LED-VALOJEN SPEKTRIN VAIKUTUS LEHTIKAALIN KEMIALLISEEN KOOSTUMUKSEEN
Reeta Tolari LED-valojen spektrin vaikutus lehtikaalin kemialliseen koostumukseen
Pro Gradu -tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, ympäristö- ja biotieteiden laitos
maaliskuu 2020
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristö- ja biotieteiden laitos, Ympäristötieteen pääaine
Reeta Tolari: LED-valojen spektrin vaikutus lehtikaalin kemialliseen koostumukseen Pro Gradu -tutkielma, 57 sivua
Tutkielman ohjaajat: Yliopistotutkija dos. Minna Kivimäenpää ja professori Jarmo Holopainen maaliskuu 2020
_______________________________________________________________________
avainsanat: LED, lehtikaali, kemia, rakenne, metabolia, VOC, fenoli, glukosinolaatti
TIIVISTELMÄ
Kasvit tarvitsevat kasvaakseen valoa. Valolla on merkittävä rooli kasvien kasvatuksessa, sillä se vaikuttaa kasvien morfologiaan, mutta myös kasvien sekundaarisiin metaboliatuotteisiin.
Muutokset valon spektrissä vaikuttavat kasvien kasvuun ja ravinteiden ottokykyyn. LED (Light Emitting Diode) -valot ovat uusi teknologia, jonka käyttö on lisääntynyt kasvihuonetuotannossa merkittävästi. LED-valoilla on monia sellaisia ominaisuuksia, kuten valospektrin kontrollointimahdollisuus, energiatehokkuus ja vähäinen lämpeneminen, joiden vuoksi ne ovat optimaalisia valonlähteitä käytettäväksi kasvihuonetuotantoon.
Tämän työn tavoitteena oli altistaa lehtikaaleja kolmelle erilaiselle LED-valospektrille ja tutkia, onko eri spektreillä vaikutuksia lehtikaalien kemialliseen koostumukseen ja ulkonäköön. Spektrit muodostivat sarjan, joissa sinisen valon osuus väheni ja punaisen osuus lisääntyi lineaarisesti. Spektri 1 oli punavoittoinen ja spektri 3 sinivoittoinen. Spektrissä 2 sinisen ja punaisen valon osuudet olivat suunnilleen samalla tasolla. Tarkoituksena oli myös kartoittaa, onko kaalien kemiallisessa koostumuksessa eroja, kun kasvit ovat eläviä kasveja tai kun ne on pilkottu salaatiksi eli niille on aiheutettu mekaanista vauriota. Kaaleista tutkittiin glukosinolaatti- ja fenolipitoisuudet, sekä VOC (volatile organic compounds) - emissionopeudet ja mitattiin lehtien leveys, pituus ja ryppyisyys, sekä arvioitiin visuaalisesti valon aiheuttamien vaurioiden määrä.
Tulosten perusteella havaittiin, että valolla on vaikutusta kasvien kemialliseen koostumukseen ja morfologiaan. Punavoittoisen spektrin (spektri1) havaittiin lisäävän glukosinolaattipitoisuuksia vaurioitumisen vaikutuksesta. Spektri 1 myös aiheutti näkyviä vaurioita, nekroosia, kasveissa eniten. Spektrin 2 havaittiin olevan kaaleille paras spektri, sillä tämän spektrin kasveilla näkyviä vaurioita oli vähiten, vain vähäistä kloroosia.
Fenoliyhdisteiden kohdalla havaittiin, että salaatiksi pilkkomisen myötä tilastollinen merkitsevyys näkyi kokonaisfenolipitoisuuksissa korkeimpien pitoisuuksien ollessa spektrin 2 kaaleilla. Elävissä kasveissa valokäsittelyjen vaikutus näkyi viidessä eri VOC-yhdisteessä (hiilidisulfidi, paraxyleeni, alfapineeni, cis-3-heksenyyliasetaatti ja linalooli). Näistä spektri 1 nosti hiilidisulfidin, alfapineenin ja cis-3-heksenyyliasetaatin emissioita eniten, kun spektri 2 nosti paraxyleenin emissiota ja spektri 3 linaloolin emissiota eniten. Pilkkomisen vaikutus VOC-yhdisteisiin oli niin suuri, että se peitti valokäsittelyjen vaikutukset salaatiksi pilkotuissa kaaleissa. Puolustusyhdisteiden muodostuminen on kaaleille tärkeää, sillä se tekee niistä kestävämpiä tuhohyönteisiä vastaan, mutta jotta kuluttajat ostaisivat kaalia, tulee sen olla myös edustavan näköistä ja mahdollisimman vähän näkyvästi vioittunutta.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of science and forestry Department of Environmental and Biological Sciences, Environmental Science Reeta Tolari: The effects of LED light spectra to the chemical consistency of kale Master of Science thesis, 57 pages
Instructors of thesis: University researcher dos. Minna Kivimäenpää and Professor Jarmo Holopainen
March 2020
_______________________________________________________________________
keywords: LED, Brassica/kale, chemistry, structure, metabolism, VOC, phenol, glucosinolate
ABSTRACT
The plants need light for the growth. The light has a significant role for growing plants because it has effects on the morphology, and the secondary metabolic production. The changes in the spectra of light can affect plants and their growth. LED (Light Emitting Diode) lights are a new technology use of which has increased in the greenhouse production. LED lights has many benefits which makes it a very good light source for the greenhouse production. Those benefits are e. g. an opportunity to control the light spectra, energy efficiency and they do not heat a lot in use.
The aim of this research was to expose kale to three different light spectra and to observe if the spectra affects the morphology and chemical composition of the kale. Three spectra differed for the proportion of blue and red wavelengths. The spectra 1 was red-dominant and spectra 3 blue-dominant. The levels of blue and red light were almost the same in the spectra 2. Effects of light spectra on both living plants and leaves cut to salad, i.e. mechanically damaged, was studied. Glucosinolate and phenolics concentrations and VOC (volatile organic compounds) emission rates were analyzed from the kale. Also, the leaf length, width and wrinkliness as well as visual damage were assessed.
The results showed that light spectra affected morphology and chemical composition of the kale. Spectra 1 increased the concentrations of the glucosinolates and caused most severe visible damage on leaves. Spectra 2 was the best for the kales from the view it caused least damage. Spectra 2 increased the concentrations of the total phenolics at damaged plants. Effects of different light spectra was seen in five different VOC compounds (carbon disulfide, p- xylene, alphapinene, cis-3-hexenyl acetate and linalool) at alive plants. Spectra 1 increased the emissions of the carbon disulfide, alphapinene and cis-3-hexenyl acetate the most, spectra 2 increased the emissions of p-xylene and spectra 3 increased the emissions of linalool the most.
Mechanical damage affected to the VOC emissions so that it masked the effects of the light. It is important that plants produce the protective compounds because it makes them more resistant to the herbivory. For selling vegetables, it is important that the plants also look good.
ESIPUHE
Tämä Pro gradu -tutkielma on tehty Itä-Suomen yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksen Ympäristöekologian tutkimusryhmässä fyysisesti kesällä 2018, kirjoitusprosessin kestäessä aina maaliskuulle 2020 asti. Työn ohjaajina toimivat yliopistotutkija ja dosentti Minna Kivimäenpää, sekä professori Jarmo Holopainen.
Haluan kiittää erityisesti pääohjaajaani Minna Kivimäenpäätä todella osaavasta ja opiskelijalähtöisestä ohjauksesta, sekä kaikesta kannustuksesta työn saattamisessa valmiiksi asti. Lisäksi haluan kiittää koko ympäristöekologian tutkimusryhmää ja ryhmän laboranttia kaikesta avusta kokeen suorittamisen ja laboratorioanalyysien kanssa.
Lopuksi haluan kiittää vielä poikaani, perhettäni, puolisoani ja ystäviäni, jotka ovat tsempanneet ja kannustaneet koko tutkielmaprosessin ajan.
Kuopiossa 12.3.2020 Reeta Tolari
SISÄLLYSLUETTELO TIIVISTELMÄ
ESIPUHE
1. JOHDANTO ... 7
2. KIRJALLISUUSKATSAUS ... 8
2.1. VALO ... 8
2.1.1. Valon laatu ja määrä ... 8
2.1.2. Kasvien aistimekanismit eri aallonpituuksille... 10
2.1.3. Valon spektrin vaikutus fotosynteesiin, kasvuun ja morfologiaan ... 12
2.2. KASVIEN SEKUNDAARIMETABOLIA JA VALON SPEKTRIN VAIKUTUKSET ... 15
2.2.1. Kasvien sekundaarimetabolia ... 15
2.2.2. Valon spektrin vaikutus sekundaarimetabolian yhdisteisiin ... 19
2.2.3. LED-valot kasvien kasvatuksessa ... 20
2.2.4. Lehtikaali ... 22
3. TYÖN TAVOITTEET ... 23
4. AINEISTO JA MENETELMÄT ... 24
4.1. KASVATUKSET ... 24
4.2. KEMIALLISET JA FYSIKAALISET ANALYYSIT ... 26
4.2.1. Kasvu ja ilmiasu ... 26
4.2.2. Glukosinolaattianalyysi ... 26
4.2.3. Fenolianalyysi ... 27
4.2.4. VOC-keräys ... 28
4.3. TILASTOLLISET ANALYYSIT ... 29
5. TULOKSET ... 29
5.1. LEHTIEN KASVU JA ILMIASU ... 29
5.2. GLUKOSINOLAATIT ... 35
5.3. FENOLIT ... 38
5.4. VOC ... 42
6. TULOSTEN TARKASTELU ... 47
7. YHTEENVETO ... 53
LÄHDELUETTELO ... 54
1. JOHDANTO
LED-valot ovat tehokkaita, edullisia ja koko ajan kehittyviä valonlähteitä kasvien kasvatukseen ja niiden käyttö lisääntyy jatkuvasti mm. kasvihuonetuotannossa. LED-valojen etuna on se, että niiden spektriä voidaan säätää ja kontrolloida, jolloin kasveja voidaan altistaa tarkasti vain sellaiselle valon aallonpituudelle, mitä kasvi tarvitsee kasvuun ja kehitykseen, ja samalla säästää energiaa. (Holopainen ym. 2018, Kivimäenpää ym. 2014, Singh ym. 2014) Koska LED-valot ovat vielä melko uusi valonlähde kasvien kasvatukseen, niin niiden vaikutuksia eri lajeihin ei ole tutkittu vielä kovin paljon ja tutkimustieto on vaihtelevaa.
Kaalivihannekset ovat melko paljon tutkimuksissa käytetty kasvisuku. Lehtikaali on tummanvihreä ja voimakkaanmakuinen kasvi, joka kuuluu kaalivihannesten sukuun (Brassica). Lehtikaali on hyvin ravintorikas kasvi, joka sisältää useita makroravinteita.
Kaalivihannekset ovat myös kylmänkestäviä vihanneksia ja ne pystyvät kasvamaan hyvin erityyppisissä maaperissä luonnossa, mutta myös kasvihuoneolosuhteissa. Kaalit ovat kuitenkin herkkiä mm. tuhohyönteisten aiheuttamille vaurioille. (Fahey ym. 2003, Migliozzi ym. 2015). Kasveilla esiintyy sekä primaari-, että sekundaarimetaboliaa. Primaarimetabolia on kasvien elämisen kannalta välttämätön ja siihen kuuluvat mm. yhteyttäminen eli fotosynteesi ja soluhengitys eli respiraatio. Sekundaarimetabolia taas ei ole kasveille elossa pysymisen kannalta välttämätöntä, mutta se tukee kasvien kasvua, kehitystä ja selviytymistä ympäristössä.
(Caretto ym. 2015, Scoonhoven ym. 2005). On tutkittu, että sinisen valon osuuden kasvu aiheuttaa kaaleissa mm. korkeampia klorofylli-, antosyaani- ja karotenoidipitoisuuksia ja edistää lehtiruodin pitenemistä. (Li ja Kubota 2009, Mizuno ym. 2011, Singh ym. 2014).
Sininen valo vaikuttaa myös kasvien ilmarakojen säätelyyn ja kasvien yhteytys on tehokasta sinisen valon spektrillä. (Kivimäenpää ym. 2014). On tutkittu, että punaisen valon osuuden kasvu aiheuttaa myös korkeampia antosyaani-, fenoli- ja karotenoidipitoisuuksia. On myös havaittu, että punainen valo lisää klorofyllien ja fytokemikaalien määrää kaaleilla. (Delfin ym.
2019, Li ja Kubota 2009, Singh ym. 2014). Punainen valo aktivoi myös kasvien haihtuvien yhdisteiden, kuten terpeenien, vapautumista (Holopainen ym. 2018).
Työn tavoitteena oli tutkia kolmen eri LED-valospektrin vaikutuksia lehtikaalien kemialliseen laatuun. Spektrit muodostivat sarjan, joissa sinisen valon osuus väheni ja punaisen osuus
lisääntyi lineaarisesti. Spektri 1 oli punavoittoinen ja spektri 3 sinivoittoinen. Spektrissä 2 sinisen ja punaisen valon osuudet olivat suunnilleen samalla tasolla. Työ suoritettiin kasvattamalla lehtikaaleja kammioissa eri spektrien alla ja analysoimalla niistä glukosinolaatti- ja fenoli -yhdisteet sekä -pitoisuudet, ja VOC (volatile organic compounds) -yhdisteet sekä - emissionopeudet. Lisäksi tutkittiin, onko kaalien pilkkomisella salaatiksi myös vaikutusta glukosinolaatti-, fenoliyhdisteiden pitoisuuksiin, sekä VOC-yhdisteiden vapautumiseen.
Kemiallisten analyysien lisäksi tutkittiin myös valokäsittelyjen vaikutuksia lehtikaalien ilmiasuun.
2. KIRJALLISUUSKATSAUS 2.1. VALO
2.1.1. Valon laatu ja määrä
Kasvit tarvitsevat kasvaakseen valoa. Valolla on merkittävä rooli kasvien kasvatuksessa, sillä se vaikuttaa kasvin morfologiaan (mm. kasvu ja kukinta), mutta myös kasvien sekundaarisiin metabolia- eli aineenvaihduntatuotteisiin. Muutokset sekä keinotekoisen valon spektrissä, että säteilytehossa (irradianssi) vaikuttavat kasvien kasvuun ja ravinteiden ottokykyyn.
(Samuoliene ym. 2013).
Kasvit absorpoivat valoa lyhytaaltoisesta UV-B säteilystä aina pitkäaaltoiseen kaukopunaiseen saakka: (Holopainen ym. 2018, Huché-Thélier ym. 2016, Singh ym. 2014).
280 – 315 nm – UV-B 315 – 380 nm – UV-A
380 – 400 nm – UV-A, näkyvän valon spektri alkaa 400 – 520 nm – Sininen, myös violetti
520 – 610 nm – Vihreä, myös keltainen ja oranssi
610 – 700 nm – Punainen, näkyvän valon spektri päättyy 700 – 800 nm – Kaukopunainen
800 – 1000 nm – Infrapuna (IR)
>1000 nm – IR
Kuitenkin näkyvän valon spektri eli 400 – 700 nm aallonpituudet ovat kasveille tärkeimmät, sillä ne aktivoivat fotosynteesiä ja puolustusyhdisteiden (fytokemikaalien) tuotantoa kasveissa.
Tämän vuoksi näkyvän valon spektristä käytetään ns. PAR (photosynthetically active radiation) nimitystä. (Holopainen ym. 2018, Singh ym. 2014).
On tutkittu, miten eri aallonpituudet vaikuttavat kasveihin ja mm. lyhytaaltoinen UV-C eli 200 – 280 nm aallonpituus on haitallista kasveille, sillä se vaurioittaa kasvien soluja ja DNA:ta.
UV-C säteily kuitenkin suodattuu jo otsonikerrokseen, eikä täten pääse säteilemään maanpinnan tasolle (Huché-Thélier ym. 2016, Singh ym. 2014). Myös UV-B eli 280 – 320 nm aallonpituus aiheuttaa kasveille haittavaikutuksia, kuten hajottaa klorofylliä ja vähentää fotosynteesiä, mikä mm. häivyttää kasvien väriä, mutta ei ole niin vaarallista kuin UV-C säteily. (Sztatelman ym. 2015). UV-A säteily eli 320 – 400 nm aallonpituus ei taas juurikaan vaikuta kasvin kasvuun, mutta aktivoi puolustusyhdisteiden synteesiä. Sinisen eli 400 – 500 nm aallonpituus on välttämätön fotosynteesin kannalta ja se säätelee myös fotoperiodisia reaktioita. Sinisellä aallonpituusalueella valoreseptorit (mm. kryptokromit ja fototropiinit) ja fotosynteettiset klorofyllipigmentit absorpoivat valoa tehokkaasti. (Lin 2002, Kivimäenpää ym. 2014, Kuleshova ym. 2017). Vihreän eli 500 – 600 nm aallonpituusalue on hyödyllinen alimpien lehtien fotosynteesille ja sellaisten kasvien fotosynteesille, joilla on hyvin tiheään kasvaneet lehdet, koska tällä aallonpituusalueella valo on hyvin läpitunkevaa. (Kuleshova ym.
2017). Vihreä valo yksinään ei kuitenkaan riitä tukemaan kasvien kasvua riittävästi, koska kasvit eivät absorpoi sitä niin paljon, kuin esim. punaista valoa. Punaisen eli 600 – 700 nm aallonpituusalueella on vaikutusta kasvien pituuskasvuun ja kukintaan. Punaisen valon alueella fotosynteesin klorofylli a ja b, ja fytokromin inaktiivinen Pr muoto absorpoivat punaisen valon aallonpituuksia tehokkaasti. (Leivar ja Quail 2011, Singh ym. 2014). Kaukopunaisen eli 700 – 750 nm aallonpituusalueella on säätelevä vaikutus kasveihin, mm. kukintaan ja itämiseen, sillä fytokromin aktiivinen Pfr muoto absorpoi kaukopunaisen valoa aktiivisesti. Infrapunan eli 1200 – 1600 nm aallonpituusalueen valoa absorpoivat solujensisäiset ja solujenväliset vedet, mikä lisää biokemiallisia lämpöreaktioita. (Kivimäenpää ym. 2014, Kuleshova ym. 2017, Singh ym. 2014). Valon spektristä kasveille tärkeimmät fotosynteesin ja kasvun kannalta ovat kuitenkin sinisen valon eli 420 – 490 nm aallonpituusalue ja punaisen valon eli 620 – 660 nm aallonpituusalue (Holopainen ym. 2018, Huché-Thélier ym. 2016). Myös vihreän valon eli 500 – 600 nm aallonpituusalue edesauttaa kasvien kasvua ja kehittymistä. Vihreä valo yhdistettynä muihin aallonpituuksiin, kuten punaiseen, siniseen ja kaukopunaiseen, onkin todettu olevan
hyödyllistä kasveille, sillä se parantaa kasvien kasvua. (Huché-Thélier ym. 2016, Singh ym.
2014). On myös havaittu, että viljelykasveille paras valosuhde olisi 25 – 30 % sinistä valoa, 20
% vihreää valoa ja 50 % punaista valoa (Kuleshova ym. 2017).
Valospektri ei kuitenkaan ole ainoa asia, jolla on merkitystä kasvien kasvuun ja laatuun, sillä myös säteilytysvoimakkuudella eli irradianssilla on huomattava vaikutus kasveihin. Matala irradianssi voi aiheuttaa nitraatin kertymistä kasveihin, kun taas korkea irradianssi voi aiheuttaa stressiä ja aktivoida kasvien suojamekanismia, mikä vaikuttaa kasvien primaariseen ja sekundaariseen metaboliaan. Samuoliene ym. 2013 tutkivat PAR-alueen eri irradianssitasojen vaikutusta kyssäkaaliin (Brassica oleracea var. gongylodes), mustasinappiin (Brassica juncea), pinaattikiinankaaliin (Brassica rapa var. chinensis) ja tatsoihin (Brassica rapa var.
rosularis), ja havaitsivat, että korkea PAR-alueen irradianssi eli 545 µmol/m2s ei kasvata kasveja niin tehokkaasti, nostaa fenolipitoisuuksia, nostaa sakkaroosipitoisuuksia ja lisää klorofyllien määrää kasveissa. Kasvit kasvatettiin kasvatuskammioissa. Nitraattipitoisuutta korkea irradianssi taas vastaavasti laskee. Matalakin irradianssi on kuitenkin kasveille riittävä fotosynteesin, fotosynteettisten pigmenttien aktiivisuuden, biomassan, lehtien muodostumisen ja typen saannin kannalta. Tutkimus kuitenkin osoitti sen, että parhaat olosuhteet kasvien kasvulle ja ravinteiden ottoon antoi keskitason irradianssi eli 320 – 440 µmol/m2s, sillä tällöin lehtien pinta-ala oli kaikista suurin, kokonaisantosyaanipitoisuudet olivat korkeimmat, kokonaisfenolipitoisuudet olivat korkeimmat, kasveille toksisia vapaita radikaaleja muodostui vähiten ja nitraattipitoisuudet olivat alhaisimmat. (Samuoliene ym. 2013).
2.1.2. Kasvien aistimekanismit eri aallonpituuksille
Kasveilla valoa aistiva reseptoreita ja pigmenttejä on useita. Kasvien valoreseptoreita ovat mm.
fototropiinit, kryptokromit ja fytokromit, kun taas valopigmenttejä ovat mm. klorofyllit ja karotenoidit. (Huché-Thélier ym. 2016, Singh ym. 2014).
Fototropiinit ovat fotoreseptoreita, jotka havaitsevat UV-A valoa ja sinistä valoa. Ne ovat seriini tai treoniiniproteiinikinaaseja (solun toiminnan säätelijöitä), joissa on flaviini mononukleotidi kromoforeja sitoutuneena proteiiniin kahdessa LOV (light-oxygen-voltage) domeenissa. LOV domeeni on kasvien proteiinisensori. Kaksi erilaista fototropiinia löytyy mm. lituruohosta (Arabidopsis). Fototropiini 1 reagoi heikosti sinisen valon kanssa, kun taas fototropiini 2 reagoi hyvin vahvasti yhdessä fototropiini 1 kanssa. Sinisen valon havaitseminen
siis laukaisee näiden fototropiinien proteiinien muodon muutokset, mikä johtaa kinaasi (fosfaattiryhmiä substraateille siirtävä entsyymi) domeenin aktivointiin ja täten seriinin (aminohappo) autofosforylaatioon. Fototropiinit sijaitsevat solukalvolla ja hajoavat myös siellä, kun reagoivat sinisen valon ja UV-A valon kanssa. (Demarsy ja Fankhauser 2009, Huché-Thélier ym. 2016, Inoue ym. 2008).
Kryptokromit ovat reseptoreita, jotka ovat herkkiä UV-A säteilylle ja siniselle valolle ja niitä löytyy sekä kasveista, että eläimistä. Monilla kasveilla on useita kryptokromeja, esimerkiksi lituruoholla (Arabidopsis thaliana) on kaksi kryptokromia. Kryptokromien geeniperhe siis vaihtelee kasvien välillä, toisilla on kaksi samanlaista kryptokromigeeniä, kun taas toisilla on kaksi erilaista kryptokromigeeniä. (Chatterjee ym. 2006, Huché-Thélier ym. 2016, Lin 2002).
Sininen valo vaikuttaa kryptokromien ilmentymiseen eri tavalla eri lajeilla. Esimerkiksi lituruoholla molemmat kryptokromit ovat solun tumassa ja sininen valo aiheuttaa toisen kryptokromin siirtymisen solulimaan, kun taas toinen kryptokromi säilyy tumassa.
Kryptokromit ovat rakenteeltaan samankaltaisia fotolyaasi-entsyymien kanssa, vaikka niillä ei ole fotolyaasien entsymaattista aktiivisuutta. Kryptokromeilla on kromoforeina flaviini adeniinidinukleotidi ja metyylitetrahydrofolaatti. (Chatterjee ym. 2006, Huché-Thélier ym.
2016, Lin ym. 1996, Platten ym. 2005).
Fytokromit ovat proteiineja, joissa on fytokromobiliini kromoforina. Kromofori syntetisoidaan viherhiukkasissa, mistä se kulkeutuu solulimaan ja solulimassa se sitten sitoutuu fytokromin proteiiniosaan. Fytokromeilla on kaksi erilaista muotoa: Pr ja Pfr. Pr on fytokromin inaktiivinen muoto ja Pfr on fytokromin aktiivinen muoto. Fytokromi absorpoi inaktiivisessa Pr muodossa tehokkaasti punaista aallonpituutta, kun taas aktiivisessa Pfr muodossa fytokromi absorpoi tehokkaasi kaukopunaista valoa. Fytokromit siis muuttavat muotoaan inaktiivisesta aktiiviseksi aallonpituuden mukaan. Fytokromit absorpoivat tehokkaimmin punaista valoa, mutta myös muita aallonpituuksia. Kuitenkin punaisen aallonpituusalueen ulkopuolella aktiivisen Pfr fytokromin aktivoituminen on vähäistä. (Huché-Thélier ym. 2016, Lau ja Deng 2010, Leivar ja Quail 2011, Singh ym. 2014.).
Klorofyllit ovat orgaanisia yhdisteitä, joiden avulla kasvit yhteyttävät eli ne ovat fotosynteettisiä pigmenttejä. Klorofyllit sijaitsevat viherhiukkasissa ja ne sisältävät magnesiumionin keskusatominaan. Kaikilla fotosynteettisillä eliöillä, kuten levillä ja
syanobakteereilla on klorofylli a, mutta vain vihreillä kasveilla on klorofylli a:n lisäksi myös toinen klorofylli, klorofylli b. Klorofyllit ovat rakenteeltaan muuten samanlaisia, mutta klorofylli a:lla on metyyliryhmä, kun taas klorofylli b:llä on aldehydiryhmä.
Klorofyllimolekyylit absorpoi pääasiassa sinistä ja violettia valoa, mutta myös punaista valoa.
Klorofyllit toimivat siis fotonien vastaanottajina fotosynteesissä. (Khan academy 2020, Kuleshova ym. 2018).
Karotenoidit ovat tetraterpenoideja, jotka voidaan jakaa kahteen ryhmään: ksantofylleihin ja karoteeneihin. Karoteenit ovat oransseja fotosynteesipigmenttejä, jotka hyödyntävät niitä sinisen ja vihreän valon aallonpituuksia, joita klorofyllit eivät käytä. Karotenoidit siis auttavat klorofyllejä absorpoimaan valon fotoneja fotosynteesiin. Karotenoidit myös suojaavat kasveja liialliselta valolta ja fotosynteesivaurioilta mm. pysäyttämällä vapaiden happiradikaalien muodostumisen. (Chen 2015, Khan academy 2020).
2.1.3. Valon spektrin vaikutus fotosynteesiin, kasvuun ja morfologiaan
Fotosynteesi on prosessi, jossa kasvi sitoo valon säteilyenergiaa ja muuttaa sen kemialliseksi energiaksi ja orgaanisiksi yhdisteiksi. Fotosynteesin perusperiaatteena on, että vedestä ja hiilidioksidista muodostetaan happea ja glukoosia. (Scoonhoven ym. 2005). Fotosynteesi tapahtuu kasvin viherhiukkasissa, joissa kasvien valopigmentit (klorofyllit) absorpoivat valon fotoneja eri aallonpituuksilta. Tämä valosta saatu energia sitoutuu kasvien ATP ja NADPH - molekyyleihin, jota kasvi käyttää kemiallisena energiana myöhemmässä vaiheessa fotosynteesiä. Valosta saatua energiaa kasvit käyttävät myös vesimolekyylien hajottamiseen.
Fotosynteesiä tapahtuu paljon sinisen valon, mutta myös punaisen valon aallonpituudella, sillä klorofyllit absorpoivat sekä sinistä että punaista valoa tehokkaasti. Lisäksi karotenoidit absorpoivat vielä klorofyllien apuna fotosynteesiin niitä aallonpituuksia, joita klorofyllit eivät absorpoi. (Khan academy 2020, Kuleshova ym. 2018). Soluhengitys taas on kasvin mitokondriossa tapahtuva fotosynteesin käänteisreaktio.
Fotoperiodismi tarkoittaa valojaksoisuutta, eli kasvin päivä-yö-rytmiä. Fotoperiodismi vaikuttaa mm. kasvin kukintaan ja kasvit, jotka kukkivat vain, kun päivän pituus laskee tietyn taso alapuolelle, ovat lyhyen päivän kasveja ja kasvit, jotka kukkivat vain, kun päivän pituus nousee tietyn tason yläpuolelle, ovat pitkän päivän kasveja. Jotkut kasvit ovat myös päiväneutraaleja, jolloin niiden kukintaan ei vaikuta päivän pituus. Kasvien fotoreseptorit
aistivat valoa ja päivän pituutta, ja vaikuttavat siten kasvien kasvuun ja kukintaan. (Khan academy 2020, Lin 2002).
Koska kasvit altistuvat väistämättä erilaisille elottoman ja elollisen luonnon stressitekijöille, niin kasvit hyötyvät sekundaarisesta metaboliasta. Kasvit tuottavat hyvin paljon erilaisia kemiallisia yhdisteitä, jotka voidaan luokitella kuuluvaksi primaariseen tai sekundaariseen metaboliaan. (Caretto ym. 2015). Kasvit ovat varustautuneet erilaisilla fytokemikaalisilla puolustusyhdisteillä, joiden koostumus vaihtelee eri kasvilajeilla (Delfin ym. 2019). Kasvien sekundaariset aineenvaihduntatuotteet jakautuvat eri tavoin kasvikunnissa ja niillä on erittäin laaja fysiologinen rooli kasvien kasvussa. Sekundaarimetabolialla on myös merkittävä rooli vuorovaikutuksessa kasvien ja ympäristön välillä (Delfin ym. 2019). Täten sekundaarimetaboliaa ja sen aineenvaihduntatuotteita pidetään välttämättöminä ympäristöstressiltä suojautumisessa. On laajalti tutkittu, että sekundaarisilla aineenvaihduntatuotteilla on merkitystä kasvien kasvussa, lisääntymisessä ja maalla viljeltyjen kasvien jatkuvassa säilymisessä. (Caretto ym. 2015).
Kasvien sekundaarimetabolia koostuu erittäin monimutkaisista synteesireiteistä, sillä kasvien rakenteet ovat suurelta osin erilaisia eri solukoiden, kasvuvaiheiden ja lajien välillä. Kasvien sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden kemiallinen monimuotoisuus perustuu pääosin geneettiseen säätelyyn, mutta ympäristöolosuhteilla ja aineenvaihduntatuotteiden kemiallisten rakenteiden ja toimintojen luontaisella joustavuudella on myös merkittävä rooli. Monet kasvien sekundaariset aineenvaihduntatuotteet ovat tärkeitä myös ihmisille niiden lukemattomien biologisten vaikutusten takia. Tällaisia ihmisille tärkeitä sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita ovat mm. farmaseuttiset tuotteet, makuaineet, väriaineet ja hyönteismyrkyt. Aineenvaihduntatuotteet ovat solujen ja biokemiallisten prosessien väli- ja lopputuotteita, jotka ovat geneettisten muutosten tai ympäristön muutosten seurausta. (Delfin ym. 2019, Scoonhoven ym. 2005).
Valon spektrin eri aallonpituuksilla on havaittu olevan vaikutuksia mm. kasvien kasvuun, kukintaan ja aineenvaihduntatuotteiden pitoisuuksiin. Esimerkiksi sinisen valon aallonpituudet ovat aiheuttaneet kaaleissa korkeampia klorofylli-, antosyaani- ja karotenoidipitoisuuksia sekä lisännyt lehtiruodin pituutta, mutta lyhentänyt varren pituutta. Sininen valo on myös osoittanut kurkuilla hitaampaa kasvua, mutta lisännyt lehtien pinta-alaa, sekä kasvattanut tuore- ja
kuivapainoja. (Li ja Kubota 2009, Mizuno ym. 2011, Singh ym. 2014). Sininen valo ja UV- säteily sisältävätkin korkeaenergistä säteilyä, jolloin kasvien täytyy suojata niiden soluja säteilyltä suojapigmentillä. Nämä suojapigmentit ovat paljolti fenoliyhdisteitä kuten flavonoideja. (Holopainen ym. 2018). Sininen valo vaikuttaa myös kasvien ilmarakojen säätelyyn ja suuntautumiskäyttäytymiseen. Myös kasvien yhteytys on tehokasta sinisen valon aallonpituusalueella. (Kivimäenpää ym. 2014).
Vihreän valon aallonpituuksien on havaittu olevan tehokkain aallonpituusalue kasvun edistämiseksi salaateilla. Vihreä valo on myös osoittanut fotosynteettisten pigmenttien aktivoitumista kurkulla ja kasvattanut lehtien pinta-alaa, sekä tuore- ja kuivapainoja tomaateilla sekä paprikalla. (Singh ym. 2014).
Punaisen valon on havaittu aiheuttavan lisääntyneitä antosyaani-, fenoli- ja luteiinipitoisuuksia.
(Li ja Kubota 2009, Singh ym. 2014). On myös havaittu, että klorofyllien määrä on lisääntynyt punaisen valon alla, mutta vastaavasti punainen valo on laskenut nitraattipitoisuuksia salaateilla ja kaaleilla. (Singh ym. 2014). Punainen valo lisää myös kasvien fytokemikaalien tuotantoa. Fytokemikaalit ovat biologisesti aktiivisia kemiallisia yhdisteitä, joita esiintyy kasveissa luonnollisesti pääasiassa sekundaariaineenvaihdunnan tuotteina. Fytokemikaalien rakenteellinen monimuotoisuus johtuu siis suurelta osin sekundaarisesta aineenvaihdunnasta.
(Delfin ym. 2019). Fytokemikaalit voivat olla visuaalisesti havaittavia tai antaa hajua ja makua kasviin. Fytokemikaalit ovat hieman erilaisia, sillä jotkut niistä antavat juurikin väriä, kun taas toiset antavat hajua ja makua kasviin. Monet fytokemikaalit siis auttavat kasveja taistelemaan kasvien kilpailijoita vastaan ja täten suojautumaan taudinaiheuttajilta, kasvinsyöjiltä, sekä elottoman luonnon stressitekijöiltä. Punainen valo aktivoi myös kasvien terpeenituotantoa, jolloin kasvit vapauttavat myös enemmän hajua aiheuttavia VOC (volatile organic compounds) -yhdisteitä ilmaan. (Holopainen ym. 2018). Punaisen valon spektri on siis erittäin tärkeää kasveille, sillä fytokromireseptorit absorpoivat punaista valoa ja tällöin kasvit saavat viestiä mm. kukinnoista ja varjostuksesta, mikä vaikuttaa niiden kasvuun erityisesti kilpailutilanteessa. (Kivimäenpää ym. 2014).
Punaisen ja sinisen valon yhdistelmäspektri, joissa punaisen valon osuus on ollut sinistä valoa suurempi, on osoittanut antosyaanipitoisuuksien, antioksidanttien, C-vitamiinipitoisuuksien,
klorofyllipitoisuuksien ja lehtien kokonaispinta-alan kasvamista sekä kukinnan viivästymistä salaateilla ja kaaleilla. (Li ym. 2012, Singh ym. 2014, Stutte ym. 2009).
2.2. KASVIEN SEKUNDAARIMETABOLIA JA VALON SPEKTRIN VAIKUTUKSET
2.2.1. Kasvien sekundaarimetabolia
Ympäristön stressitekijät, kuten kuivuus, lämpö, suolapitoisuus, kylmä, lyhyt/pitkä valon aallonpituus (UV-B-kaukopunainen), raskasmetallit, ilmansaasteet, ravinteiden puute, tuhohyönteiset ja taudinaiheuttajat aiheuttavat haitallisia vaikutuksia kasvien kasvuun ja satoon kenttäolosuhteissa. Esimerkiksi valo on keskeinen ympäristötekijä, joka säätelee kasvien kehitystä ja geenien ilmentymistä. Mm. lisääntyneellä UV-B säteilyllä on useita erilaisia vaikutuksia kasvien elämään. Yleisimmät UV-B säteilyn aiheuttamat vaikutukset ovat kasvien kasvun hidastuminen ja lisääntyneet fenoliyhdisteiden määrät kasvisolukoissa. Vapaiden happiradikaalien (ROS) muodostuminen on myös osa UV säteilyn aiheuttamaa stressiä.
Kasvien yleinen strategia vapaiden happiradikaalien torjumiseen onkin tuottaa sekä entsymaattisia, että ei-entsymaattisia puolustusyhdisteitä, kuten fenolisia yhdisteitä. (Caldwell ym. 2003, Caretto ym. 2015)
Kasvien on tunnistettava viipymättä ympäristöstressit ja aktivoitava sitten puolustusreaktiot.
Ympäristön stressi aiheuttaa muutoksia kasvien kasvuun muuttamalla tai häiritsemällä niiden metabolista homeostaasia. Tällöin kasvien on siis muutettava aineenvaihduntaansa, jotta ne saavat aikaan yhdisteitä, joita tarvitaan stressistä selviytymiseen. Solujen ja molekyylien aktiivisuuden muutokset ovat kasvien mekanismeja sopeutua stressiin. Luonnollisessa ympäristössä kasveja ympäröivät useat tuholaiset ja taudinaiheuttajat. Kasvien puolustus potentiaalisia taudinaiheuttajia vaatii sekä fysiologisten että kemiallisten esteiden nopean vahvistamisen ja suuren määrän puolustusyhdisteitä. (Caretto ym. 2015, Shulaev ym. 2008).
Sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden koostumus voi vaihdella sekä määrällisesti, että laadullisesti myös jopa saman kasvilajin eri yksilöiden välillä. (Delfin ym. 2019). Kasvien sekundaariset aineenvaihduntatuotteet myös jakautuvat sekä laadullisesti että määrällisesti eri tavoin eri solukkoihin ja kasvinosiin. Kasvit syntetisoivat aineenvaihduntatuotteita geneettisissä prosesseissa ympäristön ärsykkeiden vaikutuksesta. Aineenvaihduntatuotteet
syntetisoidaan kasveissa aineenvaihduntaprosessien kautta, jotka ovat olennainen osa kasvien kehitystä. (Caretto ym. 2015).
Kasvifenolit ovat hyvin laaja sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden ryhmä. Kasvit ovat tuottaneet fenoliyhdisteitä vuorovaikutukseen ympäristön kanssa kautta aikojen. Kasvit tuottavat fenoliyhdisteitä selviytyäkseen ympäristöstressistä, mikä kertoo siitä, että kasvien aineenvaihdunta on muovautumiskykyistä. Kasvien fenolit toimivatkin siis puolustusyhdisteinä, jotka kerääntyvät usein kasvisolukkoihin, kun kasvit altistuvat erityyppisille stressiolosuhteille. Putkilokasvien lehtiuutteista voidaan löytää useita eri yhdisteitä, kuten esimerkiksi estereitä, amideja, glykosideja, flavonoideja ja proantosyaniideja.
(Caretto ym. 2015, Scoonhoven ym. 2005). Fenoliyhdisteitä tuotetaan kasveissa viiden biosynteesireitin peräkkäisellä toiminnalla, glykolyysi ja pentoosifosfaattireitti, sikimihapporeitti, aromaattisten aminohappojen synteesi, fenyylipropanoidien synteesi ja jatkobiosynteesit. Glykolyysit ja pentoosifosfaattireitit muodostavat esiasteita sikimaattisynteesille, joka on fenolien muodostumisen edellytys. Sikimaattisen reitin tuottama fenyylialaniini on fenyylipropanoidimetabolian edeltäjä, joka puolestaan ruokkii erilaisia spesifisiä flavonoidireittejä. Mm. katekiinien (flavonoidi) polymeroinnilla syntyy proantosyanideja (tanniini, eli polyfenolinen yhdiste), joilla on tärkeä rooli puolustaa kasveja viruksia, bakteereja, sieniä, hyönteisiä ja kasvinsyöjiä vastaan. Tanniinilla voi myös olla negatiivinen vaikutus hyönteisten kasvuun niiden karvaan maun takia ja niiden kyvystä inaktivoida hyönteisten erittämiä entsyymejä. Tanniineilla on myös kyky tuottaa monimutkaisia proteiineja, mikä myös osaltaan vähentää hyönteisten aiheuttamaa negatiivista vaikutusta kasveihin. Fenolit estävät myös hyönteisten lisääntymisen ja toukkien kasvun isäntäkasveissa. Kemiallisten puolustusyhdisteiden tuotanto kuitenkin kuluttaa kasvien resursseja, koska niiden biosynteesiin tarvitaan energiaa. (Caretto ym. 2015, Hyvärinen 2001).
Glukosinolaatit ovat kasvien sekundaarimetabolian aineenvaihduntatuotteita. Glukosinolaatit ja niiden hajoamistuotteet ovat tärkeitä yhdisteitä, joiden avulla kasvit vuorovaikuttavat kasvinsyöjien ja mikro-organismien kanssa. Jotkut glukosinolaattien hajoamistuotteista voivat olla esimerkiksi makua antavia yhdisteitä ja joillakin voi olla antikarsinogeenisiä ominaisuuksia. Kasvien glukosinolaattien metaboliaa säätelevät useilla eri tasoilla mm. geenit, ympäristötekijät ja aineenvaihduntatuotteet. Glukosinolaatteja esiintyy kasveissa myrosinaasien yhteydessä, sillä myrosinaasit vastaavat glukosinolaattien muokkaamisesta.
Esimerkiksi kun kasvit vaurioituvat kasvinsyönnin seurauksena, niin myrosinaasit hydrolysoivat glukosinolaateista eri hajoamistuotteita, joilla voi olla mm. toksisia vaikutuksia kasvinsyöjiin ja bakteereihin. Kaalivihannesten glukosinolaattien hajoamistuotteista esimerkiksi sulforafaani on osoittanut vahvoja antikarsinogeenisiä ominaisuuksia.
Glukosinolaatteja biosyntetisoidaan aminohapoista. Glukosinolaattien biosynteesi sisältää aminohappojen sivuketjujen pidentämisen, oksidatiivisen dekarboksyloinnin, rakenteen muuttamisen emäksiseksi, sekä sekundaariset muutokset. Onkin havaittu, että viisi sytokromigeenituotetta katalysoivat mm. fenyylialaniinin ja tryptofaanin muutosta aldoksiimeiksi biosynteesiä varten. CYP83A1 ja CYP83B1 entsyymien avulla sitten nämä aldoksiimit metaboloituvat muodostaakseen S-alkyylitiohydroksimaatteja, jotka pilkotaan tiohydroksimaateiksi. Tämän jälkeen tapahtuu glykolysointi ja muodostuu primaarisia glukosinolaatteja. Tämän jälkeen glukosinolaattien sulfaattista sivuketjua voidaan vielä muokata sulfotransferaaseilla, jolloin saadaan tuotettua aromaattisia glukosinolaatteja, alkenyyliglukosinolaatteja ja indolyyliglukosinolaatteja. Glukosinolaattien muodostumiseen vaikuttavat mm. ravinteet, valo, lämpötila, vesi, hiilidioksidi ja raskasmetallit. (Hyvärinen 2001, Yan ym. 2007).
Suuri osa kasvien metabolian aineenvaihduntatuotteista koostuu VOC (volatile organic compounds) -yhdisteistä (Dudareva ym. 2013). Kasvit päästävät ilmaan useita erilaisia haihtuvia yhdisteitä, kuten terpenoideja ja GLV (grean leaf volatiles) -yhdisteitä. VOC- yhdisteet ovat kaasumaisia orgaanisia yhdisteitä, joihin kasvit emittoivat noin 10 % fotosynteesissä sitomastaan hiilestä. VOC-yhdisteet ovat rasvaliukoisia, pienen molekyylipainon ja korkean höyrynpaineen omaavia yhdisteitä. VOC-yhdisteet ovat kasveille merkittäviä, sillä ne houkuttelevat pölyttäjiä, puolustavat kasveja kasvinsyöjiltä, suojaavat taudinaiheuttajilta ja toimivat kasvien välisessä vuorovaikutuksessa. (Widhalm ym. 2015).
GLV-yhdisteet (grean leaf volatiles) ovat VOC-yhdisteisiin kuuluvia haihtuvia orgaanisia yhdisteitä, joita vapautuu kasvien vaurioituessa. GLV-yhdisteet koostuvat C6yhdisteistä, joihin kuuluu aldehydejä, alkoholeja ja estereitä. GLV-yhdisteet muodostuvat ja emittoituvat erittäin nopeasti, niitä löytyy kaikista vihreistä kasveista ja niiden vapautumista lisäävät elottoman ympäristön tekijät, kasvinsyöjät ja taudinaiheuttajat. GLV-yhdisteiden vapautumiseen vaikuttaa myös ympäristöolosuhteet kuten maaperän kosteustasapaino, lannoitteiden määrä ja lämpötila. GLV-yhdisteiden vapautuminen on yleensä hetkellistä, mutta sitä voi tapahtua
pidempään, jopa päiviä, kasvinsyönnin tai toistuvan vaurioitumisen vuoksi. Esimerkiksi kasvinsyöjät aiheuttavat kasveille stressitilan vaurioittamalla kasvien lehtiä, jonka vuoksi kasvi alkaa tuottamaan GLV-yhdisteitä. Vaurioitumisen vuoksi tapahtunut GLV-yhdisteiden runsaampi muodostuminen voidaan yhdistää myös mm. muuttuviin ympäristöolosuhteisiin.
Esimerkiksi maaperän korkeampi kosteuspitoisuus tai ilman lämpötilan nousu lisäävät GLV- yhdisteiden vapautumista kasveista. Kasvien altistuminen taudinaiheuttajille ja bakteerien pääsy kasveihin myös lisää GLV-yhdisteiden vapautumista kasveissa. GLV-yhdisteet voivat toimia viestinvälittäjinä tai signaaleina kasvien välisessä vuorovaikutuksessa, mutta niillä on myös antimikrobisia ominaisuuksia, joilla ne pystyvät estämään kasvien infektoitumista ja vaurioitumista. Täten GLV-yhdisteiden vapautuminen onkin kasveille myös tietynlainen puolustautumismekanismi, jolla se estää bakteerien kasvua kasvin pinnalla ja karkottaa myös kasvinsyöjiä. Erityisesti C6 aldehydien on osoitettu olevan antimikrobisesti tehokkaita GLV- yhdisteitä kasveilla. Kasvit voivatkin kasvattaa resistenssiään taudinaiheuttajia vastaan altistumalla tautia aiheuttamattomille mikrobeille juurivyöhykkeessään. (Scala ym. 2013, Shiojiri ym. 2006).
On havaittu, että VOC-yhdisteet voivat myös suojata kasveja elottoman luonnon rasitteilta, kuten liialliselta valolta, lämpötilalta ja oksidatiiviselta stressiltä. VOC-yhdisteiden biosynteesiä säännellään alueellisesti, kehityksellisesti ja ajallisesti ja se on riippuvaista elollisen ja elottoman luonnon tekijöistä, kuten kasvinsyöjistä, CO2-pitoisuudesta, kosteuspitoisuudesta, ravinteista (hiili, typpi, rikki) ja primaarimetaboliassa tuotetun energian määrästä. (Dudareva ym. 2013, Widhalm ym. 2015). VOC-yhdisteitä vapautuu lehdistä, kukista ja hedelmistä ilmaan, ja juuristosta maaperään. Kasvusolukoissa VOC-yhdisteet syntetisoidaan usein eritysrakkuloissa, jotka sijaitsevat lehden pinnalla ja erittyvät sieltä sitten kutikulaan. Eritysrakkuloita esiintyy monilla putkilokasveilla, mutta esim. lehtikaalilla niitä ei kuitenkaan ole. Jotkut kasvilajit keräävät VOC-yhdisteitä myös pihkatiehyisiin tai rauhaskarvoihin, jolloin yhdisteet voivat vapautua kasvista heti, kun niiden rakenne hajoaa esim. kasvinsyönnin seurauksena. VOC-yhdisteiden on siirryttävä biosynteesissään soluliman, solukalvon, soluseinän ja jopa kutikulan läpi poistuakseen solusta. Pääsääntöisesti VOC- yhdisteet leviävät passiivisesti solun rakenteiden läpi ja siitä ympäristöön. Lisäksi kuitenkin tarvitaan myös aktiivisia biologisia menetelmiä, joilla voidaan päästää ympäristöön myös alhaisempia VOC-emissionopeuksia. VOC-yhdisteiden pääseminen ympäristöön korostuu erityisesti ympäristöstressin vaikutuksen alla, kun VOC-päästöt kasvavat merkittävästi, sillä
solukalvon eheys vaarantuu systemaattisesti koko kasvissa. VOC-yhdisteiden passiivisessa kulkeutumisessa on kuitenkin olemassa mahdollisuus, että ne kertyvät solukalvoon solutoksisiksi tasoiksi, sillä niiden kulkeutuminen seuraavan tason, soluseinän, läpi ei ole riittävän nopeaa. Tämän takia VOC-yhdisteiden kulkeutumisen tueksi tarvitaan myös biologisia aktiivisia mekanismeja, jotta VOC-yhdisteet eivät pääse kerääntymään solussa yhteen tasoon liiaksi. VOC-yhdisteitä muodostetaan erilaisissa biokemiallisissa synteeseissä.
(Maffei ym. 2010, Widhalm ym. 2015).
On kuitenkin tutkittu, että VOC-yhdisteiden alaryhmillä, terpenoideilla, fenyylipropanoideilla, rasvahappojen ja aminohappojen johdannaisilla on kaikilla omanlainen biosynteesi.
Terpenoidit muodostuvat MEP ja MVA biosynteesissä, kun mm. GLV-yhdisteet muodostuvat rasvahapoista lipaasien aktiivisuuden ja hydroperoksidien kautta, ja aromaattiset VOC- yhdisteet muodostuvat sikimaattisen reitin kautta. Terpenoideilla on siis kaksi toisistaan eriävää biosynteesireittiä, mevalonihapporeitti MVA ja metyylitritolifosfaattireitti MEP. MVA reitti vapauttaa seskviterpeenejä, kun taas MEP reitti vapauttaa hemiterpeenejä ja monoterpeenejä. MVA reitti koostuu kuudesta entsymaattisesta reaktiosta, joka alkaa asetyyli- CoA:n asteittaisella kondensaatiolla 3-hydroksi-3-metyyliglutaryyli-CoA:ksi. Tämän jälkeen yhdiste pelkistetään mevalonihapoksi, jonka jälkeen tapahtuu kaksi fosforylointia ja dekarboksylointi ja lopputuotteena muodostuu isopentenyyli difosfaatti, jonka jälkeen vapautuu seskviterpeenejä. MEP reitti taas koostuu seitsemästä entsymaattisesta vaiheesta, joka alkaa d-glyseraldehydi-3-fosfaatin ja pyruvaatin konsentraatiolla 1-deoksi-d-ksyluloosi- 5-fosfaatin tuottamiseksi, joka isomeroidaan muodostamalla välituote metyylitritolifosfaatti.
Tämän jälkeen tarvitaan vielä viisi eri vaihetta, joilla MEP muutetaan isopentyyli difosfaatiksi ja dimetyyliallyyli difosfaatiksi, jonka jälkeen vapautuu hemi- ja monoterpeenejä. MEP reitti perustuu siis primaarimetabolian tuottamien pyruvaatin ja d-glyseraldehydi-3-fosfaatin saatavuuteen. (Dudareva ym. 2013, Maffei ym. 2010).
2.2.2. Valon spektrin vaikutus sekundaarimetabolian yhdisteisiin
Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että valolla on vaikutusta kasvien sekundaarimetabolian yhdisteisiin. Yksittäisten fenoliyhdisteiden ja kokonaisfenolien muodostumisen on havaittu aktivoituvan sinisen valon vaikutuksesta. Fenoliyhdisteet suojaavatkin kasvia sinisen, lyhyen aallonpituusalueen, korkeaenergiseltä säteilyltä. Toisaalta kokonaisfenolipitoisuudet voivat nousta myös pidemmillä aallonpituusalueilla, kuten vihreän ja punaisen/kaukopunaisen
aallonpituusalueella. (Holopainen ym. 2018, Hongmei ym. 2016, Taulavuori ym. 2013). On kuitenkin myös havaittu, että runsas sinisen valon saatavuus voi myös heikentää fenoliyhdisteiden muodostumista (Litvin ym. 2020). Glukosinolaattien muodostumisen on havaittu aktivoituvan myös sinisen valon vaikutuksesta (Holopainen ym. 2018), mutta myös punaisen valon vaikutuksesta (Hongmei ym. 2016).
VOC-yhdisteistä terpenoidit muodostavat suurimman ja monimuotoisimman joukon sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita, joissa on monia haihtuvia ainesosia. (Widhalm ym.
2015). Tutkimuksissa on havaittu, että punaisen ja kaukopunaisen valon aallonpituudet lisäävät monoterpeenien vapautumista. Terpeeneistä myös seskviterpeenien on havaittu vapautuvan kaukopunaisen aallonpituusalueella. (Holopainen ym. 2018, Hyvärinen 2001). Toisaalta on myös havaittu, että terpeenien vapautuminen vähenee punaisen/kaukopunaisen valon vaikutuksesta valkoiseen valoon verraten (Kegge ym. 2013). Myös seskviterpeenien vapautumisen on havaittu vähenevän merkittävästi punaisen/kaukopunaisen valon vaikutuksesta (Kegge ym. 2015). Kuitenkin joillakin lajeilla, kuten basilikalla ja piparmintulla on havaittu, että lyhyemmät aallonpituudet, sininen ja UV-B-säteily, lisäävät terpeenien vapautumista. (Hyvärinen 2001). GLV-yhdisteiden vapautumisen on havaittu olevan runsaampaa valkoisen valon, kuin punaisen/kaukopunaisen valon vaikutuksesta (Kegge ym.
2015). Toisaalta on myös havaittu, että GLV-yhdisteiden vapautuminen lisääntyy juuri punaisen ja kaukopunaisen valon vaikutuksesta. Myös sinisen valon on havaittu lisäävän GLV- yhdisteiden vapautumista kasveilla. (Colquhoun ym. 2013). Muiden VOC-yhdisteiden (kuin GLV tai terpeenit) vapautumisen on havaittu vähenevän punaisen valon vaikutuksesta (Kegge ym. 2013, Kegge ym. 2015), mutta myös lisääntyvän punaisen valon vaikutuksesta (Colquhoun ym. 2013). Joidenkin VOC-yhdisteiden vapautumisen on havaittu olevan runsasta myös valkoisen ja sinisen valon vaikutuksesta (Colquhoun ym. 2013).
2.2.3. LED-valot kasvien kasvatuksessa
Kaikista yleisimpiä kasvien kasvatuksessa käytettyjä valonlähteitä ovat korkeapainenatriumlamput, monimetallilamput (metallihalidit) ja loisteputkivalaisimet (Brazaityte ym. 2014, Singh ym. 2014). Nämä valonlähteet ovat kuitenkin epäedullisia kasveille, sillä niissä on kiinteä spektri, jota ei voida säätää. Niissä on myös paljon sellaisia aallonpituuksia, joita kasvi ei pysty juurikaan hyödyntämään ja mm.
korkeapainenatriumlamput toimivat korkean paineen avulla, jonka vuoksi ne lämpenevät
käytössä runsaasti, kuluttavat paljon sähköä ja täten niitä ei voida asettaa lähelle kasvia.
Aiemmin kasvihuoneolosuhteissa valonlähteillä onkin pyritty simuloimaan auringonvalon spektriä, jolloin lamput tuottavat enemmän sellaisia aallonpituuksia, joita kasvit eivät niin tehokkaasti absorpoi, mikä on johtanut siihen, että suuri osa energiasta on säteillyt takaisin kasvin pinnasta. Ongelmana on siis ollut se, että kasvien pigmenttien absorbanssipiikit ja valon spektri sekä säteilyteho eivät kohtaa ja täten suuri osa valon energiasta jää hyödyntämättä.
(Holopainen ym. 2018, Singh ym. 2014). Tämän vuoksi LED (Light Emitting Diode) -valot uutena teknologiana ovat tulleet kasvihuonetuotantoon ja niiden suosio kasvaa koko ajan.
LED-valot ovat puolijohdettuja diodeja, joista parhaiten kasvintuotantoon sopivat sellaiset valot, joiden valospektri voidaan säätää kasveille optimaaliseksi, joiden valointensiteettiä ja säteilytehokkuutta voidaan säätää tarpeen mukaan, jotka voidaan asettaa lähelle kasvia niiden vähäisen lämpenemisen vuoksi, ovat energiatehokkaita, omaavat yksinkertaisen himmennyssysteemin, omaavat korkean kasvin spektriherkkyyskäyrän RQE (relative quantum efficiency), joilla on pidempi elinikä muihin valonlähteisiin verrattuna, ovat luotettavia ja kompaktin kokoisia, sekä joilla on stabiili lämpötila sisätiloissa kammoissa ja kasvihuoneissa.
Näillä ominaisuuksilla LED-valojen käyttö mm. vähentää kasvien lämpöstressiä ja vähentää kastelun ja tuulettamisen tarvetta. Kaikissa LED-valoissa ei kuitenkaan ole näitä kaikkia ominaisuuksia. (Brazaityte ym. 2014, Holopainen ym. 2018, Singh ym. 2014).
Kasvien kasvatuksessa mahdollisuus valotehon ja spektrin säätämiseen on etu, koska tällöin valo-olosuhteet voidaan optimoida kasville parhaiten, jolloin sen fotoreseptorit aktivoituvat tehokkaasti ja pystytään parantamaan kasvien kasvua ja fysiologisten prosessien, kuten kukinnan ja yhteyttämisen tehokkuutta. Kasvit tarvitsevatkin valoa läpi niiden eliniän aina idätyksestä kukintaan ja siementen tuottamiseen. Valon määrä ja laatu vaikuttavatkin tiettyjen fotoreseptorien kykyyn aistia valoa, jonka vuoksi valolle on asetettava kolme vaatimusta: laatu, määrä ja aika. Valon määrä tai voimakkuus on tärkein tekijä, joka vaikuttaa kasvin fotosynteesin fotokemiallisiin reaktioihin viherhiukkasissa, sillä fotosynteesissä tarvitaan valoenergiaa. Valon laatu taas tarkoittaa valon spektrijakaumaa, eli missä suhteessa spektrissä on esim. sinistä, vihreää ja punaista valoa. Fotosynteesiä varten kasvit tarvitsevat erityisesti sinistä ja punaista valoa. Aika eli valojakso vaikuttaa lähinnä kukintaan ja kukinta-aikaa kasveissa voidaankin kontrolloida säätelemällä valojaksoa. (Singh ym. 2014).
2.2.4. Lehtikaali
Lehtikaali on tummanvihreä ja voimakkaanmakuinen kasvi, joka kuuluu kaalivihannesten sukuun (Brassica). Lehtikaali on myös koko ajan lisääntyvä kasvi markkinoilla sen ravintorikkauden ja terveellisyyden vuoksi. Onkin tutkittu, että lehtikaali on hyvin ravintorikas kasvi ja sisältää runsaasti useita mikroravinteita, kuten antioksidantteja, karotenoideja, glukosinolaatteja, polyfenoleita, kuituja, vitamiineja ja mineraaleja. Lehtikaalissa on siis runsaasti A, K ja C -vitamiineja, sekä kaliumia, kalsiumia ja magnesiumia. Lehtikaalien ravintosisältö kuitenkin vaihtelee paljon geneettisen ja ympäristön vaikutusten, kuten auringonvalon, lämpötilan, kuivuuden, vuoksi. Tämän lisäksi kaalin ravintosisältöön vaikuttavat sadonkorjuun, varastoinnin ja myyntikuljetuksen olosuhteet, sekä ruuanvalmistusmenetelmät. Esimerkiksi keittäessä kaalin vesiliukoiset yhdisteet, kuten C- vitamiini ja glukosinolaatit, liukenevat helposti kaalista pois. (Fahey ym. 2003, Migliozzi ym.
2015).
Koska kaalivihannekset ovat kylmänkestäviä vihanneksia, niin on myös tutkittu, että parhaat olosuhteet lehtikaalin viljelylle ovat 15 – 20 ℃ lämpötilassa. Kaalit pystyvät sietämään jopa - 4 ℃ lämpötilaa ja vastaavasti 26 – 27 ℃ lämpötila heikentää kaalin laatua. Kaalit pystyvät kasvamaan hyvin erityyppisissä maaperissä luonnossa ja suoran siementen kylvämisen lisäksi kaaleja viljellään myös enenevissä määrin siirtämällä kasvihuoneissa kasvatetut taimet luonnonpellolle. Kaikki kaalivihannekset ovat myös herkkiä samoille sairauksille ja tuhohyönteisille. (Fahey 2003).
Ravinteiden lisäksi tiedetään, että lehtikaali sisältää joitakin fytokemikaaleja, kuten foolihappoa, askorbiinihappoa, riboflaviinia ja karoteeneja. (Migliozzi ym. 2015).
Glukosinolaatit ovat laaja ryhmä orgaanisia yhdisteitä, jotka sisältävät anioneja ja rikkiä, ja ovat hydrofiilisiä, sekä toimivat kasvien aineenvaihduntatuotteina. Glukosinolaatit luokitellaan aminohappoihin ja aminohappojen sisällä ne voidaan jakaa vielä alifaattisiin (mm.
glukonapiini, progoitriini, glukorafaani), aromaattisiin (mm. glukonasturtiini) ja indolisiin (mm. glukobrassikiini) glukosinolaatteihin. Kasvit tuottavat glukosinolaatteja glukoosista.
(Hahn ym. 2016). On havaittu, että esimerkiksi eläimillä kaalien glukosinolaatit, erityisesti progoitriini, on häirinnyt tyroksiinin tuotantoa vähentämällä jodin pääsyä kilpirauhaseen ja täten kehittänyt struumaa ja muita vastaavia ongelmia. Muiden glukosinolaatteihin kuuluvien yhdisteiden on kuitenkin havaittu estävän syöpäsolujen syntyä. Mm. sulforafaanin on havaittu
toimivan nisäkkäillä voimakkaana entsyyminä, joka helpottaa deaktivaatiota ja monien karsinogeenien eritystä pois kehosta. (Fahey 2003).
Kaalivihannekset ovat erittäin hyviä antioksidantteja ja A-vitamiinin karotenoidien, kuten β- karoteenin, lähteitä. Nämä yhdisteet ovat pitkäketjuisia, rasvaliukoisia hiilivetypigmenttejä, jotka keräävät valoa ja niitä on tyypillisesti kasvien lehdissä, varsissa ja kukinnoissa.
Kaalivihannekset ovat myös hyviä flavonoidien ja muiden niihin yhdistettyjen yhdisteiden lähteitä, jotka toimivat myös hyvinä antioksidantteina. (Fahey 2003).
Kaalikasveilla on monia haihtuvia yhdisteitä, jotka vaikuttavat niiden makuun ja tuoksuun.
Kaaleilla tunnettuja monoterpeenejä ovat mm. alfapineeni, betapineeni, kamfeeni, 3-kareeni, limoneeni, linalooli ja geranyyliasetaatti. Kaaleille tunnettuja seskviterpeeenejä ovat mm. alfa- farneseeni ja valenseeni. Kaaleilla tunnettuja GLV-yhdisteitä ovat mm. cis-3- heksenyyliasetaatti, trans-2-heksenaali, 1-heksanoli ja cis-3-heksenoli. Kaaleilla tunnettuja muita VOC-yhdisteitä ovat mm. metyylisalisylaatti, metyylipyrroli ja bentsaldehydi. (Acton ym. 2018, Barros ym. 2014., Veromann ym. 2013). Näistä GLV-yhdisteet aiheuttavat ruohomaista hajua. (Scala ym. 2013). Monoterpeeneistä mm. pineenit aiheuttavat kuusen ja männyn tuoksua, limoneeni aiheuttaa sitrusmaista (appelsiini, lime, minttu, sitruuna) tuoksua, linalooli aiheuttaa kukkaista ja laventelin tuoksua, kamfeeni aiheuttaa pistävää hajua ja 3- kareeni makeaa, mutta pistävää hajua. (Medical Jane 2020).
3. TYÖN TAVOITTEET
Työn tavoitteena oli altistaa lehtikaaleja kolmelle erilaiselle LED-valospektrille ja tutkia, onko eri spektreillä vaikutuksia lehtikaalien kemialliseen koostumukseen ja ulkonäköön.
Tarkoituksena oli myös kartoittaa, onko kaalien kemiallisessa koostumuksessa eroja, kun kasvit ovat eläviä kasveja tai kun ne on pilkottu salaatiksi eli niille on aiheutettu mekaanista vauriota. Koska valon eri aallonpituuksilla on vaikutuksia mm. kasvien hajua ja makua tuottaviin yhdisteisiin, niin on myös mielenkiintoista tutkia empiirisesti onko eri spektriolosuhteissa kasvaneiden kaalien hajussa ja maussa eroja. Tämä tutkielma keskittyy kuitenkin vain eri spektriolosuhteiden aiheuttamiin vaikutuksiin kaalien kemiallisessa koostumuksessa.
4. AINEISTO JA MENETELMÄT 4.1. KASVATUKSET
Lehtikaalien (Brassica oleracea var. sabellica, lajike Nero di Toscana, alkuperä Enza Zaden, Alankomaat) kasvatus aloitettiin 25.4.2018. Ennen kasvatuksen aloitusta siemeniä idätettiin, jonka jälkeen kaalit laitettiin kasvamaan kammioihin. Idätystä varten kylvettiin kolme lehtikaalin siementä yhden (1) litran ruukkuihin, joissa kasvualustana käytettiin turve (Kekkilä Puutarhaturve) : multa (Kekkilä Puutarhamulta) : hiekka (0,5 – 1,2 mm Weber Saint-Gobain) -seosta 3:1:1 suhteessa. Ruukkuja oli yhteensä 288 kappaletta. Tämän jälkeen ruukut laitettiin 12 muovilaatikkoon, joista jokaiseen tuli 24 ruukkua ja laatikot laitettiin itämään matalan valotason alle. Lämpötila oli idätyksen alkaessa 22 ℃ ja suhteellinen kosteus RH oli 32 %.
Lämpötilaa ja suhteellista kosteutta kokeen ajan mittasi ja tallensi TinyTag-merkkinen sensori/tiedonkeruulaite.
Idätyksen jälkeen kaalit siirrettiin kasvatuskammioihin. Jokaisessa kammioissa oli kaksi muovilaatikkoa, A ja B -laatikot, ja jokaisessa laatikossa 24 ruukkua, joten yhdessä kammiossa oli aina 48 ruukkua. Kasvatuksessa käytettiin kuutta kasvatuskammioita (Fitotron, Weiss Technik, Germany) ja kolmea eri valokäsittelyä. Täten kahdessa kammiossa oli aina samanlainen valospektri. Kasvatusten kaksi ensimmäistä vuorokautta kaikissa kammioissa oli 50:50 -spektri teknisten ongelmien vuoksi. Tämän jälkeen LED-valaisinten (Valoya Oy, B100- sarja, G2 ja NS1 –spektreillä varustetut valaisimet) tehosuhteet asetettiin siten, että G2:NS1 → 80:20 (myöhemmin tekstissä spektri 1), 50:50 (spektri 2), 20:80 (spektri 3), joista spektri 1 oli punaisin ja spektri 3 oli sinisin (Taulukko 1). Kammioissa käytettiin nk. heinäkuun kaaliohjelmaa, eli RH oli 50 % klo 9.00–17.00, joka nostettiin 80 %:iin klo 17.00 alkaen klo 23.00 asti, RH oli 80 % klo 23.00–3.00 ja RH lähti laskemaan takaisin 50 %:iin klo 3.00 alkaen klo 9.00 asti. Lämpötila oli 23 ℃ klo 9.00–18.00, jonka jälkeen sitä lähdettiin laskemaan 18
℃ klo 18.00 alkaen klo 1.00 asti, lämpötila oli 18 ℃ klo 1.00–4.00 ja nostettiin takaisin 23 ℃ klo 4.00 alkaen klo 9.00 asti. Valot olivat kokonaan pois päältä klo 23.00–1.00, jonka jälkeen valotasoa nostettiin aina klo 6.00 asti. Valointensiteetti PAR (photosynthetically active radiation) oli 320 µmol m-2 s-1 klo 6.00–18.00, jonka jälkeen valointensiteetti laski aina klo 23.00 asti. Kasvatuksessa lamppujen korkeutta säädettiin siten, että PAR-taso saatiin pysymään
kaikissa kammioissa samana koko kasvatuksen ajan. PAR tasoa mitattiin auringonvalon PAR- mittauksiin tarkoitetulla Licorin mittarilla, jonka lukemat ovat alhaisempia, kuin spektroradiometrin lukemat. Tämän vuoksi selvitettiin se, että Licorin mittarilla saadaan sama tavoitetaso PAR 320 µmol m-2 s-1, niin sen tulee näyttää seuraavasti: spektri 1 80:20 – 260 µmol m-2 s-1, spektri 2 50:50 – 255 µmol m-2 s-1 ja spektri 3 20:80 – 250 µmol m-2 s-1. PAR taso mitattiin aina ylimpien lehtien kohdalta kammion keskeltä.
Kasvatuksen aikana kasveja kasteltiin päivittäin hanavedellä ja laatikoiden asentoa kammoissa muutettiin päivittäin. Kasveja lannoitettiin aina kerran viikossa 0,1 % Taimi-Superex lannoitteella, jossa N:P:K (typpi, fosfori, kalium) suhde oli 19:4:20. Tämän lisäksi kammioita valospektreineen vaihdettiin kerran viikossa kammiovaikutusten minimoimiseksi, sillä jokaisen kammion valot voivat olla hieman erilaisia, niissä voi olla esim. pieniä eroja valaisintehokkuudessa, niiden asento hieman erilainen tai joku yksittäinen ledi voi olla rikki.
Täten pyrittiin siis siihen, että kaikki kasvit saisivat mahdollisimman tasapuolisen altistuksen.
Kammioiden vaihdon yhteydessä vaihdettiin myös oikeat valospektrit ja säädettiin lamput oikeille korkeuksille. Kasvatus päättyi 27.6.2018.
Taulukko 1. Eri aallonpituuksien osuudet (%) kammioissa olleissa kolmessa eri valospektrissä 200 – 800 nm välillä. Arvot ovat kuudessa kammiossa mitattujen tulosten keskiarvoja.
Spektri 1 Spektri 2 Spektri 3
aallonpituus, nm 80:20 G2:NS1 50:50 G2:NS1 20:80 G2:NS1 320-400 UV-A
400-500 sininen
<0.05 9.6
0.1 12.9
0.2 15.7
500-600 vihreä/keltainen 9.6 20.9 30.3
600-700 punainen 62.4 49.3 37.3
700-800 kaukopunainen 19.2 12.7 7.0
punainen/kaukopunainen* 3.33 4.22 6.44
sininen/vihreä 1.67 0.83 0.66
sininen/punainen 0.20 0.33 0.52
Pfr/Ptot 0.76 0.77 0.78
*650–670 nm/720–740 nm.
Spektrit on mitattu Optronics spektroradiometrillä jokaisen kammion keskeltä.
4.2. KEMIALLISET JA FYSIKAALISET ANALYYSIT
Kasveista analysoitiin näkyvät oireet, glukosinolaatti- ja fenoliyhdisteet ja -pitoisuudet sekä VOC-yhdisteet ja -emissionopeudet. Glukosinolaatti- ja fenolipitoisuudet valittiin tutkittavakasi juuri sen takia, että ne ovat lehtikaalin tärkeimmät puolustuskemikaalit, ja täten reagoivat ensimmäisinä ympäristöolosuhteiden muutoksiin.
4.2.1. Kasvu ja ilmiasu
Kasveista mitattiin lehtien pituudet ja leveydet mittanauhalla, sekä arvioitiin niiden ryppyisyys silmämääräisesti laboratorion loisteputkivalaistuksessa. Tämä tehtiin neljälle eri lehdelle jokaisesta kasvista. Visuaalisessa kuntoarviossa arvioitiin kasveille kasvatuksen aikana LED- valoista aiheutunut vaurio prosentuaalisesti 0 – 100 % luokituksella, sekä laskettiin kokonaislehtimäärä. Näkyvien vaurioiden määrä arvioitiin laboratorion loisteputkivalaistuksessa. Kasveista punnittiin myös niiden tuore- ja kuivapainot. Kaikki näytteet kemiallisia analyysejä varten otettiin sekä elävistä kasveista, että salaatiksi pilkotuista kasveista. Kasvit pilkottiin salaatiksi siten, että lehdistä leikattiin ensin lehtiruoti pois ja sitten noin 1,5 cm × 1,5 cm kokoisia vakioitua neliöitä, joista jokaiselle sivulle tuli leikkauspinta.
4.2.2. Glukosinolaattianalyysi
Glukosinolaatit analysoitiin uuttomenetelmän avulla. Glukosinolaatit analysoitiin Hahn ym.
2016 tutkimuksen menetelmään pohjautuen. Glukosinolaattianalyysejä varten tuoretta lehtikaalia punnittiin n. 10 g. Ensin glukosinolaattinäytteet kuivattiin uunissa 120 °C kaksi tuntia, jonka jälkeen ne jauhettiin hienoksi jauheeksi nestetypen avulla huhmareessa.
Jauhamisen jälkeen glukosinolaattinäytteisiin lisättiin 8 ml 80 % -metanoli-20 % -vesiseosta ja näytteet vortexoitiin. Metanoli-vesiseoksen lisäämisen jälkeen näytteet uutettiin ultraäänihauteessa 80 °C lämpötilassa 60 min. Uuttamisen jälkeen näytteet suodatettiin ja haihdutettiin kuivaksi typpikaasun, sekä lämpöblokin avulla. Näytteitä oli 10 kappaletta per spektri.
Esikäsittelyn jälkeen näytteet ajettiin korkean erotuskyvyn nestekromatografialla eli HPLC- laitteistolla. HPLC-ajon ja yhdisteiden tunnistamisen teki yhteistyökumppani Itä-Suomen
yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksen Joensuun kampuksella. Näytteiden jälkikäsittely ja HPLC-ajo tehtiin Nybakken ja Julkunen-Tiitto 2013 tutkimuksen menetelmään pohjautuen. Uutetut ja kuivaksi haihdutetut näytteet liuotettiin uudelleen siten, että näytteisiin lisättiin 600 µl metanoli-vesiseosta (1:1). Näytteet ajettiin Agilent Series 1100 HPLC laitteistolla, jossa oli pumppu G1312A, lämpöinjektori G1329A lämpökolonniuuni G1316A ja diodijärjestelmäilmaisin G1315B. Varsinaisena kolonnina, jossa yhdisteiden erottuminen tapahtuu, laitteistossa oli Zorbax SB-C18 (4,6 × 60 mm) HPLC kolonni. Eluenttina ajossa käytettiin 100 % metanolia virtauksen ollessa 2 ml/min. Diodijärjestelmäilmaisimessa eluenttina oli 0,25 % ortofosforihappoa. Autoinjektoinnin suuruus oli 20 µl ja injektorin lämpötila oli 24 ℃. Kolonniuunin lämpötila oli 30 ℃. Yhdisteet tunnistettiin vertaamalla näytteiden kromatogrammien retentioaikoja standardeihin. Kvantitointiaallonpituus glukosinolaateilla oli 229 nm.
4.2.3. Fenolianalyysi
Fenolit käsiteltiin siten, että ne kuivattiin kylmäkuivurissa ja kuivatut näytteet jauhettiin nestetypen avulla hienoksi jauheeksi. Jauhamisen jälkeen näytettä punnittiin 10 mg fenolianalyysiä varten. Näytteitä oli 10 kappaletta per spektri.
Esikäsittelyn jälkeen näytteet ajettiin HPLC-laitteistolla. Myös fenolinäytteiden HPLC-ajon ja yhdisteiden tunnistamisen teki yhteistyökumppani Itä-Suomen yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksen Joensuun kampuksella. Näytteiden jälkikäsittely ja HPLC-ajo tehtiin Nybakken ja Julkunen-Tiitto 2013 tutkimuksen menetelmään pohjautuen. Ennen HPLC-ajoa näytteet uutettiin siten, että näytteiden sekaan lisättiin kolme ruostumatonta terästä olevaa palloa ja 600 µl raakaa metanolia. Tämän jälkeen näytteet homogenisoitiin Precellys 24 homogenisaattorissa 30 sekuntia 5000 rpm nopeudella. Homogenisoinnin jälkeen näytteiden annettiin olla jäähauteessa 15 minuuttia. Jäähdytyksen jälkeen näytteet vielä sentrifugoitiin Eppendorf 5415 R sentrifugissa kolmen minuutin ajan 9500g putkissa ja sentrifugoinnissa saatu supernatantti (liuos) erotettiin 6 ml lasiputkeen. Sentrifugoinnissa saatu jäännös homogenisoitiin vielä kolme kertaa 600 µl:ssa metanolia. Saadut supernatantit haihdutettiin kuivaksi sentrifugissa Eppendorf 270 ja näytteitä säilöttiin -20 ℃ pakkasessa, kunnes ne ajettiin HPLC-laitteistolla. Uutetut ja kuivaksi haihdutetut näytteet liuotettiin uudelleen siten, että näytteisiin lisättiin 600 µl metanoli-vesiseosta (1:1). Näytteet ajettiin Agilent Series 1100 HPLC laitteistolla, jossa oli pumppu G1312A, lämpöinjektori G1329A lämpökolonniuuni
G1316A ja diodijärjestelmäilmaisin G1315B. Varsinaisena kolonnina, jossa yhdisteiden erottuminen tapahtuu, laitteistossa oli Zorbax SB-C18 (4,6 × 60 mm) HPLC kolonni.
Eluenttina ajossa käytettiin seosta, jossa oli 100 % metanolia ja 1,5 % tetrahydrofuraania virtauksen ollessa 2 ml/min. Diodijärjestelmäilmaisimessa eluenttina oli 0,25 % ortofosforihappoa. Autoinjektoinnin suuruus oli 20 µl ja injektorin lämpötila oli 24 ℃.
Kolonniuunin lämpötila oli 30 ℃. Yhdisteet tunnistettiin vertaamalla näytteiden kromatogrammien retentioaikoja standardeihin. Kvantitointiaallonpituudet fenoleilla olivat 270 ja 320 nm, yhdistekohtaiset aallonpituudet on mainittu tulostaulukoissa (taulukot 3 ja 4).
4.2.4. VOC-keräys
VOC-keräys tehtiin analyysien tavoin myös sekä elävistä kasveista, että salaatiksi pilkotuista kasveista. Elävien kasvien VOC-keräys suoritettiin kasvatuskammioissa keräyspakeilla. VOC- keräyksiä varten elävien kasvien päälle laitettiin uunipussi ja kulmiin tehtiin reiät.
Ensimmäisestä reiästä laitettiin teflonista valmistettu tuuletusputki pussiin, jonka annettiin tuuletta pussia n. 10 min korvausilman virtausnopeuden ollessa 500 ml min-1. Tuuletuksen jälkeen aloitettiin varsinainen näytteenotto, jonka vuoksi toisesta reiästä laitettiin adsorbenttiputki, joka sisälsi 250 mg adsorbenttia (Tenax TA:Carbopack B 1:1, Markes international, Llantrisant, UK), johon VOC-yhdisteitä kerättiin pumpun (Thomas 5002 12 V DC, Puchheim, Saksa) avulla 30 min virtausnopeuden ollessa 200 ml min-1. Salaatiksi pilkotuissa näytteissä menetelmä oli hieman erilainen. Tällöin pilkotut näytteet olivat noin yhden (1) litran lasipurkeissa, joiden kansiin kiinnitettiin letkut. Salaatiksi pilkotuiden näytteiden VOC-keräyksessä tuuletus kesti n. 10-15 min (virtausnopeus 500 ml min-1) ja varsinainen keräysaika oli 60 min (virtausnopeus 200 ml min-1). Blankkonäytteet kerättiin tyhjästä uunipussista ja lasipurkista. Näytteenoton jälkeen Tenax-putket laitettiin ajoon GC- MS laitteelle, jonka jälkeen analysoitiin kasveista löytyvät VOC-yhdisteet. Elävissä kasveissa näytteitä oli 10 kappaletta per spektri ja salaatiksi pilkotuissa kasveissa näytteitä oli yhdeksän (9) kappaletta per spektri.
Salaatiksi pilkotut näytteet analysoitiin laitteella, jossa lämpöblokki oli Markes Thermal desorber, kaasukromatografi oli Agilent 7890A ja massaspektrometri oli Agilent 5975C.
Salaatiksi pilkottujen kasvien GC-MS ajossa lämpöblokissa oli 38 ℃ lämpötila neljä minuuttia, jonka jälkeen se nousi aina 5 ℃ minuutissa 210 ℃ asti ja sen jälkeen 20 ℃ minuutissa 260 ℃ asti, joka oli lämpöblokissa myös neljä minuuttia. Tämän jälkeen näytettä
injektoitiin 1 µl kolonniin. Kolonnin (pituus 60 m, sisähalkaisija 250µm, stationäärifaasin paksuus 0.25 µm, 19091S-436UIHP-5MS, Agilent), kantajakaasuna oli helium, lämpötila 350
℃ ja virtaus 1 ml/min. Yhdisteet tunnistettiin ja kvantitoitiin ChemStation Data Analysis ohjelmistolla vertaamalla niiden retentioaikoja kaupallisten standardien retentioaikoihin ja määriin. Lisäksi tunnistuksessa käytettiin apuna Wileyn ja NISTin tietokantoja.
Elävät kasvit analysoitiin ATD400 GC-MS laitteella. Elävien kasvien GC-MS ajossa lämpöblokissa alkulämpötila oli 40 ℃ kaksi minuuttia, jonka jälkeen se nousi 5 ℃ minuutissa 210 ℃ asti ja sen jälkeen 20 ℃ minuutissa 250 ℃ asti, joka oli lämpöblokissa viisi minuuttia.
Tämän jälkeen näytettä injektoitiin 1 µl kolonniin. Kolonni oli samanlainen kuin edellä, kantajakaasuna oli helium, lämpötila 350 ℃ ja virtaus oli 1,2 ml/min. Yhdisteet tunnistettiin kuten edellä.
4.3. TILASTOLLISET ANALYYSIT
Tilastollisessa testauksessa käytettiin IBM SPSS tilasto-ohjelmaa. Tuloksista laskettiin spektrikohtaiset keskiarvot ja keskihajonnat fenoliyhdisteille, glukosinolaateille ja VOC- yhdisteiden emissionopeuksille. Lisäksi tuloksista laskettiin kokonaisfenolit ja kokonaisglukosinolaatit. Tulokset testattiin tilastollisesti Kruskal-Wallis testillä eli testattiin, onko eri spektrien välillä tilastollista merkitsevyyttä. Tämän lisäksi käsittelyjenväliset erot testattiin tilastollisesti Bonferroni testillä, mikä kertoi sen, minkä spektrien välillä tilastollinen merkitsevyys oli. Tulos oli tilastollisesti merkitsevä, jos p < 0,05.
5. TULOKSET
5.1. LEHTIEN KASVU JA ILMIASU
Kuvissa 1, 2 ja 3 on esitetty spektrien vaikutus kaalin lehtien morfologiaan. Kuvista 1 ja 2 voidaan nähdä, että spektreillä ei ollut juurikaan vaikutusta lehtien pituuteen tai leveyteen vaan kaikissa käsittelyissä lehtien pituudet ja leveydet ovat lähes samanlaiset.
Kuva 1. Spektrien vaikutus kasvien lehtien pituuteen, n = 10, p-arvo 0,186
Kuva 2. Spektrien vaikutus kasvien lehtien leveyteen, n = 10, p-arvo 0,976
Kuvasta 3 voidaan nähdä, että lehtien ryppyisyyteen spektreillä oli enemmän vaikutusta.
Kaikista sileimmät lehdet olivat spektrin 3 kasveilla ja kaikista ryppyisimmät lehdet spektrin 2 kasveilla. Spektrin 1 kasvien ryppyisyys on hyvin lähellä spektrin 2 kasvien ryppyisyysluokkaa, näiden molempien ryppyisyysluokan keskiarvon ollessa yli kahden. Ero ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkitsevä. Kaikkien spektrien ryppyisyysluokan mediaani oli 2. Kuitenkin eri spektrien lehtien ryppyisyysjakaumaa tarkemmin tarkasteltaessa voidaan havaita, että spektrissä 2 myös lehtien ryppyisyys oli kaikkein tasaisimmin jakautunut eri
ryppyisyysluokkien kesken (kuva 5). Spektrin 1 kasveilla taas lehdet kuuluivat pääasiassa ryppyisyysluokkiin 1 ja 2 (kuva 3), kun spektrin 3 kasveilla ei ollut kaikkein ryppyisimmän, eli ryppyisyysluokan 4 lehtiä ollenkaan (kuva 6).
Kuva 3. Spektrien vaikutus kasvien lehtien ryppyisyyteen, n = 10, p-arvo 0,095
Kuva 4. Spektrin 1 lehtien ryppyisyysjakauma, n = 10
Kuva 5. Spektrin 2 lehtien ryppyisyysjakauma, n = 10
Kuva 6. Spektrin 3 lehtien ryppyisyysjakauma, n = 10
