Valkendorff, Miiro Aleksi Opinnäytetutkielma Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos
Joulukuu 2020
NRF2- HYPERAKTIIVISUUDEN VAIKUTUS PLK1- INHIBIITTORI VOLASERTIBIN TEHOON KEUHKON A549-ADENOKARSINOOMASOLULINJASSA
OPINNÄYTETUTKIELMA
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos
Lääketieteen koulutusohjelma
Valkendorff, Miiro Aleksi: NRF2-hyperaktiivisuuden vaikutus PLK1-
inhibiittori volasertibin tehoon keuhkon A549-adenokarsinoomasolulinjassa Opinnäytetutkielma, 22 sivua
Tutkielman ohjaajat: Anna-Liisa Levonen, Jouni Härkönen Joulukuu 2020
TIIVISTELMÄ:
Keuhkosyöpien hoidossa siirrytään vähitellen yksilöidympään suuntaan.
Jatkuvasti lisääntyvä teoreettinen ymmärrys solutason mekanismeista on lisännyt kiinnostusta syöpäsairauksien hoitoon molekyylipatologian perusteella.
Tässä tutkimuksessa tutkittiin keuhkon adenokarsinoomasolujen NRF2- geenin hyperaktiivisuuden vaikutusta Plk1-inhibiittori volasertibin tehoon. Plk-perheen kinaasit ovat tärkeitä solusyklin säätelijöitä. Preliminäärisessä datassa nähtiin NRF2- hyperaktiivisuuden lisäävän volasertibin toksisuusvastetta, ja preliminäärisestä datasta tiedetään solusyklin markkerigeenien olevan NRF2+/+-solulinjassa koholla. Tutkimuksessa mitattiin NRF2+/+- ja NRF2-/--solulinjojen toksisuusvastetta ja viabiliteettia
volasertibikäsittelyn jälkeen eri konsentraatioilla, ja lopuksi tehtiin apoptoosianalyysi FACS-menetelmää hyödyntäen sopivalla volasertibikonsentraatiolla.
Tässä tutkimuksessa nähtiin tilastollisesti merkittsevät kuolleiden solujen määrän sekä toksisuusvasteen kasvut volasertibistä annosriippuvaisesti, mutta solulinjojen välillä ei nähty tilastollisesti merkitsevää eroa. Apoptoosikokeessa nähtiin tilastollisesti merkittävä ero solulinjojen välillä apoptoottisten solujen määrässä volasertibikäsittelyn jälkeen. Täten preliminäärisen datan tuloksia ei voitu validioida.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences School of Medicine
Valkendorff, Miiro Aleksi: Effect of NRF2-hyperactivity to PLK1-inhibitor volasertib’s effectiveness in lung A549-adenocarcinoma cell-line.
Thesis, 22 pages
Tutors: Anna-Liisa Levonen, Jouni Härkönen December 2020
Abstract:
Treatment of lung cancer is rapidly moving into more personalized medication.
Increasing theoretical understanding of cell-level mechanisms has increased interest in treatments utilizing molecular pathology.
In this study, we examined the effect of NRF2-hyperactivity in lung A549- adenocarcinoma cell-line when treated with PLK1-inhibitor volasertib. Plk-family of kinases are important regulators of cell-cycle. In preliminary data it has been shown that NRF2- hyperacticity increases volasertib’s toxicity. In preliminary data, it has also been shown that cell-cycle markers are elevated in NRF2+/+ cell line. We measured toxicity response and cell viability after volasertib treatment in NRF2+/+ and NRF2-/- cell-lines, and after these examinations we also performed an apoptosis assay analysis using FACS with the best suited volasertib concentration.
We saw a statistically significant difference in non-viable cells and toxicity response that was dependent in volasertib concentration, but we did not find a statistically significant difference between the cell lines. In apoptosis analysis we found a statistically significant difference between the number of apoptotic cells in different cell lines after volasertib treatment. We could not validate the results of preliminary data.
SISÄLLYSLUETTELO
1. Johdanto ... 5
2. Tavoitteet ja merkitys ... 11
3. Materiaalit ja menetelmät ... 13
3.1 Soluviljely ... 13
3.2 Proliferaatio ... 13
3.3 Viabiliteetti... 13
3.4 Toksisuus ... 13
3.5 Apoptoosi ... 13
3.6 Tilastollinen analyysi ... 14
4. Tulokset ... 14
4.1 Viabiliteetti... 14
4.2 Toksisuus ... 15
4.3 Apoptoosi ... 16
5. Pohdinta ... 17
6. Yhteenveto ... 19
7. Lähdeluettelo ... 20
1. JOHDANTO
Suuresta määrästä keuhkosyöpätutkimusta huolimatta se on maailmanlaajuisesti edelleen esiintyvyydeltään yleisin syöpä. Vuonna 2002 keuhkosyöpään arvioidaan sairastuneen 1,35 miljoonaa ihmistä ja kuolleen 1,18 miljoonaa ihmistä. Suomessa keuhkosyöpä on miehillä toiseksi yleisin, ja naisilla neljänneksi yleisin syöpä; vuonna 2010 miehillä todettiin 1620 ja naisilla 754 tapausta. Vaikka keuhkosyöpätapausten absoluuttinen määrä on jatkuvasti nousussa, Suomessa suhteellinen ikävakiotu keuhkosyöpäsairastavuus on kuitenkin ollut laskussa 1970-luvulta lähtien. Tupakointi on tärkein vaaratekijä, ja se aiheuttaa tutkimuksesta riippuen jopa 85-90% keuhkosyöpätapauksista, ja tupakoinnin vähentyminen selittänee keuhkosyöpätapausten suhteellisen määrän laskun.(1)
Kuva 1:
Keuhko- ja henkitorvisyöpien suhteellin ilmaantuvuus vuosina 1953-2018 Suomessa. Tiedot haettu Suomen syöpärekisteristä.
Keuhkojen epiteliaaliset syövät jaetaan histopatologisen tyypityksen mukaan pienisoluiseen karsinoomaan ( engl. small cell lung cancer, lyh. SCLC) ja ei-pienisoluiseen karsinoomaan (engl. non-small cell lung cancer, lyh. NSCLC). WHO:n luokituksen mukaan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä voidaan jakaa levyepiteelikarsinoomaan, adenokarsinoomaan ja suurisoluiseen karsinoomaan. Tämän karkean luokituksen lisäksi malignit tuumorit voidaan jaotella vielä tarkempiin alaluokkiin.
Keuhkosyövät voidaan luokitella myös molekyylipatologisesti eri geenimuutosten perusteella. Adenokarsinoomista tehtiin vuonna 2014 kattava molekyyliprofilointi (n = 230), jossa havaittiin 18 tilastollisesti merkittävää geneettistä mutaatiota: TP53 (46%), KRAS (33%), KEAP1 (17%), STK11 (17%), EGFR (14%), NF1 (11%), BRAF (10%), SETD2 (9%), RBM10 (8%), MGA (8%), MET (7%), ARID1A (7%), PIK3CA (7%), SMARCA4 (6%), RB1 (4%), CDKN2A (4%), U2AF1 (3%) ja RIT1 (2%).
Noin 75%:lla tutkituista keuhkon adenokarsinoomista oli RTK/RAS/RAF -signalointireittiä vahvistavia geneettisiä mutaatioita, kun koko tutkitussa keuhkosyöpäaineistossa määrä oli 62%. Nämä RTK/RAS/RAF -signalointireitit säätelevät solujen proliferaatiota, selviytymistä ja translaatiota. (2)
Nrf2/Keap1-signalointireitti on vastuussa vasteesta ärsykkeiden aiheuttamaan solunsisäiseen hapetusstressiin. Se ylläpitää redox-homeostaasia, vaikuttaa anti- inflammatorisesti sekä syöpää ehkäisevästi säätelemällä useita sytoprotektiivisia geenejä, ja täten on elintärkeä osa solun selviytymistä. Kuitenkin nykydatan valossa Nrf2/Keap1- signalointireitillä on myös toinen puoli: Nrf2/Keap1-reitin epätarkoituksenmukainen aktivaatio on yhdistetty alentuneeseen eliniänennusteeseen tietyissä syöpätyypeissä. NRF2- hyperaktiivisuus on keuhkosyövissä yleistä, ja Keap1-geenimutaatio löytyy noin 17%
adenokarsinoomista tehden siitä kolmanneksi yleisimmän mutatoituneen geenin keuhkojen adenokarsinoomassa. (3)
Nuclear factor (erythoid-derived 2)-like 2 –transkriptiofaktori (NRF2) on NFE2L2-geenin koodaama proteiini, joka säätelee antioksidatiivisten proteiinien ilmentymistä. Nämä antioksidatiiviset proteiinit suojaavat solua oksidatiiviselta stressiltä, jonka esimerkiksi vamma, tulehdus tai muu solun homeostaasia horjauttava tila aiheuttaa.
Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1) on KEAP1-geenin koodaama proteiini joka vaikuttaa NRF2-proteiinin toimintaan inhibitorisesti. Tämä inhibitorinen vaikutus tapahtuu NRF2-proteiinin ETGE- ja DLG-alayksiköiden kautta, joihin KEAP1-proteiini kiinnittyy solun homeostaasitilanteessa. KEAP1:en kiinnittyminen NRF2:een aktivoi CUL3- välitteisen ubikitiini-molekyylien kovalenttisen kiinnittymisen (ubikitinaation) NRF2:een, mikä johtaa NRF2-proteiinin proteosomaaliseen hajotukseen 26S-proteosomin toimesta.
Näin ollen NRF2:den koodaamat vasteet oksidatiiviseen stressiin eivät aktivoidu solun ollessa oksidatiivisen steressin suhteen homeostaasissa.(4)
Kuva 2:
Yksinkertaistettu malli Nrf2-Keap1-kompleksin toiminta solun normaali- ja stressitilanteessa. Solun normaalitilanteessa NRF2 kiinnittyy Keap1:teen sen ETGE- ja DLG-alayksiköiden kautta. Tämä käynnistää Cul3-välitteisen ubikitinaation mikä johtaa NRF2:den hajotukseen. Stressitilanteessa Keap1:den kysteiinimodifikaation kautta NRF2-ETGE-DLG-kompleksi irtaantuu Keap1:stä ja siirtyy tumaan. Tumassa NRF2 kiinnittyy sMaf-proteiiniin muodostaen heterodimeerin, ja yhdessä nämä kiinnittyvät ARE:en aloittaen geenien transkription.
Vastaavasti solun stressitilanteessa KEAP1-proteiinin kysteiinitähteitä muokataan niin, että proteiinin konformaatio muuttuu, mikä aiheuttaa NRF2-proteiinin DLG- ja ETGE-alaosien irtaantumisen KEAP1-proteiinista. NRF2:n ja KEAP1:n välinen sitoutumisaffiniteetti laskee ja ubikitinaatio häiriintyy. Näin NRF2:den normaaliolojen hajottaminen estyy, ja de novo syntetisoitu NRF2-proteiini pääsee siirtymään tumaan, missä se muodostaa heterodimeerin sMaF-proteiinin (engl. small musculoaponeurotic fibrosarcoma lyh. sMaf) kanssa, ja kiinnittyy ARE:iin (engl. antioxidant response element lyh. ARE) ja aloittaa näiden transkription.(4) Lopputulemana kohdegeenin vaikutukset johtavat solunsisäisen oksidatiivisen stressin vähenemiseen ja homeostaasin ylläpitoon. (5) Solunsisäisen homeostaasin palautuessa KEAP1 siirtää NRF2:n pois tumasta hajotettavaksi.
Kattavat genomiset sekvensointitutkimukset ovat osoittaneet Keap-Nrf2- geenireitin alassäätelyn syövissä sekä geneettisillä että epigeneettisillä mekanismeilla.
KEAP1-inaktivoivia mutaatioita on tunnistettu koko proteiinin alalta, mutta yleisimin Kelch- domainissa, joka välittää proteiini-proteiini interaktioita NRF2:den kanssa (6) ja johtaa NRF2:den akkumuloitumiseen tumassa. (7) Mielenkiintoisesti uuden datan valossa vaikuttaisi siltä, että mutaatiot KEAP1-geenissä ovat vähemmän yleisiä tupakoimattomilla verrattuna nykyisiin tai entisiin tupakoijiin. (8, 9)
Keuhkosyövissä NRF2-geenin gain-of-function mutaatiota vaikuttavat olevan suurimmalta osin rajoittuneita levyepiteelikarsinoomiin ja ovat toisiaan poissulkevia KEAP1- ja CUL3-mutaatioiden kanssa. (10, 11) Kaikki NRF2-geenin mutaatiot lokalisoituvat DLG- ja ETGE-alueille, mitkä ovat ankkurialueita NRF2:den kiinnittymiselle KEAP1:een. Siten mutaatiot NRF2:ssa heikentävät kiinnittymisen affiniteettiä KEAP1:een johtaen NRF2-proteiinin stabilisaatioon ja tumakertymiseen.(12)
Seriini-treoniiniproteiinikinaasi PLK1, eli polo-like kinase 1 (PLK1) ja muut Plk-perheen kinaasit ovat normaalin solusyklin säätelijöitä. PLK1-säätelee useita vaiheita mitoosissa ja sen käynnistymisessä: sentrosomien muodostumista, sukkularihmaston muodostumista, anafaasia edistävän komplexin aktivaatiota, kromosomien eriytymistä sekä sytokineesin alkamista. Tavallisesti Plk1-ekspressio ja –aktivaatio ovat matalalla solun G0- /G1- ja S1-vaiheissa, nousten G2-vaiheessa ja saavuttaa huippunsa M-vaiheessa. Tasaiset PLK1-ekspressiotasot ovat elintärkeitä solun tavanomaisen jakaantumisen kannalta. PLK1- yliaktivaatio ja/tai –yliekspressio voi johtaa sentrosomien epätäydelliseen muodostumiseen, toimimattomien tumasukkuloiden muodostumiseen tai epätarkoituksenmukaiseen
solusyklin checkpoint-aktivaatioon. Nämä aiheuttavat solutasolla kromosomien epästabiiliutta ja aneuploidiaa. Useissa syövissä PLK1 on yliekspressoitunut, mukaan lukien NSCLC, ja se korrelloi huonomman ennusteen kanssa. Näinollen PLK1-inhibiittoreita on tutkittu yhtenä mahdollisena syöpälääkkeenä tilanteissa, joissa PLK1 on yliekspressoitunut.
(13) Muut Plk-perheen kinaasit taasen vaikuttavat inhiboivan solun muuntumista syöpäsoluksi.(14)
Kuva 3:
Plk-perheen toiminta solusyklissä: PLK1 on tärkeä tekijä mitoosin käynnistymisessä, sukkularihmaston muodostuksessa, anafaasin alkamisessa ja solujakautumisessa M-faasissa, kromosomien kondensaatiossa ja keskusjyvästen kehittymisessä välifaasissa. G1-faasissa PLK2 ja PLK4 käynnistävät keskusjyvästen monistuman ja S-faasissa PLK3 säätelee DNA:n replikaatiota. PLK5:den, jota ei tässä ole kuvattuna, tiedetään olevan osana neuronien eriytymistä.
Tsvetkov et al. (2009) tutkimuksen mukaan mitokondrioiden toimimattomuus indusoi PLK2-ekspressiota. Samassa tutkimuksessa myös tutkittiin PLK2 vaikutusta, ja huomattiin PLK2:n kykenevän fosforyloimaan PLK1:stä aktivoiden sen toimivaksi.
Preliminäärisen datan perusteella tiedetään PLK2-ilmentymisen olevan koholla sekä solusykliin vaikuttavien proteiinien olevan rikastuneen NRF2-hyperaktiivisissa keuhkosyöpäsolulinjoissa (Kuva 4 kohdat a-d). Tämä tekee PLK1-inhibiittori volasertibista mielenkiintoisen tutkimuskohteen. (15, 16)
Jatkuvasti lisääntynyt ymmärrys keuhkosyövän solutason mekanismeista on siirtänyt keuhkosyöpien lääkehoitoa yksilöidympään suuntaan ja on synnyttänyt suuren mielenkiinnon kohdennettujen lääkkeiden kehittämiseen. Useat uudet lääkeaineet, kuten epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors (TKI) (esim. erlotinibi, afatinibi, gefitinibi) ja anaplastic lymphoma kinase (ALK) inhibitors (esim. crizotinibi, ceritinibi, alectinibi) ovat nykyään tärkeitä ja tehokkaita lääkkeitä ei-pienisoluisen keuhkosyövän yksilöidyssä hoidossa. Ongelmana näissä on kuitenkin niiden sopivuus suhteellisen pienelle ryhmälle NSCLC-potilaita, sekä lähes aina kehittyvä lääkeresistenssi.
(13)
Volasertibi on yksi uusista PLK1-inhibiittoreista, jota on tutkittu mahdollisena syöpälääkkeenä. Se toimii estämällä solujen jakaantumisen kiinnittymällä PLK1-proteiinin ATP:tä-sitovaan taskuun estäen PLK1-proteiinin toiminnan.
Farmakologisilta ominaisuuksiltaan Volasesrtibi on potentti ja selektiivinen.
Sen IC50 (half-maximal inhibitory concentration) on PLK1:lle 0.87nM, PLK2:lle 5.0nM ja PLK3:lle 56nM. volasertibillä ei ollut suurempaa vaikutusta yli 60 muuhun testattuun kinaasiin 10M konsentraatiolla. Farmakokineettisesti volasertibin puoliintumisaika ihmisillä on 111 tuntia, poistuma keskiverto 797mL/min ja jakautumistlavuus suuri >4000 litraa.
Eläinkokeissa oraalinen bioavailabiliteetti oli hyviä: hiiri 51%, rotta 55% ja koira 53%. (17, 18)
Siedettävyydeltään volasertibi vastaa muita hyvin siedettyjä syöpälääkkeitä.
Lin et al (2014) julkaisemassa 1-faasin tutkimuksessa tutkittiin 65:den jo metastasoituneen keuhkosyöpäpotilaan vastetta 12mg – 450mg volasertibiannoksille. Potilaille annettiin yksi 1-tunnin infuusio volasertibiä kolmen viikon välein. Annosta rajoittava toksisuus (engl.
Dose limiting toxicity) nähtiin kun annosta nostettiin yli 300mg:aan. Yleisimmät lääkehaitat olivat anemia (yhteensä: 22%; luokka 3; 8%), neutropenia (yht. 15%; luokka 3/4: 14%),
trombosytopenia (yht. 14%; luokka ¾: 14%) ja väsyneisyys (yht. 15%; luokka 3: 2%).
Verenkuvamuutokset olivat seurannassa palautuvia. Suurin siedetty annos oli 400mg.
Kahdessa muussa faasin I -tutkimuksessa löydökset olivat samankaltaisia: ensimmäisessä puoliintumisaika oli 135 tuntia, jakautumistilavuus >3000L ja poistuma keskivertoa; toisessa puoliintumisaika oli 116 tuntia, poistuma keskiverto 897mL/min ja jakautumistilavuus suuri 6130L. (19, 20)
2. TAVOITTEET JA MERKITYS
Tämän tutkimuksen tavoitteena on tutkia PLK1-inhibiittori volasertibin tehoa NRF2- hyperaktiivisessa (KEAP1 G333C) ja NRF2-poistogeenisessä A549-NSCLC-solulinjassa.
A549-solut ovat hengitysteiden alveolien epiteelisolukkoa adenokarsinooma tyyppisestä tuumorista. Kuten johdannossa on jo perusteltu: nykytiedon valossa PLK1 on elintärkeä kinaasi solusyklissä. PLK1 on yliekspressoitunut useissa erityyppisissä syöpätyypeissä, ja tämä yliekspressio on yhdistetty tutkimuksissa alentuneeseen selviytymiseen. Volasertibi on suhteellisen spesifi PLK1-inhibiittori, jonka todetut haittavaikutukset ovat suhteellisesti lieviä ja lääkeine on famakokineettisiltä ominaisuuksiltaan syöpälääkkeeksi sopiva.
Preliminäärisen datan perusteella NRF2-positiivisuus lisää volasertibin toksisuusvastetta (Kuva 4, kohdat e ja f). Teoreettiseltä taustalta tiedetään, että PLK2-tasot vaikuttaisivat korreloivat NRF2-positiivisuuden kanssa, sekä PLK2 kykenee fosforyloimaan PLK1:tä aktiiviseksi.(15, 16) Ennalta tiedetään, että NRF2-aktiivisuus on yhteydessä solusyklin tarkistuspistegeenien ilmentymiseen (Kuva 4 kohdat c ja d). A549-solulinjassa on myös aiempien tutkimusten mukaan soluhengitys alentunut. PLK2 indusoituu oksidatiivisesta stressistä ja parantaa solujen selviytymistä näissä tilanteissa.(21)
Kuva 4:
a) A549-solujen NRF2-kohdegeenien ilmentyminen NRF2+/+ ja NRF2-/- -solulinjoissa.
b) Plk2 ilmentyminen NRF2+/+ ja NRF2-/- solulinjoissa.
c) Geenisettirikastuma-analyysi. Kuvaajassa nähdään solusykliin liittyvien geenien rikastuma NRF2-poistogeenisessä solulinjassa.
d) Geenisetin rikastumaan vaikuttavat geenit sanapilvessä. Sanan koko on suhteessa geenin differentiaaliekspressioon.
e) Preliminäärisen datan A549-solulinjan toksisuusvaste volasertibille eri konsentraatioissa.
f) Preliminäärisen datan A549-solulinjan viabiliteetti volasertibikäsittelyn jälkeen eri konsentraatioissa.
3. MATERIAALIT JA MENETELMÄT
3.1 SOLUVILJELY
Soluja kasvatettiin Dulbecco’s modified eagle –liuoksessa jossa oli 10 % naudan sikiön seerumia ja 1 % penisilliini/streptomysiiniä, ja inkuboitiin 37 C°:ssa ja 5 % CO2. Solut jaettiin aina ennen 100 % konfluenssia suhteessa 1:10 ja siirrostusluku pidettiin alle 10:ssä.
3.2 PROLIFERAATIO
Solujen proliferaatiota varten solut jaettiin 96-kuoppalevyille 1000 solua per kuoppa ja kasvua seurattiin neljän päivän ajan 10 nM volasertibissa. Solumäärän mittaus tehtiin CyQuant Cell Proliferation Assay –reagenssipaketilla pakkauksen ohjeen mukaisesti.
3.3 VIABILITEETTI
Viabiliteettia varten solut jaettiin 96-kuoppalevylle 1000 solua / kuoppa, ja solujen kiinnittymisen jälkeen ne altistettiin volasertibille konsentraatioissa 0, 0.1, 1, 10, 100 ja 1000 nM, joista nollakonsentraatioon lisättiin maksimikonsentraatiota vastaava määrä DMSO:ta (1:1000). Solujen annettiin kasvaa 24 tuntia, jonka jälkeen elävien solujen määrä mitattiin MTS cell proliferation –assaylla (Promega, #Lot: ) ohjekirjan protokollan mukaan.
3.4 TOKSISUUS
Toksisuusmittausta varten olosuhteet pidettiin samana kuin viabiliteettikokeessa, ja mittaus tehtiin CellTox Green (Promega, #Lot: ) reagenssipakkauksen ohjeen mukaan aikapisteissä 24 ja 48 tuntia. Positiivisena kontrollina solut lyysattiin mittauksen yhteydessä paketissa olevalla lyysauspuskurilla ohjekirjan mukaisesti.
3.5 APOPTOOSI
Apoptoosia mitattiin FACS:lla Annexin V –merkkiaineella. Solut jaettiin 6-kuoppalevyille ja altistettiin 100 nM volasertibille 24 tunnin ajan. Positiivisena kontrollina käytettiin 100 µM H2O2, ja negatiivisena DMSO:ta. Inkubaation jälkeen solut pestiin kahdesti PBS:llä.
Merkkiainekäsittely tehtiin 100 µl 1X Annexin V sitomispuskurissa Annexin V Alexa Fluor 488:lla suhteessa 1:100 ja propidiumjodidilla konsentraatiolla 2 ng/ml 15 min inkubaatioajalla. Lopuksi näytetilavuutta kasvatettiin 500 µl:aan, ja näytteitä pidettiin jäillä ennen mittausta. Mittauksessa käytettiin FITC ja TRITC –aallonpituuksia vastaavia filttereitä. Tulokset analysoitiin Mann-Whitneyn U-testillä. Statistisen analyysin mahdollistamiseksi solujen määrät arvioitiin CytExpert-ohjelmistolla (v.2.4.0.28) rajaten solupopulaatiot apoptoottisiin ja elinkykyisiin soluihin DMSO-käsiteltyjen ryhmien perusteella (Kuva 7 kohta b).
4.6 TILASTOLLINEN ANALYYSI
Proliferaation, viabiliteetin ja toksisuuden tilastollisia eroja tarkasteltiin kaksisuuntaisella varianssianalyysillä GraphPad Prism 5 –ohjelmistolla. Eroa apoptoosifrekvenssissä arvioitiin Studentin t-testillä R:llä (v 1.2.1335).
4. TULOKSET
Tutkimuksen ensimmäisessä osassa oli tavoitteena oli validoida preliminäärisen datan toksisuus- ja viabiliteettitulokset.
4.1 VIABILITEETTI
Viabiliteettikokeessa nähtiin pieni eroavaisuus NRF2+/+ ja NRF2-/--populaatioiden välillä, mutta tämä ero jäi alle tilastollisen merkitsevyyden (P = 0.28). Lääkevaste kasvaa volasertibista annosriippuvaisesti (P < 0.0001), ja suurimmat eroavuudet havaittiin Volaseribin konsentraatioilla 100nM ja 1000nM. 1000nM konsentraatiolla keskiarvoiset suhteelliset solumäärät olivat NRF2+/+-solulinjassa 71,8% ja NRF2-/--solulinjassa 81,5%.
Tarkemmin tulokset on esitetty seuraavassa kuvaajassa (Kuva 5).
4.2 TOKSISUUS
Toksisuuskokeessa nähtiin vastaavasti elinkelvottomien (eng. non-viable) solujen määrän kasvu NRF2-hyperaktiivisessa solulinjassa verrattuna kontrolliryhmään, mutta ero jäi kaikilla konsentraatioilla alle statistisen merkittävyyden (P = 0.343). Statistinen eroavaisuus kasvaa volasertibikonsentraation kasvaessa (P < 0.0001) ja, ja suurin eroavaisuus nähtiin 1000nM konsentraatiolla. Tällä konsentraatiolla keskiverrot relatiiviset elinkelvottomien solujen määrät olivat NRF2+/+ solulinjassa 27.1% ja NRF2-/- -solulinjassa vastaavasti 19.7%.
Tarkemmin tulokset on esitetty seuraavassa kuvaajassa (Kuva 6).
Kuva 5:
Viabiliteettitestauksen tulokset. volasertibikonsentraatiot ilmaistu nanomooleina. Elävien solujen osuus ilmaistu relatiivisena määränä.
Viabiliteetti- ja toksisuuskokeessa ei kyetty toistamaan preliminäärisen datan tuloksia. Kuvan 6 toksisuusvastetta ei myöskään kyetty toistamaan luotettavasti (dataa ei ole näytetty). Mikroskooppikuvissa kuitenkin lääkkeellä havaittiin olevan apoptoosia indusoiva vaikutus (data ei näytetty), ja tämän perusteella siirryttiin tutkimaan apoptoosia Annexin V- merkkiaineella.
4.3 APOPTOOSI
Apoptoosikokeissa havaittiin apoptoottisten solujen osuuden kasvu verrattuna NRF2-knock- out -solulinjaan. Solulinjojen välillä havaittiin tilastollisesti merkitsevä ero (P = 0.0152) apoptoottisten solujen osuudessa lääkeainekäsittelyn jälkeen. Tarkemmin tulokset sekä solupopulaatioiden rajaus on esitetty seuraavassa kuvassa (kuva 7).
Kuva 6:
Toksisuuskokeen tulokset. Volasertibikonsentraatiot ilmaistu nanomooleina. Toksisuusvaste ilmoitettu lääkeainekäsittelyn jälkeen fluoresoivien solujen määränä verrattuna kontrolliryhmän fluoresenssiin.
5. POHDINTA
PLK1 on tärkeä osa solusykliä, ja on täten tärkeä tutkimuksen kohde. Volasertibi on osoittanut lupaavia sytotoksisia ominaisuuksia prekliinisissä tutkimuksissa, mutta kliinisissä kokeissa volasertibin kasvaimen kasvua rajoittava vaikutus on jäänyt vajaaksi, ja vaste on nähty vain pienillä osilla potilaista. (22) Tämän perusteella eri onkogeenien vaikutusta volasertibin lääkevasteeseen tulisi tutkia. NRF2 on vaikuttanut preliminääristen tutkimusten mukaan mielenkiintoiselta kohteelta, kuten johdannossa on perusteltu. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää NRF2 roolia Volasertbin tehossa.
Volasertibikäsittely vähensi molempien solulinjojen viabiliteettiä ja lisäsi elinkelvottomien solujen määrää annosriippuvaisesti, mutta vasteet testatuilla konsentraatioilla olivat pieniä verrattuna preliminääriseen dataan. Annexin V on annexin- ryhmän proteiini, joka kykenee kiinnitymään solukalvon fosfatidyyliseriini-proteiiniin (engl. Phosphateditylserine lyh. PS). Normaalitilassa PS on kiinnittyneenä solukalvon intrasellulaaripuolelle, mutta varhaisen apoptoosin aikana tämän proteiini siirtyy solukalvon
Kuva 7:
a) Apoptoottisten solujen osuus eri solulinjoissa. Keskiarvoinen apoptoottisten solujen osuus NRF2+/+ solulinjassa oli 6.7% ja NRF2-/- solulinjassa 3.6%.
b) Edustavat otokset solupopulaatioiden rajaamisesta. Punainen populaatio kuvaa apoptoottisia NRF2+/+ soluja, sininen populaatio kuvaa apoptoottisia NRF2-/- soluja.
ekstrasellulaaripuolelle. Tällöin Annexin V kykenee sitoutumaan PS-proteiiniin, ja fluorokromi-käsitelty Annexin V antaa FITC-mittauksessa mitattavan fluoresenssiresponssin. Apoptoosianalyysin perusteella vaikuttaisi, että NRF2-aktiivisuus lisää herkkyyttä volasertibille in vitro. Huomioiden heikot viabiliteetti- ja toksisuusmittausten vasteet, sekä apoptoosianalyysin pienet apoptoottiset solupopulaatiot, ei datasta voida tehdä merkittäviä päätelmiä volasertibin NRF2-riippuvaisesta vasteesta.
Kuten tulokset-kohdassa mainittiin, ei preliminäärisen datan toksisuus- ja viabiliteettituloksia kyetty toistamaan. Todennäköisesti tämän taustalla on useita eri tekijöitä. Preliminäärinen data on tuotettu suurkapasiteettisella analyysillä, jolla on analysoitu kerralla yli 500 lääkeainetta ilman tilastollista voimaa. Täten preliminäärisen datan tulokset voivat selittyä satunnaishajonnalla. Kuvan 6 toksisuustuloksen toistettavuuden ongelmat todennäköisesti johtuvat inhimillisistä teknisistä virheistä ja heikosta todellisesta tehosta käytetyillä konsentraatioilla ja aikapisteellä. Huomioiden myös viabiliteettikokeen heikon lääkevasteen, tulisi jatkotutkimuksissa optimoida lääkeaineen konsentraatio sekä mittausten aikapisteet.
Valitettavasti täysin vertailukelpoisia tutkimuksia A549-solulinjan NRF2- ekspression ja PLK1-inhibiittoreiden yhteydestä ei tällä hetkellä ole. Van der Bossche et al (2019) tutki A549-solulinjan p53-ekspression ja volasertibin lääkevasteen yhteyttä, ja he havaitsivat huomattavasti tätä tutkimusta vahvemman lääkevasteen A549-solulinjassa.
Tuossa tutkimuksessa viabiliteettitestauksessa A549-solulinjan volasertibin IC50
normoksisessa tilassa oli 15.54nM ± 2.17nM 24 tunnin aikapisteessä (mitattu Sulforhodamine B Assay Kit:llä), kun vastaavasti meidän tutkimuksen viabiliteettituloksista ekstrapoloiden molemmissa solulinjoissa nähtiin vastaavalla konsentraatiolla noin 95%
solujen selviytyminen 24 tunnin aikapisteessä. Samassa tutkimuksessa käytettiin myös Annexin V-positiivisten solujen mittausta apoptoosin varmistamiseksi. Tuloksia mitattiin 72 tunnin aikapisteessä volasertibin konsentraatioilla 0nM, 7,5nM, 12,5nM ja 20nM ja suurimmalla konsentraatiolla Annexin V-positiivisia soluja oli 12.06% ± 6.07%. Tuo tulos ei tietysti ole täysin vertailukelpoinen meidän tutkimuksen tuloksiin eri aikapisteen ja käytetyn konsentraation vuoksi, mutta nämä tulokset vaikuttavat olevan enemmän yhteen meidän tulosten kanssa huomioiden molempien tutkimusten suuri vaihteluväli.
Mainittakoon, että edellä mainitussa tutkimuksessa ei saatu statistisesti merkittävää eroa 24 tunnin ja 72 tunnin aikapisteiden välillä, joten jatkotutkimusten kannalta aikapisteen merkitsevyyttä tulisi arvioida. (13)
6. YHTEENVETO
Entuudestaan tiedetään volasertibin olevan spesifi Plk1-inhibiittori, jonka antikarsinogeeninen vaikutus on osoitettu in vitro, mutta kliinisen kokemuksen perusteella lääkevaste on jäänyt vajaaksi. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään voisiko volasertibi tehota paremmin NRF2-hyperaktiivisissa solulinjoissa, koska preliminäärisessä datassa nähtiin lupaavia tuloksia. Tämän tutkimuksen datasta ei voida tehdä merkittäviä päätelmiä volasertibin NRF2-riippuvaisesta vasteesta. Kokonaisuudessaan tämän tutkimuksen tulokset poikkesivat aiemmasta datasta, eikä esimerkiksi toksisuusmittauksen tuloksia pystytty luotettavasti toistamaan. Syitä tähän on jo arveltu pohdinta-kohdassa ja valitettavasti poikkeavien tulosten tarkemman perisyyn selvittäminen jää aikarajoitteisista syistä tämän tutkimuksen ulkopuolelle. Tulosten merkittävyyden selvittämiseksi volasertibin NRF2- riippuvaa vaikutusta tulisi tutkia laajemmin useammilla solumalleilla samoilla vastemuuttujilla, ja tehokkuutta tulisi lisäksi arvioida eläinmalleissa.
7. LÄHDELUETTELO
1. Joensuu H, Roberts PJ, Kellokumpu-Lehtinen P, Jyrkkiö S, Kouri M, Lyly T. Syöpätaudit.
; 2013.
2. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 2014 Jul 31;511(7511):543-50.
3. Bauer AK, Hill T, Alexander C. The Involvement of NRF2 in Lung Cancer. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2013;2013:746432.
4. Wu S, Lu H, Bai Y. Nrf2 in cancers: A double-edged sword. Cancer Med. 2019;8(5):2252- 67.
5. Raghunath A, Sundarraj K, Nagarajan R, Arfuso F, Bian J, Kumar AP, et al. Antioxidant response elements: Discovery, classes, regulation and potential applications. Redox Biology.
2018;17:297-314.
6. Canning P, Sorrell FJ, Bullock AN. Structural basis of Keap1 interactions with Nrf2. Free Radic Biol Med. 2015 Nov;88(Pt B):101-7.
7. Padmanabhan B, Tong KI, Ohta T, Nakamura Y, Scharlock M, Ohtsuji M, et al. Structural basis for defects of Keap1 activity provoked by its point mutations in lung cancer. Mol Cell.
2006 Mar 3;21(5):689-700.
8. Luo W, Tian P, Wang Y, Xu H, Chen L, Tang C, et al. Characteristics of genomic alterations of lung adenocarcinoma in young never-smokers. Int J Cancer.
2018;143(7):1696-705.
9. Frank R, Scheffler M, Merkelbach-Bruse S, Ihle MA, Kron A, Rauer M, et al. Clinical and Pathological Characteristics of KEAP1- and NFE2L2-Mutated Non-Small Cell Lung Carcinoma (NSCLC). Clin Cancer Res. 2018 Jul 1;24(13):3087-96.
10. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 2012 Sep 27;489(7417):519-25.
11. Sanchez-Vega F, Mina M, Armenia J, Chatila WK, Luna A, La KC, et al. Oncogenic Signaling Pathways in The Cancer Genome Atlas. Cell. 2018;173(2):321,337.e10.
12. Shibata T, Ohta T, Tong KI, Kokubu A, Odogawa R, Tsuta K, et al. Cancer related mutations in NRF2 impair its recognition by Keap1-Cul3 E3 ligase and promote malignancy.
Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105(36):13568-73.
13. Van den Bossche J, Deben C, De Pauw I, Lambrechts H, Hermans C, Deschoolmeester V, et al. In vitro study of the Polo-like kinase 1 inhibitor volasertib in non-small-cell lung cancer reveals a role for the tumor suppressor p53. Mol Oncol. 2019;13(5):1196-213.
14. Barr FA, Silljé HHW, Nigg EA. Polo-like kinases and the orchestration of cell division.
Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2004;5(6):429-41.
15. Matsumoto T, Wang P, Ma W, Sung HJ, Matoba S, Hwang PM. Polo-like kinases mediate cell survival in mitochondrial dysfunction. Proc Natl Acad Sci USA.
2009;106(34):14542-6.
16. Tsvetkov L, Stern DF. Phosphorylation of Plk1 at S137 and T210 is inhibited in response to DNA damage. Cell Cycle. 2005 Jan;4(1):166-71.
17. Rudolph D, Steegmaier M, Hoffmann M, Grauert M, Baum A, Quant J, et al. BI 6727, a Polo-like kinase inhibitor with improved pharmacokinetic profile and broad antitumor activity. Clin Cancer Res. 2009 May 1;15(9):3094-102.
18. Gjertsen BT, Schöffski P. Discovery and development of the Polo-like kinase inhibitor volasertib in cancer therapy. Leukemia. 2015 Jan;29(1):11-9.
19. Döhner H, Lübbert M, Fiedler W, Fouillard L, Haaland A, Brandwein JM, et al.
Randomized, phase 2 trial of low-dose cytarabine with or without volasertib in AML patients not suitable for induction therapy. Blood. 2014 Aug 28;124(9):1426-33.
20. Lin CC, Su WC, Yen CJ, Hsu CH, Su WP, Yeh KH, et al. A phase I study of two dosing schedules of volasertib (BI 6727), an intravenous polo-like kinase inhibitor, in patients with advanced solid malignancies. Br J Cancer. 2014 May 13;110(10):2434-40.
21. Li J, Ma W, Wang PY, Hurley PJ, Bunz F, Hwang PM. Polo-like kinase 2 activates an antioxidant pathway to promote the survival of cells with mitochondrial dysfunction. Free Radic Biol Med. 2014 Aug;73:270-7.
22. Van den Bossche J, Lardon F, Deschoolmeester V, De Pauw I, Vermorken JB, Specenier P, et al. Spotlight on Volasertib: Preclinical and Clinical Evaluation of a Promising Plk1 Inhibitor. Med Res Rev. 2016 Jul;36(4):749-86.
