Radioaktiivisten merkkiaineiden käyttömahdollisuudet vesistöjen hajotustoiminnan mittauksessa

KAYTTOMAHDDLLISUUDET VESISTOJEN HAJOTUSTOIMINNAN MITTAUKSESSA

Timo Tamminen

0:4

RA IVISTEN R IAIN N K 0 LLISU DET VESISToJEN

T I NN N MI TAUKSESS

T mo Tamminen

n n sip n v sit i isto

He lsi

1 •

JOHDANTO

2. VESISTOJEN HAJOTUSTOIMINTA 2.1 HETEROTROFIT JA VESIEKOLOGIA

2 • 1 • 1 2 "1 • 2 2. 1 • 3

2.2

2 .. 2. 1 2. 2. 2 2 • 2 • 3

2.2.4

2. 2 .. 5

3 • 3. 1 3 • 1 • 1 3 • 1 • 2 3 • 1 • 3 3 • 1 • 4 3. 2 3 • 2. 1 3. 2. 2 3. 2. 3

3.2.4

3 • 2. 5 3. 2. 6 3. 2. 7

Heterotrofia

Heterotrofisten bakteerien osuus aineiden kierrossa Hajotustutkirnuksen ekologinen rnerkitys

TUTKIMUSMENETELMISTA

ja epasuorat rnenetelrnat

Radioaktiivisten rnerkkiaineiden kaytto Substraatin ongelrna

Entsyyrnikineettinen analyysi Tyossa kaytetty rnenetelrna ENTSYYMIKINETIIKKA

MATEMAATTISET PERUSTEET Populaatiodynarniikkaa .

Michael -Menten-kinetiikan lineaariset rnuunnokset Sovellutukset luonnonpopulaatiotutkimukseen

Pararnetr luottarnusvalit PARAMETRIEN

B - b ia - ekolog

Heterogeenisen bakteeriyhteison kinetiikka

Entsyyrnikinetiikka vesiekologisessa tutkirnuksessa Aktuaalisuus ja potentiaalisuus

Substraat s asot 3 H-leirnatut substraat Pararnetrien jaottelu

1

3 4

7 7 10 11 12

1 15

5 1

2 26 31 1 33 37 38 4 43 44

3. 3 . 1 3 • • 2 3 . 3 . 3 3.4 3. 4. 1 3 • 4. 2

4 . 4. 1 4. 2 1+.3 5 . 5 . 1 5. 2 5. 3 5.4 6 .

7 •

LIITTEET

Ottonopeudet

Kiertoa Ja -nopeus uussumma +

VAIHTOEHTOIS LITYK

Ensimmainen kerta ^l eti La

YHDEN LISAYKSEN MENETELMAN KEHITYS KAKSI STYMISTAPAA

YHDEN LISAYKSEN PARAMETRIT MENETELMIEN VERTAILU

OTTONOPEUDET

KINEETTINEN JA YHDEN LISAYKSEN KIERTOAIKA LUONNON KIERTOAJAN MAARITYKSESTA

SUBSTRAATTI YHTEENVETO KIRJALLISUUS

47 49 0 5 53 55

57 57 60 61

62 62 64 66 67

70

72

1. JOHDANTO

Vesiekologisen tutkimuksen merkitys on korostunut s a mukaa kun ves tojen luonnontilan muutokset ovat yle tyneet.

Kokonaisvaltaisen ekologisentarkastelutavan tarpeellisuus on ilmennyt esimerkiksi malliteor.eettisen tutkimuksen voimakkaa- na kehityksena viime vuosikymmenella. sen tutkimuksen perustan muodostavat tiedot vesiston eloll en organismien toiminnasta, johon muutokset vesistossa valittomasti heijas- tuvat.

Vesiston biologinen kokonaisaktiivisuus tuu lukuisista isista, mutta iinsa kytkaytyneista prosesseista, jotka voidaan j kahteen paalohkoon: tuotantoon, jossa

ja orgaanisista yhdisteista muodostuu orgaa- biomassaa, seka hajotukseen, jossa e linen orgaani- nen aine palautuu elottomaan, lopulta epaorgaaniseen muotoon.

Vesiekologisen tutkimuksen keskeinen kohde on tuotanto- ja hajotustoiminnan tasojen ja keskinaissuhteiden selvittaminen - esimerkiksi vesiston kuormitustilanteissa naiden ekosystee- min perusprosessien suhde ratkaisee mahdollisen rehevoitymis- kehityksen luonteen.

Vesiston b en kokonaisaktiivisuuden tuotantopuolen tutkimusmenetelmat ovat j·o pitkalle kehitettyja ja mm. perus- tuotantomittauksena standardoituja. Hajotustoiminnan tutkimus on metodologisesti vaikeampaa, koska hajotusta tapahtuu eko-

t lla lla hyvin heterogeenisina pro-

sesse ist kokonaismetabol - ts. iden kierron - kannalta keskeis hajottaj ovat heterotrofiset baktee-

. Naiden toimintaa kuvaavilla parametreilla voidaan tie-

ede 1 arvio vesiston koko hajo-

tustoimintaa; kuvaavat ekosysteemin kannalta pe- rustuotantoon verrattavaa "perushajotusta", josta kenties olisi luontevampaa yleisnimitysta hajotusnopeus.

Kahden viime vuosikymmenen kuluessa on kehitetty erilaisia

ten perustuvia menetelmia

a

Tass

a

^{kokoamaan e}

keis ista mene e s

a

J sesti es

lahes

lemaan niill saatavaa forma at stavan j osta menet

leen ei tarkerrun puututa.

Kaskisten edustan mer ess Vaasan ves llr harjo

en isot esitett lueelta

el

a.

hava

n

seen puo- ineist lL3 1978 to

Haluan aa lampimasti loista es stani FK Pertti Sevolaa isesta ty5skente l sten luomisesta seka Helsingin iopiston maatalous-metsatieteell en tiedekunnan

sotooppiosaston vastaavaa johtajaa FK Antti Uusi-Rauvaa a eisty5sta rad iivisuuksien mittauks ssa.

MMK Tuomo selta sain hyodyllista opastusta eraissa ent- syymikinetiikkaan liittyvissa matemaattisissa kysymyksissa.

alkuvirikkeesta seka in matkaa saaduista ideoista Ja hedelmallisesta an erityisesti kiittaa MMK Kuparista, jonka imusapulaisena toimiessani

kaynnis . Tyo esitetaan opinnaytteena Helsingin yli- opiston limnologian laitoksen es lle, professori Reina Ryhaselle, jota haluan kiittaa kannustavasta suhtautumisesta tyon eri vaiheissa. Paula Hartmania ja Tuula Juvosta kiitan pitkamieli sta ja hyvasta yhte sta puhtaaks oi- tuksen ja -piirtamisen parissa.

2. 1 2 • 1 •

sevat

si ne es

)

i kahteen ottavat essa muodossa

aetaan a

s

iset e muuntamaan val

sa

ottamatta.

TAULUKKO 1 • EliBkunnan

llihde

kemialliset

sa

ihin.

semansa h

. Het tarv

i ener-

es- ek- sty- amalla. Taulukossa 1 on

hiilen- ja

ka e 11 et oliot a b eeriryhmia tarkastelemaan eere . Naista

(autot~ofia)

co

kemoautotrofit - useat bak-

it korkeammat elaimet

valo

i)

1 )

fotoheterotrofit eerit

197 )

fotoautotrofit - kasvit

smeista valtaosa tuottaa energiansa synteettisesti.

oittuu p v

teer in, ovat lahes

en ja purppurabak- etta anaerobeja.

Kemosyntees res

t

, j ossa solun

muoto 11 issa olosuhteissa on

l

kulkevat s molekyyle

aisen elektron

1 sitoutunut ener- e a saadut elektronit oketjun kautta happi- taat ) , jossa

luovuttaj tomiin oloih

joten sen

lisesti vahainen.

2 • 1 • 2

eere a isissa ves

o on kayminen (fermen- s elektronien

o tuu hapet- ottamatta), otapahtumissa on taval-

en bakteer osuus aineiden kierrossa Kaiken sen toiminnan perusta on auringon sateilya ja ilmakehan hi idioksidia hyodyntavien fotoautotrofien aineenvaihdunta. Perustuotanto on vesiekologiassa vakiintu- nut nimitys planktisten lev suor le yhteytykselle.

Kasvieri orgaaniseen muotoon sitomat yhd joutuisivat pois ekosysteemin aineiden kierrosta, elleivat heterotrofiset organismit kykenisi kayttamaan niita hiilen- ja energianlah-

teinaan. Eko ' e sot koostuvat aineen-

heterotrofisista kuluttajista, jotka vo muodostaa monivaiheisia ravintoketjuja (kuva 1).

ottaj tuottamat sille tuottaj

lis so, joka

1 erote yleisekologiassa aa muiden trofiatasojen

et teet isiksi, autotrofi-

le kayttokelpoisiksi yhdisteiksi.

einen trof sojaottelu on eemin tarkastelussa ekas, mutta yks sten ismiryhmien kohdalla vain approksimaat jokainen organismi seka tuottaa biomassaa etta hengittaa (respiroi) epaorgaan hiilta. Esimerkiksi heterotrofisten bakteerien (h a j o t t a j i e n) osuus ves on b ssa t u o t a n n o s t a voi merki tta-

ja kulun ulkopuol

ottajien valisen aineiden kierto- on es kuvassa 2. Kun vesistoon tulee

a (allokt a

asema muuttuu

sta, hetero- isen aineen hiili sa vasta hetero- ja

pauksissa j

2 • 1 • 3

Monissa t

ten

en (es

on muun syst otustoiminnan j

kaytettav

(kuva 3). laisissa ta- sten bakteer biomassatuotanto voi

issa on t

isi s

KUVA 1. Ekosysteemin yleiset trofiatasot.

s

saada tietoja vesistossa esse t ku yks

a

is-

sen stutki- olla soveltava:

l tiedonintressi voi vaikutukset kohdistu- vat vain

Ves t

on

i

svalta

sa keh isteen si

esseih

on y lsen

sen staatt ta (to aan). Ind

smeih

telu oleellisen

isesti joh- itteista ilaj j at-

c

FOTOAUTOTROFIT

(levat)

KEMOHETEROTROFIT

(bakteerit) KUVA 2. Vesiekosysteemin tuot- tajien (fotoautotrofit) ja hajottajien (kemohetero- trofit) v!linen kiertokulku.

telun sijaan sivat 1950-luvulla etualalle eri trofiata- sojen toiminnan tutkimustavat. Steemann-Nielsenin (1952)

s perustuot

kykeni antamaan t aut

een johtanut rnenetelma en levien aineenvaihdunnan isuudesta. Vuonna 1956 Ohle esitti uudeksi vesistojen luokittelukriteeriksi dynaamista kas a bioaktiivisuus:

"Biosysteemin spesif bioaktiivisuus on sen kapa- siteetti muodostaa entiaalienergiaa ja muuntaa tata kineettiseksi i, aika- ja tilavuus-

(tai p ala)

KUVA 3.

sen ,, ... "' ...

tuotanto- ja hajotustoimin- taan.

ikkoa kohti".

KUORMITUS

-o- ~'/

/'"'

0

FOTOAUTOTROFIT

(levat)

BIOAKTI

HAJOTUS (resp _{' R)}

(produkt , P) +

essa tarkastelutavassa vesistoa kas ellaan " s- isesti organismina", jonka a a

aineenvaihdunnan yks

3.2.7)

Yks val so mall a

en

isin t

t

sa ( vrt. J 0

est ves ton b aktiivisuutta on tuotanto- ja hajotustasoja kuvaavat

ja jattaa huomiotta muilla trofiata- tuotanto ja res io. Jokaisella siirty-

asolta toiselle noin 10 % l een muotoon sitoutuneesta energiasta jatkaa kulkeu- tumista ravintoketjussa (Odum 1971). Nain ollen vesistojen b satuotannossa ja iden kierroissa merkittavin osuus on tasojen

on eko sen

illa, joiden toiminnan seuraaminen

~J~~w~".wen kannalta keskeista.

Vakiintunut stuotanto~etodologia tarjoaa yksinkertaisen ja tarkan tavan veden en tuotannon mittaa- miseen. Vastaavaa jotustoiminnan tutkimusmenetelmaa ei toist

reett

i ole

heterotrofisen bakteer

l

ten

saatu suhteellisen

kehittamaan, johtuu seka teo- 1 ista vaikeuksista. Vesiston oiminnan tutkimus on talla hetkella nopistealue, ja erailla radioaktiivis-

tuvil menetelmilla on

2.2 TUTKIMUSMENETELMISTA

2.2.1 Suorat ja epasuorat menetelmat selv

systeemin kokona~sakti

kuva bakteerien o sta rossa. Tutkimusmenetelmil

vesiston bakteeritoimintaa eko- kannalta, on keske ta saada iden (etenkin hiilen) kier- asettuu kaksi vaatimusta:

menetelman on oltava s s ei bakteer lle ( menetelman on kyettava

sen to kvant i

hajotustiedot s

eereille, mutta approach)

bakteeripopu- ihdunnan nopeutta)

illa, j olloin lisiksi tuotanto- t jen kanssa esim. hiilen )

.

Tall a lla ettavista tutk e sta ei ilrne

sesti kannalta tyydyttavasti naita

ede

.

^{Use joudutaan}

bakteerien akti uutta otustoirnintaa kahdella tavalla: suorilla ja

vain yleisesti Ja.

aan tutkia periaatteessa rnenetelmilla.

Suorat toiminnan mittaukset kohdistuvat joko solunsisaisten aineenvaihduntatapahtumien valijas tai aineenvaihdunnan alku- tai eisiin ( aisiin tai ulkopuolisiin).

Epasuorat mittaukset kohd tuvat populaation tilaa kuvaaviin parametreihin kuten yksilolukurnaaraan t biomassaan. Naiden lis 1 on kehitetty er s orityyppis rnene- telmia, jo a osa edustaa eraanlaista valiastetta suor1en

ja epasuorien

.

menete~H,,~~~~

Epasuorien rnittausten (tilapararne rnoirnaan to aa lla

en) avulla ei kyeta esti- e la. Mikroskopoirnalla pys a an essa erottamaan toisistaan kuol- leet J e solut. Astetta tietoa tarjoaa

1 9 7 6) , j onka

( Ja

avulla saadaan sel lle t 1n suhteen aktiivi- sesti toimivien solujen . Sarnantapaista tiedon tasoa edustaa es . Hagstrornin (197 ) esittama jakautuvien solujen maara populaation kas ina. Nama rnenetelrnat ovat toi- minnan suhteen kvalitatiivisia: tuloksena on solurnaaria, ei

varsinais to re a )

.

ke e s populaa- tion b isuutta. Paras tal in en indikaattori

on a ATP (ad enos s t i

'

^j on univer- solun komponentti ATP on lisaksi suorassa suh-

teessa solun iaan, joten sen antaa

est a t ilasta.

kvant en kuvan

Tamakaan ei ole suoraan muunnettavissa aineiden kier-

ron ellis i l .

een verrannoll t solu-

mittauks la. Bakteerisolun aineenvaih- dunta on

ta on t t

an

koko ketjun to

antaa kuvan koko tulee kysymykseen

merkki t sen soluns soveltuvuudesta

en elektronins

en en verkosto. S lisen autonomisia reak-

ketjujen ak- , j os kyetaan

{rate-1

emaan reak- ). Taman

osapuolen elevan ion

ketjun toiminnasta. Tavallisesti jonkin entsyymin analyysi. Es aisen envaihdunnan mittauksen bakteeripopulaatioihin on respirato-

un iivisuuden entsymaattinen maaritys (ETS-akti isuus, Packard 1971).

l kiertokulkuun liittyvaa tietoa saadaan tietenkin seuraamalla mu~toksia populaat aineenvaihdunnan

ja lopputuott

ismien sella hiilidioksid

sa. is

il

menetelmia ovat

joko

stumisella pimeasitoutuminen (Kuznetsov ja 1966)

muiden 1

Hapenmaar

on herkkyys. Viime a metod

seuraamaan s

en substraatt oton seuraaminen

stuvan menetelman kriittinen tekija on kehitet ssisen Winkler-

' j 0 kyetaan ilmeisesti

iden aiheuttamia

tgnen 1979). Hiilidioksid rnu n uusirnrnallak ana l lla ( 19 9)

rnanipulo la (hiilidioksid sa vesissa tapahtuvaa vo

poi oa) sta bakteer

urata va

teen rnakei - (es sedirnentin ja vesifaas raJa

rnenetelrnat perustuvat radioakt toon.

2.2.2 Radioaktiivisten

itut a Piden

to

hajotustoirninnan nopeutta vo aan seurata yksin- kertaisesti rnittaarnalla hajotettavan yhdisteen p oisuuden rnuutoks teessa. Kun luonnonvesien bakteeri-

aat en to aa, ste tulisi rnuuttaa.luon- nont

si

aa rnahdollis~ ... ~A· vahan, jotta saatuja tuloksia voita kayttaa vesist sa vall sevan to est tina.

Taman takia bakteerien kaytt straattien 1 aaminen naytteeseen kemiallisen vakioanalyti vaatirnina pitoisuuk- sina ei ole tavallisesti mahdollista. Luonnonpopulaatioiden substraattien ottoa tutkitaankin lahes yksinornaan radioakt isesti rnerkittyjen yhd eiden avulla. Naita voi- daan lisata naytteeseen jopa

pienempina pitoisuuksina (tracer isotooppiteknisesti mitattavissa

avasti luonnonpitoisuutta level), jotka ovat kuitenkin

(jopa 10 -11 M).

Radioakt isten otooppileimojen avulla voidaan rnitata periaatteessa minka substraat ottoa tahansa. Menetelrna on lyhyesti seuraava: vesinaytetta inkuboidaan .rnaaraaika radio- aktiivisesti merkityn substraatin lisayksen jalkeen, nayte suodatetaan suodatinkalvolle ja sen radioaktiivisuus rnita- taan. Lisatyn ja mitatun akti isuuden suhde kuvaa nopeutta, J la kyseinen substraatti siirtyy naytevedesta biornassaan

(jaksossa 3.2.3 esitellaan myos organismien respiroiman substraatin mittausmenetelma).

Radioaktiivisten merkkia en la saatuja bakteerien

eenvaihdunnan iivisuut re a on myos

esim. mikro yhd

lukuina (kts. Wr

maaritettyyn solumaaraan - ja kaytetty eer t kuvaavina indeks

2 .. 2. 3 in ongelma

Kun oton s

n

voi

heterotrof a bakt

teoreettisi

substraatin etta kaytannoll iin. Het on maar elman mukaan orgaa-

kayttamista hi enlahteena. Yksittainen

a a

ilenlahteenaan use orgaanisia eita, ja heterogeenisen yhteison tapauksessa hiil lahteiden maara moninkertaistuu. Yhden substraatin oton mit- taus ei s voi antaa kattavaa kuvaa koko heterotrofisesta

. Jos pyr t si mittaamaan koko hetero- eeripopu ion kautta kulkeva hiilivirta,

j 1 eeseen lisaamaan kaytannossa mahdoton maara radioaktiiv esti merkittyja substraatteja.

teoreett on pyritty k amaan maarittamalla t en substraatt ^o~uutta organismien koko hiilen otos- ta. Sorokin (1965) ^Sl, heterotrofisetkin baktee- rit ottavat osan tarvitsemastaan hi sta (aerobisissa olois- sa 3 ... 5 %) hi

muunsivat rad et h

(6

%).

Myohemmat vakiosuhteen

sidina. Kuznetsov ja Romanenko (1966) isen h idioksidin C14

co

₂) oton mittaus-

isotoksi amalla vakiokerrointa

~·~~w.~stulokset ovat ku enkin osoittaneet eenalais i (Overbeck 1972, 1979).

Monheimer (1974, 1975) esitti yksittaisten hiiliyhdisteiden kayton s aan rad en faat ( 35 SOq ) ottoa hetero-

en akt in otolla (

en mitaksi. Perusteena oli oletus rikin eesta orgaanisessa a

sa oloissa) vo

ssa, jolloin sul- siin suoraan las- kokona en otto. Myos tama kerroinmenetelma on osoit- tautunut epavarmaksi (Monheimer 1978, Jordan ja Peterson 1978).

Tavall immin ta hi en ottoa on mitattu yks taisilla orgaanis la yhd la (tai naiden seoks la),

jotka on val semaan s man an bakteer

set ovat talloin suhteell h

en, etta ne ovat mahdollisim- lta kayttokelpois . Tulok-

isottoon

Substraatin ongelmaan palataan es en tutkimustulosten val ossa jaksossa .4.

2.4.4 Entsyymikineett ana Eraaksi heterotrofisen bakteer on usein kutsuttu "entsyymik

l on itse asiassa

si

tutkimusmenetelmaksi a menete . Entsyymi-

radioaktiivisten ien kayton mittaustu en, etta lopputulok- sena on en alta laskettuja, uuden tason parametreja.

antamaan esti elekkaita tulkintoj a, j a on kas e ista toimintaa kuvaav tunnuslukuina. Entsyymikineti perusteita ja

lutuks tarkastellaan lahemmin luvussa 3.

2. 2 • 5 sa menete

Tassa tyossa esiteltava kokeell aineisto on hankittu onsin ja Stricklandin (1962) es t radioaktiivise~

traat kayt perustuvan menet sovellutuksella~

Alkuperaisen 'menetelman per ^e on ¹⁴

c-1

glukoosin lisaaminen useana pitoisuutena vesinaytteeseen, inkubointi, suodatus s suodatinkalvojen radioaktiivisuuden mittaus.

] a sen (1973) kaytt l en hiilen

s asta '3H-le traatteja.

Vesinayte noudettiin 2 6 .1.0 .1 97 8 Kaskisten edustan merialueel- ta, i 6 ometr ulo sta saaresta lapalle pain.

Naytteenot la veden lampot oli +4,6°C, luoteis- oli no 10 metr sekunnissa ja taivas oli pilveton.

Nayte nostettiin Ruttner-noutimella kokoomanaytteena valilta 0 - 2,5 metria ( 0 - 0,5- 1

,o-

1,5- 2,0- 2,5 metria). Vesi- naytetta sailytetti yli yon inkubointikaapissa, j oli

8 + C.een

(Rad , Amersharn), jonka aktiivisuus oli 22,5 C sesta p isuudesta (0,978 rnCi/rnl) valrnistettiin t lattuun veteen la s I (4,89 pCi/rnl,

0,039 la s II (0,611 pCi/rnl,

0,0049 ~g glukoos ja autoklavo l

absoluutt et akt isuudet t i

l lasiarnpulleihin siliuosten nestetu askirnella (Wallac Ultra-Beta). ikej ja sen laskentatehok-

eessa 1 . kuuden rnaaritys on es etty l i

Rad en glukoosin lisaksi valrnistettiin inaktiivi- sesta D- ista (AnalaR, reagent) tislattuun veteen juuri ennen kaytt kaksi 1 sta, joiden glukoosi-

ol 0,32 rng/1 ]a 3,2 rng/1.

50

valrnistett

lis iin 100 rnl:n lasipulloissa oleviin e l 26 eri p oisuutena, joista kustakin lrne rinnakka naytetta s nk. sokea nayte, johon lisattiin 0,5 rnl iinia (35 %) ennen glukoosi- l aysten a euttarna e glukoosipitoisuuk- s nousu vaihteli val _a 0,005 . . . 22,6 ~g/1. Liitteessa 2 on esitetty eri glukoosiliuosten kaytto ja lopullisten glu- koosipitoisuuks

Inkubointi suor nuutt (- 2 +

rnuodosturninen.

etti ~irneassa, inkubo ika oli 120 rnl- ia) ja l +5°C. Naytepullot oli esijaahdytetty inkubointilarnpotilaan ennen naytteiden annos- te (j t 50 :n ki ipet kasin ravistele- mall a

1000 v

s tus

HA-suodat i

evedesta) ja osilisaysta.

e (50 ... 250 Jll ja 200 . . . ja inkubo ika laskettiin alkavaksi radioaktii-

ett kuhunkin naytepulloon -

ottarnatta- 0,5 rnl forrnaliinia (35 %). Suoda- heti, ja se suoritettiin 0,45 urn Miilipore i e. Naytteen suodatuksen jalkeen naytepullo 2 x 1 :1 t vetta, J rnyos suoda-

tettiin kalvon lapi. Kalvot siirrettiin tyhjiin nestetuike- pulloihin, joissa ne saivat kuivua ennen jatkotoimenpiteita.

Suodat jen radioaktiivisuus atti em. nestetuike- laskimella (tuikej estelma l i ssa 1). Mittaustulokset

(cpm =counts per minute) muutettiin laskentatehokkuuskayran avulla absoluuttisiksi dpm-arvo i (d integrations per minute, hajoamista minuutissa).

Kalvojen iivisuusmittauksella oletettiin saatavan selville heterotrofisten bakteerien ass ima radioaktiivisen glu- koosin maara. Koska vesinaytteen esisuodatusta ei suoritettu, myos muiden organismien glukoos otto tai epaorgaanisten partikkele en absorptio saatto vaikuttaa tuloksiin.

Wright ja Hobb (1966)ovat ku todenneet, etta alle 300 pg/l:n isuuks levat e kykene tehokkaaseen

glukoosin ottoon.Williams (1970), Allen (1971), Berman (1975), Gocke (1975) seka Azam ja Hodson (1977) ovat tutkineet eri suodatusfrakt iden osuutta glukoosiotosta, ja todenneet, etta valtaosa tasta tapahtuu organismien kokoluokassa, joka vastaa bakteer olujen kokoa. Nain allen myos taman tutki- muksen glukoosin oton voidaan olettaa tapahtuneen paaasiassa heterotrofist~n bakteerien toimesta.

Mittauks la todettua glukoosin ottoa kasitellaan seuraa- vissa jaksoissa seka entsyymikinetiikkaan etta muihin ana- lyysitapoihin nojautuen.

3.

ENTSYYMIKINETilKKA

3.1

MATEMAATTISET PERUSTEET 1 )

3. 1 • 1 Populaatiodynamiikkaa

Mikrobien populaatiodynamiikkaa on kuvattu useilla matemaat- tisilla esitystavoilla. Tavallisesti kaytettyja ovat mm.

Langmuirin abso~ptioisometrina tai Michaelis-Menten~entsyymi­

kineettisena lausekkeena tunnettu yhtalo

( 1 ) v

= v

_max

s

K

+

S

jossa v

=

nopeus (otto-, kasvu~

rajoittRvan substraatin pitoisuudessa S

V

max

=

rnaksimaalinen nopeus K

=

vakio

seka yleinen logistinen kasvuyhtalo

(2)

3.£:

dt

p · K

1 (1 - K

2 • p), jossa p

=

populaatio

=

vakioita.

K1 ,K2

Langmuirin absorptioisotermi on fysikaalisen kemian,

Michaelis-Menten-entsyymikinetiikka biokemian kasitteistoon pohjautuvia lausekkeita. Yhtaloa 1 on tasta huolimatta ylei-

.

sesti sovellettu myos biologisten tapahtumien analyysiin.

Vasta Caperon (1967) esitti teoreettisesti yhtenaisen perus- tan yhtal6iden 1 ja 2 kaytolle biologisina kasvumalleina.

Caperon myos rajaa synteesinsa ennakko-oletuksilla mallien kayttoedellytykset.

Caperon esittaa mikro-organisrnin ravinnon oton kaksiportai- sena prosess : organisrnin absorptiopaikalla (absorption site) tapahtuva kompleksinmuodostus on ensimmainen vaihe, ja toisessa vaiheessa absorptiopaikka vapautuu jalleen uutta 1) Tassa jaksossa on pyritty kayttamaan rratemaattisia symboleita yhden-

mukaisesti, joten esitetyt syrnbolit poikkeavat osittain alkuperais- lahteissa esiintyvista, samansisdltoisista syrnboleista.

kompleksimuodostusta varten ("ravintd' on kasitettava laajasti sisaltaen joko hiukkas- tai sateilymuodossa olevia kasvuteki- joita):

( 3)

~ k

^{C +} P, j ossa C

=

absorptiopaikka

B =

ravintohiukkanen P

=

organismiin siirty-

nyt ravintohiukkanen Kutakin reaktioyhtalon nuolta vastaa reaktiovakio k. Vakioi- den avulla voidaan muodostaa kunkin osareaktion reaktioyhta- lot. Tahan asti kasittely on matemaattisesti analogista ta- vallisen entsymaattisen reaktiokinetiikan kannssa (vrt.

Lehninger 1975). Caperonin ennakko-oletukset kuitenkin suh- teuttavat biologisen kasvumallin klassiseen. entsyymikinetiik- kaan:

a)

b)

c)

d)

e)

f)

vain yksi kasvutekija kerrallaan toimii minimiteki- jana

tietty ravintomaara johtaa kasvunopeudesta riippu- matta yhta suuren organismimaaran tuotantoon

kasvlinopeuden reaktiossa ravintopitoisuuden muutok- siin ei ole viivetta

kerran absorptiopaikalla sidottu ravinto ei merkit- tavassa maarin palaudu ymparistoon

tasa.painotila d ( C ·B) = 0 saavutetaan nopeasti dt

suhteessa muutoksiin ravintopitoisuudessa ja popu- laation koossa

ravinto ja organismit ovat jakailluneet ymparistoonsa satunnaisesti

Oletus d) ilmaisee, etta yhtalon 3 vakiot suhtautuvat toi- siinsa:

(4) ja/tai

Entsyymikineti suhteen oletus on ilme esti liian rajoit- tava, ko reakt

( 5) C + B C • B

on reversiibeli. Caperonin mukaan oletus on kuitenkin pateva useimmille b sille reaktioketjuille. Tama onkin hyvak-

sa: painvastainen tila merkitsisi organismin toimin- nan "purkautumista", joka johtaisi valittomaan menehtymiseen.

Yhtalon 3 os pohjalta

alan:

( 6)

=

^r

.

ioyhtalo en seka ennakko-oletusten (a-f) suoraan johtaa yle en kasvumallinsa

s

_jossa

populaatio p

=

D +

s

_{t aika}

=

s ₌

kasvutekijan pitoi- suus

r,D

=

^vakioita

Matemaattisesti yhtalo 6 on analoginen Michaelis-Menten- entsyymikineettisen yhtalon 1 kanssa. Caperon voi kuitenkin todistaa vakioidensa (r ja D) koostuvan seuraavista biologi- sista perusominaisuuksista:

( 7) D

= -

_k1 ^{jossa k3 ja k1} ovat yhtalon (3) vakioita k ·c

3 0

r

=

( 8) jossa k3

=

yhtalon ( 3 ) vakio

q•n c In

=

yksilon absorptiopaikkojen

0 1 km

q

=

uuden yksilon muodostumiseen tarvittava ravinnon maar a Caperon o logistinen kasvuyhtalo (2) on yleisen kasvumallin eriko s t ilanteessa k3

>>

k1 , ts. organismin ravinnon oton minimitekijana on yhtalon 3 ensimmainen vaihe eli ravinnon saattaminen absorptiopaikalle (vakiot ovat tul- kittavissa asti, k

1 seka aktiivisena etta passiivisena

ravinnon hankintana, K

3 absorptiopaikan vapautumisena entsy- maattisesti tai pureskelun, nielemisen ym. ravinnonkasittely- prosessien kuvaajana).

Caperonin kasvumalli eroaa seka Michaelis-Menten-entsyymi- kinetiikasta etta yleisesta logistisesta kasvuyhtalosta myos siina, etta se ottaa toisella yhtalolla huomioon populaation kasvun aiheuttamat ymparistomuutokset (tassa tapauksessa muutokset ravintopitoisuudessa). Suljetussa systeemissa mal- lin toinen yhtalo saa yksinkertaisen muodon:

( 9)

dt

=

^dS

dt

Caperonin esittama biologinen kasvumalli antaa hyvan taustan Michaelis-Menten-entsyymikinetiikkaa hyodyntaneiden tutkimus- ten tarkasteluun. Ainakin seuraavat nakokohdat on syyta ottaa huomioon:

(I) Caperonin ennakko-oletukset sisaltavat ekologisia implikaatioi ta, j oiden tayttyminen luonnonpopulaatio- tutklmuksissa on usein kyseenalaista. Erityisesti oletus ravinnon ja organismien satunnaisesta jakau- tumisesta ymparistoonsa voi olla kriittinen.

(II) Caperonin biologinen tulkinta kasvuyhtalon vakioista r ja

D

(jotka vastaavat Michaelis-Menten-kinetiikan vakioita

V

max ja

K)

antaa naille tasmallisen ekolo- gisen (adaptiivisen) rnerkityksen. Organisrni (tai populaatio) voi kiihdyttaa ravinnon ottoaan peri- aatteessa neljalla tavalla:

- 1 aarnalla adsorptiopaikkojen tehollista kokoa (k1 kasvaa)

- lisaamalla absorptiopaikkojen lukumaaraa yksiloa kohden (c

0 /n kasvaa)

- lisaamalla adsorptiopaikkojen vapautumisnopeutta ( kasva51)

(III)

- pienentamalla reaktiovakioiden k

3 ja k

1 suhdetta (ravinnon ottonopeus v lahestyy vakiota r eli vmax).

Kolmas ekologinen tasmennys liittyy Michaelis-Menten -kinetiikasta puuttuvaan vuorovaikutusyhtal66n

(feedback). Kun tutkittavan kasvutekijan varanto on niukka, organismin (populaation) toiminnan vai- kutus siihen korostuu. Tama voi olla yksi entsyymi- kineettisen analyysin tuloksiin vaikuttava tekija

(vrt. jakso 3.2.2).

Kuten jakson alussa huomautettiin, Michaelis-Menten-entsyymi- kinetiikan itte ja parametrien kaytto vakiintui vesi- mikrobiologiseen tutkimukseen jo ennen lausekkeen biologista perustelua ja kayttoedellytysten selvittamista. Taman joh- dosta tullaan tassakin tyossa kayttamaan seka nimitysta

"entsyymikinetiikka" etta kineettisia perussymboleita

(v, Vmax' K) ja naiden muunnoksia. Esitysta seurattaessa on kuitenkin syyta pitaa mielessa Caperonin esittamat huomiot

ja kineettisten parametrien "todelliset" (biologiset) vasfi- neet (taulukko 2).

TAULUKKO 2. Kineettisten parametrien m~~ritelm~t biologi- sessa kasvumallissa.

Michaelis-Menten-kinetiikka

substraatin ottonopeus substraatin maksimaalinen ottonopeus

puolikyll~stysvakio

v

v _max

K

Caperon (1967).

dp/p·dt

r

=

3.1.2 Michaelis-Menten kinetiikan lineaariset muunnokset Michaelis-Menten-entsyymikineettista lauseketta on bakteeri- populaatiotutkimuksissa kaytetty yleensa muodossa

v' (pg/l·h

o,os

0,04

0,03

0,02

0,01

( 1 ) v

= v

_max

^s

K

+

S

^{jossa v}

v

_max

s

K

=

substraatin otto- nopeus

=

maksimaalinen substraatin otto- nopeus

=

substraatin pitoisuus

=

puolikyllastysvakio 1 ) Yhtalossa esiintyvista tekijoista ottonopeus (v) ja substraa- tin pitoisuus (S) maarataan laboratorioviljelmilla yleensa kokeellisesti. Naiden avulla lasketaan populaatiota luonneh- tivat parametrit V max (maksimaalinen ottonopeus) ja K (puoli- kyllastysvakio).

(15)

- - - o - - _Vmax ^{I ( 17)}

Vmax (l.S >

5 10 15 20

KUVA 4. Kaskjs~en aineistosta laskettu ottonopeuden kyllilstysk~yr~.

KMyr~ vastaa yht~16n 1 perusteell3 muodostuvaa hyperbolaa, mu~ta

ottonopeus on suhteellinen (v', vrt. kuva 19). Ku':'aan on mez;kl.tt~

yhtJH:Hden 1 5, 16 ja 17 avulla lasketut (teoreettlset) maks1.maal1.·

set ottonopeudet.

Yhtalo 1 on hyperbolamuotoa (kuva 4), joten sen kayton hel- pottamiseksi yhtalo on pyritty saattamaan lineaariseen muo- 1) TYossa kaytetaan systemaattisesti Michaelis-Menten-kinetiikan puoli-

k.y llastysvakiosta tat a symbolia, koska sekaannuksen vaaraa ei ole.

Kirjallisuudessa sii ta kaytetaan tavallisesti symbolia K , kun se tahdotaan erottaa rrRlista kineettisista vakioista (kts. illhninger 197 5)

tapaa:

K

.

_v

(V v;s)

(10a) v

= v

_max ^vs.

s

(10b) S/v

=

K/V + ^{s c8/v vs. S)} vmax

max

1 1 K 1 1/S)

( 1 Oc)

- =

vmax +

v

^{. s} ( /v vs ..

v max

Naista yhtaloista viimeista (10c) kutsutaan Lineweawer-Burk -muunnokseksi (tai kaksoiskaanteismuodoksi, double reciprocal

plot), ja se on ollut tavallisimmin kaytossa biokemiallisissa .ja bakteerien laboratorioviljelmien tutkimuksissa (Dowd ja

Riggs 1965, Lehninger 1975). Jo Wilkinson (1961) esitti kui- tenkin tilastollisella tarkastelulla kaksoiskaanteismuodon heikkouksia. Koska mitattavat suureet (v ja S) esiintyvat yhtalossa kaanteismuodossa, erityisesti naiden pienet arvot

(suuret kaanteisarvot) maaraavat voimakkaasti regressiosuo- ran asettumisen. Wilkinson vertaili yhtaloita 10b ja 10 c ja suositteli kaksoiskaantei~muodon hylkaamista.

Dowd ja Riggs (1965) tarkastelivat kaikkia em. lineaarisia muunnoks tietokonesimulaation avulla. Mikali mitattavat suureet olisivat virheettomia, muunnokset olisivat tietenkin samanarvoisia. Normaalissa koejarjestelyssa nimenomaan otto- nopeuden (v) maarityksessa syntyy kuitenkin virheita. Simu- loimalla "kokeisiinsa" eri suuruisia v:n virheita (s

vakiosuuruisia etta v:n mukana muuttuv , ts. vakiosuhteisia)

Dowd ja Riggs osoittivat kaksoiskaanteismuodon olevan merkit-

tavasti mu a heikomman. Etenkin pienilla ottonopeuden ar- voilla syntyvat virheet (pienetkin) vaaristivat suoraa mer- kittavasti.

Paradoksaalisesti kaksoiskaanteismuoto antaa kuitenkin par- haiten pistejoukkoon sopivia suoria (pienin neliosumma), vaikka sen avulla saadut parametrit (V ja K) ovat epaluo-

max

tettavampia. Ilmeisesti tama naennaisyys on osaltaan vaikut- tanut juuri taman muunnokse.n vakiintumiseen. Yhtalo 10 a

(nk. Eadie-Hofsteen-muunnos) varoittaa herkimmin, koska ai- neisto poikkeaa lineaarisuudesta, eli koska entsyymikineetti- nen analyysi kuvaa populaation toimintaa vain likimaarin

(Dowd ja Riggs 1965, Lehninger 1975).

3.1 .3 Sovellutukset luonnonpopulaatiotutkimukseen

Laborator±oviljelmien analysoinnissa kaytetyt entsyymikineet- tiset yhtalot eivat ole suoraan sovellettavissa luonnonpopu- laatiotutkimuksiin. Luonnonvedessa on tavallisesti pieni, tuntematon pitoisuus kaytettavaa substraattia, joten yhtalon 1 pitoisuussymboli S on korjattava muotoon

( 11 ) S

=

Sn + A, jossa sn

=

luonnonveden substraat- tipitoisuus

A

=

kokeessa lisatty pitoi- suus

Yleensa luonnonpitoisuutta on kasiteltava tuntemattomana vakiona.

Maaritelman mukaan ottonopeus (v) on substraatin pitoisuuden ja sen hyodyntamisajan (kiertoaika T) funktio:

( 1 2) v

=

S

+

A

. n

T

jossa T

=

se aika, jossa populaa- tio kayttaa loppuun pitoisuuden (Sn+A)

Kiertoaika T (turnover time) voidaan helposti maarittaa radioaktiivisilla merkkiaineilla, jolloin se saadaan yhta- losta

( 1 3) T

= ^{c .}

_c ^t jossa

c =

naytteeseen lisatty radioaktiivisuus t

=

koeaika

c

=

organismien kokeen aikana kayttama radio- aktiivisuus

Michaelis-Menten-kinetiikkaa vesiston bakteeriplanktonin substraatin oton analyysiin, laskivat substraatin ottonopeu- den johtamalla yhtalot 12 ja 13 muotoon

(14) v = ^{c . f} ·<Sn+A~ jos·sa f

=

c

t

isotooppihylkimisvakio (1 ,05)

Lisattyaan radioaktiivisesti merkittya substraattia ositel- tuun vesinaytteeseen useana pitoisuutena he laskivat myos pitoisuussumman ^(K + S ) eraanlaista kaksoiskaanteismuotoa

n

olevan lineaarisen yhtalon avulla. Wright ja Hobbie (1965, 1966) ottivat kayttoon Lineweawer-Burk-muunnokseksi kutsu- mansa yhtalon

( 1 5) T

=

K

+

S

v---

n max

+

v

A max

(T vs. A)

joka sittemmin vakiintui vesimikrobiologiseen tutkimukseen.

Yhtalon avulla voidaan mittaustulosten (A ja T) pohjalta maarata kineettiset parametrit (y

X = A, y = T)

=

^{a + bx ·}

'

maksimaalinen ottonopeus Vmax =

b

¹ pitoisuussumma K + S

n kineettinen kie~toaika Tk

=

= a

b

a

GraafiBesti parametrien maaraytyminen esitetaan kuvassa 5.

Kuvissa 6 a, 6 b ja 6 c on Kaskisten aineisto esitetty yhta- lon 15 mukaisesti.

T

( h)

A(t9/t)

KUVA 5. Kineettisten paramet- rien m~~r~~minen graafi- sesti.

300

200

100

10 15 20 A (J.lg/1)

T (h)

120 110 100 90

so

70

60

so

ItO

r~

30 20 10

I

A ()lg/1) T (h)

35

30

0,1 0,2 0,3 0,1+ 0;5 0,6 A <pg/1)

KUVAT 6 a, 6 b ja 6 c. Kaakisten aineiston kiertoajat (T) glukoosin lis~yspitcisuuden (A) funktiona. Pystyjanat ilmaisevat kolmen alanaytteen haionnan.

Yhtalo 15 ei ole varsinainen Lineweawer-Burk muunnos, vaan muistuttaa muunnosta 10 b, johon sijo etaan yhtalot 11 ja 12.

Muita muunnoks

( 1 6) A

T

= ^v

_max

iotutkimukseen soveltuvia lineaarisia

K

+

S

n T

(A/T vs. 1 /T)

joka on muotoa y

=

^{a + bx (x}

=

^{1 IT, y}

josta saadaan:

v

_max = a K + sn = b Tk = ^b;a taman eismuoto

( 1 7) 1 T

=

v

max K+

A (K+S ) ·T

n

(1/T vs. A/T)

. t b ( A;T

=

1 /T),

J on muo oa y

=

a + x ¹

x = ,

y

josta

v

_max

=

K

+

S

_n

=

Koska yhtalon 16 riippuva muuttuja (A/T) voidaan tulkita

ottonopeudeksi (v~, s. 3.2.7), yhtalo muistuttaa laheisesti yhtaloa 10 a (Ead -Hofsteen- ):

( 1 8) v~

=

V max

Kaikkia 1

esittaa is

K

+ T

la muunnoksia (15, 16 ja 17) kohtaan voidaan huomautuksia. Regressiosuoran maaraaminen normaalilla pienimman neliosumman menetelmalla edellyttaa, etta riippumaton muuttuja (x) on virheeton (kts. esim Sokal

ja Rohlf 1973). Mikaan yhtaloista ei tays tayta tata teo- reettista edellytysta, mutta ilmeisesti yht 15 kohdalla tilanne on turvallisin - yhtalossa 17 taas koko kokeellinen virhe (seka A:n etta T:n maaraamisessa syntyva) rasittaa riippumatonta muuttujaa.

Yhtalo sa 16 ja 17 esiintyy sama tekija (T) yhtalon kummal- lakin puolella, joten X ja y korreloivat vaistamatta jonkin verran keskenaan. Tama sisainen korrelaatio kuitenkin heiken- taa muuttujien A/T ja 1/T valilla'hava korrelaatiota, koska naiden valinen suhde on negatiivinen (vrt. Dowd ja Riggs 1965).

Mitatusta muuttujasta T voidaan myos panna merkille, etta sen esiintyminen kaanteismuodossa merkitsee mitatun suureen (c) esiintymista osoittajassa (yhtalo 13). Taman johdosta Wilkinsonin (1961) ja Dowdin ja Riggsin (1965) esittama kri- tiikki kaanteismuodossa olevien mittaustulosten heikkouksista koskee yhtaloa 15, ei yhtaloita 16 ja 17.

3.1 .4 Parametrien luottamusvalit

Kineettisten parametrien piste-estimaatti ei usein riita sellaisenaan. Vasta tilastollisen luottamusvalin ilmoittami- nen antaa selvan kuvan estimaatin kayttokelpoisuudesta.

Kaikki lineaariset muunnokset (15, 16 ja 17) ovat muotoa y

=

a + bx. Kineettiset parametrit ovat regressioyhtalon va- kioiden a ja b funktioita, joten niiden luottamusvalit laske- taan a:n ja b:n hajontalukujen avulla. Laskuperiaatteet seka yksityiskohtainen menettelyohje on esitetty liitteessa 3.

Koska tavallinen koej estely kineettisten parametrien maa- rittamiseksi on useiden rinnakkaisnaytteiden valmistaminen

sakin substraatin l ayspitoisuudessa, kaavat parametrien luottamusvalien laskemiseksi esitetaan tassa muodossa. Menet- tely perustuu vahaisin muutoksin Haldin (1967) esitykseen,

T (h)

300

200

100

0,02 0,01

1/T (1/h)

·0,02

0,01

muunnoksen (15) mukaisille laskutoimenp eille. Jos kayte- taan yhtaloita 16 tai 17, ei regressiota laskettaessa ole rinnakkaisia, joten laskutoimitukset yksinkertaistuvat.

Eri lineaaristen muunnosten ominaisuuksia tutkittiin Kaskis- ten aineistolla. Kuvissa 7, 8 ja 9 esitetaan aineiston poh-

jalta lasketut lineaariset regressiot (yhtalot 15, 16 ja 17).

Suorien luottamusval on laskettu .lii tteen 3 mukaan.

...

5

0,01

0,01 0,02

y = 39,1 + 16,1·x r = 0,991

'7:'2 = 0,983

10 15 20 A ^()..lg/1)

y = 0,050 - 1,66·x r = - 0,916

r2 = 0,838

0,02

... _{.. .}

0,03 1/T (1/h)

y = 0,028 - O,OSO•x

r = - 0,916

r2 = 0,838

0,03 0,04 A/T (;,1&/l·h)

KUVA 7. Kaskisten aineis- ton lineaarinen reg- ressio (yhtgl~ 15) ja 95 \:n luottamusvali.

KUVA 8. Kaskisten aineis- ton lineaarinen reg- ressio (yhtal~ 16) ja 95 t:n luottamusvgli.

KUVA 9. Kaskisten aineis- ton lineaarinen reg- ressio (yhtal~ 17) ja 95 \:n luottamusvgli.

Kuten kuvista ilmenee, tavallisesti kaytetty regressio (15) vaikuttaa pisteiden sijoittumisen ja regressiosuoran luotta- musvalin peru8teella 8elva8ti muita lineaari8emmalta. Suoran korrelaatiokerroin (r) ja selity8aste Cr2

) ovat selvasti parhaat. Tarka8teltaessa lineaarisuutta F-arvon avulla

Cs2 2;s 1

2, jossa 8

2 on varianssi regressiosuoran ymparilla, 81 varian88i rinnakkai8ten valilla) tama ssio paljastuu kuitenkin erittain merkitsevasti (p

=

0,01) epalineaariseksi.

Vaikka muidenkin regressiosuorien korrelaatiokertoimet vai- kuttavat korkeilta, ne poikkeavat lineaarisuudesta erittain selvasti (F-testia ei nailla voida kuitenkaan suorittaa).

Yhtalo 16 kayttaytyy siis samaan tapaan kuin varsinainen Eadie-Hofsteen muunnos (10 a), joka korostaa ainei8ton poik- keamia lineaarisuude8ta.

Koska korrelaatiokertoimien ja regres8iosuoran la8keminen kahden muuttujan valille on teoreetti8esti peru8teltua vain silloin, kun muuttujat ovat jakautuneet normaalisesti (kts.

Sokal ja Rohlf 1973), tutkittiin, missa maarin laskettujen regressioiden ominaisuudet johtuivat riippumattoman muuttu- jan epatasai8esta jakautumi8e8ta. Kuvi88a 10, 11 Ja 12 esi- tetaan aineistosta ta8avali8esti valitun otok8en avulla la8- ketut regre88i?t· Taulukkoon 3 on keratty seka koko ainei8- tolla etta ta8avalisen otok8en avulla la8ketut kineettiset parametrit (vmax' Tk seka K + Sn)' naiden luottamusvalit ja variaatiokertoimet.

TAULUKKO 3. Koko aineistosta sek~ tasavalisesta ^{( 6} lisayksen) otoksesta la'sketut kineettiset parametrit, ^n~iden 95 % luottamusv~lit ja variaatiokertoimet

(s/x·1oo %) •

Koko aineisto otos

yht~no parametri 95 % s/x• six·

100 % 95 % 100 \

1 5 v 0,062 +

0,002 1 , 5 vmax 0,029 + 0,000 0,4

:: =

max

K+Sn = ^{2 ,4 2 ~ 0,1 9 4,0} K+Sn = ^0,77 ± _{0,02 1 '3}

Tk ^{:: 39,1} :!: _{2,9 3,7 Tk = 26,9} :!: _{0,7 1 '2} 16 v ₌ 0,050 :!: _{0,004 3,9}

vmax = ^0,028 :!: _0,004 6 ,1 max

K+Sn ^:::: 1 '66 :!: _{0 '17 5,2 K+Sn} :::: 0,73 ± _{0 '1 2} 7,9 Tk = ^33,4 ± _{4,3 6,5 Tk =} 26,6 ± 5,6 1 0, 0 17 vmax ^0,056

+ 0 '011 9,7 vmax ^0,030 :!: _{0,004 6,6}

= =

K+Sn ^::: 1 '9 9 :!: _{0,011 8,9} K+Sn = ^0,80 :!: _{0,004 7,9} Tk ^{:: 35,2} :!: _{2,6 3,7} Tk = 2 7 t 1 :!: 1 , 1 1 '9

1/T (1/h)

0,03

0,02

0,01

0,1 0,2

0,01

I' = - r2 = 0

0,002

en

0,004

saadaan samasta isia muunnos erot maal en ot teell l ot

0,3 ^{0,4 A}

y = 0,0275 - 0,732·x - 0,954

= 0,910

0,02 0,03 1/T (1/h)

0,006 0,008 A/T 0ug/l·h)

a er

tosta valitun tasavgli- sen otoksen lineaarinen regressio (yhtalo 5)

ja 95 \:n luottamusvali.

KUVA 11. Kaskisten aineis- tosta valitun tasavali- sen otoksen lineaarinen

<yhtalo 16) luottamusvali.

KUVA 12. Kaskisten aineis- tosta valitun tasavgli- sen otoksen lineaarincn

< .tao 1 7 >

isilla muunnoks

osta toisistaan selvasti poikkea- a. Lis sp isuuksien vahentyessa stuvat. Kuvassa es ettiin jo maksi-

suhde a istosta laskettu suh-

l s . 4 . 3 j a 5 . 1 ) . Var

tiokertoimien tarkastelu oso etta tav lisimrnin kay- tetty ss (15) antoi a tolla luotettavirnp

Varsinaisten isten ( ja

tuloks

K

+ ) osalta tama oli selvaa seka koko a istolla etta een tilanne ei otoksella.

enkaan ollut

t en kiertoajan istaton.

i luotettavirnman k

tuot i koko a istolla s otoksessa variaa- oli sarnaa luokkaa al a 15. Yhtalo 16 ant

et odotetulla tettav...I..HLJH..I...LL

, selvasti yhtaloa 15 he tuloksia.

siot kayt . Kineettiset

1 a 1 5 ' j 0 s sa I¹

siis suurin piirtein maaraytyivat luo- ja riippurnattornan

rnuuttujan o kokonais hairitsevia

s ia korrelaat . Yhtalo 6 i selvasti herkirnrnin suude ta, ja tuottaa epa- imp (1 isia) pararnetreja. Kaytannon tutki- rnuks sa kayttokelpoisirnrnalta va s s yhtalo 15, mikali pyritaan maaraamaan k ettiset parametrit.

Kiertoaika voidaan maarittaa yhta luotettavasti rnyos yhta- lol 17. Ku enkin on tahdelli silmalla aineiston poikkeamia lineaarisuudesta, koska entsyymikinetiikan kaytto- kelpoisuus on tahan sidoksissa. isuutta voidaan kont- rolloida kayttamalla yhtaloa 16, mutta kaytannollisemmin las- kemalla yhtaloa 15 vastaava F-arvo. Jotkut tutkijat ovat seuranneet lineaarisuutta vain korrelaatiokertoimen avulla, mutta kuten tamakin aineisto osoitti, korrelaatiokerroin ei kuvaa lineaarisuutta riittavan tarkasti, etenkaan joo aineisto on jakautunut epatasaisesti.

3 2

3 • 2 •

(1967)

- b

1 -Menten-entsyymikineti soveltaminen b sten iin

steli ja et. Tutkimu

ista analyys

i jo ennen ku

isen b en soveltamisen ol kuitenkin osoittaneet, kayttaen isto saatiin usein jarkevaan muotoon. saalta julkistettiin myos eja, J "kumoavan" entsyymik iikan ves tee-

een kaytettavana teoreettisena tyokaluna (Vaccaro ja Jannas 1967, ym. 968, Hamilton ja

slan 1970, 1975). Taman a naennaisen rist

s sijo is-Menten-

ja biologinen kasvumalli yhteyks a, een tarkast onsa kanssa.

1 -Menten-entsyymikinetiikan teoria perustui biokemial- 1 en tason t joihin. rajallisen maaran

entsyymimolekyyleja, jotk.a val avat biokemiallista reaktio- ta (kuva 13). Kun reaktion alkujasenet varaavat useamp

entsyymipaikkoja kuin loppujasenilta vapautuu, entsyymisys- lahestyy kyllastymispistetta, ja kun tama saavutetaan,

.

jokainen entsyymimolekyyli taydella kapasiteet la, ts. alkujasen kiinnittaa sen heti loppujasenen irtautuessa.

sovellettiin val nen nahti

ja sen entsymaattis otto a

avul muodostettua kineti ilotason b . Yks

ena entsyymipaikkojen kokoelmana, ita, kuten aktiivista ravinnon

l , steltiin kinetiikan valossa

( s. Cohen a Monad 1957, Pardee 1968). Tarkastelutason muutos i iivinen, mutta et osoittavat, ettei s tee entsyymikineettista mallia patemattomaksi.

Monod (1942 1949) kaytti ensimmais

t aation to

lis-Menten-kine-

i .

Jos

solut to enttisesti, muutos solus-

ta kvant at lasku on

to mikali so jen lu- Ja

iovaikutukset jattaa myohemmin sis ¹ kasvumalli a).

pahtuukin vasta ettaessa b nytta ja b stelunsa s

en bakteeriyhteison o koostuu avoiltaan kuten luonnossa a1na on as

TARKASTELUTASO

BIOKEI'IIA

"''iKSILOBIOLOGIA"

l

"POPULAATIO- IHO!..OGIA"

EliOLOGII>r

KOKONAISRI:AKTIO

v" VMx - 5

s + )( -

s +

V m ?

a

(minka Caperon murros ta- sta alun perin synty-

saanutta teoriaa asti - ts. kun ta mikrobeista,

KUVA 13. Substraatin otto- nopeuden ongelma eri tarkastelutasoilla.

Onkin syyta kysya, on odottaa entsyymikine- tiikan heterogeenisen iyhteison toimintaa.

i puol llastysvakio (K) ja maksimaalinen ottonopeus (Vmax) ovat lajikohtaisia suur•eita, tuntemattomissa suhteis-

i

s

ent

een e- kuvaav

joi s pa-

l

1

traat

eet en k

en aat -akse-

1 le ( ala 10 b) ei vastaa bakteere ellista

t la substraat ella

teor

emaattisesti samaan suuntaan - saatu arvo on odellisen

s lasketaan eri alas

2

sest onnasta.

lvast C oisuus

teor ennustama

A

suuruus tama uora kaartuu tavalla.

KUVA 15. Kaskisten aineistosta eri pitoisuusvaleilta (I-III) lasketut lineaari-

set tukevat

Williamsin (1973) teoriaa.

o

noudattaa ¹

t aron (1969)

en lla

Vaccaron a Janna een s

soveltuvuutta, e

he ta

l

t

s

lis

l

e ema

sel joko populaatioiden

kierrolla ( 969) tulosten kineettisen analyysin

. Toimenpiteet diversiteettia,

sen selitys-

vi taa myos to een

l -Ment 11-

e e l e ora an a a tavalli est

erottelu on

sesta

K:n

maar tahan

a.

.

aa. Yhtalon rnuotoon, koska

est a

summa a ⁽ + ^{) lo llo}

( s

.

b svurna l

esti (ei ent

sa joutuu est"-

varmasti uuri

Kuznets Ja ^{9 7 9) •}

antaa l l

ossa

las

to a tarkastellaan ekolo ses-

ssa sarnan s straat e voi la

e oissa.

suuresti ' J

e ei

t

s j s

c

s ent

a

s

et

er

s

1 en

i

an-

) totesi

w

1

la odot- en

ottoa iden

osuu-

j

sevat

ltava ^l

a

hyvinkin samansuun- rnm. solun-

)

Kas

t v

ent ton

en lis

s s e

sess

ent

jonta 1

j a s

rrun.

nel juuren

i

isuu.- 5 /1, jalta es

-Menten-ent tiseksi

la s straat sa tun- ei eudu

l

et ta straa-

ss en standardi-

osuus est a

vastaavat ottamatta) esti

)

) menet es

enk (p ettavana

essa ens

ja s s

10 000

essa

luonnon mikroplank-

1 en

i t i vesiekolo-

t otossaan

neen

ja

(

1975).

ent

jossa

s olevaan etano a

i a

(1969) menet ja

on

traa-

en avul-

en t i

i liuoksen essa

otto saat iivisuus.

las-

ln muunnoks etty luku jalkeenkin on es

sa ei sovellu luonnon- i (esim. Overbeck ett et" tulokset on saatu oligo- sa vesistois a (mm. valtamer sa), Ja on j esi-

isten

t soveltuisi

ves

l

s ja ent use es ja

man

ss suhde

lSUUS

en

e e

a van

1969).

lis sten ja

a ' jo okelpoisen

sessa Parsonsin iin tuntematto-

ssa vo 20) A>>

nostettu

sesti s s

suoraan

A ^1'"'1 A A

~ + r--.- ~ vrv ~

T

la saadut et antavat t oa luonnon-

isesta est a eisen

usealla luokalla luonnont lsuus VOl muuttaa rad ist

l

oja traattil

(tracer level), seva

et

vo

oleell

3 . .

a:

H-lelmattu]en

a ^e

suuksina (tarkem- avasti luonnonp

olettaa, ett avasti sta (kts. 4.1).

tu sten ent i antaa si

ista.

t t avulla s ei ole

kelpo j

j

neett en

todellis a

erot rad isten merkkiaineiden tu sten .suhteen: i subs lisays

i nostanut naytteen pitoisuutta, tulokset aen luonnollista mikrobitoimintaa; muutoin

koej este perusteella ja kuvaavat

lS - tulosten

sti sidoksissa koe- eat entsyymikinetiikkaa evasti muuttanut

j jeste lla, smien elinolosuhte ). Seuraavassa tarkastellaan la-

asojen vaikutuks entsyymiki- tu i

3 2 5

as aks

een

traat lis

tulosten ent

todetaan,

a an

en

iss a

is sa.

kokeessa substraat kiertoaika

pienimpaan

nen,

0

s

nen le

en

an ja lis

oa on

seka tra- toman muuttujan vaih-

hajonnasta.

lineaari- esti. Mutta kuten

substraatt sta vaikuttavat luotettavuuteen.

pitoisuuden staan suh-

en vaikutus ekstra- selvasti . Suhteelliset saadaan

muuttujan arvot traatti-

' joten eellisen regression

Esitys eessa saman-

ym. 1976), mutta . (1976, 1977)

X t

s ^{Lt )}

samaan 1 en ss perus-

, 0 0 ) , j oten lahtotason teet ovat suhd

s

een

keminen on alai- on teoreetti- a ilmenee suht lisen

Regressioiden ja y-akselin

j ' J kineett

las-

Kuvassa s en, s

vast

6 a-c 1 5) •

l s

OS ta

( 73 eor

en a j

s

l

is est

.

^Kuten

l hava

tolle perustuv tu is ssarjan

ss

suu-

a

suu-

kuvassa eel-

OS ta 1 5

et vastaavat teoreett s- p

teoreett

l alueelta (80 x eluku 5 oisuuksilla laskettuun

) l

( 6 5' ) , j oka

tolla saatavasta ( h, vrt. s

KUVA 17. Sarnaan teoreettiseen li- neaariseen regressioon perustu- via suhteellisia ioita,

on laskettu 8 vaihtelevilta soilta lahtien.

ilrnaisevat kineettisen kierto- osuuden laht~tason kierto-

KUVA 18. Kaskisten aineistolle suhteellisia sioita, on laskettu

vastaavilta ta.

Kuvat 7 J 18 oso miten lo lyh nen j

s issa

poik- pro- vir he

kineet- sidoks sa samansuunta esti. Kun

t sesti, est on si

substraattil en tasoon

te

vuus si

rus

a P

^p

saatu, s a on nan

i on

Jos kineett

) on tavall kaytetyn 1

ettisen

suoraan s

s

substraatt analyysil

ssiokertoimen kaan- in luotetta- hajonnan pe-

teet suoran maaraamiseen maaraytyy (vrt.

matemaattisen ilmion 1 toimintaa (V )

max arvoja silloin, tilannetta, ts.

isuutta.

ittamaan maksimaa- linen

van

s, suurimpien lis sten on si oltava riitta-

1 luonnontason suh-

teen. Tama on use johtanut 1 ays isuuksien epatasaiseen s 0 1 en pitoisuusalueel . Jos yksi pitoisuus on muita selvasti suurempl, se maaraa suhteettoman voimakkaasti

re ^{. 1} staa muuttuj

laat imen

isilla muuttujien jakaumilla, Sokal ]a Rohlf 1973). a imatta se ei joh-

tulosten sa- vo t i vain yhden en

Substraatt isaysten tason val riippuu si haluttavista

ta. e en seka kierto-

am a Ho en 3

i tr le

l

s 1

vastaavi

s s

j

Ves

maan ta

( s

s. 1

s lta (kts. 4. )

l

s

. . k . 3 SUUden maar Se Sl.

on i 40-kerta verrattuna essa saavute-

s (

en 1 5 ••• 2 0

verrattuna, jotta

luonnontasol on

llista ol

jat ovat satoja tuja straat- 1 9 7 , Diet z ym •

H-

jen

en joustavaan koej 3

ja

isesti

l et-