 1esea1 usta 1 la, johon on usein lisätty kivennäisaineita ( Pozsá r-Ha j na 1 et ai., 197i*a). Kirjallisuuden mukaan submerssiviljely epäonnistuu voimakkaan proteolyytt i sten

( Pozsá r-Ha j na 1 et al., 1 97*tb ) ta i 1 i po 1 yy 11 i s t en entsyy­

mien (Somkutî ja Babel, 1968) muodostumisen takia. Pozsár- Hajnal ia Hegedüs-Völgyesi (1975) osoittivat, että sub­

mer s s i ka sva t u s tuotti erilaisen maitoa seostavan entsyymin kuin pintavil iely. Khan et ai. (1979) erottivat ionin- vaih tok roma tog ra fia a käyttäen submerssikasvatuksella tuote­

tusta entsyymistä kaksi eri hapanta proteinaasia, joista toinen muistutti kymosiinia ja toinen oli valikoimattoman proteolyyttinen. Paras heidän käyttämänsä tuotantoa lusta sisälsi 1 % : n glukoosia ja 3 % maissini iotusvettä.

h.h Muaor miehei -renniinit

Useita renniinin tuottoprosesseja, joissa käytetään M. miehet -kantoja, on patentoitu vuodesta 1968 lähtien. Tämän mikro­

bin tuottamalle entsyymille on ominaista sen herkkyys lämpö­

tilan ja erityisesti kalsiumkonsentraation suhteen. Entsyymi on verrattain turvallinen ma ku ha it toj en kannalta vieläpä

pitkääkin kypsymisaikaa käytettäessä (Scott, 1979). M. miehein renniini on voitu jakaa kolmeen fraktioon, joista yhden

1ämpöti 1aopti mi oli selvästi muita korkeampi (Edelsten ja Jenssen , 197 0).

(29)

Feldman (1979) sai aikaan 'erinomaista Chedda r-j uus toa 1 entsyymillä, jota tuotettiin alustassa, joka sisälsi 82 % heraa, 5 % maissi tärkkelystä, 1 % pan imohiivaa ja 1 % glu­

koosia. Entsyymi erotettiin asetonisaostuksella.

Joyeaux: n (1982) hakeman patentin mukaan entsyymiä voidaan tuottaa alustalla (450 kg), jossa on 16,2 % rakeista tärk­

kelystä, 4 % soijajauhoa, 2 % herajauhetta, 0,013 % soija- öljyä ja tarpeeksi a-amy1 aa sia tärkkelyksen nesteyttämi- seksi . Kasvatuksen (37,9°C, 110-140 h) aikana lisättiin (NH^)2S04:a j a vaahdonestoainetta. Puhdistuksen jälkeen entsyymin avulla valmistettiin 'hyvänlaatuista Cheddar- juustoa'.

Myös Aun s t rup (1976) käytti tärkkelyspohjäistä alustaa (200 dm^ ) , joka sisälsi 4 % perunatärkkelystä, 3 % soija­

jauhoa, 10 % ohrajauhoa, 1 % CaCO^ra ja bakteeriamy1 aasia.

Tärkkelys nesteytetti in ja steriloitiin, jonka jälkeen se si irrostettiin 40 litralla samanlaisessa alustassa kaksi vuorokautta kasvatettua mikrobiviljelmää. Kasvatus kesti

121 h ja sen aikana pH pidettiin arvossa 6,5 ja vaahdon­

estoai neena käytettiin tarvittaessa soijaöljyä. Sekoitus-

- 1 3 - 3 . - 1

nopeus oli 400 min ja ilmastus 1 mm min . Samaa kantaa voitiin käyttää myös pintaviljelmänä 1esea1 us ta 1 la

(1 e s e : ve si = 1:1), josta entsyymi voitiin uuttaa vedellä.

Valmistetta käyttäen tehtiin juustoa ja ‘saavutettiin tyydyttävä maku ja saannot'.

4.5 Endothia parasitica -renniinit

Endothia parasiticaw renniinî eroaa selvemmin kymosiinistä kuin Mucor-renniinit, joiden kaseo1yytt i nen aktiivisuus on pienempi. Niinpä etenkin kun vesipitoisuus kypsyvässä juus tossa on korkea, sitä käytettäessä on vaarana kitkerän maun muodostuminen. Kitkeryyden välttämiseksi on sopivan hapat-

teen valinta osoittautunut tärkeäksi. E. parasitican ent­

syymiä ei suositella käytettäväksi yksinään, vaan seoksena va sikanmahajuosetteen kanssa. Sen käytön on todettu nopeut

(30)

tavan juuston kypsymistä ja maun muodostumista (Scott, 1979) Entsyymin etuja ovat pienempi herkkyys pH : n ja kalsium-

konsent raation vaihtelulle kuin vas ikankymosi i n i 11 a

(Sardinas, 1 972) ja lämpölabii 1ius. Scottin (1 979) mukaan 5 minuuttia 60°C: s sa inaktivoi sen.

C se rha ti ja Holló ( 1 972) etsivät optimiolosuhteita maitoa koaguloivan entsyymin tuotolle E. parasítica11a. He pää­

tyivät alustaan, joka sisälsi soijajauhoa, sakkaroosia, rasvatonta maitojauhetta sekä suoloja: N a N 0 ^ ^ H 2 P 0 ^ ja M g S 0 ^ . Kasvatuslämpötila oli 28-30°C ja pH 3-4. Proteo-

lyyttisen aktiivisuuden muodostumista he eivät mitanneet.

Sardinas (1968) käytti entsyymin tuottoon alustaa, jossa oli 3 % soijajauhoa, 1 % ce re 1 osea, 1 % rasvatonta maito­

jauhetta, 0,3 % NaN03 , 0,05 % KH2P04 ja 0,025 % MgSO^HjO.

Kasvatus 1ämpöti 1 a oli 28°C ja pH alussa 6,8. Ilmastus oli 0,5 m3m 3m i n 1 .

4.6 Muut homeet ja sienet renn i i nien tuottajina

Useat muutkin Mucor -suvun lajit tuottavat maitoa koaguloi- Via entsyymejä. Fraile et ai . (1981) viljelivät 1ese-hera- a1u s ta

1

la pintaviljelmänä M. bacilli formista , joka tuotti suhteellisen te rmolabiilia ja proteinaasiakti¡visuudeltaan alhaista entsyymiä. Kanta oli valikoitu testaamalla meso- fiilistä Mucor- kantoja, joista peräti kahden kolmasosan havaittiin tuottavan solunulkoisia proteinaaseja.

Belyauskaite et ai. (1979) kasvattivat Uuoov renninusta 1,5 m3: n fermentor i ssa. He käyttivät seuraavaa alustaa:

3 % maissi tärkkelystä, 1,5 % kaseiinia, 0,2 % Ca C12 ja 0,05 KH-PO. . Lämpötila oli* 30°C , alku-pH 5,5 eikä pH : ta säädetty. Ilmastus oli 0,8-0,9 m m "'min ja sekoitus 200 min"1. Entsyymi 1 iuoksesta he pystyivät erottamaan kolme proteinaasifraktiota, joiden molekyyl¡painot olivat likimain samat ja joista yksi muistutti pepsi iniä ja toinen kymosiinia. Näitä entsyymejä ei tutkijain mukaan voida

(31)

erottaa toisistaan edes geeli- tai i on i nva i htok roma tog ra fi- alla, minkä vuoksi tätä kantaa tuskin voidaan käyttää teol­

lisessa prosessissa.

Sardinasin (1972) , Sternberg in (1976) ja Scottin (1979) keräämien tietojen mukaan useat muutkin homeet ja sienet tuottavat kymosiinin kaltaisia entsyymejä. Tuotteliaimpia sukuja ovat Muoor, Rhizopus ja Aspergillus. Patentteja on myönnetty myös useille bas idiomykeettien käyttöön perus­

tuville prosesseille. Näissä on käytetty sieniä suvuista Coriolus, Fomitopsis ja Irpex. Ainakin seuraavien lajien tuottamilla entsyymeillä on tehty onnistuneita j uus tokokeita Basidiobolus ranarum, Conidiobolus sp., Aspergillus oandidus Entomophthora sp., Byssoehlamus fulva, Rhizopus niveus,

Irpex laoteus, Trametes ostreiformis ja Fomitopsis pinioola , jonka entsyymi kuitenkin tuotti kitkerähköä makua juustoon.

Myös Fusarium moniliforme (Ch rzanowska et ai., 1982) sekä Streptomyaes albogriseolus ja Streptomyoes rimosus (Hylmar et ai. , 1982) tuottivat entsyymejä, joiden avulla voitiin valmistaa kelvollista juustoa.

Vaikka monet muutkin sienet tuottavat maitoa koaguloivia entsyymejä, niiden käyttöä rajoittaa liian suuri proteo- lyyttinen aktiivisuus. Esimerkiksi Egyptissä tutkittiin Aspergillus oohraoeuV.ser\ entsyymi ntuottoa 1 970-luvulla.

Parhaaksi alustaksi osoittautui hera. Kuitenkaan entsyymiä ei voitu osoittaa erityisen käyttökelpoiseksi juuri korkean proteolyyttisen aktiivisuuden vuoksi (Ismail et ai., 1978).

k.7 Bakteerientsyymit

Vaikka bakteerit tuota n tomitta kaava s sa ovat osoittautuneet ongelmallisiksi ja saatu entsyymi proteo 1yy11i seksi, on bak- teeriproteaasei1 lakin tehty onnistuneita juustokokeita

(Scott, 1979)• Lupaavimpia lajeja ovat Bacillus subtilis ja В. polymyxa ja muita hyviä tuottajia В. oereus ja

B. mesentrious (Dimitroff ja P rodansk i , 1 973) , jonka ent­

syymiä on myös käytetty onnistuneesti juustonteossa.

(32)

Bacillus-kantojen fermento int¡alustoista on kirjallisuu­

dessa tietoja niukanlaisesti. RaO ja Mathur (1975) käyt­

tivät B. subtilisilla 5 % : n lesealustaa 37°C:ssa. В. poly- myxaa voidaan patentin mukaan kasvattaa 30 C: s s a alustassa, jossa on 10 % maissijauhoa, 0,1 % kuivattua hiivaa ja

0,005 % CaC12: a, joka voidaan korvata Ca-asetaat illa

(Godo Shuhei Co, Ltd., 1968). Veselov et al. (1975) käyt­

tivät samalle lajille alustaa, joka sisälsi 2 % tärkke­

lystä, 1 % peptonia ja suoloja: K 2 H P 0 ^ , KH2P04 * M9S0it*

MnSO^, Fe2(SO^)2 ja CaCO^.

4.8 Geeninsiirtotekniikka

Toukokuussa 1 982 va sikan rennÎ ini - tai prorenn i inigeeni oli kloonattu jo neljässä eri paikassa, joista kolme oli kaupal lista yritystä ja yksi Tokion Yliopisto (Anon., 1982) ,

Vuosi tämän jälkeen suunniteltiin entsyymin teollista tuo­

tantoa E. colin avulla ja kokeiltiin entsyymiä j uustonva1 - mistuksessa. Lupahakemus näin valmistetun entsyymin käy­

töstä juustonteossa oli tekeillä (Anon., 1983).

5. TUOTON OPTIMOINTI

Kymosiinin käyttäytyminen on niin tarkoin määritetty ja erityislaatuinen, että valmistettaessa sitä korvaavaa mik­

rob i renn i i n i ä tuotto ei voi juurikaan kasvaa laadun kustan­

nuksella. Juustonva1 m istuksen vähimmäisvaatimukset täyt­

tävässä tuotteessa on vielä paljon parantamisen varaa, ja paraskin mahdollinen käytetyn kannan tuottama entsyymi saavuttaa usein vain vaivoin nämä minimivaatimukset. Tuot­

teen laatuun vaikuttaa suuresti myös puhdistus- ja kon s ent­

ro i n t i va i heen onnistuminen, joskin suurin vaikeus on riit­

tävän hyvän tuottajakannan löytäminen.

Kasvualustan koostumus vaikuttaa osaltaan muodostuvan ent­

syymin määrään ja laatuun. Kirjallisuudessa annettuja tavallisimpia kasvualustan komponentteja ovat mm. leseet,

(33)

soijajauho ja tärkkelys. Myös heraa on käytetty. Vaikka­

kin lese on usein osoittautunut tuoton kannalta erinomai­

seksi, se on prosess i teknisesti hankala. Käytännön sovel­

lutuksissa kasvualustan komponenttien hinnan lisäksi on tärkeää, kuinka ne vaikuttavat kasvu 1 iuoksen puhdistus- ja konsentrointivaiheeseen.

Siirrosteen ikä tai aktiivisuus ei kirjallisuustietojen perusteella näytä useinkaan olevan tuoton kannalta kriit­

tinen. Raon ja Mathurin ( 1975) tuottaessa kymosiinin tyyppistä prote inaasi a pi 1 ot fe rmen to r i s sa S. subtilis illa ei siirrosteen aktiivisuudella ollut vaikutusta ka svu 1 i uok­

sen lopulliseen aktiivisuuteen eikä sen muodostumisen nopeu­

teen. C se rha t i ja Holló (1972) huomasivat, että

E. parasitiaao 2 4 tunnin ikäinen kasvusto oli li iän nuori , mutta kahden ja kolmen päivän vanhojen välillä ei ollut enää eroa. Poszár-Hajnal et a l. (1974b) havaitsivat, että M. pusillus var. Lindtin yhden ja kahden viikon ikäisten

kasvustojen itiöt siirrosteena saatiin samat entsyymi­

kon s en t raa t i o t , mutta itiöt kymmenen viikon ikäisestä kas­

vustosta tuottivat ka svu1 iuokseen jo vähemmän maitoa saos­

ta v a a aktiivisuutta. Edelliset esimerkit käsittelivät ravistelukasvatuksia. Aunstrup (1976) käytti suurta kas-

*5

vavien solujen siirrostusta: 50 nv 48 tunnin ikäistä

M. miehet -kasvustoa 200 litraan tärkkelys- ja soijapohjaista alustaa.

Rao ja Mathur (1975) etsivät В. subtilisi 11 e optimin ilmas­

tuksen ja sekoituksen suhteen . Sekoituksen lisääminen 3 0 0 : s ta 40 0 kierrokseen minuutissa nosti tuoton kolmin­

kertaiseksi. Samalla optimaalinen i 1mastusmäärä putosi puoleen. Homefermentaati o i s sa asia on mutka 11 isempi , sillä

renniinin tuottajilla ongelmaksi voi tulla my see 1 in rikkou­

tuminen käytettäessä kiivasta sekoitusta. Aivan kasvatuksen lopussa se saattaa olla eduksikin, sillä tällöin entsyymin vapautuminen kasvu 1iuokseen saattaa nopeutua (Bailey, 1 982) . Aunstrup (1976) käytti 200 dm^:n fermentor i s sa M. mieheiWe

3 -1

ilmastusta 0,2 m -min

(34)

Kasvatus 1ämpöt¡1 ana on kirjallisuuden mukaan käytetty homeille noin 30°C, paitsi M. mieheilie 37~38°C (Joyeaux,

1982 ja Feldman, 1979) ja Bacillus-suvun bakteereille

esimerkiksi 3 7°C (Rao ja Mathur, 1975). Käytetystä pH :sta on vähemmän tietoja; se on vaihdellut välillä 3~7•

6. JÄLKIKÄSITTELY

Jälkikäsittelyn lopputuloksena on juustonvalmistuksessa käyttökelpoinen entsyymi liuos tai -jauhe, jonka saamiseksi kasvu 1Îuoksesta on poistettava solumassa, liuos on konsent­

roitava, usein siitä on poistettava haitallisia aineosia, erityisesti entsyymejä, ja se on standardisoitava.

Fermentoinnin aikana syntyvää ei-toivottua entsyymiaktiivi­

suutta voidaan joskus poistaa jollain yksinkertaisella ja käytännöllisellä menettelyllä, jopa vain sopivalla pH- tai

lämpökäsittelyllä. Joyeaux (1982) lämmitti M. miehein entsyymikonsentraattia 5 min 60°C:ssa inaktivoiden näin

lipaaseja ja es teraa seja. Kokusho et ai. (1976) vähensivät selvästi sel 1u1 aas i akt i i visuutta M. pusilluksen kasvu-

liuoksessa kuumentamalla se 5 minuutiksi 60°C:een pH : s sa 5.

NaCl-1 isäys edisti sel 1u1 aas¡n inaktivoi turnis ta ja stabiloi kymosiinia. Mitä enemmän Na C1 : a lisättiin, sitä parempiin tuloksiin päästiin. Suurin käytetty konsentraatio oli 20 %, mutta jo 5 % : n lisäys riitti stabiloimaan kymosiinin.

Teollisuuteen soveltuvista konsentrointimenetelmistä paras lienee ultrasuodatus. UItrasuodatuksen etuna esim. haih­

dutukseen nähden on myös se, että tällöin päästään eroon veden lisäksi monista muista pienimolekyylisistä kasvu­

alustan komponenteista. A1 ipainehaihdutuksesta on kirjal­

lisuudessa vähän mainintoja. Sardinas konsentroi E. para- sitican en tsyymil iuoksen 15-kerta i seen kon sent raatioon (1972) haihduttamalla 3 5°C:ssa ja pH : s sa 4,5. Tämän jälkeen seu­

rasi ammoniumsu1faattisaostus , dialyysi ja jät kopuhdistus.

(35)

Järkevä ja yksinkertainen tapa on lisätä erilaisia hento­

ni i 11 e j a tai hartseja suoraan kas vu 1 i uokseen. Tämä voi­

daan tehdä jo ennen sol urnas s an poistamista, jolloin lisätty aine saattaa myös auttaa solujen erottamisessa liuoksesta.

Mey rat h i n ja Vo1avsekin (1 975) mukaan erityisesti hento- niitit, permutiitti ja attapulgiitti, mutta mahdollisesti myös esim. kolloidinen pii, carbuniitti, f rancuni i tti , kao­

liini, silikageeli ja erilaiset jauhetut mineraalit absor­

boivat selektiivisesti proteiineja ja entsyymejä, mutta jättävät kymosiinin liuokseen. Ka 1unyants et ai. ( 1 983) sitoivat Muoor-renniinejä hentoni ittiin pH : s sa 2,8-3 lämpö­

jä H202~käsittelyssä. Entsyymi eluoitiin benton Iitistä etanol igradientti in.

Laboratoriossa on tavanomaista saostaa liuoksesta joko epä­

puhtauksia tai myös kymosiini jossakin fraktiossa (esim.

Ismail et ai. , 1978) suolojen tai orgaanisten liuottimien avulla. Erilaiset kromatografiset menetelmät ovat käyttö­

kelpoisimmat haluttaessa todella puhdasta entsyymiä (esim.

Kobayashi et ai. , 1982).

7. RENNI I N I EN OMINAISUUKSIEN MITTAAMINEN

Renni i nin laadun ratkaisevat sen avulla tehdyn juuston laatu ja saanto. Näitä ominaisuuksia on hyvin vaikea mää­

rittää laboratorio-oloissa, joten mitataan niitä kuvaavia helpommin tutkittavia suureita. Näitä voivat olla esim.

maidon koaguloitumisnopeus entsyymiä käytettäessä, saadun saostuman koko ja pysyvyys ja eri entsyymiaktiivisuudet.

Kirjallisuudessa esiintyy hyvin monenlaisia menetelmiä ren­

ni in ien ominaisuuksien selvittämiseen. Niitä on käsitellyt mm. G reen (1 977).

Juus tonva 1 mistuksen kannalta tärkeä proteolyyttinen aktiivi­

suus on luontevinta mitata kaseiinia vastaan. Substraat­

tina on kuitenkin käytetty myös hemoglobiinia, insuliinin

(36)

В-ketjua, synteettisiä peptidejä ym.. Kun lisäksi muut määr i tystu 1okseen vaikuttavat tekijät, kuten inkubointi- ajat ja -lämpötilat, puskuriliuokset ja pH:t, vaihtelevat, on usein kovin hankalaa verrata keskenään eri tavoin määri­

tettyjä proteolyyttisiä ominaisuuksia.

Maitoa koaguloivan aktiivisuuden perusyksikkö määräytyy tavallisesti sen entsyymimäärän mukaan, joka muodostaa mai­

dossa silmin havaittavan saostuman tietyssä ajassa. Tässä määrityksessä käytetään hyvin vaihtelevia laitteistoja ja olosuhteita. Lisäksi substraattina käytetyn maidon tai maitojauheen koostumus muuttuu vuodenajan, karjan rodun,

ruokinnan ym. seikkojen mukaan. Yleisimmin maitosubstraatti valmistetaan rasvattomasta maitojauheesta, mutta myös pastö­

roitua tai raakamaitoa käytetään. Teollisuuden käyttämä tapa on verrata kymosiinin korvikkeita standardisoituun

kymosi i n i 1iuokseen (Richardson, 1 975). Tällöin on kuitenkin muistettava, että eri entsyymit toimivat optimaalisesti eri olosuhteissa, joten saadut tulokset riippuvat jossain määrin määritysolosuhteista . Lisäksi kymosi i n i standard i n stabii- 1

liutta on vaikea seurata maidon laadun vaihtelujen takia.

Näistä syistä pyritään mm. kehittämään synteettisiä peptidi- substraatteja saostavan aktiivisuuden määrityksen standar- disoimiseksi (de Koning, 1978).

Juuston saanto voidaan määrätä tarkoin vain tekemäJIä juus­

toa. Laboratoriossa voidaan kuitenkin rajoitetusti tutkia saostuman suuruutta, pysyvyyttä sekä fysikaalista laatua ja viskositeettia (Green, 1977). Tällöin käytetään määrä­

tynlaisia olosuhteita ja tiettyä ma i to substraa11 i a , edellä kerrotuin ongelmin. Saannon ja laadun tarkempi selvittämi­

nen on jo sidoksissa pienen koejuuston valmistukseen, joka tulee kyseeseen vasta kun entsyymin teollista tuottamista a 1 etaan ha rkita .

Laboratoriossa määritetty koaguloiva aktiivisuus sekä sakan laatu ja hydrolysoituminen eivät välttämättä kuvaa täysin entsyymin toimintaa meijerioloissa. Syinä tähän ovat erot

(37)

esimerkiksi pH : s sa , lämpötiloissa ja myös maidon laadussa (Sardinas, 1972). Niinpä j uustokokeet ovat välttämättömät mikrobientsyymi n käytännön arvon määrittämiseksi kymo si i nin korvikkeena. Tällöin yhteistyö jonkun juustolan kanssa on välttämätöntä ja kustannukset melkoiset. Näin ollen jo

laboratoriomittakaavan kokeilla olisi saatava mahdollisimman selkeä käsitys kunkin entsyymin ominaisuuksista, vaikkakaan niiden perusteella ei voida tehdä lopullisia johtopäätöksiä.

Tärkeimmät laboratoriossa mitattavat suureet kehitettäessä kymosiinin korvikkeita ovat proteolyyttinen aktiivisuus, maitoa saostava aktiivisuus ja jokin juuston saantoa kuvaa­

va suure. Juustokoe voidaan osin korvata jollakin labora­

toriomenetelmällä, joka kertoo saostuman koosta, laadusta tai pysyvyydestä. Lisäksi on hyvä varmistaa, ettei tuote­

tussa entsyymi 1 iuoksessa ole liikaa muita ei-toivottuja entsyymejä kuten lîpaaseja tai seilulaaseja.

(38)

KOKEELLINEN OSA

8. KOELAITTEISTOT

Rav i stelukasvatuksissa 30°C:ssa käytettiin VTT : n biotekniikan laboratorion New Brunswick -ravisteli jaa (New Brunswick

Scientific Co, New Brunswick, N.J., USA). Muissa lämpö­

tiloissa käytettiin pienempää 1 a bo ra to rio ravi s te 1 i jaa (infos HT, tyyppi RT-1, Infos AG, Basel, Sveitsi), jota pidettiin 1ämpökaapis sa .

Ana 1yys ityöskente 1 y s sä ja erotettaessa kiinteä aines ja solumassa ka svu 1 iuokse sta käytettiin 1 a bora tori os entrifug i a

(CF-500-A, Labsystems Oy, Helsinki). Fermentori 1 iuokset 3 käsiteltiin tarvittaessa kapasiteetiltaan noin 4 dm : n

sentrifugilla (MSE Major, maahantuoja Laboteam Oy, Helsinki).

U 1tra suodatus 1 aitteenä oli TKK:n kemian osaston pumppuyksikkö (ruuvipumppu Seeberger, tyyppi SNP/12.2 H1 01), jossa käy­

tettiin P CI : n (Paterson Candy International, Whîtechurch, Englanti) kalvoja tyyppiä T 6 / В , modulin pituus 1,2 m ja kalvon pinta-ala 0,84 m .2

Kuva 4. Työssä käytetty fermentori1 a itteis to säätö- yksiköineen .

(39)

Liuos u11 ra suoda t us ta varten kasvatettiin VTT : n biotek­

niikan laboratorion 30 dm^:n siirrostefermentorissa.

Muutoin kasvatuksiin käytettiin Eschweiler-laboratorio- fermentoria (L. Eschweîler u. Co, Kiel, Saksan liittotasa­

valta), jonka kokonaistilavuus oli 5 dm^ ja jossa neste- 3

tilavuutena käytettiin 3 dm . Fermentor iin kuuluvat auto­

maattiset vaahdonesto- ja pH-säätöyksiköt, jotka on kyt­

ketty letkupumppuihin. Lisäksi siinä on jäähdytysveden ja 1ämpövastuksen avulla toimiva automaattinen lämpötilan

säätö ja i 1 ma s tusmäärän ja sekoitusnopeuden portaaton säätö.

Sekoi11imena on kaksi kuusi1 apa i s ta turbiinisekoitinta

(läpimitta 60 mm, fermentorin s isäha1 ka i s ij a 150 mm) samassa akselissa, joiden etäisyydet pohjasta olivat 50 mm ja 110 mm nestepinnan (3 dnv ) ollessa 18 0 mm : n korkeudessa. Fermen­

tor i 1 a i tte i sto on kuvassa k.

9. KOEJÄRJESTELYT

9.1 Materiaalit

Määrityksissä käytetyt materiaalit esitellään analyysimene­

telmien yhteydessä. Seu raavana on luettelo kokeissa käyte­

tyistä muista aineista.

Kasvualustan pääkomponentit (hi il ilähde):

lese (Mylly-Matti, Leipuri vehnä lese, Heisin- g i n kauppiaat Oy)

vehnä (Vehnä Oy, Raisio, jauhettu laboratorio- myi lyllä)

ohra (Lahden Polttimo Oy, jauhettu laborato- riomy11 y 11ä)

maissitärkkelys (Maizena, valmistaja A/S Maizena compagniet, Tanska)

(Soyolk, valmistaja Soya Foods Ltd.) soijajauho

soij a rou he maitojauhe herajauhe

herapermeaatti rankki

(Difco Bacto Skim Milk, dehydrated, Difco-0032-01)

(Herajauhe E, Kuivamaito Oy, Lapinlahti) (keskusosuusliike Valio)

(Rankki seos , Oy Alko Ab, Rajamäki)

(40)

me 1 a s s i sakka roos i g 1ukoosi 1aktoos i

(Seosme1 a s s i , Suomen Sokeri Oy, Kirkko- n ummi)

(Ana 1aR, Prod. 1 0274 , BDH Chemicals Ltd., Pool e , Eng 1 ant i )

(Ana 1aR, P rod. 10117) (Ana 1 a R, P rod. 10139) Kasvualustan orgaaniset lisäaineet:

peptoni hi i vauute mal 1asuute ma 11 asidut

glutam i i nihappo 1 eus i ini

fy t i ini

natriumsi t raattî

(Difco Bacto Peptone, D i fco-0118-01-8) (Difeo Yeast Extract, Di fco-0127-01) (Difco Malt Extract, Difсо-0186-01 -5) (Lahden Polttimo Oy, jauhettu 1aborato-

riomy11 у 11ä)

( F1uka, tuote 49450) (Fluka, tuote 61820)

(Phytin, Gesellschaft für Chemische Industrie in Basel, Sveitsi)

(Merck, Art. 6448) Liuokset pH-säädös sä :

NH-liuos yli 2 5 % (Ana 1 aR, Prod. 10011, jota tarpeen vaatiessa laimennettiin)

H.PO. (Merck, Art. 573, jota tarpeen vaati- es sa laimennettiin)

HC1 (väkevä) (Yliopiston apteekki, Ph. Nord. 51)

NaOH, n. 10-M ja n. 1-M-lJuokset valmistettiin kiinteästä NaOH: s ta (Merck, Art. 6498) tislattuun veteen.

Vaahdonestoain ее t : s i 1 i kon i

s t rukto1

Muut aineet :

(nh4)2hpo4 (Merck, Art . (nh4)2so4 (Merck, Art.

KH2P04*3H20 (Merck, Ar t .

KN03 (Merck, Ar t.

NaN03 (Merck, Art.

urea (Merck, Ar t .

NaC 1 (Merck, Art.

CaCl , (Merck, Art.

RD emu 1 s i on , Belgia)

Schill S Scheilâcher, Liittotasavalta)

1 207) 1217) 5099) 5063) 6537) 8487) 6404) 2382)

(Dow Corning anti foam, N.V. Dow Corning S.A.

(Structol J 650, Hampuri, Saksan

Viittaukset

LIITTYVÄT TIEDOSTOT

Tarkasteltaessa psyykkisen hyvinvoinnin vaihtelua regressiomallilla saatiin viitteitä siitä, että fyysinen aktiivisuus ja luontoliikunta-aktiivisuus ovat

(2012) tulivat niin ikään siihen tulokseen, että kavereiden lukumäärän kasvaminen alakoulusta yläkouluun siirryttäessä on positiivisesti yhteydessä etenkin

(2012) tulivat niin ikään siihen tulokseen, että kavereiden lukumäärän kasvaminen alakoulusta yläkouluun siirryttäessä on positiivisesti yhteydessä etenkin tyttöjen

Pearsonin korrelaatiokertoimella saadut tulokset osoittivat, että liikuntamuuttujista vain raskas liikunta ja kokonaisliikunta olivat tilastollisesti merkitsevästi

Tämän tutkielman tarkoituksena oli selvittää, onko fyysinen aktiivisuus yhteydessä elämänlaatuun iäkkäillä henkilöillä, ja selittävätkö ikä, siviilisääty,

Fyysinen aktiivisuus oli yhteydessä uupumukseen siten, että urheiluseuraharrastuksen lopettaneet olivat uupuneempia (1-suunt. va- rianssianalyysi, p=0,048) ja heillä oli

Onko äitien kokemalla työstressillä yhteyttä lasten subjektiiviseen hyvinvointiin (elämäntyytyväisyys, masentuneisuus, fyysinen aktiivisuus)? Aikaisempiin

Tässä tutkimuksessa tutkitaan toisen asteen opiskelijoiden fyysistä aktiivisuutta niin lasten- ja nuorten kuin aikuisten fyysisen aktiivisuu- den suosituksia hyödyntäen,