NZW-KANIMALLISSA
Aleksi Leikas Syventävien opintojen opinnäytetyö A.I. Virtanen -instituutti Terveystieteiden tiedekunta Itä-Suomen yliopisto 11.1.2021
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos
Lääketieteen koulutusohjelma
LEIKAS, ALEKSI J.: Valoaktivoituvien nanopartikkelien turvallisuuden testaaminen NZW-kanimallissa
Opinnäytetutkielma, 30 sivua + 2 liitettä
Tutkielman ohjaajat: FT Petri Mäkinen, LT Jarkko Hytönen Joulukuu 2020
Asiasanat: Ateroskleroosi, nanopartikkelit, dendrimeerit
CosmoPHOS-nano on yhteensä 19 eri yhteistyökumppanin monikansallinen hanke, jos- sa pyritään löytämään uudenlainen valoaktivoituviin nanopartikkeleihin perustuva hoi- tomuoto sepelvaltimotautiin. Tässä tutkimuksessa selvitettiin hankkeessa käytettyjen dendrimeerinanopartikkeleiden turvallisuutta koe-eläinmallissa, jonka aineisto koostui yhteensä kahdeksasta (n = 8) naaraspuolisestaNew Zealand White (NZW) -rotuisesta kanista. Eläimille oltiin aikaansaatu valtimonkovettumatauti syöttämällä niille koles- terolipitoista rehua ja suorittamalla kanien aorttojen denudaatio. Kaneista kuudelle (n
= 6) annettiin nanopartikkeleita sisältänyt injektio, ja kontrolliryhmän kaksi (n = 2) koe-eläintä saivat aktiivisen yhdisteen sijasta injektion keittosuolaa. Nanopartikkelei- den annettiin jakaantua elimistössä viikon verran, minkä jälkeen kaneille suoritettiin valoaktivaatioterapia. Terapiaa seurasi kahden kuukauden pituinen seuranta-aika, jon- ka jälkeen kanit lopetettiin ja niistä otetiin kudosnäytteet analyysin kannalta keskeisistä elimistä. Kudokset käsiteltiin ja leikattiin näytelaseille, jonka jälkeen leikkeet värjät- tiin hematoksyliini-eosiinivärjäyksellä. Näytteille suoritetun histopatologisen analyysin perusteella voidaan todeta, että suurimmassa osassa kudoksia ilmeni muutoksia, jotka voidaan yhdistää joko suoraan tai välillisesti kaneille syötettyyn kolesterolia sisältänee- seen rehuun. Nanopartikkeleita saaneiden kanien näytteissä ei pystytty havaitsemaan sellaisia muutoksia, joita ei olisi näkynyt myös kontrollieläinten näytteissä tai joita ei olisi pystynyt selittämään hyperkolesterolemian aiheutumilla kudosmuutoksilla ja elin- vaurioilla.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences School of Medicine
Medicine
LEIKAS, ALEKSI J.: Testing the Safety of Nanoparticles in NZW-Rabbit Model Thesis, 30 pages + 2 appendices
Tutors: Ph.D. Petri Mäkinen, M.D., Ph.D. Jarkko Hytönen November 2020
Keywords: Atherosclerosis, Nanoparticles, Dendrimers
CosmoPHOS-nano is a multinational project consisting of 19 different consortium part- ners, which aims to find a novel therapeutic method for coronary artery disease based on the photosensitive nanoparticles. In this study, the safety of the dendrimer nano- particles used in the project was assessed in the animal model, whose study population consisted of eight (n = 8) female New Zealand White (NZW) rabbits. Atherosclerosis was induced to the animals by feeding cholesterol-rich chow and performing an aortic denudation to the rabbits. An injection containing nanoparticles was given to the six of the rabbits (n = 6), while two of the rabbits (n = 2) received an saline injection ins- tead of the active substance. Nanoparticles were allowed to distribute for about a week, after which the phototherapy was performed to the rabbits. The therapy was followed by approximately two month follow-up time, after which the rabbits were sacrificed and samples were harvested from the tissues relevant for purpose of the analysis. The tissues were processed and cut into tissue slides, after which they were stained wtih hematoxylin-eosin staining. Based on the histopatological analysis of the samples, it can be concluded that most of the tissues manifested changes that can be connected either directly or indirectly with the cholesterol-containing chow fed to the rabbits. No changes were observed in the samples of the rabbits that had received nanoparticles that could not be observed also in the samples of the control animals or that could have not been explained by changes or organ damage caused by the hypercholesterolemia.
1 JOHDANTO
52 TEOREETTINEN TAUSTA
62.1 Valtimonkovettumatauti . . . 6
2.2 Sepelvaltimotauti . . . 7
2.3 NZW-kanit valtimonkovettumataudin tutkimuksessa . . . 7
2.4 Nanopartikkelit ja dendrimeerit . . . 8
2.4.1 Dendrimeerien turvallisuus . . . 9
2.5 Fotodynaaminen terapia ja valoaktivaatio . . . 10
2.5.1 Sinkkiftalosyaniini valoherkistäjänä . . . 10
2.5.2 Fotodynaaminen terapia sepelvaltimotaudin hoidossa . . . 11
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET
124 MATERIAALIT JA MENETELMÄT
13 4.1 Aineisto . . . 134.1.1 Näytteiden ottoa edeltäneet toimenpiteet . . . 13
4.2 Menetelmät . . . 14
4.2.1 Näytteiden käsittely ja värjäys . . . 14
4.2.2 Valomikroskopointi ja analyysi . . . 15
5 TULOKSET
15 5.1 Maksa . . . 155.2 Ohutsuoli . . . 16
5.3 Mahalaukku . . . 17
5.4 Perna . . . 18
5.5 Munuainen . . . 19
5.6 Silmä . . . 19
5.7 Keuhkot . . . 20
5.8 Sydän . . . 21
5.9 Iho . . . 22
5.10 Munasarjat . . . 22
5.11 Imusolmuke . . . 23
5.12 Luustolihas . . . 24
6 POHDINTA
24 6.1 Johtopäätökset . . . 263
LIITTEET
1 JOHDANTO
Sydän- ja verisuonitaudit johtavat vuosittain maailmanlaajuisesti yli 17,3 miljoonaan ennenaikaiseen menehtymiseen (v. 2013) muodostaen siten yleisimmän kuolinsyyn maa- ilmassa. Suurin osa sydän- ja verisuonitautien kuolemaan johtavista päätetapahtu- mista on seurausta pitkälle edenneestä valtimokovettumataudista eli ateroskleroosis- ta (Mozaffarian ym. 2015). Ateroskleroosin seurauksena valtimoihin muodostuu tau- dille tyypillisiä kovettumia eli leesioita, jotka lopulta ahtauttavat valtimoita. Revetes- sään leesiot voivat aiheuttaa vaarallisia komplikaatioita, kuten sydän- ja aivoinfarkteja (Glass ja Witztum 2001). On ilmeistä, että sydän- ja verisuonitautien aiheuttaman valtavan kansanterveydellisen merkityksen vuoksi on tarve uusille ja tehokkaille valti- mokovettumataudin hoito- ja kuvantamiskeinoille.
Yksi mahdollinen lähestymistapa sydän- ja verisuonitautien ehkäisemiseksi saattaisi löytyä nanoteknologian tarjoamista mahdollisuuksista: Vaikka nanoteknologian hyö- dyntäminen lääketieteessä on keskittynyt aiemmin yksinomaan onkologian alalle, on nanolääketieteen käyttöedellytyksiä selvitetty viime aikoina laajalti myös valtimonko- vettumataudin viitekehyksessä. Yksi lupaavimmista ja eniten tutkituista nanopartik- keleiden käyttömahdollisuuksista liittyy niiden kykyyn toimia lääkeaineiden kuljetti- mina haluttuihin kohdekudoksiin, tässä tapauksessa esimerkiksi ateroskleroottisiin lee- sioihin (Lobatto ym. 2011). Terapeuttisten käyttökohteiden lisäksi partikkeleita pysty- tään hyödyntämään myös diagnostisessa kuvantamisessa esimerkiksi käyttämällä niitä kontrastia lisäävänä varjoaineena tai liittämällä niihin erilaisia fluoresoivia molekyylejä (Jaffer ym. 2009).
CosmoPHOS-nano on yhteensä 19 eri yhteistyökumppanin EU-rahoitettu hanke, jossa pyritään kehittämään uudenlainen terapia- ja kuvantamismenetelmä valtimonkovet- tumataudille (CosmoPHOS-nano 2016). Menetelmä perustuu lääkkeenä annettavien, fluoresoivien ja valoaktivoituvien nanopartikkeleiden kulkeutumiseen leesioissa olevien makrofagien sisälle. Valtimoplakit pystyttäisiin helposti paikallistamaan niissä olevien nanopartikkelien fluoresenssiominaisuuksien avulla. Terapiavaikutus taas saataisiin ak- tivoimalla makrofagien sisällä olevat partikkelit näkyvää valoa lähettävällä valtimon- sisäisellä katetrilla. Aktivaation jälkeen nanopartikkelit aikaansaavat happiradiaaklien muodostumisen makrofagien sisällä, jolloin partikkeleita fagosytoineet makrofagit tu- houtuvat, millä otaksutaan olevan plakkien regressoitumista edesauttava vaikutus.
Opinnäytetyöni liittyi osana CosmoPHOS-nano-tutkimushankkeeseen. Opinnäytetyös- säni minun tuli selvittää, onko hankkeessa käytetty nanopartikkeli turvallinen käyte-
tyssä koe-eläinmallissa. Aineistonani minulla oli kahdeksasta aiemmin nanopartikkelia saaneestaNew Zealand White (NZW) -kanista otetut kudosnäytteet, joille suoritin pe- rusteellisen histopatologisen analyysin.
2 TEOREETTINEN TAUSTA
2.1 Valtimonkovettumatauti
Valtimonkovettumatauti eli ateroskleroosi on elimistön valtimoita vaurioittava sai- raus, joka saa alkunsa lipoproteiinien tunkeutuessa valtimon endoteelikerroksen alle intimaan. Lipoproteiinien vuorovaikutus monosyyteistä erilaistuvien makrofagien, T- solujen ja valtimoseinämien omien solujen kanssa aiheuttaa verisuonielimistön kroo- nista inflammaatiota, mikä saa aikaan taudille tyypillisten ateroomaplakkien kehit- tymisen. Kasvaessaan plakit paksuuntavat intimaa, mikä aiheuttaa lopulta valtimon ahtautumista. Valtimonkovettumataudista johtuvat komplikaatiot, kuten sydän- ja ai- voinfarktit, johtuvat hauraiden ateroomaplakkien repeämisestä ja tämän seurauksena tapahtuvasta verihiutaleiden aktivoitumisesta, kun ne pääsevät kosketuksiin revenneen plakin sisemmän kerroksen kanssa. Aktivoituneet verihiutaleet aggregoituvat ja muo- dostavat yhdessä von Willebrand -tekijän ja fibrinogeenin kanssa trombin, joka tukkii verisuonen ja estää hapekkaan veren pääsyn kohde-elimeen (Ross 1999, Glass ja Witz- tum 2001).
Valtimokovettumataudin riskitekijöitä ovat seerumin suuri LDL-pitoisuus, diabetes, korkea verenpaine, tupakointi, ikä, suvussa esiintynyt valtimonkovettumatauti ja mies- sukupuoli. Valtimonkovettumataudin primaaripreventio perustuu näiden riskitekijöi- den hoitoon ja koostuu ensisijaisesti terveellisten elämäntapojen ja ruokailutottumus- ten noudattamisesta. Taudin puhkeamisen ehkäisyä voidaan tarvittaessa tehostaa lää- kehoidolla, johon sisältyvät muun muassa veren kolesterolipitoisuutta alentavat statii- nit, verenpainetta laskevat reniini-angiotensiini-aldosteronijärjestelmän estäjät ja bee- tasalpaajat sekä erilaiset diabeteslääkkeet, kuten metformiini. Mikäli ehkäisevistä toi- mista huolimatta valtimonkovettumatauti todetaan ja se aiheuttaa oireita, kuten rin- takipua, ohimeneviä neurologisia puutosoireita tai katkokävelyä, suositellaan verihiu- taleiden aggregoitumista estävän lääkityksen käyttöä (Piepoli ym. 2016). Valtimoiden ahtautumisesta johtuvia oireita voidaan myös lievittää kajoavilla toimenpiteillä, kuten pallolaajennuksilla ja ohitusleikkauksilla (Rihai ym. 2003).
vaahtosoluja rasvajuoste kehittyvä ateroomaplakki revennyt plakki
< 20 vuotta 30 vuotta 40 vuotta
Kuva 1: Valtimonkovettumataudin kehittyminen. Mukailtu lähteestä Stary ym. Circu- lation. 1995; 92: 1355–1374.
2.2 Sepelvaltimotauti
Sepelvaltimotauti on sydänlihakseen verta tuovien suonien valtimokovettumataudista johtuva sairaus, joka ilmenee yleisimmin rintalastan alaisena kipuna etenkin rasitukses- sa. Oireina voivat olla myös hengenahdistus, painon tunne rinnalla tai ainoastaan epä- miellyttävä tunne. Sepelvaltimotaudille altistavat riskitekijät ovat yhteisiä valtimonko- vettumataudin kanssa. Sepelvaltimotautikohtaukseksi kutsutaan tilannetta, jossa sydä- men hapen saanti vähenee äkillisesti suhteessa sen tarpeeseen. Yleisimmin sepelvaltimo- kohtaus aiheutuu trombosoituneesta plakista, mutta se voi johtua sekundaarisesti myös esimerkiksi anemiasta tai nopeasta rytmihäiriöstä, joiden seurauksena sydänlihaksen hapensaanti heikkenee. Sydäninfarktiksi kutsutaan sepelvaltimotautikohtausta, jonka seurauksena sydänlihassoluja kuolee, jolloin verestä pystytään mittaamaan hajonneista sydänlihassoluista vapautunutta troponiinia. Sydäninfarktit luokitellaan edelleen ST- nousu- tai ei-ST-nousuinfarkteiksi sen mukaan, havaitaanko sydänsähkökäyrässä ST- välin amplitudin kasvua (Sydäninfarktin diagnostiikka: Käypä hoito -suositus, 2014).
2.3 NZW-kanit valtimonkovettumataudin tutkimuksessa
Kaneja käytettiin jo 1900-luvun alussa ateroskleroosin mallintamiseen etenkin venäläi- sissä tutkimusryhmissä. Silloisissa tutkimuksissa havaittiin, että merkittävin yksittäi- nen kanien ateroskleroosin syntyyn vaikuttava tekijä oli ravinnon sisältämä kolesteroli, ja että nautitun kolesterolin määrä oli suoraan verrannollinen valtimoissa tapahtunei- den muutosten suuruuteen (Finking ja Hanke 1997). Sittemmin kolesterolin kausaalinen syy-yhteys ateroskleroosin ja sen myötä myös sydän- ja verisuonisairauksien syntyyn
on osoitettu kiistattomasti sekä epidemiologisissa, kliinisissä, perinnöllisissä että myös muilla koe-eläimillä tehdyissä tutkimuksissa (Gotto ym. 1990).
NZW-kanit ovat alttiita valtimokovettumataudin muodostumiselle, kun ne altistetaan korkeakolesteroliselle ruokavaliolle. NZW-kanien normaali fysiologinen plasman koles- terolikonsentraatio on matala, n. 1,3 mmol/L, mutta lisääntyy jopa 2–8 kertaiseksi syö- tettäessä eläimille massastaan 0,1–2 % kolesterolia sisältävää rehua. Samalla myös ka- nien maksan kolesterolipitoisuus kohoaa 2–10-kertaiseksi normokolesterolisiin kaneihin verrattuna (Bocan ym. 1993, Finking ja Hanke 1997). Tyypillisesti kolesterolia sisäl- tävällä rehulla aikaansaadun ateroskleroosin synnyttämiseen vaadittu aika on kaneilla noin 8–16 viikkoa (Kolodgie ym. 1996).
Kaneille syntyvien leesioiden morfologiaan pystytään vaikuttamaan vaihtelemalla niil- le syötetyn kolesterolin annostusta ja ruokavalioaltistuksen pituutta. Lyhytaikainen, massastaan vähintään 0,5 % kolesterolia sisältävälle ruokavaliolle tapahtuva altistus saa aikaan leesioita, jotka sisältävät runsaasti makrofageista kehittyneitä vaahtosolu- ja ja jotka muistuttavat rakenteeltaan eniten ihmisillä tavattavia rasvajuosteita. Sitä vastoin pidempiaikainen ja vähemmän kolesterolia sisältävä ravinto tuottaa kaneille pi- demmälle edenneitä leesioita, jotka sisältävät paljon sileitä lihassoluja, kolesterolikiteitä ja nekroottista kudosta (Bocan ym. 1993, Kolodgie ym. 1996). Plakkien kehittymistä pystytään edesauttamaan aiheuttamalla kanin valtimoihin mekaaninen vaurio eli suo- rittamalla denudaatio esimerkiksi harjaamalla niiden endoteelikerrosta pallokatetrilla (Abela ym. 1995).
2.4 Nanopartikkelit ja dendrimeerit
Nanopartikkelit ovat määritelmän mukaan kolmiuloitteisia, jokaiselta akseliltaan noin 1–100 nm pituisia kappaleita (British Standards Institute 2007). Nanopartikkelit vas- taavat siten kooltaan elimistön omia biologisia molekyylejä ja niillä on suuri pinta-ala suhteessa omaan tilavuuteensa; monet niiden hyödyllisistä ominaisuuksista liittyvät näihin tekijöihin. Nanopartikkelit voivat olla muodostuneita muun muassa lipideistä, erilaisista metalleista tai näiden yhdistelmistä (Kim ym. 2010).
Dendrimeerit ovat 1980-luvun alussa kehitettyjä nanopartikkeleita, jotka ovat synteetti- siä, voimakkaasti haaroittuneita polymeereja. Dendrimeerit rakentuvat keskusmolekyy- linsä ympärille siten, että alempiin kerroksiin polymerisoituvien haararakenteiden su- kupolvi muodostaa seuraavan kerroksen nanopartikkelin pallomaisesta pinnasta (Kuva 2). Keskusmolekyylinsä ympärillä ainoastaan yhden kerroksen haararakenteita omaa-
via dendrimeeriä nimitetään 0. sukupolven dendrimeereiksi, ja luku kasvaa kerrosten lisääntyessä. Uusi haararakenteiden sukupolvi kasvattaa dendrimeerin molekyylimas- saa ja ulkokerroksen pinta-alaa. Varhaisimmat dendrimeerit olivat rakenteeltaan poly- amidoamineja (PAMAM). CosmoPHOS-nano-hankkeessa käytetyt nanopartikkelit ovat nimenomaisesti PAMAM-dendrimeerejä.
Kuva 2: Kaavakuva dendrimeeristä, joka rakentuu ytimestä (musta väri) sekä sii- hen haaramaisesti kiinnittyvistä polymee- rirakenteista (harmaa väri). Mahdolliset vierasainemolekyylit (liukuväri) voivat olla sulkeutuneena dendrimeerin haararakentei- den sisälle, niiden väliin tai kiinnittyä peri- feerisesti haararakenteiden pinnalle. Tässä kaavakuvassa uloin vierasainemolekyyli on kiinnittynyt dendrimeeriin kovalenttisesti.
Dendrimeerien ainutlaatuisesta raken- teesta johtuen ne saattavat olla erin- omaisia nanomittaluokan työkaluja in vi- vo -kuvantamiseen, diagnostiikkaan se- kä terapeuttisten yhdisteiden kuljettami- seen. Eräs mielenkiintoinen dendrimee- rien ominaisuus liittyy niiden fotoreak- tiivisuuteen: dendrimeerien haararaken- teiden sisälle pystytään sulkemaan eri- laisia vierasmolekyylejä, ja tämä kulje- tettavaa ainetta ympäröivä vaipparaken- ne saadaan aukeamaan hallitusti valoak- tivaatiolla (Klajnert ja Bryszewska 2001).
2.4.1 Dendrimeerien turvallisuus Aiemman kirjallisuuden perusteella PA- MAM-dendrimeerit vaikuttavat olevan yleisesti ottaen haitallisia eliöille, mikä on seurasta niiden ulkokuoren positiivi- sesti varautuneista ryhmistä. PAMAM- dendrimeerien on havaittu aiheuttavan punasolujen hajoamista, jonka laajuus on verrannollinen dendrimeerien pitoisuuteen ja sukupolven järjestysluvun suuruuteen (Ziemba ym. 2012). Seeprakaloilla ja jyrsijöillä tehdyissä eläinkokeissa suonensisäises- ti annetut PAMAM-dendrimeerit saivat aikaan verihyytymien muodostumista, kun ne olivat vuorovaikutuksessa plasman komponenttien, kuten fibrinogeenin ja albumiinin kanssa. Lisäksi niiden on havaittu synnyttävän tulehdusvasteen, jonka suuruus on ver- rannollinen käytettyjen PAMAM-dendrimeerien sukupolven järjestysluvun suuruuteen.
Kaneilla tehdyn biodistribuutiotutkimuksen perusteella huomattava osuus PAMAM- dendrimeereistä kulkeutuu maksaan, keuhkoihin, munuaisiin ja sydämeen. Hiirille suun
kautta annettujen dendrimeerien vaikutuksia selvittäneessä tutkimuksessa havaittiin, että PAMAM-dendrimeerit biodistribuoituvat edellisten kudosten lisäksi myös vereen, virtsaan ja ruoansulatuskanavaan. Vaikuttaa siltä, että histopatologisia tutkimuksia PAMAM-dendrimeerien vaikutuksista ei ole toistaiseksi suoritettu tai raportoitu (Na- ha ym. 2018).
2.5 Fotodynaaminen terapia ja valoaktivaatio
Valoa on hyödynnetty erilaisten tautien hoidossa jo tuhansia vuosia sitten, mutta varsi- naisen nykyaikaisen fotodynaamisen terapian (FDT) keksimisen voidaan sanoa ajoittu- neen viime vuosisadan alkupuolelle (Ackroyd ym. 2001). FDT:lla tarkoitetaan kahden itsenäisesti vaarattoman tekijän eli tietyn aallonpituisen valon sekä sille reaktioherkän lääkeaineyhdisteen yhdistämistä sytotoksisen vaikutuksen aikaansaamiseksi (Dolmans ym. 2003). FDT:n edut verrattuna perinteisiin hoitomuotoihin ovat pienemmässä inva- siivisuudessa, kivuttomuudessa sekä mahdollisuudessa terapian toistamiseen (Kuzyniak ym. 2004).
Valon sisältämä energia virittää kudoksiin joko pinnallisesti tai sisäisesti annostellun valoherkistäjäksi kutsutun yhdisteen, joka emittoi valolta samaansa energian kudoksis- sa olevalle molekyylihapelle. Tällöin muodostuu erittäin reaktiivisia happiradikaaleja, jotka reagoivat nopeasti kudosten solurakenteiden kanssa, mikä aiheuttaa niissä vau- rioita. Koska fotodynaamisen terapian vaikutusmekanismi on pääasiassa hapen kautta välittyvä, ei soluvaurioita tyypillisesti tapahdu terapialle altistetun kudoksen hapet- tomissa osissa. Vaikka fotodynaamisen vaikutuksen aikaansaamiseksi voidaan käyttää monenlaisia valonlähteitä, kaikista yleisimpiä ovat monokromaattista valoa lähettävät laser-valot, sillä niiden avulla emittoidun valon aallonpituutta ja altistuksen suuruut- ta pystytään kohdentamaan hallitusti vaadittuun paikkaan esimerkiksi optisen kuidun kautta (Ackroyd ym. 2001, Dolmans ym. 2003).
2.5.1 Sinkkiftalosyaniini valoherkistäjänä
Ftalosyaniinit ovat toisen sukupolven orgaanisia valoherkistäjiä, jotka ovat rakenteel- taan luonnollisesti esiintyvien porfyriinien johdannaisia (Kuzyniak ym. 2004). Raken- teeltaan ne ovat tasomaisia, aromaattisia ja makrosyklisiä yhdisteitä, jotka koostuvat neljästä typpiatomien yhdistämästä isoindolialaryhmästä (Torres 2006). Ftalosyanii- nien ominaisuuksia pystytään lisäksi hienosäätämään liittämällä niihin erilaisia me- tallisia keskusligandeja sekä perifeerisiä substituentteja. Aiemmin tätä yhdisteryhmää
käytettiin laajasti väriaineina, mutta nykyään ftalosyaniinit ovat herättäneet kiinnos- tusta myös niiden valoreaktiivisuuden vuoksi, joka on mahdollistanut niille runsaasti optoelektroniikan käyttökohteita aina valokennoista fotodynaamisen terapian valoher- kistimiin saakka (de la Torre ym. 2004).
N
N
N N
N
N N
Zn N
COOH
t-Bu t-Bu
t-Bu
Kuva 3: TT1-valoherkistäjän rakennekaa- va. Molekyylin runkona toimii ftalosyanii- ni, jonka keskusligandina on sinkkiatomi.
Perifeerisinä substituentteina ovat karbok- syyliryhmä sekä kolme tertiääristä butyyli- ryhmää.
Ihanteellisen valoherkistäjän tulisi omata seuraavat ominaisuudet: voimakas absor- banssi lähi-infrapuna-alueella (650–800 nm), vähäinen sytotoksisuus muulloin kuin valoaktivaation yhteydessä eli niin sanottu pimeätoksisuus, kyky apoptoo- sin käynnistämiseen kohdesolussa, nopea poistuminen elimistön terveistä kudoksis- ta sekä kustannustehokkuus. Sinkkiftalo- syaniini, jonka molekyylin keskusligandi- na toimii sinkkiatomi, omaa kaikki edel- lä luetellut ominaisuudet. Lisäksi sink- kiftalosyaniini on fluoresoiva yhdiste, jol- loin sitä sisältävät rakenteet ovat help- po paikallistaa ja erottaa normaalisoluis- ta (Jiang ym. 2014, Kuzyniak ym. 2004).
TT1 on sinkkiftalosyaniinijohdannainen (kuva 3), johon kuuluu perifeerisinä substi- tuentteina yksi karboksyyliryhmän sekä kolme tertiääristä butyyliryhmää (Hardin ym.
2009). TT1-molekyylit valikoituivat CosmoPHOS-nano-hankkeessa käytettäviksi valo- herkistäjiksi, koska ne omaavat hyvälle valoherkistäjälle edellytetyt ominaisuudet eli hyvät solutoksiset ominaisuudet aktivoitaessa ne valolla, mutta toisaalta niiden pimeä- toksisuus on vähäistä.
2.5.2 Fotodynaaminen terapia sepelvaltimotaudin hoidossa
Jain ym. (2017) ovat tuoreessa katsausartikkelissaan käsitelleet kattavasti FDT:aan liit- tyvän tutkimuksen nykytilannetta. Vaikka eri valoherkistäjien toimintaperiaate on pit- kälti samanlainen, yhdestä tutkimuksesta saatu tulos ei ole välttämättä yleistettävissä kuvaamaan FDT:n vaikutuksia, koska tutkimuksissa käytetyt valoherkistäjät ja niiden kuljettajamolekyylit ovat vaihdelleet. Yleisesti ottaen koe-eläintöissä saatujen tulosten perusteella vaikuttaa kuitenkin siltä, että suonensisäisesti kohdistettu FDT näyttäi- si pienentävän plakkien kokoa ja vähentävän niiden sisältämää makrofagien määrää.
FDT saa aikaan sileiden lihassolujen uudelleen järjestymistä, minkä otaksutaan olevan syynä terapian plakkeja stabilisoivalle vaikutukselle. On myös saatu viitteitä siitä, että FDT vähentää vaurioitetun valtimon uudelleen ahtautumista eli restenoosia.
Kliinisissä tutkimuksissa vakuuttavin näyttö FDT:n tehosta tulee restenoosin estos- sa, minkä lisäksi käyttöön liittyviä vakavia haittatapahtumia ei ole todettu. Jenkin- sin ym. (1999) valoherkistäjänä 5-aminolevuleenihappoa käyttäneessä tutkimuksessa seitsemälle potilaalle annettiin FDT restenoosin vuoksi suoritetun uuden reisivaltimon pallolaajennuksen yhteydessä. 6 kuukauden seuranta-aikana terapian havaittiin olevan turvallista, minkä lisäksi yhdelläkään potilaalla ei havaittu restenoosia tai valtimon tukkeutumista. Moteksafiini-lutetium-valoherkistäjällä suoritetuissa faasien I ja II tut- kimuksissa annettu hoito osoittautui turvalliseksi sekä itsenäisesti annettuna että sepel- valtimon pallolaajennustoimenpiteen yhteydessä (Kereiakes ym. 2003). Myös laserka- tetrilla aikaansaatu fotofriini-valoherkistäjän aktivaatio sepelvaltimostentin asennuk- sen yhteydessä vaikuttaisi tehokkaalta ehkäisemään stentin sisäistä restenoosia, jota ei havaittu yhdelläkään viidellä tutkimuksessa olleella potilaalla 18 kuukauden seuranta- ajan jälkeen. Myöskään vakavia sepelvaltimoihin liittyviä haittatapahtumia ei havaittu (Usui ym. 2004).
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET
Kysymys nanopartikkeleiden turvallisuudesta on herättänyt keskustelua, ja tähän liit- tyneet johtopäätökset ovat olleet toistaiseksi pitkälti in vitro -soluviljelymallien sekä in vivo -eläinkokeiden varassa (Kim ym. 2010). Nanopartikkeleiden hyödyllisiä omi- naisuuksia selittävä partikkelien pieni koko saattaa asettaa samalla niiden käytölle ra- joituksia. Tietyt nanopartikkelit omaavat toksisia ominaisuuksia, minkä lisäksi niiden poistuminen elimistöstä voi olla hidasta (Lobatto ym. 2011). On myös huomionar- voista, että PAMAM dendrimeerien käytön turvallisuudesta ei löydy kudoskohtaista histopatologista tutkimusta. Ennen kuin nanopartikkeleihin ja dendrimeereihin perus- tuva terapia voi edetä kliinisiin, ihmisillä tehtäviin koeasetelmiin, nanopartikkeleiden käyttöön liittyvä turvallisuus on tärkeää selvittää perinpohjaisesti prekliinisissä eläin- malleissa.
Tässä tutkimuksessa selvitetään PAMAM-dendrimeerien turvallisuutta altistaessa koe- eläimiä niitä sisältäneille injektioille. Tavoitteena on myös selvittää CosmoPHOS-nano tutkimushankkeessa käytetyn dendrimeeripartikkelin valoaktivoimisen vaikutusta käy- tetyssä koe-eläinmallissa. Tutkimuksesta saatujen tulosten perusteella voidaan tehdä
johtopäätöksiä siitä, millaisia vaikutuksia hankkeessa käytettävien dendrimeerien an- tamisesta ja valoaktivoimisesta voidaan odottaa tulevissa koeasetelmissa. Tutkimustu- lokset antavat myös laajemminkin tietoa nanopartikkelien ominaisuuksista ja käyttäy- tymisestä.
4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT
4.1 Aineisto
Tutkimukseni aineisto koostui kahdeksasta NZW-rotuisesta, naaraspuolisesta koekanis- ta (taulukko 1) otetuista kudosnäytteistä.
4.1.1 Näytteiden ottoa edeltäneet toimenpiteet
Taulukko 1: Kanien tiedot Koodi Tunnus Massa Sukupuoli
35LA D2772 3,602 kg Naaras 35HB D2680 3,352 kg Naaras 35LB D2762 3,167 kg Naaras 36HA D2545 3,535 kg Naaras 36LA D2719 3,617 kg Naaras 36HB D2551 3,270 kg Naaras CTRL1 D2682 3,295 kg Naaras CTRL2 D2547 3,384 kg Naaras Kaikille kaneille aiheutettiin valtimonko-
vettumatauti syöttämällä niille massas- taan 1% kolesterolia sisältävää rehua noin 8 viikon ajan ennen nanopartikkeleita si- sältäneen injektion antamista. Lisäksi kai- kille kaneille suoritettiin injektion anta- mista ennen vatsa- ja rinta-aortan denu- daatio.
Kahdeksasta kanista yhteensä kuudelle annettiin nanopartikkeleita sisältänyt in-
jektio (taulukko 2). Injektiolle altistettavat kanit jaettiin kahteen eri ryhmään, jois- ta toisen ryhmän kanit saivat suurempaa 36.2-dendrimeeriä (sukupolvi 6) ja toisen ryhmän kanit pienempää 35.2-dendrimeeriä (sukupolvi 5). Edelleen kahta eri partik- kelikokoa saaneissa ryhmissä kanit saivat joko pitoisuudeltaan suurempaa (40 mg/kg) tai pienempää (4 mg/kg) partikkeliannosta. Kahdeksasta kanista kaksi kania olivat kontrollieläimiä, jotka saivat nanopartikkelien sijasta keittosuolaa sisältäneen injek- tion. Kaikki injektiot annettiin 21.11.2015 – 27.11.2015 välisenä aikana, jonka jälkeen niiden sisällön annettiin distribuoitua kanien elimistöihin noin viikon verran.
Jokaiselle kanille suoritettiin valoaktivaatioterapia (671 nm, 10 min, 1700 mW) 29.11.2015 – 3.12.2015 välisenä aikana (taulukko 3). Terapiaa seurasi noin kahden kuukauden mit- tainen seuranta-aika. Kanit lopetettiin 23.1.2016 – 25.1.2016 kylläisellä magnesiumsul-
Taulukko 2: Kanien saamat injektiot
Koodi Injektion pvm. Antoaika Dendrimeeri Annos Injektion tilavuus
35LA La 21.11.2015 08:35 35.2 4 mg/kg 7,2 ml
35HB Su 22.11.2015 16:37 35.2 40 mg/kg 6,7 ml
35LB Su 22.11.2015 16:30 35.2 4 mg/kg 6,3 ml
36HA Ma 23.11.2015 09:24 36.2 40 mg/kg 7,1 ml
36LA Ma 23.11.2015 09:40 36.2 4 mg/kg 7,2 ml
36HB Ti 24.11.2015 09:40 36.2 40 mg/kg 6,5 ml
CTRL1 Pe 27.11.2015 09:05 Saliini 2 ml/kg 6,6 ml
CTRL2 Pe 27.11.2015 09:20 Saliini 2 ml/kg 6,8 ml
faattiliuoksella syvässä anestesiassa. Välittömästi lopettamisen jälkeen kanit perfusoi- tiin 1% paraformaldehydiliuoksella ja niistä otettiin kudosnäytteet.
Taulukko 3: Valoaktivaatioterapian ja lopetuksen päivämäärät Koodi Tunnus Terapian pvm. Lopetuksen pvm.
35LA D2772 29.11.2015 23.1.2016
35HB D2680 30.11.2015 23.1.2016
35LB D2762 30.11.2015 23.1.2016
36HA D2545 1.12.2015 24.1.2016
36LA D2719 1.12.2015 24.1.2016
36HB D2551 3.12.2015 24.1.2016
CTRL1 D2682 3.12.2015 25.1.2016
CTRL2 D2547 29.11.2015 24.1.2016
4.2 Menetelmät
4.2.1 Näytteiden käsittely ja värjäys
Kaneista otetut kudosnäytteet fiksoitiin 4% paraformaldehydiliuoksella ja niiden annet- tiin olla yön yli 15% sakkaroosiliuoksessa. Fiksoinnin jälkeen kudosnäytteet prosessoi- tiin Citadel 1000 ja 2000 -kuljetusautomaateissa (Thermo Fiscer Scientific). Kuljetuk- sen aikana kudokset dehydratoitiin niissä olevasta vedestä nousevalla alkoholisarjalla, kirkastettiin ksyleenillä ja lopulta infiltroitiin parafiinilla (liite 1). Kuljetuksen jälkeen kudosnäytteet valettiin parafiiniin, näytteille tarkoitetuille kaseteille. Parafiiniin vale- tuista kudoksista leikattiin 3–5 lasia 5mm:n paksuisia leikkeitä Microm HM 355 ja HM
355s -mikrotomilaitteilla (Thermo Fiscer Scientific). Näytelasien annettiin kuivua, jon- ka jälkeen ne värjättiin hematoksyliini-eonisiinivärjäyksellä (liite 2). Värjäyksen jälkeen näytelasit päällystettiin peitinlaseilla käyttämällä ksyleenipohjaista Permount-liimaa.
4.2.2 Valomikroskopointi ja analyysi
Valmiit näytelasit mikroskopoitiin DS-Ri2 -valomikroskoopilla (Nikon). Näytelaseis- ta otettiin anatomisesti mahdollisimman edustavia valokuvia pääosin 10-kertaisella objektiivilla. Lisäksi koe-eläimien silmien kudosnäytteistä otettiin mosaiikkivalokuvia 4-kertaisella objektiivilla ja edelleen tarkempia valokuvia silmien verkkokalvoista 40- kertaisella objektiivilla. Lopuksi jokaisen leikkeen koko näyteala mikroskopoitiin eri objektiiveilla ja analysointiin kauttaaltaan verraten näytekudoksien morfologiaa niiden normaalianatomiaan sekä kontrollikudoksien anatomiaan.
5 TULOKSET
5.1 Maksa
Jokaisen koe-eläimen maksanäytteessä oli vaihtelevissa määrin steatohepatiittin eli maksan rasvoittumisesta aiheutuneen inflammaation merkkejä. Erityisen huomattavia muutokset olivat kontrollinäytteessä (CTRL1, D2682, kuva 4b), jonka parenkyymira- kenne oli kauttaaltaan häiriintynyt ja jonka etenkin sentrilolobulaarisissa osissa oli näh- tävissä runsaasti niin kutsuttua ballooning-degeneraatiota eli maksan rasvoittumisesta aiheutuvaa hepatosyyttien apoptoosia. Lisäksi kontrollinäytteestä pystyi havaitsemaan rasvaa kerryttäneitä Kupferin soluja ja myös jonkin verran tulehdussoluinfiltraatio- ta. Kontrollinäytteen sinusoidit olivat suurimmaksi osaksi umpeutuneet paisuneista ja morfologialtaan vaahtomaisista hepatosyyteistä.
Umpeutuneita sinusoideja lukuun ottamatta myös muissa näytteissä oli havaittavissa kontrollinäytteessä olleita löydöksiä, joskin paljon lievemmässä mittakaavassa. Varsin- kin kaikkien näytteiden sentrilolobulaariset osat ilmentivät ballooning-degeneraatiolle tyypillisiä muutoksia eli hepatosyyttien paisumista ja niiden sytoplasman vaalenemista.
Ainoastaan yhdellä suurelle partikkeliannokselle altistetulla kanilla (De36.2HA D2545) edellä kuvattu degeneraatio oli diffuusia ja sitä oli havaittavissa muuallakin koko näy- tealasta.
Eräs mielenkiintoinen löydös oli se, että jokaisessa suurelle partikkelikoolle (De36.2HA
D2545, kuva 3, De36.2HB D2551 & De36.2LA D2719) altistettujen koe-eläimien näyt- teissä oli nähtävissä sinusoidien dilatoitumista. Tällaista muutosta ei esiintynyt pienelle partikkelikoolle (De35.2HB D2680, De35.2LA D2772 & De35.2LB D2762) altistettujen kanien näytteissä.
(a) De36.2HA (b) CTRL1
Kuva 4: Kaikissa suurelle partikkelikoolle (36.2) altistettujen koe-eläimien maksanäyt- teissä oli nähtävissä sinusoidien dilatoitumista verrattuna muiden koe-eläimien näyt- teisiin (a). Kaikista maksanäytteistä pystyi erottamaan ballooning-degeneraatiolle tyy- pillisiä piirteitä, kuten hepatosyyttien soluliman vaalenemista ja siinä esiintyvää va- kualisaatiota etenkin näytteiden sentrilolobulaarisissa osissa. Nämä muutokset olivat erittäin huomattavia etenkin kontrollinäytteessä (b).
5.2 Ohutsuoli
Pienelle partikkelikoolle altistettujen eläimien ohutsuolinäytteet (De35.2HB, D2680 &
De35.2LA, D2772) olivat annoskoosta riippumatta siistin näköisiä. Näytteissä näky- neet villukset olivat avonaiset. Mukoosaa verhoava nukkainen enterosyyttikerros oli ehyt ja yhtenäinen, eikä siinä ollut ylimääräistä valkosoluinfiltraatiota. Myöskään sub- mukoosassa, lihaskerroksessa eikä adventitiassa ollut havaittavissa mitään normaalista poikkeavaa. Yhden pienen partikkelikoon koe-eläimen (De35.2LB, D2762, kuva 5a) ku- dosnäyte oli otettu ohutsuolen sijaan paksusuolesta, mutta se ei vaikuttanut eroavan laisinkaan tämän ruoansulatuskanavan osan normaalianatomiasta.
Toisin kuin pienen partikkelikoon näytteissä, suurelle partikkelikoolle altistettujen ka- nien näytteissä (De36.2HB, D2551 & De36.2LA, D2719) oli havaittavissa muutoksia se- kä kontrollinäytteisiin että ohutsuolen normaalianatomiaan verrattuna. Kahdesta näyt- teestä kummassakin näkyi villusten degeneraatiota, ja villukset olivat ulkonäöltään ma- talan tylppämäisiä. Mukoosan epiteeli oli paikoin nekroottista ja osin myös revennyttä
niin, että näytteistä pystyi erottamaan revenneiden villusten jättämät värjäytyneet ää- riviivat. Myös mukoosan tukikalvo eli lamina propria oli kummassakin suuren partikke- likoon kudosnäytteessä vaurioituneen näköinen. Suolen tätä ulommat kerrokset olivat kummassakin näytteessä normaaleja. Kahdesta suurta partikkelikokoa (36.2) saaneesta kanista ohutsuolen kudosmuutokset olivat suuremman partikkeliannoksen (40 mg/kg) saaneella kanilla huomattavampia.
(a) De36.2LA (b) CTRL2
Kuva 5: Tylppämäisiä, degeneroituneen näköisiä ohutsuolen villuksia suurempaa par- tikkelikokoa saaneella kanilla (a). Kontrollieläimen intakti ohutsuoli (b).
5.3 Mahalaukku
Joissakin mahalaukuista otetuissa näytteissä limakalvon pintaepiteeli oli paikoin hil- seillyt pois, ja osissa näytteistä mahalaukun pinnan solut näyttivät myös vaurioituneil- ta. Kohdissa, joissa mukoosan epiteeliä oli yhä jäljellä, muodostivat epiteelisolut ma- halaukulle tyypillisen tylppämäisen pintakerroksen, jonka väliin jäivät maharauhaset.
Lukuun ottamatta yhden kanin näytettä (De35.2, D2680), joka oli otettu mahalaukun sijaan ohutsuolesta, jokaisesta näytteestä pystyi erottamaan mahalaukun limakalvoon kuuluvat eosinofiilisesti värjäytyvät katesolut, pepsinogeeniä erittävät pääsolut sekä musiinia tuottavat pinta- ja sivusolut. Edellä luetelluissa solutyypeissä ei ollut havait- tavissa pahanlaatuisia muutoksia. Muut mukoosan osat, toisin sanoen epiteelin alla oleva limakalvon tukikerros eli lamia propria ja sitä seuraava limakalvon lihaskerros muscularis mucoase olivat kaikissa näytteissä moitteettoman näköisiä. Myöskään sub- mukoosa, lihaskerrokset tai ulkokalvo eivät eronneet ulkonäöltään näiden osien nor- maalianatomiasta, eikä niistä ollut löydettävissä tulehdussoluinfiltraatteja.
(a) De35.2LB (b) CTRL2
Kuva 6:Osissa näytteistä pintaepiteeli oli revennyt paikoin pois (a). Muut mahalaukun seinämän kerrokset vaikuttivat hyväkuntoisilta.
5.4 Perna
Nanopartikkeleita saaneiden kanien pernanäytteistä ei ollut erotettavissa minkäänlaisia muutoksia verrattuna kontrollieläimien kudosnäytteisiin. Toisaalta lähes kaikissa näyt- teissä oli havaittavissa runsain määrin vaahtosoluja, rasvapisaroita ja kolesterolikiteitä pernan parenkyymissä ja sidekudoskapselin alla, mistä syystä kudosten histopatologi- nen analysointi oli nanopartikkelien vaikutusten näkökulmasta haastavaa.
(a) De36.2LA (b) CTRL2
Kuva 7: Terapian saaneiden kanien pernanäytteissä ei ollut havaittavissa muutok- sia verrattuna kontrollinäytteisiin. Toisaalta kaikissa pernanäytteistä oli erotettavissa vaahtosoluja, rasvapisaroita ja kolesterolikiteitä.
5.5 Munuainen
Yleisesti ottaen kaikki munuaisnäytteet vaikuttivat kuori- ja ydinkerroksistaan hyvä- kuntoisilta (kuva 8a): Munuaiskeräset olivat kaikissa näytteissä selkeät ja siistit. Keräs- ten sisällä olleiden glomerulusten luumenit olivat avonaiset, eikä mesangiaalikudoksessa ollut havaittavissa solujen proliferaatiota. Tubulukset ja kokoojaputket olivat kokonai- suudessaan normaalin näköisiä, lukuun ottamatta kaikkien näytteiden proksimaalisia kiemuratiehyitä, joista osa vaikutti turvonneilta. Munuaisten verisuonet olivat hyvä- kuntoisia, eikä niiden seinämissä näkynyt paksuuntumista.
Ainoan poikkeuksen munuaisnäytteiden muuten hyvään kuntoon muodosti toinen kont- rollinäytteistä (CTRL1, D2682), jossa oli erotettavissa tubulointerstitiaaliseen nefriit- tiin viittaavia muutoksia. Lisäksi sekä matalan että suuren partikkeliannoksen koe- eläimien munuaisissa oli nähtävissä kerääntyneitä vaahtosoluja, kolesterolikiteitä ja fi- broottista kudosta.
(a) De35.2HB (b) CTRL1
Kuva 8: Kanien munuaiset olivat näytteiden perusteella hyväkuntoisia. Ainoan poik- keuksen muodosti toinen kontrollieläimistä (CTRL1, D2682), jonka munuaisnäyttees- sä oli havaittavissa tubulointerstitiaaliseen nefriittiin eli munuaisvälikudoksen ja mu- nuaistiehyiden tulehdukseen viittaavia muutoksia. Kyseisen kontrollieläimen näytteestä otetussa kuvassa on nähtävissä huomattavaa neutrofiili-infiltraatiota, munuaisväliku- doksen nekroosia sekä tubulusten dilatoitumista (b).
5.6 Silmä
Silmien ulkokalvoon lukeutuvat sarveis- ja kovakalvot olivat hyvässä kunnossa, eikä nii- den epiteelissä esiintynyt pahanlaatuisia muutoksia. Myöskään ulkokalvojen kollageeni- sessa väliosassa ei näkynyt mitään tavallisesta poikkeavaa. Suonikalvot olivat paksuun-
tuneet jokaisessa näytteessä vaihtelevissa määrin ja sisälsivät näytteestä riippuen eri määrän vaahtosoluja ja kiteytynyttä kolesterolia. Verkkokalvon eri solukerrokset pai- kallistuivat ulkonäöltään normaaleina ja vastasivat sijoittumiseltaan täysin retinan nor- maalianatomiaa. Siinä missä suonikalvojen kolesterolikristallien esiintyvyydessä esiin- tyi jonkin verran vaihtelua, oli niiden esiintyminen silmien sädekehällä pikemminkin sääntö kuin poikkeus. Jokaisen näytteen iirikset olivat tavanomaisen näköisiä. Toisen kontrollieläimen (CTRL1, 2682, kuva 9b) sidekalvossa oli jonkin verran vaahtosolu- ja ja inflammaation merkkejä. Ainoastaan yhden kanin (De36.2LA, 2719) näytteessä näkynyt Schlemmin kanava vaikutti tukkeutuneelta.
(a) De35.2LA (b) CTRL1
Kuva 9: Silmänäytteiden verkkokalvot olivat moitteettomassa kunnossa ja retinan eri solukerrokset erottuivat normaaleina (a). Myöskään silmien ulkokalvoissa ei ollut merk- kejä pahanlaatuisista muutoksista. Näytteiden suonikalvoissa ja niiden jatkeina olleissa sädekehissä esiintyi runsaasti vaahtosoluja sekä kiteytynyttä kolesterolia. Toisen kont- rollikanin (CTRL1, 2682) sidekalvossa oli nähtävissä hieman tulehdussoluinfiltraatiota sekä vaahtomaisia makrofageja (b).
5.7 Keuhkot
Kahden suuren annoskoon koe-eläimen ja toisen kontrollieläimen näytteissä oli erotet- tavissa lievää keuhkovälikudoksen eli interstitiumin paksuuntumista sekä tulehdusso- luinfiltraatiota. Lisäksi kahden pienen annoskoon koe-eläimien muuten normaalin nä- köisissä näytteissä todettiin alveolien kokoon painumista. Edellä mainittuja muutoksia lukuun ottamatta koe-eläimien keuhkot vaikuttivat näytteiden perusteella toiminta- kykyisiltä. Joidenkin kanien keuhkovaltimoissa oli havaittavissa huomattavaa plakkien kehittymistä.
(a) De36.2HB (b) CTRL2
Kuva 10: Joidenkin kanien keuhkonäytteissä oli havaittavissa lievää keuhkovälikudok- sen paksuuntumista ja tulehdussoluinfiltraatiota (a & b). Lisäksi keuhkojen valtimoissa esiintyi paikoin huomattavia leesioita (b).
5.8 Sydän
Sekä matalan että suuren partikkeliannoksen koe-eläimien kudosten joukosta löytyi näytteitä, joissa oli havaittavissa sepelvaltimoiden lähes täydellistä tukkeutumista ja sen seurauksena aiheutuneen sydäninfarktin jälkeistä sydänlihaskudoksen arpeutumis- ta. Muuten sydänlihasnäytteissä ei ollut erotettavissa vahingollisia muutoksia.
(a) De35.2LB (b) CTRL1
Kuva 11: Kanien sydänlihasnäytteistä pystyi erottamaan sydäninfarktin jälkeisesti fibrotisoitumisesta eli sydänlihaskudoksen korvautumista tiiviillä sidekudoksella (a).
Näytteissä olleet sepelvaltimot olivat ahtautuneita ja paikoin lähes kokonaan tukkeu- tuneet (b).
5.9 Iho
Ihonäytteet otettiin sekä kanien selästä että niiden kaulalta.
Kanien ihonäytteiden epidermaaliset osat olivat hyvässä kunnossa: orvaskeden epitee- lissä ei ollut nähtävissä dysplastisista muutoksia, eikä sen yläpuolella olevassa keratiini- kerroksessa esiintynyt hyperkeratoosia. Epidermiksen alla sijaitsevassa, sidekudoksesta muodostuneessa dermiksessä esiintyi jonkin verran makrofageista erilaistuneita vaahto- soluja, mutta tätä lukuun ottamatta verinahka näytti normaalilta. Eri kaninäytteiden kesken ilmeni jonkin verran vaihtelua dermiksessä sijainneiden valkosolujen määrässä.
Yhdenkään näytteen kohdalla ei voitu kuitenkaan puhua varsinaisesta inflammatoori- sesta muutoksesta, koska leukosyyttejä oli diffuusisti koko dermiksen alalla, eikä niiden määrä yltänyt patologiseen muutoksiin viittaaviin lukuihin. Osaan näytteistä oli saatu mukaan myös ihonalaiskudosta, jonka kunto ei lihas- ja rasvakudoksensa osalta eron- nut kanin tämän alueen normaalianatomiasta. Myös ihon oheisrakenteet, kuten karvat, karvatupet, karvannostattajalihakset sekä talirauhaset näyttivät anatomisesti normaa- leilta.
(a) De36.2LA (b) CTRL2
Kuva 12:Kanien ohut, vain yhdestä kerroksesta koostuva orvaskeden epiteelikerros oli hyvässä kunnossa. Myöskään dermiksessä, ihonalaiskudoksessa tai ihon oheisrakenteis- sa ei esiintynyt poikkeamia ihon normaalianatomiaan verrattuna.
5.10 Munasarjat
Ovaarionäytteistä oli erotettavissa eri kehitysvaiheissa olevia munarakkuloita sekä kelta- ja valkorauhasia. Munasarjoja ympäröivä epiteeli ja sen alla oleva sidekudoksinen val- kokalvo (tunica albuginea) näyttivät jokaisessa näytteessä ehyiltä ja säännönmukai- silta. Stroomassa ei ollut havaittavissa poikkeavia löydöksiä vertailukudosten kesken,
lukuun ottamatta joitakin pieniä kystisiä rakenteita osassa näytteistä. Mitään selkeän ja säännönmukaisen atyyppista tai jopa malignia ei ollut nähtävissä tutkituissa muna- sarjanäytteissä. Myöskään tulehduksellisia muutoksia ei ilmennyt.
(a) De35.2HB (b) CTRL2
Kuva 13: Munasarjoista otetuissa näytteissä havaittiin eri kehitysasteissa olevia fol- likkeleita sekä kelta- ja valkorauhasia. Näissä tai ovaarioiden stroomassa ja pintaosissa ei havaittu selkeän atyyppisiä löydöksiä tai inflammatoorisia prosesseja.
5.11 Imusolmuke
Jokaisessa imusolmukkeista otetussa näytteessä oli huomattava määrä makrofageista erilaistuneita vaahtosoluja, rasvapisaroita ja kolesterolikiteitä. Näytteissä oli havaitta- vissa myös nekroottista kudosta. Imusolmukkeiden normaalianatomista rakennetta ei pystynyt erottamaan edellä kerrottujen muutosten vuoksi.
(a) De36.2HB (b) CTRL1
Kuva 14: Imusolmukkeiden histopatologinen analysointi nanopartikkeleiden vaikutus- ten näkökulmasta oli haastavaa, koska tutkitut imukeräsnäytteet erosivat histologisesti merkittävästi imukudoksen normaalianatomiasta.
5.12 Luustolihas
Yhdenkään nanopartikkeleita saaneen kanin luustolihasnäytteessä ei ollut merkkejä mistään vahingollisesta muutoksesta verrattuna kudosten normaalianatomiaan tai kont- rollinäytteiden anatomiaan. Kaikissa näytteissä olleiden lihasten sidekudoksiset osat, verisuonet sekä itse lihassolut olivat täysin natiivia vastaavassa kunnossa.
(a) De35.2LA (b) CTRL1
Kuva 15: Poikkileikattuja lihassoluja sekä lihaskudoksen tukiosia. Kaikkien nanopar- tikkeleita saaneiden kanien luustolihasnäytteet olivat terveen näköisiä, eikä niissä ollut havaittavissa vahingollisia muutoksia luustolihasten normaalianatomiaan tai kontrolli- näytteiden anatomiaan verrattuna.
6 POHDINTA
Koe-eläimille valtimonkovettumataudin aiheuttaneesta, kaneille epäfysiologisesta ruo- kavaliosta ja invasiivisesta tutkimustoimenpiteestä johtuen oli odotettavaa, että kaik- kien koe-eläinryhmien histopatologisessa analyysissa havaittaisiin ainakin jonkinastei- sia muutoksia. Epäselvää oli, mikä näiden löydösten suuruus ja merkittävyys tulisi olemaan, ja olisivatko ne liittyneet yksinomaan runsaskolesteroliseen ruokavalioon vai myös nanopartikkeleiden antamiseen. Oletettuja paikkoja dendrimeerien aiheuttamien vahingollisten muutosten mahdolliselle ilmaantumiselle olivat elimet, jotka osallistuvat vierasainemetaboliaan ja -eritykseen, mistä syystä maksa- ja munuaisnäytteet herät- tivät erityistä kiinnostusta kuntonsa osalta. Toisaalta luonnonvalon kanssa kosketuk- sissa olevat elimet, toisin sanoen kanien iho ja silmät, olivat myös keskeisiä analyysin kannalta, koska luonnonvalon spektrin joillakin aallonpituuksilla olisi saattanut olla solunsisäisen ftalosyaniinin valoaktivaation aikaansaava vaikutus.
Hypoteesin mukaisesti kaikkien eläimien maksoista, pernoista, silmistä ja imusolmuk- keista pystyi havaitsemaan ainakin jonkinasteisia muutoksia edellä mainittujen kudos- ten normaalianatomiaan verrattuna. Tällaisia muutoksia olivat esimerkiksi makrofa- geista erilaistuneiden vaahtosolujen, vapaan kiteytyneen kolesterolin ja rasvapisaroi- den sekä näistä aiheutuneen tulehdusreaktion esiintyminen. Esimerkiksi imukeräsissä muutokset olivat niin huomattavia, ettei niiden tavallista imukudoksen rakennetta pys- tynyt erottamaan lainkaan. Edellä mainitut löydökset tuntuivat yhdistyvän luontevasti kanien pitkään jatkuneeseen hyperkolesterolemiaan ennemmin kuin nanopartikkeleiden antamiseen ja ne olivat yhteneviä aiemmin saatujen havaintojen kanssa siitä, että run- saskolesteroliselle ruokavaliolle altistetut NZW-kanit ovat alttiita rasvan ja kolesterolin kerääntymiselle maksaan, imukeräsiin ja pernaan (Buja ym. 1983).
Vierasainemetaboliaan- ja eritykseen osallistuvissa elimissä havaittiin sellaisiakin muu- toksia, joita ei ollut mahdollista yhdistää suoraan kanien syömän rehun aiheuttamaan hyperkolesterolemiaan. Kaikkien kanien munuaisten proksimaalisten kiemuratiehyiden epiteelisolut olivat turvonneita ja solulimaltaan muita vaaleampia. Tämän otaksuttiin johtuvan koe-eläimille lopetuksen jälkeen suoritetusta 4% paraformaldehydiperfuusion perfusointipaineesta. Lisäksi ajateltiin, että tällainen muutos olisi voinut aiheutua lo- petuksen ja kudoskeräyksen välisen ajan aiheuttamasta hapenpuutteesta, koska mu- nuaistiehyiden epiteelisolut ovat hapenpuutteelle erityisen herkkiä (Alpers ja Chang 2015). Koska tubulusten ulkonäkö oli joka tapauksessa samannäköinen nanopartikke- leita saaneiden eläimien ja kontrolliyksilöiden välillä, voitiin muutosten olettaa olevan nanopartikkeleiden antamiseen liittymättömiä.
Suurta partikkelikokoa saaneiden kanien maksanäytteissä erottuneet sinusoidit olivat suurempia muiden kanien näytteiden vastaaviin verrattuna. Koska sinusoidien dilatoi- tumista oli havaittavissa ainoastaan suuren partikkelikoon koe-eläimillä, ensivaikutel- ma oli, että muutos näytti olevan yhteydessä käytetyn partikkelin kokoon. Toisaalta maksasinusoidien dilatoituminen on saattanut liittyä myös verentungokseen, joka on voinut aiheutua sydämen vajaatoiminnasta tai muulla tavoin heikentyneestä verenpa- luusta sydämeen (Hilscher ja Sanchez 2016). Sydämen vajaatoiminta on taas saattanut seurata kaneilla todetuista sydäninfarkteista (Minicucci ym. 2011). Sydännäytteisiin leikkautuneissa valtimoissa pystyi erottamaan suuria, pääasiassa vaahtosoluista muo- dostuneita leesioita. Sepelvaltimoiden olivat ahtautuneet paikoin lähes kokonaan, mistä syystä oli helppo ymmärtää usemmassakin sydännäytteessä havaitut infarktiin sopivat löydökset, kuten sydänlihassolujen korvautuminen tiiviillä sidekudoksella.
Normaalista poikkeavia kudosmuutoksia havaittiin myös hengitys- ja ruoansulatustoi-
mintoihin osallistuvissa elimissä. Kolmen kanin keuhkonäytteissä pystyi havaitsemaan histopatologisia löydöksiä, joita tavataan muun muassa allergisen alveoliitin yhteydessä (Anttila 2012). Vaikka tietyt lääkeaineet ja allergeenit saattavatkin aiheuttaa kuvatun kaltaisia muutoksia, löydöksillä ei ollut selkeää yhteyttä tai riippuvuutta injektoitu- jen annosten pitoisuuteen tai niiden sisältämien partikkeleiden kokoon. Lisäksi kah- den pienempää nanopartikkelia saaneen kanin keuhkonäytteissä alveolit olivat kokoon- painuneen näköisiä, mutta tämän otaksuttiin johtuvan kudosten perfusointipaineeseen liittyvistä käsittelyteknisistä syistä.
Suuremman kokoisille nanopartikkeleille altistettujen kanien ohutsuolet olivat näyttei- den perusteella huonokuntoisia. Merkille pantavaa oli se, että kahdesta suurta par- tikkelikokoa saaneesta kanista ohutsuolen kudosmuutokset olivat suuremman partik- keliannoksen (40 mg/kg) saaneella kanilla huomattavampia. Toisaalta muutokset ei- vät välttämättä ole yhteydessä kaneille annettuun nanopartikkeliin, sillä myös erilaiset ohutsuolen limakalvoa affisoivat verenkiertohäiriöt saattavat aiheuttaa nähdyn kaltai- sia muutoksia, kuten villusten epiteelisolujen nekroosia ja turpoamista (Karttunen ja Mattila 2012). Ruoansulatuskanavan iskemia on taas saattanut aiheutua ruoansulatus- kanavaa ruokkivien suonien ateroskleroottisesta ahtautumisesta.
6.1 Johtopäätökset
Kiteytettynä voidaankin todeta, että suurimmasta osasta tutkituista koe-eläimien ku- dosnäytteistä pystyttiin havaitsemaan eroja joko ryhmien välillä tai verratessa näyttei- tä elinten normaaliin histologiseen anatomiaan. Nähtyjen muutosten voitiin kuitenkin päätellä olevan suurella todennäköisyydellä peräisin kaneille syötetystä rehusta, jo- ka ylläpiti eläimien veren LDL-partikkelikonsentraatiota suprafysiogisella tasolla koko tutkimuksen ajan. Muutokset saattoivat olla peräisin joko itsessään toksisen suures- ta LDL-pitoisuudesta tai sen vuoksi kehittyneestä ateroskleroosista, jonka seurauksena koe-eläimillä havaittiin erilaisia verenkiertoelimistön poikkeavuuksia, kuten sydänin- farkteja. Toisaalta oli vaikea todeta mitään sellaista muutosta, jonka olisi voinut yh- distää yksioikoisesti nanopartikkeleiden antamiseen. Mikäli epäilyjä tällaisista muutok- sista olikin, sekoittuivat löydökset kolesterolia sisältäneen rehun syöttämisestä ja kudos- käsittelytekniikasta aiheutuneiden muutoksien kanssa yhteen. Olisikin mielenkiintoista suorittaa jatkossa koeasetelma ryhmällä, jossa olevia eläimiä ei altistettaisi koleste- roliruokavaliolle, vaan ne saisivat pelkästään nanopartikkeleita. Tällöin mahdollisesti nähdyt muutokset pystyisi yhdistämään helpommin nanopartikkeleiden antamisesta johtuneisiin muutoksiin.
Suoritetun histopatologisen analyysin perusteella voitiin todeta, etteivät CosmoPHOS- nano hankkeessa käytetyt nanopartikkelit aiheuttaneet tutkittuihin kudoksiin mitään sellaisia muutoksia, joita olisi pystynyt havaitsemaan käytetyn ateroskleroosimalliin liittyneiden muutosten seasta. Aineiston pienuudesta ja tutkimusmallin rajoitteista johtuen edellytetään kuitenkin lisää tutkimuksia, ennen kuin mitään lopullista joh- topäätöstä nanopartikkeleiden turvallisuudesta voidaan tehdä, puhumattakaan aikeis- ta nanopartikkeleiden käyttämiseen kliinisissä tutkimusasetelmissa. Selkeämmän kuvan valoaktivoituvien dendrimeerien aiheuttamista kudoskohtaisista muutoksista saataisiin kaneilla, joille ei olla syötetty kolesterolirehua. Lisäksi tulevaisuudessa valoaktivoituvien dendrimeerien turvallisuutta voitaisiin tutkia myös isommilla eläimillä, kuten sioilla.
LÄHTEET
Abela GS, Picon PD, Friedl SE, ym. Triggering of plaque disruption and arterial th- rombosis in an atherosclerotic rabbit model. Circulation 1995;91:776–84.
Ackroyd R, Kelty C, Brown N, ym. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochem Photobiol 2001;74:656–69.
Alpers CE, Chang A. Acute tubular injury/necrosis. Kirjassa: Kumar V, Abbas A, Aster J, toim. Robbins and Cotran pathologic basis of disease professional edition.
Philadelphia: Elsevier/Saunders 2015, s. 927–29.
Anttila S. Allerginen alveoliitti. Kirjassa: Mäkinen M, Carpén O, Kosma V-M, ym, toim. Patologia. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim 2012, s. 571–72.
Bocan TM, Mueller SB, Mazur MJ, ym. The relationship between the degree of dietary- induced hypercholesterolemia in the rabbit and atherosclerotic lesion formation. Athe- rosclerosis 1993;102:9–22.
British Standards Institute. Terminology for nanomaterials. Publicly available speci- fication 2007;136.
Buja LM, Kita T, Goldstein JL. Cellular pathology of progressive atherosclerosis in the WHHL rabbit - an animal model of familiar hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1983;3:87–101.
CosmoPHOS-nano 2016. http://www.cosmophos-nano.eu/.
Dolmans DE, Fukumura D, Jain RK. Photodynamic therapy for cancer. Nature 2003;3:380–
7.
Finking G, Hanke H. Nikolaj Nikolajewitsch Anitschkow (1885-1964) established the cholesterol-fed rabbit as a model for atherosclerosis research. Atherosclerosis 1997;135:1–
7.
Glass CK, Witztum JL. Atherosclerosis: the road ahead. Cell 2001;104:503–16.
Gotto AM, LaRosa JC, Hunninghake D, ym. The cholesterol facts: a summary of the evidence relating dietary fats, serum cholesterol and coronary heart disease - a joint statement by the American Heart Association and the National Heart, Lung and Blood Institute. Circulation 1990;81:1721–33.
Hardin BE, Hoke ET, Armstrong PB, ym. Increased light harvesting in dye-sensitized solar cells with energy relay dyes. Nat Photonics 2009;3:406–11.
Hilscher M, Sanchez W. Congestive Hepatopathy. Clin Liver Dis 2016;8:68–71.
Jaffer FA, Libby P, Weissleder R. Optical and multimodality molecular imaging - insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009;29:1017–24.
Jain M, Zellweger M, Wagnières G, van den Berg H, Cook S, Giraud MN. Photodyna- mic therapy for the treatment of atheroscletorit plaque: lost in translation? Cardiovasc Ther 2017;35:e12238.
Jenkins M, Buonaccorsi G, Raphael M, ym. Clinical study of adjuvant photodynamic therapy to reduce restenosis following femoral angioplasty. Br J Surg 1999;86:1258–63.
Jiang Z, Shao J, Yanh T, ym. Pharmaceutical development, composition and quantita- tive analysis of phthalocyanine as the photosensitizer for cancer photodynamic therapy.
J Pharm Biomed Anal 2014;87:98–104.
Karttunen T, Mattila J. Ohutsuolen verenkiertohäiriöt. Kirjassa: Mäkinen M, Carpén O, Kosma V-M, ym, toim. Patologia. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim 2012, s. 658–
59.
Kereiakes DJ, Szyniszewski AM, Wahr D, ym. Phase I drug and light dose-escalation trial of motexafin lutetium and far red light activation (phototherapy) in subjects with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention and stent deployment: procedural and long-term results. Circulation 2003;108:1310–5.
Kim BY, Rutka JT, Chan WC. Nanomedicine. N Engl J Med 2010;363.(25):2434–43.
Klajnert B, Bryszewska M. Dendrimers: properties and applications. Acta Biochimica Polonica 2001;48.(1):199–208.
Kolodgie FD, Jr ASK, Largis EE, ym. Hypercholesterolemia in the rabbit induced by feeding graded amounts of low-level cholesterol. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1996;16:1454–64.
Kuzyniak W, Ermilov EA, Atilla D, ym. Tetra-triethyleneoxysulfonyl substituted zinc phthalocyanine for photodynamic cancer therapy. Chem Rev 2004;104:3723–50.
Lobatto ME, Fuster V, Fayad ZA, Mulder WJM. Perspectives and opportunities for nanomedicine in the management of atherosclerosis. Nat Rev Drug Discov 2011;10:835–
52.
Minicucci MF, Azevedo PS, Polegato BF, Paiva SAR, ZornoffLAM. Heart failure after myocardial infarction: clinical implications and treatment. Clin Cardiol 2011;34:410–
14.
Mozaffarian D, Benjamin EJ, Go AS, ym. Heart disease and stroke statistics - 2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation 2015;132.
Naha PC, Mukherjee SP, Byrne HJ. Toxicology of engineered nanoparticles: focus on poly(amidoamine) dendrimers. Int J Environ Res Public Health 2018;15:338.
Piepoli M, Hoes A, Agewall S, ym. 2016 European guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice: The sixth joint task force of the European Society of Cardiology and other societies on cardiovascular disease prevention in clinical practice (constituted by representatives of 10 societies and by invited experts) developed with the special contribution of the European Association for Cardiovascular Prevention &
Rehabilitation (EACPR). Eur Heart J 2016;37:2315–81.
Rihai C, Raco D, Gers B, Yusuf S. Indications for coronary artery bypass surgery and percutaneous coronary intervention in chonic stable angina review of the evidence and methodological considerations. Eur Heart J 2003;108:2439–45.
Ross R. Atherosclerosis - an inflammatory disease. N Engl J Med 1999;340:115–26.
Sydäninfarktin diagnostiikka. Käypä hoito -suositus. Suomalaisen Lääkäriseuran Duo- decimin ja Suomen Kardiologisen Seuran asettama työryhmä. Helsinki: Suomalainen Lääkäkäriseura Duodecim 2014. www.käypähoito.fi.
De la Torre G, Vázquez P, Agulló-López F, ym. Role of structural factors in the nonlinear optical properties of phthalocyanines and related compounds. Chem Rev 2004;104:3723–50.
Torres T. From subphthalocyanines to subporphyrins. Angew Chem Int Ed 2006;45:2834–
7.
Usui M, Miyagi M, Fukusawa S, ym. A first trial in the clinical application of photody- namic therapy for the prevention of restenosis after coronary-stent placement. Lasers Surg Med 2004;24:235–41.
Ziemba B, Matuszko G, Bryszewska M, Klajnert B. Influence of dendrimers on red blood cells. Cell Mol Biol Lett 2012;17:21–35.
