8.1. Proteiinin määritys Lowryn mukaan
Proteiini määritettiin Lowryn et ai. /1951/ mukaan.
Reagenssit:
- liuos A: 2 % Na2C03 0,10 M NaOH:ssa
- liuos B: 0,5 % CuSO^•5 H20 1 % natriumtartraatissa 3
- liuos C: 50 cm liuos A + liuos В
- liuos D: kuten liuos C, mutta liuos A:ssa ei NaOH: a
- liuos E: Folin-Ciocalteau -reagenssi laimennettiin 1 : 1 ionivaihdetulla vedellä.
Liukoisen proteiinin määritys :
Tutkittavasta liuoksesta tehtiin sopiva laimennos, jota pipetoi- tnn koeputkeen 1 cm ja lisättiin 5 cm liuos C:tä. Sekoitettiin ja annettiin seistä 10 min. Lisättiin 1 cm3 liuos E :tä, sekoitet
tiin välittömästi ja mitattiin absorbanssi aallonpituudella 750 nm aikaisintaan 30 minuutin kuluttua.
Standardikäyrä määritettiin valmistamalla kiteisestä naudan see- rumialbumiinista (Sigma, St. Louis, Missouri) vesiliuokset, joi
den proteiinipitoisuus vaihteli välillä 20... 100 mg-dm-3. Liukoi
sen proteiinin standardisuoran yhtälöksi saatiin
У = x(3,138 - 0,001x)_1 (n = 6 ja R = 0,999)
... -3
missa у on proteiinipitoisuus (mg-dm ) ja x absorbanssi.
(
1)
Liukenemattoman proteiinin määritys :
Tutkittavasta liuoksesta tehtiin sopiva laimennos, jota mitattiin
3 3
koeputkeen 0,8 cm , lisättiin 0,2 cm 2,5 M NaOH: a. Seosta kuumen
nettiin kiehuvassa vesihauteessa 10 min. Jäähdytyksen jälkeen jat
kettiin kuten liukoisen proteiinin määrityksessä, mutta liuos C:n sijasta käytettiin liuos D:tä.
Standardikäyrä määritettiin myös valmistamalla naudan
seerumialbu-■ • . —3
miinista vesiliuokset (10...100 mg-dm ). Liukenemattoman proteii
nin standardikäyrän yhtälöksi saatiin
y = 387x2 + 419x - 0,85 (n = 7 ja R = 0,9998) (2)
_ 3
missä y on proteiinipitoisuus (mg*dm ) ja x on absorbanssi.
Lowryn menetelmällä saatu liukenemattoman proteiinin määrä oli -3
3700 mg•dm pienempi kuin Kjeldahl-menetelmän antama (s. 67).
Siten laskettiin näytteen liukenemattoman proteiinin pitoisuus lisäämällä 3700 mg* dm standardikäyrän (2) antamaan tulokseen.
8.2. Proteiinin määritys Markwellin mukaan
Esikokeissa, joissa proteiinin määritysmenetelmää valittiin, tehtiin määritys myös Markwellin et ai. /1978/ mukaan.
Reagenssit:
- liuos A: 2 % Na2C0g, 0,16 % natriumtartraatti ja 1 % SDS 0,4 % NaOH:ssa
- liuos В: 4 % Cuso.•5 H-0 4 2
- liuos C: 100 osaa liuos A:ta + 1 osa liuos В :tä
- liuos D: Folin-Ciocalteau -reagenssi laimennettiin 1 : 1 ionivaihdetulla vedellä.
Määritys ;
Tutkittavasta liuoksesta tehtiin sopiva laimennos, jota
pipetoi-3 3
tiin koeputkeen 1 cm . Lisättiin 3 cm liuos C:tä ja seisotettiin huoneenlämmössä 10...60 min. Lisättiin 0,3 cm^ liuos D:tä ja sei
sotettiin 45 min. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 660 nm.
Standardikäyrä määritettiin valmistamalla kiteisestä naudan see- rumialbumiinistä vesiliuokset, joiden proteiinipitoisuus vaihteli välillä 10 ... 100 mg•dm ^. Yhtälöksi saatiin
У = 255x - 2,64 (R = 0,9993 ja n = 7) (3)
missä у on proteiinipitoisuus (mg.dm ) ja x absorbanssi.-3
8.3. Proteiinipitoisuuden määritys typpipitoisuuden avulla
Proteiinijauheiden ja kirnupiimän typpipitoisuus määritettiin Kjeldahl-menetelmällä /1970/. Proteiinipitoisuus (%) laskettiin käyttäen kerrointa 6,38.
8.4. Laktoosi
Laktoosi määritettiin entsymaattisesti hydrolysoimalla laktoosi ja mittaamalla sen jälkeen glukoosipitoisuus.
Reagenssit:
” 0,1 M KH2P04~puskuri, pH 7,0, säädetään KOH:lla
- Maxilact LX 5000 -entsyymivalmiste (Gist-Brocades NV, Delft, Hollanti)
- GOD-Perid -reagenssi (Boehringer Mannheim GmbH, Saksan liitto
tasavalta) .
Määritys :
.. .. ... 3
Näytettä punnittiin 100 cm mittapulloon 0,05 g laktoosia vastaa
va määrä. Pullo täytettiin ionivaihdetulla vedellä. Liuotuksen jälkeen pipetoitiin laimennosta 2 cm3:ä koeputkeen, lisättiin
3 3
2 cm Maxilaet-liuosta (10 mg /'cm 0,1 M KH2P04) ja sekoitettiin.
Seisotettiin 30... 60 min huoneenlämmössä. Seosta pipetoitiin 0,1 cm3 koeputkeen ja 5 cm3 GOD-Perid -reagenssia lisättiin. Annet
tiin seistä huoneenlämmössä 25...50 min ennen absorbanssin mit
tausta aallonpituudella 640 nm.
Laktoosipitoisuus lasketaan kaavasta :
Laktoosipitoisuus (p-%) = ■■■rWte--- • ,.5^ ^—г Ю0 %A ..
Standardi ■“У* « (4)
missä A on absorbanssi.
8.5. Rasva
Rasva määritettiin FAO/WHO STANDARDin n:o B-3, 1967 mukaan. Näy
te käsiteltiin ensin suolahapolla. Rasva uutettiin sen jälkeen liuoksesta dietyylieetterin ja petroolieetterin (1 : 1) seoksel
la. Liuotin haihdutettiin ja jäännös punnittiin. Rasvapitoisuus laskettiin painon perusteella.
8.6. Kuiva-aine ja tuhka
Jauheiden kuiva-aine määritettiin kuivaamalla vakiopainoon 105°C:ssa. Proteiinisakkojen nopeisiin kuiva-ainemäärityksiin käytettiin termogravimetristä kosteusmittaria. Tuhkamääritys tehtiin hehkuttamalla 600°C:ssa.
8.7. Kalsium ja kupari
Kalsium- ja kuparimäärityksiä varten näyte digestoitiin kloori- vetyhapolla. Suodos laimennettiin. Kalsiumia määritettäessä liuok
seen lisättiin lantaanioksidia. Määritykset suoritettiin atomi- absorptiospektrofotometrillä (Perkin-Elmer 403, Perkin Elmer, Yhdysvallat).
8.8. SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi
Reagenssit:
- akryyliamidiliuos: 32 g akryyliamidia (Eastman, New York, Yh
dysvallat) ja 1 g N,N1-metyleenibisakryyliamidia (Eastman, New York, Yhdysvallat) liuotettiin dekantterilasissa magneettise
koittajaa käyttäen ja lievästi lämmittäen 0,001 M EDTA-liuok- seen. Liuos laimennettiin mittalasissa 0,001 M EDTA:11a
3
100 cm :ksi.
- boorihappo-Tris -puskuri, pH 8,2: 30 g boorihappoa, 30 g Tris'iä (Sigma, St. Louis, Yhdysvallat) ja 10 g natriumdodekyylisulfaat
tia (SDS) (BDH Chemicals Ltd, Poole, Englanti) liuotettiin magneettisekoittajalla veteen, säädettiin pH ja laimennettiin 1000 emiksi. Säilytettiin jääkaapissa.
- EDTA-liuos, 0,001 M: 0,1861 g EDTA:ta liuotettiin 500 emaliin vettä.
- proteiinivalmisteitten solubilisointiliuos: 10 cm3 2 % SDS:n 3
vesiliuosta, 10 cm boorihappo-Tris -puskuria ja 10 mg DTT: a (Clelandin reagenssi eli ditiotreitoli) (Sigma, St. Louis, Yh
dysvallat) . Koska DTT hapettuu helposti, on solubilisointiliuok- sen oltava vastavalmistettua. Sopiva näytemäärä on noin 2...3 mg proteiinia/cm3.
- elektrodipuskuri: 4 osaa vettä + 1 osa boorihappo-Tris -puskuria, pH 8,2.
- värjäysliuos: 0,5 g Coomassie brilliant blue'ta R 250 (Serva, Heidelberg, Saksan liittotasavalta) liuotettiin 150 cm3:iin
me-3
tanolia. Lisättiin 310 cm vettä, 15 g sulfosalisyylihappoa ja 50 g TCA.
зз з
- pesuliuos: 1950 cm vettä, 750 cm metanolla ja 240 cm etikka-happoa .
- trikloorietikkahappoliuos (ТСА) 15 % : 75 g TCA:ta liuotettiin 3
500 cm :iin vettä.
3 з
- geeliliuos: 25 cm akryyliamidiliuosta, 10 cm boorihappo-Tris
3 3
-puskuria, 0,1 cm 2-merkaptoetanolia ja 0,15 cm TEMED:iä lai-3
mennettiin 97,5 cm :ksi. Dekantterilasiin punnittiin 25 mg NH^- persulfaattia, joka liuotettiin 2,5 cm3:iin vettä. Nämä kaksi liuosta sekoitettiin keskenään. Geeli valettiin välittömästi.
Määritys :
2
Geelilevyn koloon pipetoitiin-10 mm näytettä, jota oli solubili- soitu 40°C:ssa 1 h.
Erottaminen: 30 mA, 2,5 h.
Värjäys : Coomassie brilliant blue -liuos, 60°C 15 min. Ellei värjäystä voitu suorittaa samana päivänä heti ajon jälkeen, pan
tiin geelilevy yöksi 15-prosenttiseen TCA:han.
Värinpoisto : Etanoli/etikkahappo/vesi.
8.9. Liukoisuus
Liukoisuuden riippuvuus pH :sta määritettiin käyttäen muunneltua Mattilin /1971/ menetelmää.
Reagenssit:
- 0,5 M NaOH 0,5 M HC1.
Määritys :
Proteiinivalmisteesta tehtiin proteiinin suhteen 1-prosenttinen liuos, jonka pH säädettiin haluttuun arvoon 0,5 M NaOH:11a tai 0,5 M HCl :11a. 20 cm seosta sekoitettiin magneettisekoittajalla 40 min, minkä jälkeen sentrifugoitiin 20 min 4500 kierr.-min-1.
Supernatantin proteiinipitoisuus määritettiin Lowryn mukaan.
Liuenneen proteiinin määrä laskettiin proteiinivalmisteen ja supernatantin proteiinipitoisuuksien erona.
8.10. Emulgoimiskyky ja emulsionsäilytyskyky
Emulgoimis- ja emulsionsäilytyskyky määritettiin muunnetulla Inklaarin ja Fortuinin /1969/ menetelmällä /Loimaranta, 1978/.
Reagenssit:
- proteiiniliuos: jauheista valmistettiin proteiinin suhteen 4- prosenttiset liuokset ionivaihdettuun veteen ja liuotettiin magneettisekoittajalla 45 min. pH säädettiin halutuksi joko
1 M NaOH:11a tai HCl:lla.
- rypsiöljy (Raision tehtaat Oy, Raisio).
Emulsion valmistus :
3 3
65 cm :iin proteiiniliuosta lisättiin 50 cm rypsiöljyä, öljy emulgoitiin proteiiniliuokseen mekaanisella sekoittajalla nopeu
della 10, mikä vastasi varren vapaata pyörimisnopeutta 2800 kierr.
. ™1 O
min . Emulgointiaika oli 10 min. Emulgointi tehtiin 250 cm :n de- kantterilasissa. Emulgoinnin jälkeen emulsio pidettiin homogeeni
sena magneettisekoittajan avulla, ja siitä pipetoitiin 10 cm3:n
näytteet mitta-asteikolla varustettuihin sentrifuugiputkiin.
Putket suljettiin alumiinifoliolla ja niiden annettiin seistä 15 min. Tänä aikana putkeen syntyneet kerrokset (sakka, vesifaa
si, emulsio ja öljy) vakioituivat. Putket siirrettiin edelleen 15 minuutiksi 80°C:een vesihauteeseen. Putkia jäähdytettiin huo
neenlämmössä (23...24°C) 15 min ennen jatkokäsittelyä.
Määritys :
Valmistuksen jälkeen emulsioita säilytettiin huoneenlämmössä 1 h.
Sen jälkeen ne sentrifugoitiin nopeudella 2200 kierr.*min-1 (800 G) 15 min ja erottuneen öljyn tilavuus luettiin sentrifuugiputken asteikolta.
Emulsion pysyvyys - Bnulgoituneen SIЩ tilavuus .
Öljyn kokonaistilavuus (5)
emulgoituneen öljyn tilavuus = öljyn kokonaistilavuus - erottu
neen öljyn tilavuus.
Emulgoimiskyky (EK) on emulsion pysyvyys heti sentrifugoinnin jälkeen.
Emulsionsäilytyskyvyn (ES) määrittämiseksi säilytettiin emulsio
ta 7 vuorokautta joko 5°C:ssa tai 23...25°C:ssa. Säilytyskyky on emulsion pysyvyys 7 vuorokauden kuluttua.
Emulsion pysyvyyden arvosteluasteikko :
Arvosana Emulsion pysyvyys (%) Korkea
Kuva 3. Emulsionäytteet sentrifugoinnin jälkeen. Putkessa 5 näkyvät kaikki kerrokset: alinna sakka, sitten vesi- faasi, emulsiokerros ja erottunut öljy. Putkissa 1, 3 ja 4 emulsion pysyvyys on korkea, kun taas putkessa 2 melko korkea, putkessa 5 keskinkertainen ja putkes
sa 6 alhainen.
8.11. Tulosten käsittely
Tulosten käsittelyssä käytettiin Valion laboratorion BASIC- ohjelmoitavaa kalkylaattoria Wang 2000 ja siihen liitettyä piir
turia Wang 2282 (Wang Laboratories Inc., Tewksbury, Massachusetts, Yhdysvallat).