PROTOPLASTIEN OTTAMA KOKONAISRADIOAKTIIVISUUS
5. TULOSTEN TARKASTELU
5.1. Solujen makromolekyylisynteesit
Saadut tulokset vastaavat aikaisemmin eri solususpensioilla tehtyjen tutkimusten tuloksia. Birt ja Hird (1958) havaitsivat, että leimauksen alussa kasvatusalustan radioaktiivisuus vähenee nopeasti• He osoittivat, että osa radioaktiivisista aminohapoista tarttuu solun pintaan. Makromole- kyylisynteesien käynnistyminen ennen kiihtyvää kasvuvaihetta aiheuttaa myös kasvatusalustan radioaktiivisuuden nopean vähenemisen Short et ai.: n (1969) mukaan. He havaitsivat, että solujen DNA replikoitu! sekä solujen jakautu
misessa tarvittavat entsyymit ja rakenneproteiinit syntetoituivat ennen kiihtyvää kasvuvaihetta.
von Borstel (1983) tutki Lupinus hartwegii-solususpension suhteellisia DNA-, RNA- ja proteiinisynteesinopeuksia. Ne lisääntyivät keskimäärin 10 % neljännen ja kuudennen kasvatuspäivän aikana. Käytetyt määritysmenetelmät perustuivat kuitenkin homogenoituun solumateriaaliin. Jo aikaisemmin
Smillie ja Krotkov (1961) olivat korostaneet, että tällaiset arvot kuvaavat homogenaatin eivätkä kokonaisten solujen makromolekyyleihin liittynyttä radioaktiivisuutta. Fraser ja Loening (1974) olivat lisäksi havainneet, että homogenointi vähentää tulosten luotettavuutta.
5.2. Taimien makromolekyylisynteesit
Mikrobiologinen kontaminaatio oli ongelmana taimien makromolekyylisyntee
sien seurannassa. Veniksen (1967) mukaan antibioottien lisääminen kasva
tusalustoihin olisi voinut estää mikro-organismien kasvun ilman, että taimien kasvu olisi häiriintynyt.
Taimien radioaktiivisuusmääritykset perustuivat punnittuun kuiva-ainemää
rään. Punnittu määrä oli pieni (0,3...7,5 mg), koska näytteen oli riitet
tävä 6 rinnakkaismääritykseen. Lumasolve-liuos ei myöskään uuttanut kokonaan suuria kuiva-ainemääriä. Lisäksi näyte oli palanen kuivattua
materiaalia. Näytettä ei jauhettu homogeeniseksi huhmareessa, koska jauhe
mainen näyte tarttui muovisen tuikepullon seinälle staattisen sähkön takia.
Rinnakkaisten näytteiden varsi- ja lehtisolukon määrät siis vaihtelivat.
Mans ja Novelli (1961a) havaitsivat, että kasvavan taimen eri osien aineen- vaihduntanopeudet vaihtelevat. Myöhemmin Kawashiman ja Tämäkin (1967) tutkimukset osoittivat, että myös lehden sijainti vaikuttaa sen kokonais—
radioaktiivisuuteen. Taimien radioaktiivisuuden vaihtelut aiheutuivat punnitusvirheistä, puutteellisesta näytteen liukenemisesta Lumasolve- liuokseen ja värikorjauksen laskennollisista virheistä.
Myös Dickmann ja Gordon (1975) havaitsivat, että makromolekyyleihin liitty
neen radioaktiivisuuden osuus kasvaa, kun taimet vanhenevat. Heidän
mukaansa liukoisten yhdisteiden muuttuminen rakenneyhdisteiksi ja kiihtynyt aineenvaihdunta aiheuttavat osuuden kasvun.
Larson ja Beevers (1965) ruiskuttivat herneen (Pisum sativum var. Alaska) taimen lehtiin leimattua leusiinia, joka liittyi lähes kokonaan proteii
neihin ensimmäisen vuorokauden aikana. Radioaktiivisuus jakaantui lehtiin, juuriin ja versoihin. Osa radioaktiivisuudesta vapautui hiilidioksidina.
Spencer (1973) tutki eri ikäisiä omenan (Pyrus malus L.) lehtiä ja havait
si, että 44...62 % radioaktiivisesta leusiinista liittyi proteiineihin.
Lievä happohydrolyysi vapautti kuitenkin 35 % leusiinista. Vapautunut leusiini ei siis ollut liittynyt proteiineihin vaan sitoutunut kinoneihin (Hardwick ja Woolhause, 1968) ja peptideihin (de Klerk, 1982).
5.3. Solususpensioprotoplastien makromolekyylisynteesit
Solususpensioprotoplastien kasvatusalustan radioaktiivisuus väheni lineaa
risesti ensimmäisten kasvatuspäivien aikana (kuva 15). Langebartelsin (1981) tutkimusten mukaan leima liittyy tällöin vakionopeudella syntetoitu- viin makromolekyyleihin. Paszkowski et ai. (1980) olivat osoittaneet
lisäKsi, että protoplastien sisäiset aineenvaihduntapoolit ovat suurim
millaan heti eristämisen jälkeen ja lisäävät täten radioaktiivuuden poistu
mista kasvatusalustasta.
Langebartels (1981) tutki Daucus carota var. Rotin GS-solususpensioproto
plaste ja. Ne syntetoivat RNA:ta ja proteiineja vakionopeudella kaksi vuorokautta, jonka jälkeen saavutettiin vakio tila. Paszkowski et ai.:n (1980) tutkimusten mukaan aminohappojen liittyminen proteiineihin oli tehokkainta 12... 24 tunnin ikäisissä Zea mays L.—solususpensioproto- plasteissa.
Langebartels (1981) havaitsi, että protoplast!tiheys vaikuttaa leimatun uridiinin liittymiseen RNA:han (kuva 18).
Protoplastitiheys / (ml)
Kuva_18. Protoplast!tiheyden vaikutus 3H-uridiinin liittymiseen Daucus carota var. Rotin GS-solususpensioprotoplas teissä (Langebartels, 1981).
Tässä työssä kahden rinnakkaismäärityksen protoplastitiheys oli lähes sama nukleiinihapposynteesin seurannassa (taulukko 6), joten kasvatusalustan radioaktiivisuus muuttui samalla tavalla (kuva 15). Protoplastitiheydet (noin 4*105 (ml)-1) kuuluivat alueelle, joka Langebartelsin (1981) mukaan soveltuu leimauksiin. Proteiinisynteesin seurannassa ensimmäisen kokeen protoplastitiheys (2,6 • 105 (ml)-1) oli noin puolet toisen kokeen tihey
destä (4,8 • 105 (ml)-1). Täten kasvatusalustojen radioaktiivisuudet muuttuivat eri tavalla. Ensimmäisessä kokeessa alustan radioaktiivisuus kasvoi 7. ...10. rasvatuspäivinä, jolloin protoplas tien elinkyky heikkeni.
Kuolevista ja rikkoutuneista protoplasteista vapautui leimaa alustaan.
Toisessa kokeessa protoplastit säilyivät hyväkuntoisina. Alustan radio
aktiivisuuden vaihtelut aiheutuivat elävistä protoplasteista erittyneistä radioaktiivisista yhdisteistä ja epätarkkuuksista mittauksissa.
5.4. Mesofylliprotoplastien makromolekyylisynteesit
Zelcerin ja Galunin (1976) tutkimuksissa tupakan (Nicotiana tabacum cv.
Xanthi) mesofylliprotoplasteissä leimattu tymidiini alkoi liittyä DNA:han vasta ensimmäisen vuorokauden kuluttua. Liittyminen oli nopeinta toisen vuorokauden jälkeen, jolloin myös jakautuminen alkoi (kuva 19). Lisätut
kimukset (Galun et ai., 1977) osoittivat, että kasvatuslämpötilan nostami
nen 27°C:sta 32°C:een edisti sekä jakautumista että tymidiinin liitty
mistä. Kasvatuksen alkuvaiheessa uridiinin ja leusiinin liittyminen ei vaatinut auksiinia (a—naftaleenietikkahappo, NAA) eikä sytokiniiniä (b-bentsyylaminopuriini, BA), mutta mikäli alusta ei sisältänyt näitä hormoneja, uridiini ja leusiini eivät enää liittyneet (kuva 20) (Zelcer ja Galun, 1976). Tässä työssä käytetty Li-alusta sisälsi auksiinia (NAA) ja sytokiniiniä (BA).
Myös Premecz et ai. (1978) tutkivat tupakan (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) mesofylliprotoplasteja. Kun kasvatusalustan osmoottinen paine kasvo!, leimatun urasiilin liittyminen väheni (kuva 21). Leimattujen syntetoitu—
neiden makromolekyylien pilkkoutuminen aiheutti lineaarisen liittymisen päättymisen 15 tunnin kuluttua. Tässä työssä käytetty Li-alusta sisälsi 0,4 M glukoosia ja 0,05 M sakkaroosia.
o
to
o O 20 30 40 50 60 70 80 viljelyaika/h
Kuva 19. ^H—tymidiinin liittymisnopeus (•) ja tuman jakautuminen ( 1) tupakan mesofylliprotoplasteissa. Protoplastitiheys oli 2,5 • 104 (ml)-1 (Zelcer ja Galun, 1976).
V iljelyaika/h
Kuva ¿Q. (a) H-uridiiain ja (b) 14C—leusiinin liittymisnopeus tupakan mesofylliprotoplas teissä, joita kasvatettiin täydellisellä alus
talla (•) tai alustalla ilman hormoneja (o). Protoplast!tiheys oli 105 (ml)-1 (Zelcer ja Galun, 1976).
V iljelyaika/h
Kuva 21. 3H-urasiilin liittyminen TCA-liukenemattomaan fraktioon tupakan mesofyliiprotoplasteissa, joita kasvatettiin (a) 0,4 M ja
(b) 0,7 M mannitolissa (Premecz et ai., 1978).
Rubin ja Zaitlin (1976) osoittivat, että leiman liittyminen lehdistä eris
tettyjen protoplastien makromolekyyleihin vaihtelee eri vuodenaikoina.
Vaihtelu oli suurinta kesällä. Heidän mukaansa valon voimakkuus kasvatuk
sen aikana ei vaikuttanut leiman liittymiseen. Kaur-Sawhney et ai. (1976) havaitsivat samana vuonna, että lehtien esikäsittely sykloheksimidillä (0,5...1,0 pg/ml) tai kinetiinillä (1...5 pg/ml) lisää eristettyjen proto
plastien kestävyyttä ja leiman liittymistä. Tällöin nukleaasien ja proteaasien muodostuminen oli nimittäin estynyt viillellyissä lehdissä.
Rubinin ja Zaitlinin (1976) mukaan protoplastit erittävät kasvatusalustaan leimaamattornia nukleosideja ja aminohappoja, jolloin leima laimenee.
Nukleosidien ja aminohappojen pitoisuus on suurempi protoplastin sisällä kuin kasvatusalustassa, joten niiden kuljettaminen protoplastin sisälle vaatii energiaa. Jokaiselle nukleosidille ja aminohapolle on olemassa substraattispesifinen kantajaproteiini, joka siirtää ne alustasta proto- plastiin (Robinson ja Mayo, 1977).
SaKai ja Takebe (1980) havaitsivat, että RNArhan ja proteiineihin liittynyt radioaktiivisuus on verrannollinen protoplastien lukumäärään. Myös tässä työssä havaittiin, että RNA:han ja proteiineihin liittyneen radioaktiivi
suuden osuus kasvo!, kun protoplastisuspensio tiheni.
5.5. Protoplastien jakautuminen
Elinkykyiset protoplastit muodostavat soluseinän ja jakautuvat.
Constabelin (1982) mukaan kasvimateriaalin fysiologinen tila, soluseinän hajottamisessa käytettyjen entsyymien laatu ja määrä, solukalvon kestävyys sekä kasvatusolosuhteet vaikuttavat eristettyjen protoplastien elinkykyyn.
Kasvatusalustan osmoottinen paine (0,2...0,7 M), alku-pH (pH 5,5 ... 6,8) ja Ca2+-ionit (5... 10 mM CaCl2 • 2H20) lisäävät protoplastien elävyyttä.
Gaiston et al. (1978) havaitsivat, että L-arginiini ja L-lysiini lisäävät protoplastien kestävyyttä, estävät niiden hajoamisen ja kerääntymisen yhteen sekä säilyttävät kloroplastien tasaisen jakaantumisen protoplas- teissa.
Li-alusta täytti kasvatusalustalle asetetut vaatimukset. Siitä huolimatta suurin osa mesofylli- ja solususpensioprotoplasteista ei jakautunut. Kun protoplasteja tarkasteltiin makroskooppisesti, elinkyvyttömät protoplastit olivat muodostaneet kuroutumia, kutistuneet rusinamaisiksi tai haljenneet.
Kaon ja Michaylukin (1975) tutkimusten mukaan protoplastit eivät kasva, kun protoplast!tiheys on alhainen. Tällöin välttämättömiä aineenvaihduntatuot
teita vuotaa protoplastista alustaan eristyksen aikana vaurioituneen solu
kalvon läpi. Lisäksi alustassa on ylimääräisiä yhdisteitä, jotka ovat myrkyllisiä protoplasteille. Protoplast!tiheyden kasvu sekä kookosmaidon lisääminen alustaan parantavat protoplastien kestävyyttä. Protoplastit kasvavat myös paremmin ohuena nestekerroksena kuin pisaroina.
Solususpensioprotoplastit jakautuivat yhtä kasvatusta lukuunottamatta.
Ensimmäisen proteiinien leimauskokeen solususpensioprotoplastit eivät
jakautuneet, koska protoplastitiheys (2,6 • 105 (ml)-1) oli liian alhainen.
Muissa kasvatuksissa protoplastitiheys oli 3,9 • 105 ... 4,8 • 105 (ml)-1, jolloin protoplastit jakautuivat. Diettrich et ai. (1982) olivat myös havainneet, että jakautuminen edellyttää protoplastitiheyttä 3*105...5»105
(ml)-1. Heidän viljelyssään viiden vuorokauden kuluttua 7... 15 % proto- plasteista oli alkanut jakautua. Noin 100 solua muodosti rykelmän
24 vuorokauden kuluttua.
Ainoastaan yhdessä mesofylliprotoplastikasvatuksesa protoplastit jakautui
vat (RNA-synteesin seuranta, ensimmäinen koe, kuva 16). Protoplastitiheys oli 2,3 • 105 (ml)-1, kun se oli alle 1,3 • 10^ (ml)-1 muissa kasvatuksis
sa. Lin (1981) mukaan Digitalis lanata- mesofylliprotoplastit jakautuvat, kun tiheys on vain 1 • 104 ... 2• 104 (ml)-1. Myös tupakan (Nicotiana tabacum) lehdistä eristetyt protoplastit jakautuvat, kun tiheys on
2 *104...5 • 104 (ml)-1 (Gigot et ai., 1975; Zelcer ja Galun, 1976). Näissä kasvatuksissa lämpötila oli 25...27°C ja valaistusvoimakkuus 2000 lx.
Tässä työssä protoplasteja kasvatettiin huoneenlämmössä ja valaistusvoimak
kuutta ei tunnettu. Tutkitut mesofylliprotoplastit käyttäytyivät kuten tupakan mesofylliprotoplastit Gigot et ai.:n (1975) sekä Zelcerin ja
Galunin (1976) tutkimuksissa. Lin (1982) mukaan Digitalis lanata-mesofyl- liprotoplastit jakautuvat ensimmäisen kerran viiden vuorokauden ikäisinä.
Kolmen viikon kuluttua muodostuu soluryhmiä, jotka värjäävät alustan ruskeaksi. Ruskea väri havaittiin myös tämän työn kasvatuksissa. Proto—
plastit kerääntyivät yhteen kasvatuksen alkuvaiheessa.
Jakautuvien ja jakautumattomien protoplastien kasvatusalustan radioaktii
visuuksissa ei havaittu selviä eroja (kuvat 15 ja 17).
6. YHTEENVETO
Solun ulkopuoliseen radioaktiivisten nukleosidien ja aminohappojen liitty
minen makromolekyyliin on monimutkainen tapahtumasarja. Taulukossa 8 on esitetty ympäristötekijöitä, jotka säätelevät makromolekyylien leimautu
mista eri kasvisolukoissa.
Franck! et al.:n (1971) esittämän hypoteesin mukaan solunsisäisiä pooleja tyhjentävät makroraolekyylisynteesit säätelevät nukleosidien ja aminohappo
jen poistumista kasvatusalustasta. Ne on kuljetettava erilaisten rajapin
tojen läpi solulimaan ja soluelimiin, joissa makromolekyylit syntetoituvat (Birt ja Hird, 1958; Cox et ai., 1973). Clay et ai. (1975) osoittivat, että osa leimasta ei koskaan kulkeudu synteesipaikalle. Birtin ja Hirdin (1958) mukaan kuljetuksessa tarvittava energia saadaan glykolyysistä.
Solun sisällä nukleosidit ja aminohapot kuljetetaan pooleihin erityisellä kuljetusmenetelmällä (Marsh et ai., 1982). Sama leima kulkeutuu useihin pooleihin. Kuvassa 22 on esitetty esimerkkinä maissin juuren kärjen liukoinen leusiinipooli Oaksin (1965) mukaan. Proteiiniin liittyy solun ulkopuolista leusiinia, muista kasvin osista kuljetettua leusiinia sekä solussa asetaatista syntetoitua leusiinia. Solun ulkopuolinen radioaktii
vinen leusiini kulkeutuu kantajan, leusiini-X:n, välityksellä sekä liukoi
seen leusiinipooliin että aineenvaihduntapooliin.
Kuljetettu
Solun ulkopuolinen ■j leusiini
; pooli Leusiini-X
leusiini
Proteiini
Kuva 22. Liukoinen leusiinipooli maissin juuren kärjissä (Oaks, 1965).
Taulukko 8. Ympäristötekijöitä, jotka säätelevät makromolekyylien leimautumista .
Ympäristö
tekijä
Synteesi Kasvisolukko Viite
valo RNA & Nicotiana tabacum Franck! et ai., 1971 proteiini
RNA Zea mays
Stephenson et ai., 1956 Harel ja Bogorad, 1973 happi proteiini Nicotiana tabacum Stephenson et al., 1956
Zea mays Mans ja Novelli, 1961a kosteus RNA Canavalia ensiformis Bourque ja Naylor, 1971
lämpötila proteiini Nicotiana tabacum Stephenson et ai., 1956 kasvatusalusta
-pH RNA & Nicotiana tabacum Franck! et ai., 1971 - kinetiini
proteiini
DNA Nicotiana tabacum
Stephenson et ai., 1956 Vyskot ja Bezaik, 1982 RNA,DNA & Xanthium Osborne, 1962
- auksiini
proteiini
RNA Glycine max Key ja Shannon,
1964-DNA & RNA Helianthus tuberosus Fraser ja Loening, 1974 - ravinteet RNA Nicotiana tabacum Bellamy, 1966
- Mg2+ proteiini Lycopersium esculentum Hall ja Cocking, 1966 - leiman
ylimäärä RNA & Nicotiana tabacum Franck! et ai., 1971 proteiini
proteiini Triticum aestivum Lamattina et ai., 1985
Katterman ja Clay (1975) osoittivat, että leima laimenee, kun se kulkee solunsisäisten poolien läpi. Solunsisäisten poolien koko, kiertonopeus (turnover rate, engl.) ja solukalvojen läpäisevyys eri kasvuvaiheissa määräävät laimenemisen suuruuden. Patterson ja Smillie (1971) olivat jo aikaisemmin havainneet, että makromolekyylien hajoamisreaktloissa vapautu
neet osaset laimentavat leimaa. Makromolekyylien tuotannon ja käytön välinen tasapaino säätelee poolien kokoa, joka vaihtelee kasvun aikana (Holleman ja Key, 1967; Macnicol, 1983).
Myös Davies (1980) ja de Klerk (1982) havaitsivat, että syntetoituneet makromolekyylit pilkkoutuvat pieniksi osasiksi solun aineenvaihdunnan
tuloksena. Osasia käytetään erilaisten yhdisteiden synteeseissä, tai ne hajotetaan täydellisesti, jolloin vapautuu mm. hiilidioksidia.
Solun ulkopuolisen leiman liittyminen happoon liukenemattomaan materiaaliin ei siis ole yhtä suuri kuin makromolekyylien todellinen synteesinopeus (Kemp ja Sutton, 1971; Goody ja Ellem, 1975; Katterman ja Clay, 1975).
Näytteenotto, analyyttisten menetelmien toistettavuus, vaihtelevat RNAasi- aktiivisuudet (Harel ja Bogorad, 1973) sekä leiman liittyminen muihin makromolekyyleihin (Cox et ai., 1973) aiheuttavat lisäksi epätarkkuutta.
Tässä työssä ei ole määritetty synteesinopeuksia, koska nukleosidien ja aminohappojen käyttäytymistä solun sisällä ei tunnettu.
Tässä työssä makromolekyylisynteesejä seurattiin lähinnä kasvatusalustan radioaktiivisuuden muutosten perusteella. Esikokeet osoittivat, että solu
ja taiminäytteiden kokonaiskuivapainoa ja siten myös kokonaisradioaktiivi- suutta on mahdoton määrittää tarkasti. Solususpension ja taimien näytteen
ottoa leimauksen aikana ei onnistuttu vakioimaan, joten ainoastaan tutkit
tavan materiaalin spesifinen radioaktiivisuus (cpm/mg k.a.) määritettiin leimauksen päätyttyä.
Kasvatusalustan radioaktiivisuus väheni solujen, taimien ja protoplastien kasvatuksissa ajan funktiona. Tulosten tarkastelussa on oletettu, että leima liittyi ainoastaan haluttuun makromolekyyliin ja että TCA saos ti makromolekyylit täydellisesti. Lisäksi oletettiin, että RNaasi ei vaikut
tanut mittaustuloksiin.
Solujen ja solususpensioprotoplastien kasvatusalustan radioaktiivisuus väheni eniten ensimmäisten kasvatuspäivien aikana. Poistuminen oli hitaam
paa protoplasteissa kuin soluissa. Kulikowski ja Mascarenhas (1978) havaitsivat saman ilmiön Centaurea cyanus-soluissa ja -protoplasteissa.
Premecz et al.:n (1977) mukaan osmoottisen paineen muutos eristyksen aikana, jakautumisen aiheuttama aineenvaihdunnan muutos, solujen välisen yhteyden menettäminen ja soluseinää pilkkoavien entsyymien myrkylliset jälkivaikutukset muuttavat protoplastien aineenvaihduntaa.
Käytetyllä menetelmällä saatiin karkea kuva kasvimateriaalin makromole- kyylisynteeseistä. Sen avulla ei onnistuttu osoittamaan, että protoplas- tien jakautumiskyvyttömyys aiheutuu makromolekyylisynteesien häiriöistä.
Kasvatusalustan radioaktiivisuuden muutos ei kuvaa tarkasti makromolekyyli- synteesejä, koska leima jakautuu solunsisäisten poolien välille. Menetelmä ei ollut riittävän herkkä havaitsemaan eroa jakautuvien ja jakautumattornien protoplastien radioaktiivisuuksissa. Kasvatusalustan muutos on liian
karkea, jotta yksittäisten protoplastien jakautuminen voidaan havaita.
Seuranta-aika oli myös niin pitkä, että syntetoituneet makromolekyylit hajosivat.
Punnitusvirheet aiheuttivat epätarkkuutta solujen ja taimien radioaktiivi- suusmäärityksissä. Freifelderin (1982) mukaan suodatinpaperin asennon ja muodon vaihtelut vähentävät suodatinpaperimenetelmän toistettavuutta.
Lisäksi hyvin pienet molekyylit läpäisevät suodatinpaperin. Käytettyjen suodatinpapereiden muoto vaihteli, ja suodatinpaperit olivat pystysuorassa tuikepullon sisällä. Osa protoplasteista saattoi mennä rikki imusuodatuk- sen aikana. Nestetuikelaskimen mittaustehokkuus perustui ulkoisen standar
din menetelmään. Menetelmä edellyttää, että näyteputket ovat tarkasti samanlaisia ja että käytetyt nestetilavuudet ovat samat (Rekonen, 1984).
Pipetointivirheet vaikuttivat täten mittaustarkkuuteen. Happoliukoiset makromolekyyleihin liittymättömät nukleosidit ja aminohapot sekä hajoa—
misreaktioissa vapautuneet osaset voidaan määrittää TCA-saostusliuoksesta, vaikka TCA aiheuttaakin kemiallista sammutusta Rekosen (1984) mukaan.
Hiilidioksidina vapautunut radioaktiivisuus voidaan määrittää joko kasva- tusrasioiden kanteen tiivistyneestä vedestä tai kalsiumhydroksidiin kostu
tetusta suodatinpaperista, joka on kiinnitetty rasian kanteen.
Langebartels (1981) käytti RNaasi-käsittelyä, jolla hän tarkisti nukleiini
happoihin liittyneen radioaktiivisuuden oikeellisuuden. Makromolekyyli- synteesejä voidaan tutkia myös synteesi-inhibiittoreilla (taulukko 9).
Taulukko 9. Makromolekyylisynteesien Inhibilttoreita.
Synteesi Inhibiittori Viite
DNA Mitomysiini
5-fluorodeoksiuridiini
Fraser ja Loening, 1974 Haber ja Schwarz, 1972
RNA Aktinomysiini D
Klomomysiini Ag 2-tiourasiili
Sakai ja Takebe, 1970 Sakai ja Takebe, 1970 Sakai ja Takebe, 1970 Proteiini Blastidisiini S
Enomysiini Sykloheksimidi Kloramfenikoli
Sakai ja Takebe, 1970 Sakai ja Takebe, 1970 Spencer, 1973
Kaveh ja Harel, 1973
Synteesien tarkka seuranta edellyttäisi molekyylibiologisten menetelmien käyttöä. Makromolekyylisynteesejä voitaisiin myös seurata histokemialli- silla menetelmillä (Lyndon, 1970; Puite ja Ten Broeke, 1983; Prasad et ai., 1984) tai autoradiografisesti (Cashmore, 1976; Galli, 1984). Protoplastien jakautumista voidaan tutkia muuttamalla kasvatusolosuhteita kuten proto- plastitiheyttä ja valaistusvoimakkuutta ja seuraamalla jakautumista inikroskooppisesti.
7. KIRJALLISUUSLUETTELO
Aikaan, D.P. ja Patterson, B.D., Graphic Determination of Isotope Activity Rations in Simultaneous Assay of Tritium and Carbon-14, Anal. Biochem.
18. (1967) 185-190.
Anon., Histochemistry. Teoksessa Macmillan Dictionary of Life Sciences (toim. E.A. Martin), 2. painos, Macmillan Press, Hong Kong 1985, s. 177.
Ashihara, H., Fujimura, T. ja Komamine, A., Pyrimidine Nucleotide Biosynthesis during Somatic Embryogenesis in a Carrot Cell Suspension Culture, Z. Pflanzenphysiol. 104 (1981) 129-137.
Baer, G.R., Meyers, S.P., Molin, W.T. ja Schrader, L.E., A Simple and Sensitive DNA Assay for Plant Extracts, Plant Physiol. 70 (1982) 999-1003.
Barlow, P.W., RNA Synthesis in the Root Apex of Zea mays, J. Exp. Bot.
21 (1970) 292-299.
Bellamy, A.R., RNA Synthesis in Exponentially Growing Tobacco Cells Subjected to a Step-Down Nutritional Shift, Biochim. Biophys. Acta 123 (1966) 102-115.
Bensadoun, A. ja Weinstein, D., Assay of Proteins in the Presence of Interfering Materials, Anal. Biochem. 70 (1976) 241-250).
Birt, L.M. ja Hird, F.J.R., Kinetic Aspects of the Uptake of Amino Acids by Carrot Tissue, Biochem. J. 70 (1958) 286-292.
von Borstel, K., Zum Stoffwechsel von Chinolizidinalkaloiden in
Zelisuspensionskulture von Lupinus hartwegii, Diplomityö, Braunschweig 1983, 70s.
Bourque, D.P. ja Naylor, A.W., Large Effects of Small Water Deficits on Chlorophyll Accumulation and Ribonucleic Acid Synthesis in Etiolated Leaves of Sack Bean (Canavalia ensiformis [l. ] DC.), Plant Physiol.
47 (1971) 591-594.
Bradford, M.M., A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding, Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254.
Bray, G.A., A Simple Efficient Liquid Scintillator for Counting Aqueous Solutions in a Liquid Scintillation Counter, Anal. Biochem.
1 (1960) 279-285.
Bryant, J.A., DNA Replication and the Cell Cycle. Teoksessa Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, Vol 14B Nucleic Acids and Proteins in Plants Il (toim. B. Parthier ja D. Boulter), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York 1982, ss. 75-110.
Burton, K., A Study of the Conditions and Mechanism of the Diphenylamine Reaction for the Colorimetric Estimation of Deoxyribonucleic Acid,
Biochem. J. 62 (1956) 315-323.
Byfield, J.E. ja Scherbaum, O.H., A Rapid Radioassay Technique for Cellular Suspensions, Anal. Biochem. 17 (1966) 434-443.
Cashmore, A.R., Protein Synthesis in Plant Leaf Tissue. The Site of Synthesis of the Major Proteins, J. Biol. Chem. 251 (1976) 2848-2853.
Chen, H.-R., Gallocyanin Chrome-Alum Stain for Plant Nucleic Acids, Plant Cell Physiol. ]_ (1966) 489-491.
Clay, W.F., Katterman, F.R.H. ja Hammett, J.R., Nucleic Acid Metabolism during Germination of Pima Cotton (Gossypium barbadense), Plant Physiol.
55 (1975) 231-236.
Constabel, F., Isolation and Culture of Plant Protoplasts. Teoksessa Plant Tissue Culture Methods (toim. L.R. Wetter ja F. Constabel), 2. painos, National Research Council of Canada, Saskatoon 1982, ss. 38-48.
Cooper, T.G., The Tools of Biochemistry, John Wiley & Sons, New York 1977, ss. 65-135.
Cox, B.J., Turnock, G. ja Street, H.E., Studies on the Growth in Culture of Plant Cells. XV. Uptake and Utilization of Uridine during the Growth of Acer pseudoplatanus L. Cells in Suspension Culture, J. Exp. Bot.
24 (78) (1973) 159-174.
Davies, D.D., The Measurement of Protein Turnover in Plants. Teoksessa Advances in Botanical Research, Vol 8 (toim. H.W. Woolhause), Academic Press, London 1980, ss. 65-126.
Dawes, E.A., Quantitative Problems in Biochemistry, E. & S. Livingstone Ltd., Edinburgh London 1956, ss. 187-201.
Deitch, A.D., A Method for the Cytophotometric Estimation of Nucleic Acids Using Methylene Blue, J. Histochem. Cytochem. 12 (1964) 451-461.
Deken-Grenson, M. ja Deken, R.H., Elimination of Substrances Interfering with Nucleic Acids Estimation, Biochim. Biophys. Acta 31 (1959) 195-207.
Deng, Q.-I. ja Ives, D.H., Modes of Nucleoside Phosphorylation in Plants:
Studies on the Apparent Thymidine Kinase and True Uridine Kinase of Seedings, Biochim. Biophys. Acta 277 (1972) 235-244.
Dhindsa, R.S. ja Cleland, R.E., Water Stress and Protein Synthesis;
Plant Physiol. 55 (1975) 778-781.
Dickmann, D.I. ja Gordon, J.C., Incorporation of ^4¡-Photosynthate into Protein during Leaf Development in Young Populus Plants, Plant Physiol.
56 (1975) 23-27.
Diettrich, B., Neumann, D. ja Luckner, M., Clonation of Protoplast-Derived Cells of Digitalis lanata Suspension Cultures, Biochem. Physiol. Pflanzen 177 (1982) 176-183.
Dische, Z. ja Schwarz, К., Mikrochim. Acta 2 (1937) 13. Ref. Hutchinson, W.C. ja Munro, H.N., The Determination of Nucleic Acids in Biological Materials, Analyst 86 (1961) 768-813.
Dyer, T.A. ja Leaver, C.J., RNA: Structure and Metabolism. Teoksessa The Biochemistry of Plants, Vol 6 Proteins and Nucleic Acids (toim. A. Marcus), Academic Press, New York 1981, ss. 111-168.
Erkama, J., Biokemia I, 2. painos, Oy Gaudeamus Ab, Helsinki 1974, ss. 223-278.
Ferrari, T.E. ja Widholm, J.M., A Simple, Rapid, and Sensitive Method for Estimation of DNA, RNA, and Protein Synthesis in Carrot Cell Cultures, Anal. Biochem. 56 (1973) 346-352.
Fiske, C.H. ja Subbarow, Y.P., Colorimetric Determination of Phosphorus, J. Biol. Chem. 66 (1925) 375-400.
Flax, M.H. ja Himes, M.H., Microspectrophotometric Analysis of
Metachromatic Staining of Nucleic Acids, Physiol. Zool. 25 (1952) 297-311.
Flores, R., A Rapid and Reproducible Assay for Quantitative Estimation of Proteins Using Bromophenol Blue, Anal. Biochem. 88 (1978) 605-611.
Franck!, R.I.B., Zaitlin, M. ja Jensen, R.G., Metabolism of Separated Leaf Cells. II. Uptake and Incorporation of Protein and Ribonucleic Acid
Precursors by Tobacco Cells, Plant Physiol. 48 (1971) 14-18.
Fraser, R.S.S. ja Loening, U.E., RNA Synthesis during Synchronous Cell Division in Cultured Expiants of Jerusalem Artichoke Tuber, J. Exp. Bot.
25 (1974) 847-859.
Freifelder, D., Physical Biochemistry, 2. painos, W.H. Freeman and Company, San Francisco 1982, ss. 169-192, 276-322.
Fritz, H.—G. ja RÖttger, B., Die Ermittlung von Ribonucleinsäure im Pflanzenmaterial, Z. Naturforschg. 18b (1963) 124-132.
Galli, M.G., Synthesis of DNA in Excised Watermelon Cotyledons Grown in Water and Benzyladenine, Planta 160 (1984) 193-199.
Galston, A.W., Altman, A. ja Kaur-Sawhney, R., Polyamines, Ribonucléase, and the Improvement of Oat Leaf Protoplasts, Plant Sei. Lett.
П (1978) 69-79.
Galun, E., Aviv, D., Raven, D., Vardi, A. ja Zelcer, A., Protoplasts in Studies of Cell Genetics and Morphogenesis. Teoksessa Plant Tissue Culture and Its Bio-Technological Application (toim. W. Barz, E. Reinhard ja M.H.
Zenk), Springer Verlag, Berlin Heidelberg New York 1977, ss. 302-312.
Gigot, C., Kopp, M., Schmitt, C. ja Milne, R.G., Subcellular Changes during Isolation and Culture of Tobacco Mesophyll Protoplasts, Protoplasma
84_ (1975) 31-41.
Goody, H.E. ja Ellem, К.A.0., Nutritional Effects on Precursor Uptake and Compartmentalization of Intracellular Pools in Relation to RNA Synthesis, Biochim. Biophys. Acta 383 (1975) 30-39.
Gornall, A.G., Bardawill, C.J. ja David, M.M., Determination of Serum Proteins by Means of the Biuret Reaction, J. Biol. Chem.
177 (1949) 751-766.
Goulding, K.H., Radioisotope Techniques. Teoksessa A Biologist's Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry (toim. B.L. Williams ja К. Wilson), Edward Arnold, London 1979, ss. 170-198.
Grierson, D., RNA Processing and Other Post-Transcriptional Modifications.
Teoksessa Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, Vol 14B Nucleic Acids and Proteins in Plants II (toim. B. Parthier ja D. Boulter), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York 1982, ss. 192-223.
Haber, A.H. ja Schwarz, O.J., A Method for Testing the Specificity of Inhibitors of Deoxyribonucleic Acid Synthesis in Growth Studies,
Plant Physiol. 49 (1972) 335-337.
Hahne, G. ja Hoffmann, F., Dimethyl Sulfoxide Can Initiate Cell Divisions of Arrested Callus Protoplasts by Promoting Cortical Microtubule Sssembly, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 5449-5453.
Hall, T.C. ja Cocking, E.C., High-Efficiency Liquid-Scintillation Counting of 14C-Labelled Material in Aqueous Solution and Determination of Specific Activity of Labelled Proteins, Biochem. J. 96 (1965) 626-633.
Mall, T.C. ja Cocking, E.C., Amino Acid Incorporation into Protein by Aseptic Cell—Free Systems from Tobacco Cotyledons and Leaves,
Biochim. Biophys. Acta 123 (1966) 163-171.
Hannus, R., Suullinen tiedonanto, 1985.
Hansen, D.L. ja Bush, E.T., Improved Solubilization Procedures for Liquid Scintillation Counting of Biological Materials, Anal. Biochem.
18 (1967) 320-332.
Hardwick, K. ja Woolhause, H.W., Foliar Senescence in Perilla Frutescens (L. ) Britt. The Mechanisms of [2— ^**С ] Glycine Uptake and Incorporation into Protein by Leaf Disks, New Phytol. 67 (1968) 241-246.
Harel, E. ja Bogorad, L., Effect of Light on Ribonucleic Acid Metabolism in Greening Maize Leaves, Plant Physiol. 51 (1973) 10-16.
Hartree, E.F., Determination of Protein: A Modification of the Lowry Method That Gives a Linear Photometric Response, Anal. Biochem.
48 (1972) 422-427.
Holdgate, D.P. ja Goodwin, T.W., Quantitative Extraction and Estimation of Plant Nucleic Acids, Phytochemistry 4_ (1965) 831-843.
Holleman, J.M. ja Key, J.L., Inactive and Protein Precursor Pools of Amino Acids in the Soybean Hypocotyl, Plant Physiol. 42 (1967) 29-36.
Humphrey, T.J. ja Davies, D.D., A Sensitive Method for Measuring Protein
Humphrey, T.J. ja Davies, D.D., A Sensitive Method for Measuring Protein